包含活性多肽的柔性脂质体化妆品及其制备方法与流程

本发明属于化妆品领域，具体涉及一种包含活性多肽的柔性脂质体化妆品及其制备方法。
背景技术：
：多肽是由两个或两个以上氨基酸缩合并以肽键相连的一类化合物，它是蛋白质的中间物质。一种肽含有的氨基酸少于10个就被称为寡肽，超过的就称为多肽，氨基酸为50多个以上的多肽称为蛋白质。多肽类物质的生物活性高，它能调节机体细胞的各种生理活动和生化反应，也被称之为活性生物多肽。在皮肤自然老化的防御和护理过程中，活性生物多肽也起着独特而重要的生理作用，如皮肤组织细胞的增殖、细胞趋化与迁移、修复与再生、血管形成与重建、色素形成与清除以及蛋白合成与分泌、代谢与调控等。目前应用较为广泛的与皮肤美容相关的活性多肽大多是一些化学合成的、分子量较小的功能性多肽——胜肽类(cosmeticspeptide，cp)，按照功能可以分为三大类：1)抗皱类，可阻断面部神经传递肌肉收缩的信号，并影响皮囊神经传导，使脸部肌肉松弛，动态、静态皱纹和面部细纹得到改善，包括乙酰基六肽-8(又称为argireline，阿基瑞林)、棕榈酰三肽、乙酰基八肽等；2)抗自由基类，有助于皮肤抗炎和抗氧化，包括棕榈酰四肽-7、谷胱甘肽、肌肽、l-肌肽等；3)促进细胞活性类，促进人体纤维细胞中胶原蛋白及氨基葡萄糖的合成，强化结缔组织，增加肌肤紧实度，促进细胞活性，包括棕榈酰五肽-3、棕榈酰五肽-4、铜胜肽、棕榈酰三肽-1、棕榈酰三肽-5、乙酰基四肽-9、肉豆蔻酰六肽-4等；4)美白、消肿、促睫毛生长等其他类，抑制促黑色素细胞黑色素产生，或作为吸湿剂减轻眼部浮肿，或激活人体角蛋白基因表达以促进睫毛生长，包括九肽-1、二肽-2、乙酰基四肽-5、肉豆蔻酰五肽-17。等。这些活性多肽的分子量与蛋白相比已经减少很多，有些还进行了疏水修饰，但由于皮肤表皮角质层的屏障作用，大部分的活性成分很难通过。因此，开发出能够将活性多肽类等具有抗氧化、抗衰老作用等的活性物质进行高效透皮传递的化妆品，具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品。本发明的包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品，是由疏水化修饰的多肽修饰的柔性脂质体包含活性多肽制成的。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的疏水化修饰的多肽为氮端疏水化修饰的多肽。其中，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述疏水化修饰的多肽修饰的柔性脂质体由以下主要成分的原料制成：按重量比计，卵磷脂:脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯80衍生物＝7:2-4，含有重量百分比为1-10％的疏水化修饰多肽，还含有活性多肽。其中，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，还含有抗氧化剂。所述的抗氧化剂包括：维生素c或其衍生物、维生素e或其衍生物或辅酶q中的至少一种。所述抗氧化剂的重量百分比为0.1-1％。其中，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的活性多肽为能在化妆品领域使用的活性多肽。所述能在化妆品领域使用的活性多肽为具有抗皱类、抗自由基类、促进细胞活性类、美白类、消肿类或促睫毛生长类中至少一种功能的活性多肽。具体包括铜胜肽、二肽-2、棕榈酰三肽、棕榈酰三肽-1、棕榈酰三肽-5、棕榈酰四肽-7、乙酰基四肽-5、乙酰基四肽-9、棕榈酰五肽-3、棕榈酰五肽-4、乙酰基六肽-8、乙酰基八肽、肉豆蔻酰五肽-17、肉豆蔻酰六肽-4、九肽-1、肌肽、l-肌肽或谷胱甘肽中的至少一种。进一步的，所述活性多肽的重量百分比为0.01～1％。具体的，所述多肽的组成如下所示：乙酰基六肽-8：ac-glu-glu-met-gln-arg-arg-nh2；乙酰基四肽-5：ac-beta-ala-his-ser-his-oh；棕榈酰五肽-4：pal(棕榈酸)-lys-thr-thr-lys-ser-oh；棕榈酰四肽-7：pal(棕榈酸)-gly-gln-pro-arg-oh；棕榈酰三肽-1：pal(棕榈酸)-gly-his-lys-oh；肉豆蔻酰五肽-17：myr-lys-leu-ala-lys-lys-nh2；肌肽：beta-ala-l-his；谷胱甘肽：nh2-glu-cys-gly-oh；九肽-1：met-pro-d-phe-arg-d-trp-phe-lys-pro-val-nh2。seqidno:2九肽-1的氨基酸序列mpfrwfkpv。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，由下述配比的成分制备而成：卵磷脂:脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯80衍生物＝7:3，含有重量百分比为0.5％的抗氧化剂，还含有重量百分比为2-10％的疏水化修饰多肽。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述疏水化修饰多肽中多肽的序列为为在seqidno:1基础上在c端连接nh2，并在多肽的氮末端偶联甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸。seqidno:1疏水化修饰多肽的氨基酸序列vqwrirvavirk。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的甾醇类化合物为胆固醇、丁二酰化胆固醇、胆酸或去氧胆酸中的至少一种。