一种腺苷酸活化蛋白激酶的激动剂及其应用的制作方法

本发明涉及一种激酶激动剂，尤其是一种腺苷酸活化蛋白激酶的激动剂及其应用。

背景技术：

冠状动脉粥样硬化心脏病主要是由于冠状动脉粥样硬化，脂质沉积于血管壁造成冠状动脉狭窄或阻塞，引起的心肌缺血和供氧不足。经皮腔内血管成形术(pta)采用球蕤充盈将闭塞或狭窄的血管扩开，可以改善心肌的血流灌注，能够迅速有效地缓解病情，是治疗缺血性心脏病、动脉内膜增生等心血管疾病的有效手段。其中皮腔内冠状动脉血管成形术(ptca)已被广泛应用于治疗冠心病。经过20多年的发展，pta技术已在提高成功率及降低急性并发症方面取得了令人瞩目的成绩。

然而，支架植入的远期结果仍受血管再狭窄限制，血管再狭窄可以定义为管腔的再次狭窄，是一种复杂的血管修复过程。血管内支架能有效地控制pta弹性回缩所导致的再狭窄，可显著降低介入治疗时急性或亚急性缺血并发症，但是，支架的置入并不能改善由于pta和释放支架过程给局部血管内膜造成的损伤，反而刺激血管内膜组织增生及平滑肌细胞的增生而导致再狭窄。

目前冠脉支架内再狭窄发生率为20％左右，而颅内血管支架内的再狭窄高达40％以上。因此，支架内再狭窄已成为影响pta疗效的主要问题和致命弱点。再狭窄是局部血管损伤后的一种修复反应，支架的植入使血管内皮的完整性受到了破坏，激活炎症反应，产生一系列生长因子和细胞因子，vsmcs增殖及向内膜移行的结果。使用药物涂层支槊是近来备受关注的预防和治疗pta术后再狭窄的方法。药物涂层支架是通过支架负载药物在病变部位缓慢释放来预防及降低再狭窄。

腺苷酸活化蛋白激酶(adenosinemonophosphateactivatedproteinkinase，ampk)是细胞能量状态的一种生理感受器，在调节能量代谢、细胞增殖等方面起着至关重要的作用。ampk在防治心血管血管增生性疾病，特别是动脉粥样硬化，是一个十分重要的治疗靶点。临床上广泛用于治疗糖尿病和动脉粥样硬化的药物对心血管的保护作用部分是通过激活ampk，ampk可以通过调控雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mtor)等途径抑制细胞增殖。

中医药复方在临床上治疗动脉粥样硬化取得了较好的疗效。干姜提取物有降血糖、降血脂、抗动脉粥样硬化等作用，但是未见10-姜酚防治血管再狭窄的报道，亦未见10-姜酚是ampk激动剂或能激活ampk的报道。

技术实现要素：

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种ampk激动剂—10-姜酚及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

在第一个方面，本发明提供了一种腺苷酸活化蛋白激酶的激动剂，所述激动剂为10-姜酚。

优选地，所述10-姜酚与腺苷酸活化蛋白激酶稳定结合，并升高腺苷酸活化蛋白激酶的活性。

优选地，所述10-姜酚与腺苷酸活化蛋白激酶的arg-83、asp-88、asn-48、ile-46、lys-29形成5个氢键连接,以激活腺苷酸活化蛋白激酶(即ampk)。

本申请的发明人经多次试验发现，当10-姜酚的浓度为1μm以上时，能显著增加ampkα磷酸化水平，激活ampk。

在第二个方面，本发明提供了10-姜酚在制备防治血管再狭窄的药物中的应用。本申请的发明人经多次试验发现，10-姜酚能抑制新生内膜的形成。

作为上述方案的进一步优化，所述10-姜酚的给药浓度为25～50mg/kg。本申请的发明人经多次试验发现，10-姜酚的给药浓度为25～50mg/kg(表示用药对象每千克体重给药25～50mg)时，可以有效防止血管再狭窄的发生。

作为上述方案的进一步优化，所述10-姜酚减少血管新生内膜厚度。

作为上述方案的进一步优化，所述10-姜酚抑制血管平滑肌细胞增殖。

在第三个方面，本发明提供了一种防治血管再狭窄的药物，所述药物含有10-姜酚。

在第四个方面，本发明提供了一种冠状动脉支架涂层材料，所述涂层中含有10-姜酚。由此，植入血管内的支架上涂覆有10-姜酚，能激活腺苷酸活化蛋白激酶，抑制血管平滑肌细胞的增殖，从而防止血管再狭窄的发生。

综上所述，本发明的有益效果为：

本申请的发明人发现10-姜酚可增强ampk的活性，有效地抑制血管平滑肌细胞的增殖，抑制结扎颈动脉诱导的血管狭窄。此外，本申请的发明人还发现10-姜酚能与ampk在空间上结合，是一种天然的ampk激动剂。

附图说明

图1为小鼠动脉切片图；

图2为10-姜酚处理后，血管平滑肌细胞的增殖结果图；

图3为10-姜酚处理vsmcs细胞后，westernblot检测蛋白表达的结果图；

图4为10-姜酚与ampk分子对接及分子动力学模拟结果图；其中，a是10-姜酚-ampk复合物的三维丝带模型，b图显示10-姜酚相互作用的氨基酸残基，c是0纳秒和100纳秒时10-姜酚-ampk复合物络合物表面模拟模型，d显示未结合的ampk(蓝色)和10-姜酚-ampk复合物(红色)的重原子的均方根偏差，e是未结合的ampk(蓝色)与10-姜酚-ampkα复合物(红色)的势能曲线。

