生物素修饰的乳腺癌靶向脂质材料的制备和应用的制作方法

本发明涉及一类新型脂质材料及其在药物传递系统中的应用，具有延长体内循环和乳腺癌靶向药物传递的功能，包括该材料的制备，及其作为药物载体在药物传递中的应用，属于医药技术领域。

背景技术：

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，主要是由于乳腺导管上皮出现恶性改变而产生。临床主要表现为乳腺肿痛、有肿块、腋窝下淋巴结出现肿大等。据统计,全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势，且发病年龄年轻化，目前已经是世界上第二大常见的癌症，仅次于肺癌，在女性癌症中发病率最高，每年新发病例约170万，死亡约41万。中国肿瘤登记中心2015年年报中指出，乳腺癌仍居女性癌症发病率首位，严重影响我国妇女的健康和生命。乳腺癌的治疗包括手术治疗、内分泌治疗、化疗、放疗等，目前仍以根治性手术为基础。然而手术治疗不仅给病人身体上带来极大痛苦，而且预后差、易感染，同时在患者心理上也会有一定的伤害。放疗虽有一定疗效，但同样无法根除，而且副作用大。虽然化疗在乳腺癌的综合治疗中占有非常重要的地位，能够控制乳腺癌早期发生的全身播散，预防缓解乳腺癌术后的复发转移，有效地延长患者生存期，但是因其无组织及器官特异性，药物呈全身分布，对正常组织也有毒副作用，治疗效果不是很理想。近年来，随着信号通路、细胞凋亡等分子生物学方法在肿瘤研究中的深入，乳腺癌分子靶点和靶向治疗逐渐成为抗乳腺癌研究的趋势和热点。

近年来，利用环状rgd(crgd)、叶酸(fa)、生物素(biotin)、人表皮生长因子受体-2(her2)、半乳糖、甘草酸(glycyrrhizin)等不同类型的靶向配体进行肿瘤靶向药物递药系统的研究。特别是生物素作为一种小分子244da的水溶性维生素，是人类或任何哺乳动物细胞都无法合成的，与叶酸（或维生素b12）相比，具有更大的优势。目前，钠离子依赖性复合维生素转运体(smvt)已被证实是生物素的主要转运体。更重要的是，据报道，生物素受体在几种恶性的肿瘤细胞系中高度表达，如乳腺癌(mcf-7、4t1、jc和mmt06056)、卵巢癌(ov2008、id8)、结肠癌(colo-26)、肥大细胞瘤(p815)、肺癌(m109)、肾癌(renca、rd0995)和白血病细胞系(l1210fr)；而在正常细胞中正好相反，属于低表达。这种受体在恶性细胞上的高表达，其内化能力，以及癌细胞的快速增殖需要大量的维生素，使这种受体成为靶向肿瘤细胞递送药物的广泛途径。另外，一些研究也表明，生物素偶联大分子载体能够有效地增加乳腺癌细胞对抗癌药物的吸收。

此外，我们发现生物素-亲和素系统被广泛应用于生物素研究的各个领域。特别是亲和素作为一种四聚体生物素结合蛋白，它包含四个相同的亚基(均四聚体)，每个亚基都能与一个生物素(维生素h)结合，具有高度的亲和性和特异性。虽然smvt的蛋白晶体结构尚未被发现，但我们可以设想生物素与肿瘤细胞的转运蛋白之间可能存在着类似生物素-亲和素系统的相互作用。更进一步，基于生物素及其受体之间的特定相互作用，将双分枝生物素修饰的脂质材料作为配体用于乳腺癌治疗可能是一个很有前景的策略。

