人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备方法及应用与流程

本发明涉及一种人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备方法及其应用，属于生物医学领域。

背景技术：

英国学者bangham和standish在1961年通过电镜发现当磷脂分子分散在水中时会自然形成有序排列的类似生物膜结构的多层囊泡。后来，人们将这种具有双层膜形态的生物膜结构的中空小球通称为脂质体。随着近年来生物技术的发展，人们已研究出各种不同类型的脂质体，如阳离子脂质体、前体脂质体、长循环脂质体等。脂质体技术已广泛的应用到制药、生物、遗传、化工、食品等各个领域。固体脂质纳米粒(solidlipidnanoparticles,sln)是20世纪90年代初发展起来的新一代亚微粒给药系统，是指粒径在10～1000nm，以固态天然或合成的类脂如卵磷脂、三酰甘油等为载体，将药物包裹或夹嵌于类脂核中制成的固体胶粒给药系统，以毒性低、生物相容性好、生物可降解的固态天然或合成的类脂为载体，将药物吸附或包裹于脂质膜中制成的新一代纳米粒给药系统。采用脂质体包埋可以很好地解决渗透性低这一问题，它制备工艺简单，且粒径小，冻干成粉后便于运输和使用，具有广泛的应用前景。

纳米颗粒脂质体(nanoliposomes)是粒径为10-100nm的单室脂质体，其不仅具有脂质体的良好性质，还在稳定性、吸收和体内分布等方面呈现纳米效应，因此在药物制剂领域有着广泛的应用前景，是纳米药物载体研究的新途径。

人皮肤细胞生长因子是在人体内存在的一类细胞生长因子，它的主要功能是促进皮肤细胞的分裂、增殖和分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。研究表明：极微量的细胞生长因子即能强烈刺激细胞生长，抑制衰老基因表达，阻止皮肤衰老，使皮肤各组成成份保持最佳生理状态。此外，它还能刺激细胞外一些大分子(如透明质酸和胶原蛋白等)的合成与分泌，滋润皮肤，是决定皮肤活力和健康的关键因素。另有研究发现人皮肤细胞生长因子具有加速皮肤和粘膜创伤愈合，消炎镇痛，防止溃疡的功效。

但由于人皮肤细胞生长因子稳定性差，并且对温度和ph等敏感，极易失活，其还有分子量大不易透皮等缺点，极大地限制了其在临床方面的应用。

技术实现要素：

本发明克服了上述现有技术的不足，揭示一种人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备方法及其应用。采用创新纳米脂质体技术，将人皮肤细胞生长因子包裹在纳米脂质体里面，利用其纳米制剂效应与脂质体的生物相容性特点，可显著提高皮肤吸收滞留的效率，促进其疗效的充分发挥，可以开发为具有促进创面愈合作用的医疗器械产品和有美容护肤作用的高端化妆品。

该新型包裹人皮肤细胞生长因子的纳米脂质体的制备方法是乙醇注入法，此方法操作简单，封装人皮肤细胞生长因子的效率高，人皮肤细胞生长因子可以被容易地递送到活体皮肤创伤内层或需美容皮肤深层细胞中，同时保持人皮肤细胞生长因子具有高的生理活性，进而使人皮肤细胞生长因子在活体或细胞中发挥高效的作用。

一种人皮肤细胞生长因子纳米粒脂质体的制备方法，包括以下步骤：

1)人皮肤细胞的分离：利用人皮肤原始样本分离获得人的原代皮肤细胞；

2)人皮肤细胞生长因子的制备：将步骤1)中获得的原代皮肤细胞进行培养、传代，收集皮肤细胞的细胞培养液，经过清洗、酶消化、中和、离心后即可获得人皮肤细胞生长因子；

3)人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备：通过乙醇注入法利用纳米颗粒脂质体直接包埋步骤2)所获得的人皮肤细胞生长因子，获得人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体。

