电纺3D打印制备含同轴静电纺丝多层软骨复合体的制作方法

本发明属于3d打印技术领域，具体涉及一种电纺3d打印制备含同轴静电纺丝多层软骨复合体。

背景技术：

关节软骨的损伤及退变是一种非常常见的疾病形式，也是骨科临床工作中主要面对的问题之一，随着我国人口老龄化的不断加重，且由于关节软骨乏血管及自身修复能力差的特点，因关节软骨损伤及退变而导致的各种疾病的发生率也逐年升高。因此，如何干预或诱导软骨损伤的修复成为了现在研究的重点。但单纯的在损伤部位诱导软骨细胞的生成并不能解决关键问题，其主要原因在于新生软骨并不能满足正常关节软骨功能上的需求。关节软骨在结构上主要可分为表层区、中层区、深层区及钙化区四层，其每层的功能及成分结构都有所不同，如何有效的在适当区域诱导形成合适的具有相应功能的软骨成分成为了关节软骨损伤修复的难点。组织工程技术为关节软骨损伤修复提供了一个可行的方法，其采用特定的细胞因子，配合生物可降解支架，培养并诱导相关的干细胞或软骨细胞在不同区域增殖、分化，最终形成复合体，植入损伤区域，修复损伤组织，同时伴随着生物材料的逐渐降解，最终达到完全修复。在这个过程中，细胞因子、种子细胞及支架的共同作用，是关节软骨损伤修复的关键，也是临床治疗的关键。

对于软骨损伤，目前的治疗方法主要为微骨折术或软骨移植术，但前者所形成软骨功能较差，而软骨移植术则限于供体区域不足。因此，在之前部分研究采用可吸收支架，负载干细胞或细胞因子后移植于损伤区域。但这种方法，所生成的软骨不存在正常软骨的分层结构，因而，在功能上不能提供正常软骨的耐摩擦及支撑作用，容易再次损伤并引起症状，因此，除了提高手术技巧和康复计划外，需要一种有效的方法使得软骨的正常结构和功能得到重建与修复。

技术实现要素：

为解决上述背景技术中提出的问题。本发明提供了一种电纺3d打印制备含同轴静电纺丝多层软骨复合体，包括以下几个步骤：

s1、种子细胞的培养；

s2、三相一体支架的制备；

s3、细胞的种植，取适量骨髓间充质干细胞种植于各支架区域。

优选的，所述步骤s1种子细胞的培养的方法为，骨髓间充质干细胞以含10％胎牛血清的dmem培养基培养于孵箱中。

优选的，所述孵箱内的温度为37℃，其孵箱内有5％co2。

优选的，所述s2步骤三相一体支架的制备步骤中模型的建立包括以下步骤；

s21、模型的建立；

s22、材料的制备；

s23、设备的准备。

优选的，所述s21步骤模型的建立的具体流程为：使用三维打印软件建立打印模型，为多层圆柱形状，各层结构路径间隙各自根据需要进行调整和保存。

优选的，所述s22步骤中材料的制备具体流程为：量取适量的生物高分子材料和生物材料，分别装载适量tgfβ1、bmp7、igf等细胞因子和ha颗粒，得到b1’(b1+tgfβ1+bmp7)、b2’(b2+tgfβ1+igf)、b3’(b3+tgfβ1+ha)，b1’、b2’、b3’制备完成后，分别用于制备表层、中深层及钙化层软骨。

优选的，所述s23制备步骤中设备的准备流程为：调校熔融静电纺丝三维打印设备的工艺参数，将s22步骤中的生物高分子材料a1进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒外层，细胞因子生物高分子材料b1混合物进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒内层，启动设备进行熔融静电纺丝三维打印，由表层区开始打印，当表层区制备完毕后，将料筒内的材料更换为a2、b2’，对中深层区进行打印，完毕后使用a3、b3’对钙化区域进行打印，获得表层-中深层-钙化层三相一体支架。

优选的，所述三维打印设备的设置参数为：打印拉丝直径为10-50μm，打印温度根据材料的热属性进行调整，打印过程中料筒气压为600-1000kpa，负高压模块电压为-2.5～-50kv，打印结构由打印路径控制，打印路径为0/90°，打印空隙由打印路径间隔控制，间隔为100μm、150μm、200μm。

优选的，所述s3步骤细胞的种植的流程为：取适量骨髓间充质干细胞种植于各支架区域。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

该方法采用同轴静电纺丝3d打印技术，可以精确的控制纤维直径与打印路径，且较普通喷涂式打印极大地提高打印精度，单丝直径最细可达10μm。而同轴纺丝技术则可使我们获得内层含有细胞因子的双层纤维，在支架上分层诱导相应种子细胞向所对应层次的细胞分化，最终形成类似于正常软骨组织的成分层次结构，该方法所获得的复合体具有类似正常关节软骨组织的分层结构，且结构精度高，负载细胞因子有利于促进细胞增殖分化，利于软骨损伤的修复。