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述饱和直链脂肪酸为c6～c20中的至少一种。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述饱和直链脂肪酸为c8～c18中的至少一种。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的长链脂肪酸为硬脂酸、软脂酸、月桂酸或正辛酸中的至少一种。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述疏水化修饰多肽结构为：其中，所述的r为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的r为进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的抗皱类活性多肽为棕榈酰三肽、乙酰基六肽-8或乙酰基八肽中的至少一种。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的抗皱类多肽占脂质体体重量百分比为0.01～3％。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的抗皱类多肽占脂质体重量百分比为0.05～2％。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的抗皱类多肽占脂质体的重量百分比为0.1～1％。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的抗自由基类多肽为谷胱甘肽、棕榈酰四肽-7、肌肽或l-肌肽中的至少一种。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的抗自由基类多肽占脂质体体重量百分比为0.01～3％。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的抗自由基类多肽占脂质体重量百分比为0.05～2％。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的抗自由基类多肽占脂质体的重量百分比为0.1～1％。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的促进细胞活性类活性多肽为棕榈酰五肽-3、棕榈酰五肽-4、铜胜肽、棕榈酰三肽-1、棕榈酰三肽-5、乙酰基四肽-9或肉豆蔻酰六肽-4中的至少一种。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的促进细胞活性类活性多肽占脂质体体重量百分比为0.01～3％。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的促进细胞活性类活性多肽占脂质体重量百分比为0.05～2％。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的促进细胞活性类活性多肽占脂质体的重量百分比为0.1～1％。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的美白类活性多肽为九肽-1。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的消肿类活性多肽为乙酰基四肽-5或二肽-2。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的促睫毛生长类活性多肽为肉豆蔻酰五肽-17。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体化妆品，所述的美白、消肿、促睫毛生长类活性多肽占脂质体体重量百分比为0.01～3％。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体化妆品，所述的美白、消肿、促睫毛生长类活性多肽占脂质体体重量百分比为0.05～2％。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体化妆品，所述的美白、消肿、促睫毛生长类活性多肽占脂质体体重量百分比为0.1～1％。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的包含活性多肽的柔性脂质体化妆品还包括有与制备化妆品有关的乳化剂、助乳化剂、皮肤调理剂、增白剂、着色剂、保湿剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂、芳香剂、润肤剂、抗粉刺剂、成膜剂、增稠剂、ph调节剂、缓冲剂、稳定剂或紫外线吸收剂中的至少一种。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的包含活性多肽的柔性脂质体化妆品的剂型为水剂、乳剂、膏剂、胶冻状剂、锭状剂型或汽溶胶型剂型。进一步的，上述包含活性多肽的柔性脂质体的化妆品中，所述的包含活性多肽的柔性脂质体化妆品的剂型为乳液、精华液、面霜、面膜、冻干粉或洗面奶。本发明还提供了一种制备上述包含活性多肽的柔性脂质体化妆品的方法，包括以下步骤：a、称取卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯80衍生物、维生素e置于反应容器中，加入溶剂溶解，所述溶剂为氯仿与乙醇按1∶1-3组成的混合物或全部为乙醇；b、真空旋转蒸发得脂质体膜，干燥；c、在脂质体膜中加入dp7-c或pal-dp7和蒸馏水，进行超声水化得空白脂质体溶液；d、将活性多肽加入空白脂质体溶液中，轻微震荡，室温孵育30-60分钟，即得包含活性多肽的柔性脂质体。