具体实施方式

本发明提供了10-姜酚作为ampk激动剂在防治血管再狭窄中的应用，其可有效地增强ampk的活性，抑制血管平滑肌细胞的增殖。进一步的，本发明提供了10-姜酚在制备支架涂层上的应用。

本发明涉及的10-姜酚的分子式为c21h34o4，分子量350.499，结构式如下所示：

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。本申请中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域的通用方法，在本发明的实施例公开的数据的基础上结合本领域的公知技术，经过有限次试验均能得到本发明的实验结果。

实施例110-姜酚能抑制颈总动脉结扎诱导的血管狭窄

发明人采用小鼠左侧颈总动脉结扎模型。腹腔注射麻醉，固定小鼠，沿小鼠颈部正中剪开皮肤，显微弯镊钝性分离皮下组织和脂肪，在显微镜下操作，分离甲状腺及肌肉，暴露左侧颈总动脉。在颈外动脉与颈内动脉的分叉点处用6号无菌编织线结扎。颈动脉结扎术后4周小鼠新生内膜增生，分别从假手术组、模型组、小剂量(25mg/kg)和高剂量(50mg/kg)组分离出血管组织并制成伊红染色的动脉切片。

形态学结果分析显示：在颈总动脉结扎4周后，与假手术组比较，结扎组血管内膜明显增生，管腔管径明显缩小，这表明小鼠左侧颈总动脉结扎模型构建成功；此外，如图1所示，与结扎组比较，10-姜酚不同浓度(25mg/kg，50mg/kg)组均可以缓解内膜增生的程度，差异具有统计学意义(p<0.05)，由此，表明10-姜酚能够抑制颈总动脉结扎诱导的血管狭窄。

实验例210-姜酚能抑制血管平滑肌细胞的增殖

选用两种血管平滑肌细胞，即大鼠胸大动脉平滑肌细胞a7r5和人主动脉平滑肌细胞hasmc。用药物10-姜酚浓度梯度(1μm、3μm、10μm)分别处理两种vsmcs(a7r5和hasmc细胞)，孵育24h，同时设立正常对照组(0.1％dmso)，采用mts法(细胞的活力测定)检测vsmcs的增殖情况(例数＝6)。

结果如图2a-b显示，在vsmcs(a7r5及hasmc)中，与对照组相比，药物处理组细胞活性较低，且具有一定的浓度依赖性，即a7r5细胞中、高剂量组差异具有统计学意义(p<0.05)，hasmc细胞低、中及高剂量差异具有统计学意义(p<0.05)；图2的结果说明10-姜酚能够抑制血管平滑肌细胞的增殖，且具有一定的浓度依赖性。

实验例310-姜酚可以激活ampkα

选用不同浓度的10-姜酚(1μm、3μm、10μm)处理vsmcs(a7r5和hasmc细胞)，孵育24h后，通过westernblot检测p-ampkα(兔抗p-ampkα抗体购自cst公司，1：1000)、ampkα(兔抗p-ampkα抗体购自cst公司，1：1000)和gapdh(兔抗gapdh抗体购自abcam公司，1：5000)(例数＝3)的表达。

结果如图3所示，10-姜酚可以剂量依赖性的增加ampkα磷酸化水平，差异具有统计学意义(p<0.05)；上述结果提示10-姜酚可以浓度依赖性激活ampkα。

实验例410-姜酚能与ampk结合并激活ampk

发明人采用分子对接软件autodockvina以及分子动力学软件yasara进行分子对接及分子动力学模拟。分子对接主要考察受体和配体的结合亲和力，配体和受体之间的相互作用细节和参与作用的重要氨基酸残基。ampkα-10-姜酚复合物的结合能为-7.4kcal/mol。

图4a显示了ampk-10-姜酚复合物的三维丝带模型，10-姜酚位于ampkα和ampkβ异二聚体之间。图4b显示了与10-姜酚相互作用的氨基酸残基，本研究发现10-姜酚与ampk的arg-83、asp-88、asn-48、ile-46、lys-29形成5个氢键，氢键长度分别为我们还观察到10-姜酚通过范德华力与asn-111、val-113、asp-108、lys-31、lys-51相互作用。

ampkα-10-姜酚的最佳构象被用作md模拟的起始构象。图4c显示了ampk-10-姜酚复合物在0纳秒及100纳秒的表面可视化模型。由结果可见，10-姜酚稳定地呈现在ampk结合位点的中心，直到分子动力学模拟结束。图4d显示了重原子均方根偏差的演变。ampk-10-姜酚复合物的起始原子rmsd轨迹在第一个20纳秒内从上升到在26-50纳秒围绕波动，然后在最后50纳秒内在逐步降低到并围绕波动(图4d，红线)。未结合的ampk的重原子均方根偏差轨迹在前20纳秒内从上升到在20纳秒到65ns内在到之间波动，然后在最后35纳秒内逐步下降并波动左右(图4d，蓝线)。发明人还检测10-姜酚-ampk复合物结合的势能，发明人发现10-姜酚-ampk的势能高于非结合的ampk(图4d)。

以上这些结果表明ampk与10-姜酚的结合是稳定的。分子对接及分子动力学模拟证实10-姜酚是潜在的ampk激动剂，能够直接与ampk结合。

综合上述一系列实验(实施例1～4)结果，最终得出结论：10-姜酚可有效地激活ampk，并通过该反应起到抗血管平滑肌细胞增殖及抑制血管再狭窄的作用。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。