本发明属于干细胞应用领域，特别涉及一种nk细胞联合间充质干细胞在治疗肝炎及肝纤维化中的应用。
背景技术：
肝脏作为人体内最大、功能最多的实质性腺体器官之一，参与了人体内的许多过程，例如体内消化、代谢、胆汁排泄、解毒和免疫等过程，随着经济的发展，肝脏功能损害相关的疾病发病率呈逐年上升趋势。研究表明，肝脏的病变呈现出多样化和难治愈化趋势。目前，肝病的治疗方法主要有病因治疗、饮食治疗和药物治疗，到目前为止还没有效果十分令人满意的药物。寻求一种安全有效且副作用较小的药物治疗肝脏功能损害成为临床亟待解决的问题，也是成为目前临床研究的热点之一。
病毒性肝炎是由几种不同的嗜肝病毒(肝炎病毒)引起的以肝脏炎症和坏死病变为主的一组感染性疾病，其具有传染性较强、传播途径复杂、流行面广泛、发病率高等特点；部分乙型、丙型肝炎等患者可演变成慢性，并可发展为肝硬化和原发性肝细胞癌，对人民健康危害甚大。目前乙型肝炎患者最为常见。
肝纤维化是许多慢性致病因素作用于肝脏引起ecm(extracellularmatrix，细胞外基质)过度沉积的共同病理过程，致病因子引起肝脏氧化应激反应和细胞因子的产生是肝纤维化发生的始动环节。目前用于治疗肝纤维化的药物有核苷类抗病毒药拉夫米、维甲酸等，然而，长期使用上述药物会对肝脏产生毒性。
nk细胞(naturalkillercell，自然杀伤细胞)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。
间充质干细胞是中胚层来源的成体干细胞，由于来源广泛、扩增潜能巨大，横向分化能力，以及可以逃避免疫识别和抑制免疫反应等其它干细胞无法比拟的优势，目前备受研究人员的关注。
目前还没有将nk细胞与间充质干细胞联用用于治疗肝炎及肝纤维化的报道。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供一种nk细胞联用间充质干细胞、其组合物及其制剂在制备治疗肝炎及肝纤维化药物中的应用。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供一种nk细胞联合间充质干细胞、及其组合物和制剂在制备治疗肝炎及肝纤维化的药物中的应用。
进一步的改进，所述nk细胞和间充质干细胞的个数比为5-6:20-30。
进一步的改进，所述应用进一步包括将nk细胞和间充质干细胞分别进行培养后混合的步骤。
进一步的改进，所述nk细胞的培养具体方法为：将nk细胞在第一培养基中培养，当培养的细胞密度达到(2-3)×107个/ml后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养具体方法为：将间充质干细胞在第三培养基中培养，当培养的细胞汇合达到85-90％后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞。
进一步的改进，所述第一培养基由dmem培养液和第一添加剂组成，所述第一添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为2-5μg/ml聚丙烯酸钠、5-10μg/ml亚硒酸钠、5-10μg/ml半胱氨酸、20-25μg/ml甘露醇、1-3μg/ml丝氨酸、3-5μg/ml马齿苋水提物和5-10μg/ml侧伯叶水提物。
进一步的改进，所述第二培养基由dmem培养液、胎牛血清和第二添加剂组成，所述胎牛血清在dmem培养液中的总体积分数为7％-12％，所述第二添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为2-5μg/ml谷胱甘肽、15-20μg/ml柠檬酸铁、7-12μg/ml成纤维细胞生长因子、5-10μg/ml生物素、2-5μg/ml氯化硒、3-5μg/ml人白蛋白、1-3μg/ml夏枯草水提取和1-3μg/ml艾叶水提物。
进一步的改进，所述第三培养基由dmem培养液和第三添加剂组成，所述第三添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为1-3μg/ml二乙醇胺、5-10μg/ml月桂酰丝氨酸、1-3μg/ml半胱氨酸、10-15μg/ml山梨醇、5-10μg/ml脯氨酸、1-3μg/ml维生素c、5-10μg/ml野菊花水提取和5-10μg/ml筋骨草水提物。