基于上述研究及假设，本研究的目的是提出一类生物素修饰的脂质材料，并将其用于乳腺癌靶向脂质体的制备，利用生物素与乳腺癌细胞更强的特异性结合，实现更强的肿瘤靶向性，增加药物在肿瘤组织的浓度，发挥更加有效的乳腺癌治疗作用，同时降低药物在外周器官的分布，减少药物的毒副作用。因此，我们设计了如通式（i）和（ii）所示的一类脂质材料，该脂质材料的胆固醇部分嵌入到脂质体磷脂双分子层中，具有乳腺癌靶向的生物素部分则暴露在脂质体的表面，从而使脂质体具有乳腺癌靶向功能。这种脂质材料可用于脂质体、纳米粒、胶束等在内的不同剂型，同时具有长循环、乳腺癌靶向、以及降低毒性的功能，将这种脂质材料应用于药物传递系统，将具有很大的应用前景，以这种脂质材料所制成的载紫杉醇脂质体具有明显的乳腺癌靶向功能。

本发明主要提供通式（i）所示结构的化合物或其药学上可接受的盐或水合物：

其中，所用peg的分子量等于但并不仅限于200、400、600、800、1000、1500、2000、4000等。

通式（i）所示化合物的具体制备方法如下所示：

发明也同时提供一类通式（ii）所示结构的化合物或其药学上可接受的盐或水合物：

其中，所用peg的分子量等于但并不仅限于200、400、600、800、1000、1500、2000、4000等。

通式（ii）所示化合物的具体制备方法如下所示：

技术实现要素：

本发明所述的新型脂质材料可以作为配体用于制备乳腺癌靶向的脂质体。

所述脂质体其特征在于包含磷脂、胆固醇、bio-bio-chol、bio-chol及活性剂。

所述脂质体主要由膜材与活性剂组成，其膜材为磷脂双分子层，由卵磷脂，胆固醇以及脂质体配体组成，其中，各组分配比关系如下：胆固醇和磷脂的摩尔比为1~2:1~10，脂质体配体的摩尔含量为胆固醇和磷脂的总摩尔数的1~25%。本发明所述的活性剂优选治疗剂或显影剂，如本领域所知的，活性剂的剂量可以依据包含在甾体中的活性剂来调整，其中按重量百分数计算，活性剂占总脂质的0.1％~50％。

所述的脂质体中的磷脂包括所有类型的磷脂，包括但不限于大豆磷脂、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油；优选卵磷脂。

所述的脂质体中的活性剂可以是抗肿瘤药物，包括但不限于烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、蒽环类抗生素、植物生物碱、紫杉醇衍生物、拓朴异构酶抑制剂、单克隆抗体、光敏剂、激酶抑制剂和含铂化合物。抗癫痫药物，包括但不限于巴比妥类、乙丙酰脲类、双链脂肪酸类、琥珀酰亚胺类、苯甲二氮卓类、亚氨基苷类、磺胺类、恶唑烷双酮类、胡椒碱类、皮质激素类、免疫球蛋白等。抗抑郁药物，包括但不限于去甲肾上腺素再摄取抑制剂、单胺氧化酶抑制剂、5-羟色胺再摄取抑制剂。

本发明所述的乳腺癌靶向脂质体的制备方法，包括以下步骤：

（一）称取磷脂、胆固醇、紫杉醇于茄型烧瓶中，用适量溶剂溶解，加入相应比例的脂质体配体（空白脂质体不加），于20-40℃恒温水浴旋转蒸发除去有机溶剂；

（二）再将茄型瓶置于真空干燥器中真空干燥过夜除去残余溶剂；

（三）向茄型瓶中加入磷酸盐缓冲液或硫酸铵溶液等水化液，用20℃恒温空气浴摇床水化约0.5-2小时后，冰水浴探头超声，用挤压过膜或超声等方法将脂质体粒径控制在110nm左右。

优选的步骤（一）中的紫杉醇：脂质材料比为1:30。

优选的步骤（二）中的溶剂为氯仿，脂质摩尔比1:2（胆固醇：大豆磷脂）。

优选的步骤（三）中的水化液为ph7.4的0.02m磷酸盐缓冲液（pbs）。

附图说明

图1为本发明实施例9中为血浆中紫杉醇，以及脂质体ptx-lip、ptx-bio-lip、ptx-bio+bio-lip和ptx-bio-bio-lip中紫杉醇的药时曲线