其中，上述制备包含活性多肽的柔性脂质体化妆品的方法中，还包括步骤e：将真空减压后的脂质体挤压通过0.1-0.45μm聚碳酸酯膜4～8次，得空白脂质体溶液。其中，上述制备包含活性多肽的柔性脂质体化妆品的方法中，还包括步骤f：按剂型要求，将柔性脂质体再添加制备化妆品有关的乳化剂、助乳化剂、皮肤调理剂、增白剂、着色剂、保湿剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂、芳香剂、润肤剂、抗粉刺剂、成膜剂、增稠剂、ph调节剂、缓冲剂、稳定剂或紫外线吸收剂中的至少一种制成化妆品剂型。本发明所述化妆品，是指以涂擦、喷洒或者其他类似的方法，散布于人体表面任何部位(皮肤、毛发、指甲、口唇等)，以达到清洁、消除不良气味、护肤、美容和修饰目的日用化学工业产品。柔性脂质体是在脂质体基础上经处方改进的一种自聚集泡囊，在脂质体的磷脂成分中加入表面活性物质如胆酸钠、聚山梨醇酯80或其衍生物等，使其类脂膜具有高度变形能力，亦称为传递体。由于传递体粒径比脂质体小，能穿过孔径为其本身1/10～1/5的小孔，透过速率和量几乎与纯水相当。本发明的柔性脂质体(传递体)的作用机理为：1、传递体粒径较脂质体更小，能快速穿透皮肤角质层，进入表皮和真皮，形成“储库”；2、包封在传递体内的皮肤活性成分和水分能缓慢释放出来，极大提高了活性物质的作用效果。3、该传递体携带被包封的皮肤活性多肽，如棕榈酰三肽或乙酰基六肽-3等可阻断面部神经传递肌肉收缩的信号，起到抗皱作用；或棕榈酰五肽-3、棕榈酰三肽-1或乙酰基四肽-9等可促进人体纤维细胞中胶原蛋白及氨基葡萄糖的合成，强化结缔组织，起到修复皮肤的作用；或棕榈酰四肽-7、肌肽等可抗自由基，起到抗炎和抗氧化的作用；或九肽-1等抑制黑色素细胞产生黑色素，起到美白的作用；或乙酰基四肽-5、二肽-2等消除水肿，起到祛眼袋的作用；或肉豆蔻酰五肽-17等激活人体角蛋白基因表达，促进睫毛生长。进一步地，将本发明含有活性多肽的传递体配以与化妆品配方有关的乳化剂、助乳化剂、皮肤调理剂、增白剂、着色剂、保湿剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂、芳香剂、润肤剂、抗粉刺剂、成膜剂、增稠剂、ph调节剂、缓冲剂、稳定剂、紫外线吸收剂等，根据本领域的技术，能够制备成水剂、乳液、精华液、面霜、面膜、冻干粉、洗面奶等剂型的化妆品。本发明各种产品可以用于人体面部(包括眼部)、颈部、手脚和全身皮肤。本发明的有益效果为：本发明在传统的脂质体基础上经处方改进提供了一种新型柔性脂质体，通过在脂质体的磷脂成分中加入表面活性物质如脱氧胆酸钠、聚山梨醇酯80或其衍生物等，使其类脂膜具有高度变形能力，同时加入能加强透皮效果的穿膜肽，提高其透皮渗透能力。发明人将上述传递体用于包裹活性多肽，利用其优良的透皮能力，制备成新型活性多肽透皮剂，并开发其在化妆品领域中的应用。本发明新型活性多肽透皮剂所用材料安全无毒，在抗皱、抗衰老、抗氧化、修复等方面显示很好的效果。此外，它具有生物膜的功能与特性，与人体细胞有很强的亲和性，在化妆品方面的功效独特，具有巨大的经济效益。初步的试验显示：该传递体携带被包封的活性多肽，如棕榈酰三肽或乙酰基六肽-3等可阻断面部神经传递肌肉收缩的信号，起到抗皱作用；包封棕榈酰五肽-3、棕榈酰三肽-1或乙酰基四肽-9等可促进人体纤维细胞中胶原蛋白及氨基葡萄糖的合成，强化结缔组织，起到修复皮肤的作用；包封棕榈酰四肽-7、肌肽等可抗自由基，起到抗炎和抗氧化的作用；或九肽-1等抑制黑色素细胞产生黑色素，起到美白的作用；或乙酰基四肽-5、二肽-2等消除水肿，起到祛眼袋的作用；或肉豆蔻酰五肽-17等激活人体角蛋白基因表达，促进睫毛生长。在技术水平上，本发明优势在于：本发明产品除具有市场上一般的抗哀老，保湿润，促柔软功能外，该品还将新型透皮技术应用于化妆品，具有更好的效果。附图说明图1为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含乙酰基六肽-8的dp7-c修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；图2为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含乙酰基六肽-8的pal-dp7修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；图3为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂含棕榈酰四肽-7的dp7-c修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；图4为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂含棕榈酰四肽-7的pal-dp7修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；图5为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂含棕榈酰五肽-4的dp7-c修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；图6为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂含棕榈酰五肽-4的pal-dp7修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；图7为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂含九肽-1的pal-dp7修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；图8