进一步的改进，所述组合物由nk细胞、间充质干细胞和中药提取物组成，所述nk细胞的浓度为5×105-6×105个/ml，所述间充质干细胞的浓度为2×106-3×106个/ml，所述中药提取物的浓度为15-20mg/ml，所述中药提取物是由如下重量份的成分制备而成：
仙鹤草5-10密蒙花15-20淡竹叶5-10紫苏子1-3。
进一步的改进，所述中药提取物是通过如下方法制备得到的：
将仙鹤草、密蒙花、淡竹叶和紫苏子粉碎，用水煎煮2次，第一次用水量为药材总重的5倍，煎煮3h，第二次用水量为药材总重的3倍，煎煮2h，合并煎煮液，过滤，滤液用活性炭脱色，先用石油醚萃取，弃去有机相，水相再用乙酸乙酯萃取，弃去有机相，水相，浓缩，干燥，得中药提取物。
进一步的改进，所述制剂为注射液，所述注射液由间充质干细胞、nk细胞或含有间充质干细胞和nk细胞的组合物、生理盐水及辅料组成，每ml所述生理盐水含有2×106-3×106个间充质干细胞及5×105-6×105个nk细胞和/或15-20mg中药提取物，含有10-20mg辅料，所述辅料由如下重量份的成分组成：
甘氨酸5-10葡甲胺2-4
甘油1-3聚乙二醇10003-5。
本发明提供一种nk细胞联合间充质干细胞、及其组合物和注射液在制备治疗肝炎及肝纤维化的药物中的应用，该间充质干细胞联合nk细胞及其组合物和注射液可以用于治疗乙型肝炎，并且可以降低肝指数，血清alt、ast的活性及肝组织中的mda含量；还具有增高sod活性的功能，由此得出，本发明提供的nk细胞联合间充质干细胞、及其组合物和注射液还可以用于治疗肝纤维化。
具体实施方式
实施例1
一种nk细胞和间充质干细胞的混合细胞，其中nk细胞和间充质干细胞的个数比为1:4。
实施例2
一种nk细胞和间充质干细胞的混合细胞，其中nk细胞和间充质干细胞的个数比为1:5。
实施例3
一种nk细胞和间充质干细胞的混合细胞，其中nk细胞和间充质干细胞的个数比为1:6；
所述nk细胞和间充质干细胞均是分别培养后再进行混合；
所述nk细胞的培养具体方法为：将nk细胞在第一培养基中培养，当培养的细胞密度达到3×107个/ml后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养具体方法为：将间充质干细胞在第三培养基中培养，当培养的细胞汇合达到85％后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；
所述第一培养基由dmem培养液和第一添加剂组成，所述第一添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为2μg/ml聚丙烯酸钠、5μg/ml亚硒酸钠、5μg/ml半胱氨酸、20μg/ml甘露醇、1μg/ml丝氨酸、3μg/ml马齿苋水提物和5μg/ml侧伯叶水提物；
所述第二培养基由dmem培养液、胎牛血清和第二添加剂组成，所述胎牛血清在dmem培养液中的总体积分数为7％，所述第二添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为2μg/ml谷胱甘肽、15μg/ml柠檬酸铁、7μg/ml成纤维细胞生长因子、5μg/ml生物素、2μg/ml氯化硒、3μg/ml人白蛋白、1μg/ml夏枯草水提取和1μg/ml艾叶水提物；
所述第三培养基由dmem培养液和第三添加剂组成，所述第三添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为1μg/ml二乙醇胺、5μg/ml月桂酰丝氨酸、1μg/ml半胱氨酸、10μg/ml山梨醇、5μg/ml脯氨酸、1μg/ml维生素c、5μg/ml野菊花水提取和5μg/ml筋骨草水提物。
实施例4
一种nk细胞和间充质干细胞的混合细胞，其中nk细胞和间充质干细胞的个数比为3:10。
所述nk细胞和间充质干细胞均是分别培养后再进行混合；