附图说明

图1为本发明多层软骨复合体支架的制作流程图；

图2为本发明表层区对照实验图；

图3为本发明中层区对照实验图；

图4为本发明钙化层区对照实验图；

图5为本发明collagen对照实验图；

图6为本发明prg4表层区对照实验图；

图7为本发明comp对照实验图；

图8为本发明cilp中深层区对照实验图；

图9为本发明gagsg钙化层区对照实验图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供以下技术方案：一种电纺3d打印制备含同轴静电纺丝多层软骨复合体，包括以下几个步骤：

s1、种子细胞的培养；

s2、三相一体支架的制备；

s3、细胞的种植，取适量骨髓间充质干细胞种植于各支架区域。

具体的，所述步骤s1种子细胞的培养的方法为，骨髓间充质干细胞以含10％胎牛血清的dmem培养基培养于孵箱中。

具体的，所述孵箱内的温度为37℃，其孵箱内有5％co2。

具体的，所述s2步骤三相一体支架的制备步骤中模型的建立包括以下步骤；

s21、模型的建立；

s22、材料的制备；

s23、设备的准备。

具体的，所述s21步骤模型的建立的具体流程为：使用三维打印软件建立打印模型，为多层圆柱形状，各层结构路径间隙各自根据需要进行调整和保存。

具体的，所述s22步骤中材料的制备具体流程为：量取适量的生物高分子材料和生物材料，分别装载适量tgfβ1、bmp7、igf等细胞因子和ha颗粒，得到b1’(b1+tgfβ1+bmp7)、b2’(b2+tgfβ1+igf)、b3’(b3+tgfβ1+ha)，b1’、b2’、b3’制备完成后，分别用于制备表层、中深层及钙化层软骨。

具体的，所述s23制备步骤中设备的准备流程为：调校熔融静电纺丝三维打印设备的工艺参数，将s22步骤中的生物高分子材料a1进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒外层，细胞因子生物高分子材料b1混合物进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒内层，启动设备进行熔融静电纺丝三维打印，由表层区开始打印，当表层区制备完毕后，将料筒内的材料更换为a2、b2’，对中深层区进行打印，完毕后使用a3、b3’对钙化区域进行打印，获得表层-中深层-钙化层三相一体支架。

具体的，所述三维打印设备的设置参数为：打印拉丝直径为10-50μm，打印温度根据材料的热属性进行调整，打印过程中料筒气压为600-1000kpa，负高压模块电压为-2.5～-50kv，打印结构由打印路径控制，打印路径为0/90°，打印空隙由打印路径间隔控制，间隔为100μm、150μm、200μm。

具体的，所述s3步骤细胞的种植的流程为：取适量骨髓间充质干细胞种植于各支架区域

实施例1

(1)使用三维打印软件建立打印模型，为多圆柱形，表层区、中深层区、钙化层区路径间隙不同，保存；

(2)量取适量的高分子材料聚己内酯及聚乳酸，聚乳酸分别同适量tgfβ1、bmp7、igf细胞因子及ha(羟基磷灰石)颗粒混合；

(3)设备的准备：调校静电纺丝3d打印设备的工艺参数：打印拉丝直径为10-50μm，打印温度为65℃，打印过程中料筒气压为600-1000kpa，负高压模块电压为-2.5～-50kv，打印结构由打印路径控制，打印路径为0/90°，打印间隔为100μm、150μm、200μm，将聚己内酯装载入外侧料筒，载有细胞因子的聚乳酸溶液加入内侧料筒，使聚己内酯与载有细胞因子的聚乳酸液进入同轴熔融静电纺丝三维打印设备，启动设备进行同轴静电纺丝3d打印，打印表层区时细胞因子为tgfβ1+bmp7，打印中深层区时为tgfβ1+igf，打印钙化区为tgfβ1+ha。获得表层-中深层-钙化层三相一体支架。

实施例3

将得到的软骨分层支架进行生物相容性表征，将所得同轴混细胞因子三相一体支架，种植骨髓干细胞，放入培养箱中培养。以单纯聚己内酯三维打印得到的支架，种植骨髓干细胞为对照组，分别与三相支架各区作对比。分别培养1，3，5，7天后，利用mtt法检测表层区支架中的细胞活力，显示带有细胞因子微球的静电纺丝3d打印技术得到的支架上的细胞具有良好的增殖行为，细胞活力较好，且较对照组增殖行为更加显著。

实施例4

将利用同轴静电纺丝3d打印得到的表层-中深层-钙化层混合细胞因子三相一体支架，种植骨髓干细胞，进行qrt-pcr检测，以单纯聚己内酯三维打印得到的支架，种植骨髓干细胞为对照组作对比，分别培养7天后，进行qrt-pcr检测，结果如图所示，显示实验组表层区软骨相关产物(collagenii、prg4)、中身层区软骨相关产物(collagenii、cilp、comp)、钙化层区软骨相关产物(collagenii、gags)表达明显较多。

实施例5

将得到的表层-中深层-钙化层三相一体支架进行拆分，分为表层区支架、中深层区支架、钙化区支架，表层区进行力学弹性及摩擦测试，中深区及钙化区放置于万能测试机上进行力学压缩测试，结果显示表层-中深层-钙化层三相一体支架力学性能较好。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。