为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂含九肽-1的dp7-c修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；图9为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂含乙酰基四肽-5的dp7-c修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；图10为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂含乙酰基四肽-5的pal-dp7修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；图11为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂含肉豆蔻酰五肽-17的＝dp7-c修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；图12为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂含肉豆蔻酰五肽-17的pal-dp7修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；图13为制备的含乙酰基六肽-8的dp7-c和pal-dp7修饰柔性脂质体的体外透皮效果；图14为制备的含棕榈酰四肽-7的dp7-c和pal-dp7修饰柔性脂质体的体外透皮效果；图15为制备的含棕榈酰五肽-4的dp7-c和pal-dp7修饰柔性脂质体的体外透皮效果；图16为制备的含九肽-1的dp7-c和pal-dp7修饰柔性脂质体的体外透皮效果；图17为制备的含乙酰基四肽-5的dp7-c和pal-dp7修饰柔性脂质体的体外透皮效果；图18为制备的含肉豆蔻酰五肽-17的dp7-c和pal-dp7修饰柔性脂质体的体外透皮效果。具体实施方式本发明中所述的疏水化修饰多肽dp7-c为抗菌肽dp7与胆固醇的偶联物，疏水化修饰多肽pal-dp7为抗菌肽dp7与软脂酸的偶联物，其合成方法参见专利cn107441501a中的合成方法，也可采用本领域的其它方法进行合成，实施例中所用的dp7-c和pal-dp7由成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成。本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。实施例1本发明含活性多肽的柔性脂质体的制备按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素e，分别用氯仿/乙醇或乙醇溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入适量乙酰基八肽-8或棕榈酰四肽或棕榈酰五肽或九肽-1或乙酰基四肽-5或肉豆蔻酰五肽-17等，室温孵化40分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即得本发明含活性多肽的柔性脂质体。试验例1-1包含乙酰基六肽-8的dp7-c修饰柔性脂质体的制备实验材料：大豆卵磷脂：购自lipoidgmbh公司；脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；聚山梨醇酯80：购自美国merck公司；疏水化修饰多肽dp7-c：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；乙酰基六肽-8：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；仪器：马尔文激光粒度检测仪zen3600。本试验例研究柔性脂质体采用dp7-c修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含乙酰基六肽-8的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8.7:1.3，疏水化修饰多肽dp7-c比例为55％，乙酰基六肽-8终浓度为50ppm，水化介质为水，水化时间30分钟。具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素e，分别用氯仿与乙醇按体积比1∶2组成的混合物溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽dp7-c，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入乙酰基六肽-8至终浓度为50ppm，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含乙酰基六肽-8的柔性脂质体1-1和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含乙酰基六肽-8的柔性脂质体1-2，其粒径分别为74.47nm和68.57nm左右，见表1，采用超速离心法测得产品的包封率分别为45.6％和52.65％。其中，以聚山梨醇酯80为表面活性剂、dp7-c修饰的柔性脂质体，其粒径图见图1。试验例1-2包含乙酰基六肽-8的pal-dp7修饰柔性脂质体的制备实验材料：大豆卵磷脂：购自lipoidgmbh公司；脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；聚山梨醇酯80：购自美国merck公司；疏水化修饰多肽pal-dp7：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；乙酰基六肽-8：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；仪器：马尔文激光粒度检测仪zen3600。