所述nk细胞的培养具体方法为：将nk细胞在第一培养基中培养，当培养的细胞密度达到2×107个/ml后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养具体方法为：将间充质干细胞在第三培养基中培养，当培养的细胞汇合达到90％后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；
所述第一培养基由dmem培养液和第一添加剂组成，所述第一添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为5μg/ml聚丙烯酸钠、10μg/ml亚硒酸钠、10μg/ml半胱氨酸、25μg/ml甘露醇、3μg/ml丝氨酸、5μg/ml马齿苋水提物和10μg/ml侧伯叶水提物；
所述第二培养基由dmem培养液、胎牛血清和第二添加剂组成，所述胎牛血清在dmem培养液中的总体积分数为12％，所述第二添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为5μg/ml谷胱甘肽、20μg/ml柠檬酸铁、12μg/ml成纤维细胞生长因子、10μg/ml生物素、5μg/ml氯化硒、5μg/ml人白蛋白、3μg/ml夏枯草水提取和3μg/ml艾叶水提物；
所述第三培养基由dmem培养液和第三添加剂组成，所述第三添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为3μg/ml二乙醇胺、10μg/ml月桂酰丝氨酸、3μg/ml半胱氨酸、15μg/ml山梨醇、10μg/ml脯氨酸、3μg/ml维生素c、10μg/ml野菊花水提取和10μg/ml筋骨草水提物。
实施例5
一种nk细胞和间充质干细胞的混合细胞，其中nk细胞和间充质干细胞的个数比为1:5。
所述nk细胞和间充质干细胞均是分别培养后再进行混合；
所述nk细胞的培养具体方法为：将nk细胞在第一培养基中培养，当培养的细胞密度达到3×107个/ml后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养具体方法为：将间充质干细胞在第三培养基中培养，当培养的细胞汇合达到88％后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；
所述第一培养基由dmem培养液和第一添加剂组成，所述第一添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为3μg/ml聚丙烯酸钠、7.5μg/ml亚硒酸钠、7.5μg/ml半胱氨酸、23μg/ml甘露醇、2μg/ml丝氨酸、4μg/ml马齿苋水提物和8μg/ml侧伯叶水提物；
所述第二培养基由dmem培养液、胎牛血清和第二添加剂组成，所述胎牛血清在dmem培养液中的总体积分数为10％，所述第二添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为4μg/ml谷胱甘肽、17μg/ml柠檬酸铁、10μg/ml成纤维细胞生长因子、8μg/ml生物素、4μg/ml氯化硒、4μg/ml人白蛋白、2μg/ml夏枯草水提取和2μg/ml艾叶水提物；
所述第三培养基由dmem培养液和第三添加剂组成，所述第三添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为2μg/ml二乙醇胺、7.5μg/ml月桂酰丝氨酸、2μg/ml半胱氨酸、12μg/ml山梨醇、8μg/ml脯氨酸、2μg/ml维生素c、7μg/ml野菊花水提取和8μg/ml筋骨草水提物。
实施例6
一种组合物，所述组合物由nk细胞、间充质干细胞和中药提取物组成，所述nk细胞的浓度为5×105个/ml，所述间充质干细胞的浓度为2×106个/ml，所述中药提取物的浓度为15mg/ml，所述中药提取物是由如下重量份的成分制备而成：
仙鹤草5密蒙花15淡竹叶5紫苏子1。
实施例7
一种组合物，所述组合物由nk细胞、间充质干细胞和中药提取物组成，所述nk细胞的浓度为6×105个/ml，所述间充质干细胞的浓度为3×106个/ml，所述中药提取物的浓度为20mg/ml，所述中药提取物是由如下重量份的成分制备而成：
仙鹤草10密蒙花20淡竹叶10紫苏子3。
实施例8