图2为本发明实施例9中为各器官和肿瘤组织中紫杉醇，以及脂质体ptx-lip、ptx-bio-lip、ptx-bio+bio-lip和ptx-bio-bio-lip中紫杉醇的分布情况

图3为被发明实施例10中荷4t1乳腺癌小鼠注射载did的脂质体后各时间点的活体成像图

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

具体实施方法

以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。

所述的新型脂质材料具体由以下步骤制备：

实施例1

化合物2的制备

将化合物2（22.48g,41.56mmol）溶于130ml二氧六环中，加入二缩三乙二醇（27.86ml,207.82mmol），升温至回流反应6小时，减压除去溶剂，残留物用二氯甲烷（200ml）溶解后，用饱和氯化钠水溶液（100ml×2）洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析（石油醚/丙酮=8/1）纯化得到无色油状物12.27g，收率56.92%。¹hnmr(600mhz,cdcl3,ppm)δ:0.66(s,3h),0.85(d,6h,j=6.4hz),0.91(d,3h,j=6.4hz),0.99(s,3h),0.67-2.38(remainingcholesterolprotons),3.16-3.21(m,1h),3.59-3.75(m,12h),5.32(m,1h)。

实施例3

化合物4的制备

将化合物3（6.00g,11.56mmol）溶于50ml甲苯中，加入50%的氢氧化钠水溶液（30ml），溶液分层。冷却至室温后，加入溴乙酸叔丁酯（3.38g,17.35mmol）和四丁基硫酸氢铵（0.39g,1.16mmol），继续室温搅拌反应16小时。分出甲苯层，水层用乙酸乙酯（50ml×2）萃取，合并有机层，并用饱和氯化钠水溶液洗涤（50ml×2），无水硫酸钠干燥后，浓缩，残留物经硅胶柱层析（石油醚/丙酮=5/1）纯化得到浅黄色油状物5.62g，收率76.84%。¹hnmr(400mhz,cdcl3,ppm)δ:0.66(s,3h),0.85(d,6h,j=6.4hz),0.91(d,3h,j=6.6hz),0.99(s,3h),0.64-2.39(remainingcholesterolprotons),1.47(s,9h),3.14-3.18(m,1h),3.62-3.71(m,12h),4.01(s,2h),5.31(s,1h)。

实施例4

化合物5的制备

将化合物4（3.00g,4.74mmol）溶于20ml甲苯中，加入对甲苯磺酸（0.13g,0.95mmol），升温至110℃回流搅拌反应8小时。冷却至室温，反应液用饱和氯化钠水溶液洗涤（30ml×2），甲苯层用无水硫酸钠干燥后，浓缩，残留物经硅胶柱层析（二氯甲烷/甲醇=10/1）纯化得到浅黄色油状物2.45g，收率89.65%。¹hnmr(600mhz,cdcl3,ppm)δ:0.67(s,3h),0.86(d,6h,j=6.4hz),0.92(d,3h,j=6.6hz),0.99(s,3h),0.66-2.39(remainingcholesterolprotons),3.19-3.23(m,1h),3.62-3.80(m,12h),4.17(s,2h),5.34(d,1h,j=2.4hz)。

实施例5

化合物6的制备

将化合物5（4.00g,6.93mmol）溶于25ml二氯甲烷中，加入n-甲基吗啡啉（nmm,0.84ml,7.63mmol），于-10℃下缓慢滴加氯甲酸异丁酯（ibcf,0.96ml,7.63mmol）。滴加完毕后，继续在-10℃下活化15分钟，加入二乙醇胺（1.09g,10.40mmol）的二氯甲烷（5ml）溶液。加毕，将反应移至室温继续搅拌5小时，依次用稀盐酸（1mol/l,20ml×2）、饱和碳酸氢钠水溶液（20ml×2）、饱和氯化钠水溶液（20ml×2）洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析（二氯甲烷/甲醇=10/1）纯化得黄色油状物4.09g，收率88.90%。¹hnmr(400mhz,cdcl3,ppm)δ:0.67(s,3h),0.86(d,6h,j=6.4hz),0.91(d,3h,j=6.4hz),0.99(s,3h),1.01-2.38(remainingcholesterolprotons),3.14-3.21(m,1h),3.50-3.85(m,20h),4.28(s,2h),5.34(d,1h,j=4.8hz)。

