PARP1抑制剂在制备肿瘤免疫疗法制剂中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及parp1抑制剂在制备肿瘤免疫疗法制剂中的应用。

背景技术：

肿瘤免疫疗法在近年来取得了一系列进展，其中溶瘤病毒是最为引人关注的免疫疗法之一，溶瘤病毒指的是一类能够有效感染并消灭癌细胞的病毒，当癌细胞在病毒的感染下破裂死亡时，新生成的病毒颗粒会被释放，进一步感染周围的癌细胞。从机理上看，它不仅能对肿瘤进行直接杀伤，还有望刺激人体的免疫反应，增强抗肿瘤效果；但病毒诱导的免疫细胞因子风暴毒副作用很难避免，会对身体造成副作用，因此寻找一种能够同时增加疗效和降低病毒毒副作用的疗法十分重要。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种parp1抑制剂在制备肿瘤免疫疗法制剂中的应用，本发明的parp1抑制剂可以有效地在肿瘤免疫疗法中起到增强疗效以及降低病毒毒作用。

本发明的具体技术方案为：parp1抑制剂在制备肿瘤免疫疗法制剂中的应用，所述parp1抑制剂用以增强肿瘤免疫疗法疗效以及降低毒副作用。

本发明团队通过大量研究发现，溶瘤病毒感染后，parp1抑制剂可抑制腹腔nk细胞迁移且降低病毒清除能力。随后发现，parp1是调控巨噬细胞分泌ccl2的关键分子；小鼠parp1抑制后，ccl2、ccl3、ccl4等趋化因子分泌均受到了影响，其中以ccl2抑制程度最大(约降低了18倍)，并进一步证实了主要降低了巨噬细胞的ccl2分泌；机制研究发现，parp1抑制后，主要影响了nf-κb入核从而抑制了ccl2转录。以上实验结果可证明：(1)parp1抑制剂降低病毒清除能力，可提高溶瘤病毒对肿瘤细胞持续作用时间，从而提高溶瘤病毒抗肿瘤能力。

(2)parp1抑制后可明显降低巨噬细胞释放的细胞因子和趋化因子，降低溶瘤病毒诱导产生的免疫细胞因子风暴，从而降低溶瘤病毒在肿瘤免疫治疗中毒副作用。

作为优选，所述制剂的制剂形式为注射制剂。

作为优选，所述parp1抑制剂的用量为50-200mg/次。

作为优选，所述parp1抑制剂为ag14361。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明的parp1抑制剂可以有效地在肿瘤免疫疗法中起到增强疗效以及降低病毒毒作用。

附图说明

图1是病毒感染后parp1抑制剂抑制腹腔nk细胞迁移且降低病毒清除能力的结果图；其中a-b为腹腔nk细胞比例和细胞总数；c为腹腔nk细胞内ifn-γ水平检测；d为腹腔病毒清除能力检测；

图2为病毒感染后parp1抑制剂抑制腹腔液炎症因子和趋化因子的结果图(图2作左边部分字迹不清，为非关键部分，不会对本技术技术方案造成理解上的困难)；其中a为cba检测；b为白介素6(il6)；c为白介素10(il10)；d为单核细胞趋化蛋白1(mcp1)；e为γ干扰素(ifn-γ)；f为肿瘤坏死因子(tnf)；白介素12(il12)；

图3为病毒感染后parp1抑制剂小鼠对ccl2分泌的影响图；其中，a为腹腔免疫细胞的多种趋化因子mrna表达检测；b为腹腔上清液中ccl2蛋白水平的检测；

图4为ccl2-ccr2在腹腔中nk细胞招募中的作用结果图；

图5为病毒对nk细胞、t细胞和巨噬细胞分泌ccl2的影响图；

图6为parp1对腹腔中巨噬细胞nf-κb调控作用结果图；其中，a为nf-κbp65核位移检测；b为nf-κb-dna结合活性检测。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例