本试验例研究柔性脂质体采用pal-dp7修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含乙酰基六肽-8的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80比例均为8.5:1.5，疏水化修饰多肽pal-dp7比例为6％，乙酰基六肽-8终浓度为50ppm，水化介质为水，水化时间30分钟。具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80维生素e，分别用氯仿与乙醇按体积比1∶2组成的混合物溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽pal-dp7，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入乙酰基六肽-8至终浓度为50ppm，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含乙酰基六肽-8的柔性脂质体1-3和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含乙酰基六肽-8的柔性脂质体1-4，其粒径分别为70.34nm和59.23nm左右，见表1，采用超速离心法测得产品的包封率分别为47.2％和55.17％。其中纳米粒径最小、包封率最好的为以聚山梨醇酯80为表面活性剂、pal-dp7修饰的柔性脂质体，其粒径图见图2。表1制备含乙酰基六肽-8的不同组成柔性脂质体的纳米表征情况试验例2包含棕榈酰四肽-7的柔性脂质体的制备根据以上的研究思路，同时制备了棕榈四肽-7的柔性脂质体。试验例2-1包含棕榈酰四肽-7的dp7-c修饰柔性脂质体的制备实验材料：大豆卵磷脂：购自lipoidgmbh公司；脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；聚山梨醇酯80：购自美国merck公司；疏水化修饰多肽dp7-c：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；棕榈酰四肽-7：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；仪器：马尔文激光粒度检测仪zen3600。本试验例研究柔性脂质体采用dp7-c修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含棕榈酰四肽-7的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8:2，疏水化修饰多肽dp7-c比例为5％，棕榈酰四肽-7终浓度为5ppm，水化介质为水，水化时间30分钟。具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素e，分别用氯仿与乙醇按体积比1∶2组成的混合物溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽dp7-c，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入棕榈酰四肽-7至终浓度为5ppm，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含棕榈酰四肽-7的柔性脂质体2-1和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含棕榈酰四肽-7的柔性脂质体2-2，其粒径分别为82.69nm和79.47nm左右，见表2，采用超速离心法测得产品的包封率分别为47.65％和48.1％。其中，以聚山梨醇酯80为表面活性剂、dp7-c修饰的柔性脂质体，其粒径图见图3。试验例2-2包含棕榈酰四肽-7的pal-dp7修饰柔性脂质体的制备实验材料：大豆卵磷脂：购自lipoidgmbh公司；脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；聚山梨醇酯80：购自美国merck公司；疏水化修饰多肽dp7-c：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；棕榈酰四肽-7：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；仪器：马尔文激光粒度检测仪zen3600。本试验例研究柔性脂质体采用pal-dp7修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含棕榈酰四肽-7的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8.5:1.5，疏水化修饰多肽pal-dp7比例为6％，棕榈酰四肽-7终浓度为5ppm，水化介质为水，水化时间30分钟。具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素e，分别用氯仿与乙醇按体积比1∶2组成的混合物溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽pal-dp7，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入棕榈酰四肽-7至终浓度为5ppm，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含棕榈酰四肽-7的柔性脂质体2-3和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含棕榈酰四肽-7的柔性脂质体2-4，其粒径分别为75.07nm和72.57nm左右，见表2，采用超速离心法测得产品的包封率分别为48.1％和49.27％。