上述制备方法中步骤1)中所述的人皮肤细胞的分离，包括如下步骤：

s1收集人皮肤原始样本并去除皮下脂肪并称重，消毒后将皮肤组织切成糜状；

s2将步骤s1中糜状皮肤组织转入含有终浓度2.5mg/mlcollagenase和2.5mg/mldispase混合酶液的离心管中，消化成组织均浆液a；

s3在步骤s2所获得的组织匀浆液a和0.25％胰酶以体积比为4:1比例混合，继续消化，获得组织匀浆液b；

s4在步骤s3中获得的组织匀浆液b中加入10mg/ml的dna酶(1g成人组织加100μl)持续消化，获得组织消化液；

s5在步骤s4中获得组织消化液和含有10％fbs的dmem以1:1体积比混合进行中和，将中和后的消化液用细胞过滤器过滤，获得细胞悬液；

s6将细胞悬液两次离心去上清液所获得的沉淀即为分离得到的成人的原代皮肤细胞。

上述制备方法中的步骤2)所述的人皮肤细胞生长因子的制备，包括以下步骤：

ss1使用步骤1)中获得原代皮肤细胞进行细胞培养，细胞密度达到80％时进行细胞传代培养，获得皮肤细胞培养液；

ss2收集ss1中获得的皮肤细胞培养液，使用5-10ml的pbs清洗去除残留的培养基，以体积比为25:1的比例和trypleexpress(1×)混合进行消化，获得皮肤细胞消化液；

ss3步骤ss2中获得的皮肤细胞消化液中的细胞全部脱离后以1:1体积比和含有5％fbs的dmem混合进行中和，获得中和的细胞悬液；

ss4步骤ss3中获得的中和的细胞悬液离心去上清液获得皮肤细胞；

ss5步骤ss5中的皮肤细胞使用皮肤细胞生长因子培养基培养，待培养基变黄时换液，回收皮肤细胞因子培养基；

ss6将ss5回收的皮肤细胞因子培养基离心收集上清液，收集到的上清液过滤除菌，即可获得皮肤细胞生长因子。

上述制备方法中的步骤3)所述的人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备，包括以下步骤：

sss1称量大豆卵磷脂8-10g，加入50-60ml无水乙醇和40-50ml双蒸水，搅拌后过滤，获得空白脂质体溶液；

sss2将80-100ml的人皮肤细胞生长因子溶解于80-100ml双蒸水中，获得人皮肤细胞生长因子双蒸水溶液；

sss3将步骤s2获得的人皮肤细胞生长因子双蒸水溶液以8-10滴/min的速度缓慢加入到步骤s1获得的空白脂质体溶液中，搅拌获得人皮肤细胞生长因子稀脂质体；

sss4将步骤s3制备的人皮肤细胞生长因子稀脂质体注入超滤膜包中，除去游离的人皮肤细胞生长因子、空白脂质体和乙醇，获得人皮肤细胞生长因子浓脂质体悬液。

上述人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备中的步骤sss4中获得的人皮肤细胞生长因子浓脂质体悬液可直接分装和/或经过冻干工艺制备成固体成品。

上述制备方法所获得的人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体在皮肤创伤愈合中的应用。

上述制备方法所获得的人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体在化妆品中的应用。

有益效果：

(1)本发明采用乙醇注入法制备包裹人皮肤细胞生长因子的纳米脂质体，此方法操作简单，封装人皮肤细胞生长因子的效率高，人皮肤细胞生长因子可以被容易地递送到活体皮肤创伤内层或需美容皮肤深层细胞中，同时保持人皮肤细胞生长因子具有高的生理活性，进而使人皮肤细胞生长因子在活体或细胞中发挥高效的作用。

(2)本发明采用项目组的创新纳米脂质体技术平台，将人皮肤细胞生长因子包裹在纳米脂质体里面，利用纳米制剂效应和脂质体的生物相容性特点，可显著提高皮肤吸收滞留效率，促进其疗效的充分发挥，可开发为具有促进创面愈合作用的医疗器械产品和美容护肤作用的高端化妆品。

附图说明

图1为磷脂的极性基团和非极性长链结构示意图。

图2为脂质体结构模型图。

图3为不同溶解性药物在脂质体中的分布示意图。

图4为纳米颗粒脂质体悬浮液状态。

图5为纳米颗粒脂质体冻干粉状态。

图6人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体在winstar品系大鼠创伤伤口愈合中的应用。

图7人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体对人真皮细胞增殖迁移效果。

图8人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体对人表皮细胞增殖迁移效果。

图9人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体在化妆品中的应用。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图将对本发明做进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但不应因此理解为对本发明的限定。本发明所述方法中如无特殊说明，均为本领域常规方法。本发明所述试剂、仪器等，如无特殊说明，均为常规试剂、仪器，可以从商业途径获得。

