刺五加苷B在制备预防或治疗急性肾损伤的药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种生物医药技术，尤其涉及的是一种刺五加苷b(eleutherosideb)在制备预防或治疗急性肾损伤的药物中的应用。

背景技术：

急性肾损伤(acutekidneyinjury，aki)是临床常见危重疾病，可导致肾脏不完全修复、持续慢性炎症和进展性纤维化，是引起继发性慢性肾脏病、肾衰竭及住院患者死亡的重要原因。迄今为止aki尚无任何有效治疗措施，因此，寻找可以减轻组织损伤、促进修复、防止慢性纤维化发生的肾脏保护药物具有重要意义。

刺五加苷b(eleutherosideb，eb)，又称紫丁香苷，分子式为c17h24o9，化学结构式如下：

刺五加苷b是刺五加干燥根茎或茎，是一味古老的补虚类中药。现有的研究表明，刺五加苷具有双向免疫调节，抗肿瘤，抗疲劳，抗衰老，抗心律失常等功能。

但尚未报道其用作治疗急性肾损伤的药物的作用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于：现有技术中没有公开刺五加苷b在治疗或预防急性肾损伤的药物中的应用，提供了一种刺五加苷b在制备预防或治疗急性肾损伤的药物中的应用。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的，本发明的刺五加苷b在制备预防或治疗急性肾损伤的药物中的应用。

刺五加苷b在制备预防或治疗由急性肾损伤导致的疾病的药物中的应用。

所述急性肾损伤为顺铂诱发肾小管上皮细胞损伤。

所述急性肾损伤为顺铂诱导肾小管上皮细胞炎症。

所述急性肾损伤为顺铂诱导急性肾损伤模型中血肌酐和血尿素氮的水平升高。

所述急性肾损伤为顺铂诱导急性肾损伤模型中的炎症。

所述急性肾损伤为顺铂诱导急性肾损伤模型中凋亡坏死。

所述刺五加苷b的给药浓度为128μm。

所述药物的剂型为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明首次公开刺五加苷b作为治疗急性肾损伤的药物中的用途，刺五加苷b对顺铂诱发肾小管上皮细胞损伤具有保护的作用，对顺铂诱导肾小管上皮细胞炎症因子具有抑制作用，降低顺铂诱导急性肾损伤模型中血肌酐和血尿素氮的水平，对顺铂诱导急性肾损伤模型中炎症具有抑制作用，对顺铂诱导急性肾损伤模型中凋亡坏死具有抑制作用。可有效降低急性肾损伤所引起的炎症反应和凋亡反应，进而发挥肾脏保护作用，刺五加苷b可有效减轻急性肾损伤，保护肾功能，其作用机制与刺五加苷b降低炎症因子水平和降低凋亡坏死反应有关，应用前景广泛，也为急性肾损伤的治疗提供了更多的药物选择。

附图说明

图1是实施例1中的细胞存活率图；

图2是实施例1中kim-1蛋白表达图；

图3是实施例1中kim-1蛋白的半定量分析图；

图4是实施例2中tnf-αmrna的表达图；

图5是实施例2中il-6mrna的表达图；

图6是实施例3中ripk1的蛋白表达图和半定量分析图；

图7是实施例3中ripk3蛋白表达图和蛋白的半定量分析图；

图8是实施例4中肌酐的含量图；

图9是实施例4中尿素氮的含量图；

图10是实施例4中组织切片的糖原染色；

图11是实施例5中tnf-α蛋白的半定量分析图；

图12是实施例5中mcp-1蛋白的半定量分析图；

图13是实施例5中tnf-α蛋白的免疫组化染色图。

注：与对照组(nc)比较：*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001；与模型组(cis)比较：^#p＜0.05,^##p＜0.01,^###p＜0.001。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本实施例中所使用的westernblot法、提rna、逆转录、扩增、pas染色、免疫组化等方法均为常规试验方法。

实施例1

体外实验中刺五加苷b(eb)对顺铂(cisplatin)诱发肾小管上皮细胞损伤的保护作用。

mtt法：将人肾小管上皮细胞(hk2)细胞接种于96孔板中，接种密度约为4000个细胞/孔。培养24h，换用无血清培养基饥饿12小时后，分为8组分别为对照组、顺铂刺激组和8个刺五加苷b梯度剂量组(顺铂刺激+eb)，在顺铂刺激组中添加20μm顺铂，在8个刺五加苷b梯度剂量组中分别添加20μm顺铂+4μmeb20μm顺铂+8μmeb、20μm顺铂+16μmeb、20μm顺铂+32μmeb、20μm顺铂+64μmeb、20μm顺铂+128μmeb、20μm顺铂+256μmeb、20μm顺铂+512μmeb，继续培养24h。培养结束后每孔加入5g·l-1的mtt溶液20μl，继续培育4h。吸去培养基，每孔加入150μl的dmso，振荡，混匀。用酶标仪在492nm处测定各孔od值，记录结果。以细胞存活率(cellviability)对剂量作图(如图1所示)。