实施例6

配体bio-bio-chol的制备

将生物素（147mg,0.604mmol）溶于5ml二氯甲烷，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（145mg,0.755mmol）、4-二甲氨基吡啶（92mg,0.755mmol）、n，n-二异丙基乙胺（156ml,1.21mmol）。滴入化合物6（100mg,0.151mmol）的5ml二氯甲烷溶液，滴毕，移至室温搅拌18h。tlc监测反应完全，减压除去溶剂，经硅胶柱层析二氯甲烷/甲醇=15/1）得到白色固体110mg，收率65%。¹hnmr(400mhz,cdcl3,ppm)δ:0.67(s,3h),0.86(d,6h,j=6.4hz),0.91(d,3h,j=6.4hz),0.99(s,3h),1.02-2.23(remainingcholesterol&biotinprotons),2.34(s,4h),2.75-2.78(m,2h),2.90-2.93(m,2h),3.15(s,3h),3.63-3.70(m,16h),4.25-4.34(m,8h),4.53(s,2h),5.33(s,1h).esi-mscalculatedforc59h97n5o11s2na[m+na]⁺1138.6,found1138.4。

实施例7

配体bio-chol的制备

将生物素（57mg,0.23mmol）溶于5ml二氯甲烷和2ml的dmf中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（56mg,0.29mmol）、4-二甲氨基吡啶（35mg,0.29mmol）、n,n-二异丙基乙胺（75mg,0.58mmol）。滴入化合物3（100mg,0.19mmol）的5ml二氯甲烷溶液，滴毕，移至室温搅拌18h。tlc监测反应完全，减压除去溶剂，经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇=10/1)得到白色固体110mg,76%。¹hnmr(400mhz,cdcl3,ppm)δ:0.69(s,3h),0.88(d,6h,j=6.4hz),0.93(d,3h,j=7.2hz),1.01(s,3h),0.88-2.04(remainingcholesterol&biotinprotons),2.19-2.25(m,1h),2.36-2.41(m,3h),2.82(m,2h),3.16-3.24(m,2h),3.65-3.73(m,10h),4.22-4.30(m,2h),4.41(s,1h),4.61(s,1h),5.36(s,1h).esi-mscalculatedforc43h72n2o6sna[m+na]⁺767.5,found767.3。

所述的乳腺癌靶向脂质体的具体制备方法：

实施例8

薄膜分析法作为经典的脂质体制备方法，应用最为广泛，操作简单，制备出的脂质体结构典型。因此，本发明选择采用薄膜分析法来制备紫杉醇脂质体。

根据对紫杉醇脂质体的制备摸索，最终我们选取最优化处方：脂质摩尔比1:2（胆固醇：大豆磷脂），水化液为ph7.4的磷酸盐缓冲液（pbs）（0.02m），紫杉醇：脂质材料比为1:30。我们用上述处方分别制备了空白lip、bio-bio-chol修饰的bio-bio-lip、bio-chol修饰的bio-lip、bio+bio-chol修饰的bio+bio-lip(配体bio-chol的数量是bio-lip的两倍)载紫杉醇脂质体。

准确称取处方量脂质材料（按大豆磷脂：胆固醇=2:1的摩尔比）、紫杉醇（脂质材料比为1:30）于茄型烧瓶中，用适量氯仿溶解，加入相应比例的脂质体配体（空白脂质体不加），37±1℃恒温水浴旋转蒸发除去氯仿后得均匀薄膜，真空干燥过夜除去残余溶剂。加入ph7.4（0.02m）的pbs缓冲液，20℃恒温空气浴摇床，180r/min条件下水化0.5h后，冰水浴探头超声（80w,5s,5s）3分钟，即得略带乳光的脂质体溶液。将超声后的脂质体溶液在4℃条件下，10000rpm离心20分钟，通过冷冻离心法除去游离药物紫杉醇，上清液即为最终制备的在紫杉醇脂质体。