实施例1.包裹人皮肤细胞生长因子的纳米颗粒脂质体的制备

一、人皮肤细胞的分离

(1)拿到人皮肤原始样本进入实验室，从无菌工作台上将组织放在10cm细胞培养皿中，用无菌镊子和剪刀小心的将组织皮下脂肪等去除干净(做到每次去除脂肪的程度基本一致，存留的脂肪不超过1mm后)，称重并记录，然后将皮肤组织切成2cm×2cm小块。在一个新的10cm细胞培养皿中先将组织表皮朝下，真皮朝上置于75％酒精浸泡3min一次(胚胎组织漂洗一下即可)，然后用含2x青链霉素双抗的pbs(磷酸缓冲液)浸泡3min，2次换液以达到灭菌消毒的目的。

(2)用2把手术刀呈90度交叉将组织缱绻切碎，切好的组织应呈糜状，无肉眼可见的颗粒。切组织过程中避免组织太赶，可以加少量pbs或f12或dmem到组织周围。

(3)将组织用手术刀小心转入含混合酶液(2.5mg/mlcollagenase和2.5mg/mldispase)的离心管中，充分混匀，37℃水浴80rpm震荡消化(胚胎组织60min左右，成人组织90-120min)，消化过程中每隔10-15min摇晃一下管子将组织团块摇散。消化完全时，不应有大的组织块，成组织匀浆。

(4)胰酶消化：将0.25％胰酶加入含组织的离心管中充分混匀，使其终浓度为0.05％继续消化20-30min。胰酶用量的计算方法为：0.25％胰酶加入提价(ml)＝含组织的酶消化液体积(ml)/4。

(5)0dna酶消化：最后再加10mg/ml的dnase充分混匀后消化5分钟(1g成人组织加100μl，2cm²胚胎组织加100μl，可根据组织粘稠度稍微调整dnase的用量)。

(6)组织消化好后加入相同体积的含有10％fbs的dmem中和酶消化液，反复吹打20-50次(成人组织吹打50次)。

(7)准备100μm细胞过滤器，置于50ml离心管上。将中和后的消化液用过滤器过滤，并用5ml含有10％fbs的dmem清洗离心管和过滤器。

(8)将过滤后得到的细胞悬液1000rpm离心5min，弃去上清。细胞沉淀用10ml含1×sac的f12重悬，吹打4-5次，将细胞团块吹散即可。然后1000rpm离心5min，弃上清。得到的细胞沉淀即为分离得到的胚胎/成人的原代细胞。

二、人皮肤细胞生长因子的制备

(1)原代细胞的数量决定下一步实验，一般原代表皮细胞培养用400万/t75培养瓶，真皮细胞200万/t75培养瓶。原代表皮细胞所用培养皿或培养瓶需用coatingmatrix预处理，室温静置10min，将配好的matrix加入培养瓶铺匀，室温静置10min，然后将瓶内多余液体弃掉。matrix用量为1-1.5ml/75cm²培养瓶,1ml/10cm培养皿。需用加1/100010mmrockinhibitor的真皮培养基培养，7ml/皿，置于37℃培养箱中培养，培养3天后换成df-k培养基(专利号201610473310.4)培养。原代真皮细胞用真皮培养基培养，7ml/皿，置于37℃培养箱中培养。

(2)待细胞密度达到80％时，需对细胞进行传代培养。

(3)旧培养基的回收：将培养皿中的旧的表皮培养基或真皮培养基吸走，回收到回收细胞因子的塑料瓶中。

(4)清洗：用pbs(5ml)洗一次去除培养后残留的培养基。

(5)酶消化：加含gibco公司的trypleexpress(1×)于37℃培养箱中消化细胞，每个75cm²的培养瓶中加3ml，10cm皿中加2ml酶消化液。表皮细胞消化10min左右，真皮细胞消化5min左右。