一种组合物，所述组合物由nk细胞、间充质干细胞和中药提取物组成，所述nk细胞的浓度为6×105个/ml，所述间充质干细胞的浓度为3×106个/ml，所述中药提取物的浓度为18mg/ml，所述中药提取物是由如下重量份的成分制备而成：
仙鹤草7密蒙花17淡竹叶8紫苏子2
中药提取物是通过如下方法制备得到的：将仙鹤草、密蒙花、淡竹叶和紫苏子粉碎，用水煎煮2次，第一次用水量为药材总重的5倍，煎煮3h，第二次用水量为药材总重的3倍，煎煮2h，合并煎煮液，过滤，滤液用活性炭脱色，先用石油醚萃取，弃去有机相，水相再用乙酸乙酯萃取，弃去有机相，水相，浓缩，干燥，得中药提取物；所述nk细胞和间充质干细胞均是分别培养后再进行混合；
所述nk细胞的培养具体方法为：将nk细胞在第一培养基中培养，当培养的细胞密度达到达到3×107个/ml后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养具体方法为：将间充质干细胞在第三培养基中培养，当培养的细胞汇合达到88％后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；
所述第一培养基由dmem培养液和第一添加剂组成，所述第一添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为3μg/ml聚丙烯酸钠、7.5μg/ml亚硒酸钠、7.5μg/ml半胱氨酸、23μg/ml甘露醇、2μg/ml丝氨酸、4μg/ml马齿苋水提物和8μg/ml侧伯叶水提物；
所述第二培养基由dmem培养液、胎牛血清和第二添加剂组成，所述胎牛血清在dmem培养液中的总体积分数为10％，所述第二添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为4μg/ml谷胱甘肽、17μg/ml柠檬酸铁、10μg/ml成纤维细胞生长因子、8μg/ml生物素、4μg/ml氯化硒、4μg/ml人白蛋白、2μg/ml夏枯草水提取和2μg/ml艾叶水提物；
所述第三培养基由dmem培养液和第三添加剂组成，所述第三添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为2μg/ml二乙醇胺、7.5μg/ml月桂酰丝氨酸、2μg/ml半胱氨酸、12μg/ml山梨醇、8μg/ml脯氨酸、2μg/ml维生素c、7μg/ml野菊花水提取和8μg/ml筋骨草水提物。
实施例9
一种注射液，所述注射液由间充质干细胞、nk细胞或含有间充质干细胞和nk细胞的组合物、生理盐水及辅料组成，每ml所述生理盐水含有2×106个间充质干细胞及5×105个nk细胞，含有10mg辅料，所述辅料由如下重量份的成分组成：
甘氨酸5葡甲胺2
甘油1聚乙二醇10003。
实施例10
一种注射液，所述注射液由间充质干细胞、nk细胞或含有间充质干细胞和nk细胞的组合物、生理盐水及辅料组成，每ml所述生理盐水含有3×106个间充质干细胞及6×105个nk细胞，含有15mg辅料，所述辅料由如下重量份的成分组成：
甘氨酸7葡甲胺3
甘油2聚乙二醇10004。
实施例11
一种注射液，所述注射液由间充质干细胞、nk细胞或含有间充质干细胞和nk细胞的组合物、生理盐水及辅料组成，每ml所述生理盐水含有2×106个间充质干细胞、5×105个nk细胞和15mg中药提取物，含有20mg辅料，所述辅料由如下重量份的成分组成：
甘氨酸10葡甲胺4
甘油3聚乙二醇10005；
所述中药提取物是由如下重量份的成分制备而成：
仙鹤草7.5密蒙花17淡竹叶7.5紫苏子2。
对照例1
一种nk细胞和间充质干细胞的混合细胞，其中nk细胞和间充质干细胞的个数比为1:1。
对照例2
一种血管内皮细胞和间充质干细胞的混合细胞，其中血管内皮细胞和间充质干细胞的个数比为1:4。
对照例3
一种nk细胞和间充质干细胞的混合细胞，其中nk细胞和间充质干细胞的个数比为1:6；
所述nk细胞和间充质干细胞均是分别培养后再进行混合；
所述nk细胞的培养具体方法为：将nk细胞在第一培养基中培养，当培养的细胞密度达到3×107个/ml后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养具体方法为：将间充质干细胞在第三培养基中培养，当培养的细胞汇合达到85％后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；