表1四种载紫杉醇脂质体的包封率、粒径以及zeta电位

初步靶向性研究

实施例9

为了评价此类乳腺癌靶向脂质体，选择实施例8中的4种脂质体进行了小鼠血浆、器官及肿瘤组织中药物浓度的测定。

取雌性balb/c小鼠135只，体重20-22g。首先，通过皮下注射的方式建立小鼠乳腺癌模型，在第一天的时候，给雌性balb/c小鼠右下侧皮下注射0.1ml2´10⁷4t1cells/ml的细胞悬液，生长约2周，肿瘤体积达到约70-100mm³后，将小鼠随机分为5组，每组27只（3只×9），按10mg/kg紫杉醇的剂量分别经尾静脉给于游离紫杉醇溶液和不同配体修饰的载紫杉醇脂质体ptx-lip、ptx-bio-lip、ptx-bio+bio-lip和ptx-bio-bio-lip。在注射5min、15min、30min、60min、120min、240min、480min、720min、1440min后，眼眶取血，用生理盐水进行心脏灌注2次，随后分离器官（心、肝、脾、肺、肾）和肿瘤组织。将所取血液样品及组织样品处理过后，进入高效液相色谱（hplc）分析。不同时间点小鼠血浆的紫杉醇药时曲线如图1所示。

由体内药代动力学及靶向性评价实验结果可见(表2)，游离紫杉醇在血液循环中清除较快，药时曲线下面积显著低于不同配体修饰的长循环脂质体，从而说明脂质体可以降低紫杉醇在血液中的代谢速率，延长脂质体在血液循环系统中的滞留时间，具有一定的缓释作用。脂质体在延长紫杉醇在血液中半衰期的同时，也保持了紫杉醇在血液中较高的浓度，进而增加紫杉醇脂质体被转运至肿瘤组织的机会。

表2不同配体修饰的载紫杉醇脂质体以及游离紫杉醇在小鼠血液中的药代动力学参数

在具有较长体循环时间的基础上，不同配体修饰的紫杉醇脂质体可以不同程度地提高药物在肿瘤部位的聚集浓度，均显著高于不同时间点的游离紫杉醇组，也优于无配体修饰的紫杉醇脂质体（如图2）。

从表3可以看出，脂质体ptx-lip、ptx-bio-lip、ptx-bio+bio-lip和ptx-bio-bio-lip在肿瘤中的相对摄取率re分别为1.73、3.03、4.05和5.61，峰浓度比ce分别为1.50、2.30、3.00和5.06，表明各组载紫杉醇脂质体同游离紫杉醇相比，其肿瘤靶向性均有不同程度上的提高，其中ptx-bio-bio-lip的肿瘤靶向性最佳。

表3不同配体修饰的载紫杉醇脂质体以及游离紫杉醇在小鼠肿瘤中的药代动力学参数

实施例10

进一步在荷4t1乳腺癌小鼠模型考察了bio-bio-lip的肿瘤靶向能力。

荷4t1乳腺癌小鼠模型建立10天后，按did200µg/kg的剂量经尾静脉注射，向模型小鼠给予载did的脂质体did-lip、did-bio-lip、did-bio+bio-lip和did-bio-bio-lip。在给药后1h、2h、8h和24h将各组小鼠置于小动物活体成像仪中观察。结果表明（图3），在各个时间点，bio-bio-chol修饰的脂质体均表现出了最强的肿瘤靶向能力，在荷4t1乳腺癌小鼠肿瘤部位的荧光信号强度显著强于其他各组脂质体，表明bio-bio-chol修饰的脂质体具有最强的靶向乳腺癌能力。