(6)中和：消化时间到后在显微镜下观察，如果细胞全部脱落，加含5％fbs的dmem中和，吹打几次后将细胞用移液管收集起来转移至50ml离心管中。

(7)细胞收集：将中和后用移液管收集得到的细胞悬液1000rpm离心5min，弃去上清。细胞沉淀用10ml含1×sac的dmem重悬，吹打4-5次将细胞团块吹散即可。用计数板或细胞计数仪计数。根据需要进行细胞传代或冻存；

表皮细胞的传代：用适量df-k表皮细胞培养基重悬细胞。接种到相应的培养瓶或培养皿中，置于37℃培养箱中培养；

真皮细胞的传代：用适量的真皮培养基重悬真皮细胞。接种到相应的培养瓶或培养皿中，置于37℃培养箱中培养。

(8)去除表皮细胞中的真皮细胞(如果在表皮细胞中混有真皮细胞)

旧培养基的回收：将培养皿中的旧的表皮培养基吸走，回收到回收细胞因子的塑料瓶中。

清洗：用pbs(5ml)洗一次去除残留的培养基。

酶消化：加含gibco公司的trypleexpress(1×)于37℃培养相中消化细胞3min左右，每个75cm²的培养瓶中加3ml，10cm皿中加2ml酶消化液。

中和：消化时间到后在显微镜下观察，如果真皮细胞全部脱落，加含5％fbs的dmem中和，弃掉废液。

(9)表皮细胞因子的收集：步骤(7)中获得的传代后的表皮细胞使用pbs洗一次，加表皮细胞因子培养基继续培养，待培养基变黄时换液，回收表皮细胞因子培养基，放入冰箱保存。

(13)真皮细胞因子的收集同表皮细胞因子相似。

(14)回收的细胞因子从冰箱拿出化冻，3000-4500rpm离心10min，收集上清。

(15)收集到的上清用0.22μm的过滤器过滤，收到无菌的瓶子里。

(16)每500ml细胞因子加10ml10％的羟苯甲酯，使羟苯甲酯的终浓度为0.2％。

(17)瓶子上贴标签，常温存放。

三、人皮肤生长因子纳米颗粒脂质体的制备

通常磷脂具有极性基团和非极性长链(如图1)。

(1)大豆卵磷脂称重10.0g，置于烧杯底部，密封。

(2)量筒量取60ml无水乙醇，使用注射器加入盛放卵磷脂的烧杯底部，加入40ml双蒸水。

(3)用磁力搅拌器搅拌30min，温度30℃(使卵磷脂在乙醇中充分溶解)，得到的空白脂质体用0.45μm一次性滤器过滤。

(4)另一个量筒准备100ml双蒸水，将一定量的人皮肤细胞生长因子溶解于双蒸水中。

(5)一次性注射器将含人皮肤细胞生长因子的双蒸水溶液以10滴/min的速度缓慢加入大豆卵磷脂、乙醇的混合液中。同时，磁力搅拌器继续搅拌30min。

(6)将制备的人皮肤细胞生长因子稀脂质体悬液注入超滤膜包，可将包埋人皮肤细胞生长因子的脂质体浓缩，游离因子和空脂质体分离出去，并且可以去除残留的乙醇。

(7)得到的浓脂质体悬液可分装制备成纳米颗粒脂质体悬浮液(如图4所示)。

(8)步骤(5)得到的弄脂质体悬液可冻干制备成固体成品(如图5所示)。

实施例2包裹人皮肤细胞生长因子的纳米颗粒脂质体在皮肤创伤愈合中的应用

(1)对winstar品系大鼠皮肤创伤伤口进行无菌清创、消毒。

(2)在清创和消毒完毕的伤口处涂抹上包裹着人皮肤细胞生长因子的纳米颗粒脂质体产品。

(3)伤口处附上无菌纱布并对伤口进行简单包扎。

(4)定期更换包裹着人皮肤细胞生长因子的纳米颗粒脂质体产品，并观察伤口愈合情况，2天/次。

(5)伤口愈合后拆除包扎。

结果如图6所示，图中每个图的上面两个创伤伤口不涂抹任何药物，自然愈合，下面两伤口涂抹包裹着人皮肤细胞生长因子的纳米颗粒脂质体产品，结果显示，涂抹包裹着人皮肤细胞生长因子的纳米颗粒脂质体产品的皮肤创口愈合速度加快，说明包裹着人皮肤细胞生长因子的纳米颗粒脂质体显著加快皮肤创伤的愈合，在皮肤创伤愈合方面有着广阔的应用前景。