细胞存活率计算公式：细胞存活率＝(梯度剂量组细胞od值-对照组细胞od值)/(顺铂刺激组细胞od值-对照组细胞od值)×100％。

westernblot：将对数生长期的hk2细胞接种于6孔板中，接种密度约为1.0×105个细胞/ml，分别分为对照组、顺铂刺激组和3个刺五加苷b梯度剂量组(顺铂刺激+eb)，在顺铂刺激组中添加20μm顺铂，在3个刺五加苷b梯度剂量组中分别添加20μm顺铂+64μmeb(低剂量组)、20μm顺铂+128μmeb(中剂量组)、20μm顺铂+256μmeb(高剂量组)，每组重复3-4次实验，继续培养24小时，pbs洗三遍，收集细胞，提取总蛋白，通过westernblot法检测肾脏损伤分子1(kim-1)的蛋白表达(如图2所示)，并进行半定量分析(如图3所示)。

由本实施例可得：

从图1可以看出，即mtt结果显示顺铂刺激的hk2细胞经过由低剂量到高剂量梯度剂量的刺五加苷b处理后，该细胞的相对存活率值显著增加；图2的westernblot及图3所示的半定量分析结果表明顺铂刺激的hk2细胞经过刺五加苷b处理后，肾脏损伤分子kim-1的蛋白表达水平明显受到抑制，证明刺五加苷b对顺铂引起肾小管上皮细胞损伤起保护作用。

实施例2

体外实验中刺五加苷b对顺铂诱导肾小管上皮细胞炎症因子(tnf-α和il-6)的抑制作用。

将hk2细胞接种于12孔板中，接种密度约为0.5×105个细胞/孔，分别分为对照组、顺铂刺激组、刺五加苷b组(eb)和顺铂刺激+eb组，每组重复3-4次实验，孵育24小时用无血清培养基饥饿12小时，然后在模型组中添加20μm顺铂，在刺五加苷b组(eb)和顺铂刺激+eb组分别添加128μm刺五加苷b，继续培养24小时，pbs洗三遍，收集细胞，提rna，逆转录，扩增。然后进行realtimepcr检测肿瘤坏死因子(tnf-α)和白细胞介素-6(il-6)的表达水平，结果如图4(tnf-α)和图5(il-6)所示。

由本实施例可得：

从图4和图5看出，顺铂明显诱导肾小管上皮细胞中tnf-αmrna水平的升高，而刺五加苷b处理组tnf-αmrna表达明显被抑制，另一炎症因子il-6mrna结果显示肾小管上皮细胞受到顺铂刺激后经刺五加苷b处理，其il-6mrna表达明显下降，提示刺五加苷b可显著抑制顺铂诱发的炎症反应。

实施例3

体外实验中刺五加苷b对顺铂诱导损伤肾小管上皮细胞凋亡坏死具有抑制作用。

westernblot：将对数生长期的hk2细胞接种于6孔板中，接种密度约为1.0×105个细胞/ml，分别分为对照组、顺铂刺激组，刺五加苷b组(eb)，顺铂刺激+刺五加苷b组(顺铂刺激+eb)，在顺铂刺激组中添加20μm顺铂，在刺五加苷b组(eb)和顺铂刺激+eb组中分别添加20μmcisplatin+128μmeb，每组重复3-4次实验，继续培养24小时，pbs洗三遍，收集细胞，提取总蛋白，通过westernblot法检测凋亡相关蛋白ripk1和ripk3表达水平的变化，并对ripk1和ripk3进行半定量分析(如图6和图7所示)。

由本实施例可得：

图6和7中的westernblot的图和半定量分析结果表明顺铂刺激的hk2细胞经过刺五加苷b处理后，凋亡相关蛋白ripk1和ripk3表达水平明显降低，证明刺五加苷b对顺铂诱导的损伤肾小管上皮细胞具有抑制凋亡的作用。