其中纳米粒径最小、包封率最好的为以聚山梨醇酯80为表面活性剂、pal-dp7修饰的柔性脂质体，其粒径图见图4。表2制备含棕榈酰四肽-7的不同组成柔性脂质体的纳米表征情况试验例3包含棕榈酰五肽-4的柔性脂质体的制备根据以上的研究思路，同时制备了棕榈五肽-4的柔性脂质体。试验例3-1包含棕榈酰五肽-4的dp7-c修饰柔性脂质体的制备实验材料：大豆卵磷脂：购自lipoidgmbh公司；脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；聚山梨醇酯80：购自美国merck公司；疏水化修饰多肽dp7-c：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；棕榈酰四肽-7：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；仪器：马尔文激光粒度检测仪zen3600。本试验例研究柔性脂质体采用dp7-c修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含棕榈酰五肽-4的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8.5:1.5，疏水化修饰多肽dp7-c比例为5％，棕榈酰五肽-4终浓度为10ppm，水化介质为水，水化时间30分钟。具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素e，分别用乙醇溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽dp7-c，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入棕榈酰五肽-4至终浓度为10ppm，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含棕榈酰五肽-4的柔性脂质体3-1和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含棕榈酰五肽-4的柔性脂质体3-2，其粒径分别为89.37nm和82.28nm左右，见表3，采用超速离心法测得产品的包封率分别为44.3％和47.12％。其中，以聚山梨醇酯80为表面活性剂、dp7-c修饰的柔性脂质体，其粒径图见图5。试验例3-2包含棕榈酰五肽-4的pal-dp7修饰柔性脂质体的制备实验材料：大豆卵磷脂：购自lipoidgmbh公司；脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；聚山梨醇酯80：购自美国merck公司；疏水化修饰多肽pal-dp7：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；棕榈酰四肽-7：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；仪器：马尔文激光粒度检测仪zen3600。本试验例研究柔性脂质体采用pal-dp7修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含棕榈酰五肽-4的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8:2，疏水化修饰多肽pal-dp7比例为6％，棕榈酰五肽-4终浓度为10ppm，水化介质为水，水化时间30分钟。具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素e，分别用乙醇溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽pal-dp7，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入棕榈酰五肽-4至终浓度为10ppm，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含棕榈酰五肽-4的柔性脂质体3-3和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含棕榈酰五肽-4的柔性脂质体3-4，其粒径分别为87.24nm和79.47nm左右，见表3，采用超速离心法测得产品的包封率分别为45.1％和48.72％。其中纳米粒径最小、包封率最好的为以聚山梨醇酯80为表面活性剂、pal-dp7修饰的柔性脂质体，其粒径图见图6。表3制备含棕榈酰五肽-4的不同组成柔性脂质体的纳米表征情况试验例4包含九肽-1的柔性脂质体的制备根据以上的研究思路，同时制备了九肽-1的柔性脂质体。试验例4-1包含九肽-1的dp7-c修饰柔性脂质体的制备实验材料：大豆卵磷脂：购自lipoidgmbh公司；脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；聚山梨醇酯80：购自美国merck公司；疏水化修饰多肽dp7-c：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；九肽-1：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；仪器：马尔文激光粒度检测仪zen3600。