1.在体内感染病毒后nk细胞招募中parp1起着重要作用

为了确定parp1是否参与nk细胞向病毒感染部位的迁移，本发明使用了parp1抑制剂-ag14361，小鼠腹腔内感染vv的同时，小鼠尾静脉注射10mg/kg的ag14361，每天注射一次，连续3天，给药和病毒感染3天后，观察腹腔nk细胞比例和细胞总数，同时评估腹腔病毒清除能力。结果如图1所示，实验发现，病毒感染后parp1抑制剂可抑制腹腔nk细胞迁移且降低病毒清除能力。

2.parp1抑制剂抑制体内感染病毒后pcf炎症因子和趋化因子

如图2所示，小鼠腹腔内感染vv3天后，腹腔液中炎症因子和趋化因子明显升高，而小鼠尾静脉给药ag14361后，小鼠腹腔液中炎症因子和趋化因子均明显降低。

3.parp1是调控小鼠感染病毒后ccl2的分泌的关键分子

小鼠腹腔感染痘苗病毒(5x106pfu)12h后，收集腹腔免疫细胞进行ccl2、ccl3、ccl4、ccl5、ccl7、ccl8等趋化因子mrna表达；如图3所示，与空白组小鼠比较，parp1抑制的小鼠以上趋化因子mrna表达均受到了抑制，其中以ccl2抑制程度最大(大约降低了18倍)；同时用cba流式技术检测了腹腔上清液中ccl2蛋白表达，发现小鼠尾静脉给予ag14361后，小鼠腹腔上清液中ccl2水平显著降低。以上结果说明parp1是分泌ccl2的关键分子。

4.ccl2-ccr2在腹腔中nk细胞招募中的作用

同时我们发现parp1在ccl2分泌中起到了很大的作用，实验中使用抗ccl2抗体阻断小鼠体内ccl2分泌，如图4所示，发现ccl2阻断组小鼠病毒感染后，腹腔中nk总数显著降低，结果说明ccl2-ccr2在腹腔中nk细胞招募中起到了关键性作用。

5.病毒对nk细胞、t细胞和巨噬细胞分泌ccl2的影响

为了探究哪种免疫细胞是ccl2的主要来源，我们进一步观察了在小鼠腹腔感染病毒后，用细胞内染色和facs技术检测小鼠腹腔中nk细胞、t细胞、b细胞和巨噬细胞分泌ccl2功能，如图5所示，发现巨噬细胞是ccl2主要产生的细胞。

6.parp1抑制剂对腹腔中巨噬细胞nf-κb入核作用观察

为了探究parp1是如何调控巨噬细胞ccl2分泌能力，我们进行了巨噬细胞nf-κb-p65入核研究，小鼠腹腔注射3％tg4d后，收集巨噬细胞进行细胞爬片，并用病毒激活细胞，进行p65一抗和二抗孵育，共聚焦观察nf-κb-p65入核情况；如图6所示，发现parp1抑制后，主要影响了nf-κb入核从而抑制了ccl2的转录(图6-a)，与之前文献报道nf-κb调控ccl2的分泌一致。同时使用nf-κb-dna结合活性检测发现parp1抑制后可抑制nf-κb与dna结合(图6-b)，这也说明了parp1不仅参与了巨噬细胞中nf-κb核位移而且促进了nf-κb与dna启动子序列结合。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

技术特征：

技术总结
本发明涉及生物医药领域，公开了PARP1抑制剂在制备肿瘤免疫疗法制剂中的应用，本发明发现PARP1抑制剂可以增强肿瘤免疫疗法疗效以及降低毒副作用。具体地：（1）PARP1抑制剂可降低病毒清除能力，可提高溶瘤病毒对肿瘤细胞持续作用时间，从而提高溶瘤病毒抗肿瘤能力。（2）PARP1抑制后可明显降低巨噬细胞释放的细胞因子和趋化因子，降低溶瘤病毒诱导产生的免疫细胞因子风暴，从而降低溶瘤病毒在肿瘤免疫治疗中毒副作用。本发明对于肿瘤免疫疗法具有深远的意义。

技术研发人员：寿旗扬;杨文君;其他发明人请求不公开姓名
受保护的技术使用者：浙江康佰裕生物科技有限公司
技术研发日：2018.11.09
技术公布日：2019.02.15