实施例4

刺五加苷b降低顺铂诱导急性肾损伤模型中血肌酐(creatinine)和血尿素氮(bun)的水平。

将6-8周龄c57bl/6小鼠适应性饲养1周，分为对照组、顺铂刺激组、刺五加苷b组(eb)，顺铂刺激加刺五加苷b组低剂量组(顺铂+eb20mg/kg)、中剂量组(顺铂+eb40mg/kg)、高剂量组(顺铂+eb60mg/kg)，每组6-10只。对模型组和刺五加苷b低、中、高剂量组小鼠腹腔注射20mg/kg顺铂建立急性肾损伤模型，并对刺五加苷b低、中、高剂量组小鼠分别腹腔注射20mg/kg、40mg/kg和60mg/kg刺五加苷b，培养3天。

3天后麻醉状态下收取小鼠血清样本及肾组织，并根据血肌酐和尿素氮试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)说明书检测动物模型血清中肌酐和尿素氮的含量，结果如图8和9所示。根据糖原染色试剂盒(购自珠海贝索企业))说明书检测动物肾脏组织中糖原沉积情况，结果如图10所示。

表1肌酐测试结果

如表1所示，肌酐含量(μmol/l)＝[(测定a2-k*测定a1)-(空白a2-k*空白a1)]/[(标准a2-k*标准a1)-(空白a2-k*空白)]*标准品浓度(442μmol/l)

注：稀释因子k＝(加样量+酶溶液a体积)/(加样量+酶溶液a体积+酶溶液b体积)＝186/246。

表2尿素氮测试结果

如表2所示，尿素氮含量(mmol/l)＝(测定od值-空白测定值)/(标准od值-空白od值)*标准浓度(10mmol/l)*样本测试前稀释倍数。

糖原染色：对肾脏组织进行常规固定，24小时后脱水包埋切片；将石蜡切片脱蜡入后进行自来水冲洗10分钟，用pbs洗两次，每次3分钟，再用pbst洗一次，3分钟。滴加国电算溶液试剂，室温放置10分钟自来水冲洗；用雪芙试剂染色10-20分钟；自来水冲洗10分钟；用苏木素染色液进行染核1-2分钟；酸性乙醇分化液分化，自来水冲洗10分钟反蓝；逐级常规乙醇脱水，二甲苯透明，中兴树胶封片，显微镜观察。

由本实施例可得：

图8为肌酐含量变化图，显示顺铂诱导模型组中血肌酐含量明显升高，肾功能恶化，而不同浓度的刺五加苷b有效降低模型组血肌酐水平，图9为尿素氮含量变化图，同样显示不同浓度的刺五加苷b有效降低模型组尿素氮水平，进一步证实刺五加苷b对急性肾损伤时肾功能具有保护作用；图10为肾脏组织糖原染色，显示不同浓度的刺五加苷b有效降低顺铂刺激下肾小管损伤和糖原沉积。

实施例5

刺五加苷b对顺铂诱导急性肾损伤模型中炎症的抑制作用。

将6-8周龄c57bl/6小鼠适应性饲养1周，分为对照组、顺铂刺激组、刺五加苷b组(eb)，顺铂刺激加刺五加苷b组(顺铂刺激+eb)，每组6-10只。对顺铂刺激组和顺铂刺激加刺五加苷b组小鼠分别腹腔注射20mg/kg顺铂建立急性肾损伤模型，并对刺五加苷b组(eb)，顺铂刺激加刺五加苷b组(顺铂刺激+eb)分别腹腔注射40mg/kg刺五加苷b，培养3天。3天后麻醉状态下收取小鼠血样及肾组织，提取组织rna，逆转录，扩增。然后进行real-timepcr检测炎症因子tnf-α和mcp-1的表达水平，以及对肾脏组织切片进行tnf-α的免疫组化实验。

免疫组化实验：石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用ph7.4的pbs冲洗三次，每次3分钟。取一定量柠檬酸盐缓冲液，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入缓冲液中，高温微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，用自来水冲洗10分钟，之后用pbs冲洗。用3％h2o2室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性，pbs冲洗3次，每次3分钟。每张切片加1滴相应的第一抗体(相应稀释倍数)，室温下孵育2小时或者4度过夜。除去pbs液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30分钟。pbs冲洗3次，每次3分钟。除去pbs液，每张切片加1滴新鲜配制的dab液(二氨基联苯胺)，显微镜下观察，控制染色时间。苏木素复染，0.1％hcl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。

由本实施例可得：

结果如图11(tnf-α)和图12(mcp-1)所示。从图11-13中可以看出，急性肾损伤模型中炎症因子tnf-αmrna水平显著上升，而刺五加苷b可明显降低炎症因子水平，改善炎症，另一炎症因子mcp-1mrna结果同样显示，刺五加苷b可降低顺铂引起的模型组肾脏mcp-1mrna高表达；图13显示刺五加苷b有效降低顺铂刺激下肾小管损伤和tnf-α的沉积。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。