所述第一培养基由dmem培养液和第一添加剂组成，所述第一添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为2μg/ml氯化钠、5μg/ml亚硒酸钠、20μg/ml甘露醇、1μg/ml丝氨酸、3μg/ml金银花水提物和5μg/ml连翘水提物；
所述第二培养基由dmem培养液、胎牛血清和第二添加剂组成，所述胎牛血清在dmem培养液中的总体积分数为7％，所述第二添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为2μg/ml谷胱甘肽、15μg/ml柠檬酸铁、7μg/ml成纤维细胞生长因子、5μg/ml生物素、2μg/ml氯化硒、3μg/ml人白蛋白、1μg/ml夏枯草水提取和1μg/ml艾叶水提物；
所述第三培养基由dmem培养液和第三添加剂组成，所述第三添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为1μg/ml二乙醇胺、5μg/ml月桂酰丝氨酸、1μg/ml半胱氨酸、10μg/ml山梨醇、5μg/ml脯氨酸、1μg/ml维生素c、5μg/ml野菊花水提取和5μg/ml筋骨草水提物。
对照例4
一种nk细胞和间充质干细胞的混合细胞，其中nk细胞和间充质干细胞的个数比为1:6；
所述nk细胞和间充质干细胞均是分别培养后再进行混合；
所述nk细胞的培养具体方法为：将nk细胞在第一培养基中培养，当培养的细胞密度达到3×107个/ml后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养具体方法为：将间充质干细胞在第三培养基中培养，当培养的细胞汇合达到85％后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；
所述第一培养基由dmem培养液和第一添加剂组成，所述第一添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为2μg/ml聚丙烯酸钠、5μg/ml亚硒酸钠、5μg/ml半胱氨酸、20μg/ml甘露醇、1μg/ml丝氨酸、3μg/ml马齿苋水提物和5μg/ml侧伯叶水提物；
所述第二培养基由dmem培养液和第二添加剂组成，所述第二添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为2μg/ml谷胱甘肽、15μg/ml柠檬酸铁、7μg/ml成纤维细胞生长因子、5μg/ml生物素、3μg/ml人白蛋白、1μg/ml蒲公英水提取、1μg/ml鱼腥草水提物和1μg/ml桔梗水提物；
所述第三培养基由dmem培养液和第三添加剂组成，所述第三添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为1μg/ml二乙醇胺、5μg/ml月桂酰丝氨酸、1μg/ml半胱氨酸、10μg/ml山梨醇、5μg/ml脯氨酸、1μg/ml维生素c、5μg/ml野菊花水提取和5μg/ml筋骨草水提物。
对照例5
一种nk细胞和间充质干细胞的混合细胞，其中nk细胞和间充质干细胞的个数比为1:6；
所述nk细胞和间充质干细胞均是分别培养后再进行混合；
所述nk细胞的培养具体方法为：将nk细胞在第一培养基中培养，当培养的细胞密度达到3×107个/ml后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养具体方法为：将间充质干细胞在第三培养基中培养，当培养的细胞汇合达到85％后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；
所述第一培养基由dmem培养液和第一添加剂组成，所述第一添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为2μg/ml聚丙烯酸钠、5μg/ml亚硒酸钠、5μg/ml半胱氨酸、20μg/ml甘露醇、1μg/ml丝氨酸、3μg/ml马齿苋水提物和5μg/ml侧伯叶水提物；