实施例3纳米颗粒脂质体包埋人皮肤细胞生长因子在化妆品中的应用

人皮肤细胞生长因子的制备和人皮肤细胞生长因子纳米颗粒脂质体的制备方式和步骤与实施例1所述相同。包裹着人皮肤细胞生长因子的纳米颗粒脂质体加入化妆品等护肤产品中可促进皮肤细胞吸收细胞生长因子，从而促进皮肤细胞的生长，起到丰盈皮肤细胞、修复痘印疤痕、淡化皮肤皱纹的作用，可以使皮肤看起来更加光润有弹性，从而起到高效护肤功效。

对此我们做了体外人皮肤细胞迁移实验：

一、人真皮细胞迁移实验

(1)接板前，真皮细胞先使用含10％fbs的dmem在t75培养瓶中培养一代。

(2)06孔板接25-30万/孔约3d可以长满。

(3)划痕前弃去培养基使用pbs清洗一次，用黄枪头划痕。

(4)划痕后，使用pbs轻轻冲洗划痕处，弃去，再使用pbs漂洗一次。

(5)加入3-4ml含双抗的dmem稀释的不同浓度的细胞因子培养，空白组加含双抗的dmem。

(6)选择真皮细胞迁移的不同时间点拍照。

结果如图7所示，经过多次真皮细胞迁移实验结果显示，使用一定浓度浓缩后的包裹人皮肤细胞生长因子的纳米颗粒脂质体进行人真皮细胞的培养，其对真皮细胞创口的愈合有促进作用，浓度为12.5μg/ml的细胞因子诱导真皮细胞增殖迁移的速度优于25μg/ml的细胞因子和空白组，划痕优先愈合，说明12.5μg/ml的细胞因子对于愈合效果优于25μg/ml的细胞因子和空白组。

二、表皮细胞迁移实验

(1)接板前，表皮细胞先使用df-k培养基在t75培养瓶中培养一代。

(2)6孔板接150-200万/孔约3d可以长满。

(3)划痕前弃去培养基使用pbs清洗一次，用黄枪头划痕

(4)划痕后，使用pbs轻轻冲洗划痕处，弃去，再使用pbs漂洗一次

(5)加入3-4ml含df-k培养基稀释的不同浓度的细胞因子培养，空白组加df-k培养基。

(6)选择表皮细胞迁移的不同时间点拍照。

结果如图8所示，经过多次表皮细胞迁移实验结果显示，使用一定浓度浓缩后的包裹人皮肤细胞生长因子的纳米颗粒脂质体进行人表皮细胞的培养，其对表皮细胞创口的愈合有促进作用，浓度为12.5μg/ml的细胞因子诱导表皮细胞增殖迁移的速度优于25μg/ml的细胞因子和空白组，划痕优先愈合，说明12.5μg/ml的细胞因子对于愈合效果优于25μg/ml的细胞因子和空白组。

此结果与人真皮细胞迁移实验结果一致，表明包裹人皮肤细胞生长因子的纳米颗粒脂质体对皮肤的最优作用浓度为12.5μg/ml，因此我们将其加入面膜等化妆品中，使其终浓度为12.5μg/ml。

我们将制备的包裹着人皮肤细胞生长因子的纳米颗粒脂质体加入到面膜精华液等化妆品中，与不加包裹着人皮肤细胞生长因子的纳米颗粒脂质体的面膜等化妆品相比，使用含有包裹着人皮肤细胞生长因子的纳米颗粒脂质体的面膜等化妆品可以很好的起到丰盈皮肤细胞、修复痘印疤痕、淡化皮肤皱纹的作用，使用这种面膜的人皮肤看起来更加光润有弹性，面膜的护肤功效显著提高(如图9所示)。此结果与我们的体外人皮肤细胞迁移实验结果一致。