所述第二培养基由dmem培养液、胎牛血清和第二添加剂组成，所述胎牛血清在dmem培养液中的总体积分数为7％，所述第二添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为μg/ml2μg/ml谷胱甘肽、15μg/ml柠檬酸铁、7μg/ml成纤维细胞生长因子、5μg/ml生物素、2μg/ml氯化硒、3μg/ml人白蛋白、1μg/ml夏枯草水提取和1μg/ml艾叶水提物；
所述第三培养基由dmem培养液和第三添加剂组成，所述第三添加剂各成分及其在dmem培养液中的浓度为1μg/ml甘油、5μg/ml月桂酸钠、1μg/ml半胱氨酸、10μg/ml山梨醇、5μg/ml谷氨酸、1μg/ml维生素c、5μg/ml虎杖水提取和5μg/ml金钱草水提物。
对照例6
一种组合物，所述组合物由nk细胞、间充质干细胞和中药提取物组成，所述nk细胞的浓度为5×105个/ml，所述间充质干细胞的浓度为2×106个/ml，所述中药提取物的浓度为15mg/ml，所述中药提取物是由如下重量份的成分制备而成：
金樱子5密蒙花15淡竹叶5紫苏子1。
对照例7
一种组合物，所述组合物由nk细胞、间充质干细胞和中药提取物组成，所述nk细胞的浓度为5×105个/ml，所述间充质干细胞的浓度为2×106个/ml，所述中药提取物的浓度为15mg/ml，所述中药提取物是由如下重量份的成分制备而成：
仙鹤草5穿心莲15竹茹5。
对照例8
一种组合物，所述组合物由nk细胞、间充质干细胞和中药提取物组成，所述nk细胞的浓度为5×105个/ml，所述间充质干细胞的浓度为2×106个/ml，所述中药提取物的浓度为15mg/ml，所述中药提取物是由如下重量份的成分制备而成：
仙鹤草5桑葚15淡竹叶5人参1紫苏子1。
对照例9
一种组合物，所述组合物由nk细胞和中药提取物组成，所述nk细胞的浓度为5×105个/ml，所述中药提取物的浓度为15mg/ml，所述中药提取物是由如下重量份的成分制备而成：
仙鹤草5密蒙花15淡竹叶5紫苏子1。
对照例10
一种组合物，所述组合物由间充质干细胞和中药提取物组成，所述间充质干细胞的浓度为2×106个/ml，所述中药提取物的浓度为15mg/ml，所述中药提取物是由如下重量份的成分制备而成：
仙鹤草5密蒙花15淡竹叶5紫苏子1。
对照例11
一种组合物，所述组合物由中药提取物组成，所述中药提取物是由如下重量份的成分制备而成：
仙鹤草5密蒙花15淡竹叶5紫苏子1。
实验例1抗乙肝病毒型肝炎实验
将spf级sd大鼠分为给药组和空白对照组。
hbsag诊断试剂盒和hbeag诊断试剂盒，购于上海科华生物技术有限公司。
1.2实验方法
给药组的大鼠采用腹腔内注射1×1011拷贝数raav8-1.3hbv造模，通过hbsag诊断试剂盒和hbeag诊断试剂盒计算造模后各大鼠血清内表面抗原(hbsag)和核心抗原(hbeag)。
造模后的给药组和空白对照组按照如下方式给药：
空白对照：灌胃给予等体积生理盐水；
阳性对照组：给予拉米夫定10g/kg；
给药1组：灌胃给予实施例1提供的混合细胞配置的药液2ml/kg，每ml药液含6×105个nk细胞、3×106个间充质干细胞；
给药2组：灌胃给予实施例3提供的混合细胞配置的药液2ml/kg，每ml药液含6×105个nk细胞、3×106个间充质干细胞；
给药3组：灌胃给予实施例6提供的组合物配置的药液2ml/kg，每ml药液含有6×105个nk细胞、3×106个间充质干细胞和15mg中药提取物；
给药4组：灌胃给予实施例8提供的组合物配置的药液2ml/kg，每ml药液液含有6×105个nk细胞、3×106个间充质干细胞和15mg中药提取物；
给药5组：给予实施例9的注射液2ml/kg；
对照1组-对照5组：分别灌胃给予对照例1-5提供的混合细胞配置的药液2ml/kg，每ml药液含6×105个nk细胞、3×106个间充质干细胞；
对照6组-对照11组：分别灌胃给予对照例6-11提供的组合物配置的药液2ml/kg，每ml药液含有6×105个nk细胞、3×106个间充质干细胞和15mg中药提取物；
对照12组：单独给予间充质干细胞配置的药液2ml/kg，每ml药液含有3×106个间充质干细胞；
对照13组：单独给予nk细胞配置的药液2ml/kg，每ml药液液含有6×105个nk细胞；
用生理盐水配置各药液。
给药8天后，于末次给药后，禁食不禁水24h，眼眶取血，室温静置2h，2500r/min离心25min，取上层血清，用hbsag诊断试剂盒和hbeag诊断试剂盒测表面抗原(hbsag)和核心抗原(hbeag)。
计算抑制活性。抑制活性＝给药后细胞存活量/给前细胞存活性*100％。
1.3实验结果
各组对表面抗原(hbsag)和核心抗原(hbeag)的抑制活性见表1。
表1各组对hbsag和hbeag的抑制活性结果
与阳性对照组相比，pa＜0.05，pb＜0.01，pc＞0.05；与给药1组相比，pd＜0.01，pe＞0.05，pf＜0.05。
从表中可以看出，本发明提供的nk细胞和间充质干细胞联用对大鼠的乙肝抑制效果好于阳性对照组，差异性显著，并且本发明提供的经过培养好联用的nk细胞和间充质干细胞、及其组合物对大鼠乙肝的抑制效果明显好于阳性对照药，具有显著性差异。
1.4实验结论
本发明提供的nk细胞和间充质干细胞联用、其组合物及注射剂可以用于治疗乙肝。
实验例2抗肝纤维化实验
一、材料和药品
1.1动物
昆明大鼠126只，雌雄各半，体重200-220g。
1.2药品
各中药材从药房采购；四氯化碳购于百灵威试剂公司，血清丙氨酸氨基转移酶(alt)、天门冬酸氨基转移酶(ast)、丙二醇(mda)、超氧化物歧化酶(sod)试剂盒购于南京建成生物工程研究所，其余试剂和仪器均为市售。
二、方法
2.1分组与给药
将大鼠随机分为21组，每组6只，分组情况及给药如下：
空白对照组：给予等体积生理盐水；
模型组：给予等体积生理盐水；
阳性对照组：给予联苯双酯，200mg/kg；
给药1组：给予实施例1提供的混合细胞配置的药液，每ml生理盐水含6×105个nk细胞、3×106个间充质干细胞；
给药2组：给予实施例3提供的混合细胞配置的药液，每ml生理盐水含6×105个nk细胞、3×106个间充质干细胞；
给药3组：给予实施例6提供的组合物配置的药液，每ml生理盐水含有6×105个nk细胞、3×106个间充质干细胞和15mg中药提取物；
给药4组：给予实施例8提供的组合物配置的药液，每ml生理盐水含有6×105个nk细胞、3×106个间充质干细胞和15mg中药提取物；
给药5组：给予实施例9的注射液，注射给药；
对照1组-对照5组：分别给予对照例1-5提供的混合细胞配置的药液，每ml生理盐水含6×105个nk细胞、3×106个间充质干细胞；
对照6组-对照11组：分别给予对照例6-11提供的组合物配置的药液，每ml生理盐水含有6×105个nk细胞、3×106个间充质干细胞和15mg中药提取物；
对照12组：单独给予间充质干细胞配置的药液，每ml生理盐水含有3×106个间充质干细胞；
对照13组：单独给予nk细胞配置的药液，每ml生理盐水含有6×105个nk细胞；
以上均灌胃给药7天，一天一次，每只大鼠每天灌胃5ml药液。
2.2肝损伤模型的建立
给药第7天2h后，除空白对照组外，其余各组均腹腔注射0.2％ccl4橄榄油溶液10ml/kg，禁食24h，称量体重，眼球取血，3000r/min离心，取上清，并快速取出肝脏，称重。
2.3计算肝指数
肝指数＝肝脏重量(mg)/体重(g)×100％
2.4生化指标测定
血清alt、ast的活性，肝组织中mda含量、sod活性，均按试剂盒说明进行操作。
2.5统计学方法
采用spss11.5软件进行t检验。
三、结果
各组实验结果见表2。
表2各组对抗肝纤维化的实验结果(n＝6)
与正常对照组相比，pa＜0.01；与阳性对照组相比，pb＜0.05，pc＜0.01；pd＞0.05；与给药1组相比，pe＜0.05，pf＜0.01，pmg＞0.05。
与正常对照组相比，模型组肝指数增大、血清alt、ast的活性升高，肝组织中mda含量增加，sod活性降低，表明建模成功，且本发明提供的化合物与模型组和对照组比较，肝指数，血清alt、ast的活性，肝组织中mda含量均降低，且sod活性增高。
四、结论
本发明提供的nk细胞联合间充质干细胞、其组合物及其制剂能够具有肝损伤保护作用，可以用于治疗肝纤维化。