本试验例研究柔性脂质体采用dp7-c修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含九肽-1的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8.2:1.8，疏水化修饰多肽dp7-c比例为5％，九肽-1终浓度为50ppm，水化介质为水，水化时间30分钟。具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素e，分别用氯仿与乙醇按体积比1∶2组成的混合物溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽dp7-c，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入九肽-1至终浓度为50ppm，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含九肽-1的柔性脂质体4-1和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含九肽-1的柔性脂质体4-2，其粒径分别为69.26nm和64.94nm左右，见表4，采用超速离心法测得产品的包封率分别为52.3％和57.26％。其中，以聚山梨醇酯80为表面活性剂、dp7-c修饰的柔性脂质体，其粒径图见图7。试验例4-2包含九肽-1的pal-dp7修饰柔性脂质体的制备实验材料：大豆卵磷脂：购自lipoidgmbh公司；脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；聚山梨醇酯80：购自美国merck公司；疏水化修饰多肽pal-dp7：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；九肽-1：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；仪器：马尔文激光粒度检测仪zen3600。本试验例研究柔性脂质体采用pal-dp7修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含九肽-1的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8:2，疏水化修饰多肽pal-dp7比例为6％，九肽-1终浓度为50ppm，水化介质为水，水化时间30分钟。具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素e，分别用氯仿与乙醇按体积比1∶2组成的混合物溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽pal-dp7，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入九肽-1至终浓度为50ppm，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含九肽-1的柔性脂质体4-3和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含九肽-1的柔性脂质体4-4，其粒径分别为65.4nm和62.11nm左右，见表4，采用超速离心法测得产品的包封率分别为54.1％和59.34％。其中纳米粒径最小、包封率最好的为以聚山梨醇酯80为表面活性剂、pal-dp7修饰的柔性脂质体，其粒径图见图8。表4制备含九肽-1的不同组成柔性脂质体的纳米表征情况试验例5包含乙酰基四肽-5的柔性脂质体的制备根据以上的研究思路，同时制备了乙酰基四肽-5的柔性脂质体。试验例5-1包含乙酰基四肽-5的dp7-c修饰柔性脂质体的制备实验材料：大豆卵磷脂：购自lipoidgmbh公司；脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；聚山梨醇酯80：购自美国merck公司；疏水化修饰多肽dp7-c：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；乙酰基四肽-5：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；仪器：马尔文激光粒度检测仪zen3600。本试验例研究柔性脂质体采用dp7-c修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含乙酰基四肽-5的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8.5:1.5，疏水化修饰多肽dp7-c比例为5％，乙酰基四肽-5终浓度为100ppm，水化介质为水，水化时间30分钟。具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素e，分别用氯仿与乙醇按体积比1∶3组成的混合物溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽dp7-c，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入乙酰基四肽-5至终浓度为100ppm，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含乙酰基四肽-5的柔性脂质体5-1和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含乙酰基四肽-5的柔性脂质体5-2，其粒径分别为77.48nm和64.52nm左右，见表4，采用超速离心法测得产品的包封率分别为51.4％和53.6％。其中，以聚山梨醇酯80为表面活性剂、dp7-c修饰的柔性脂质体，其粒径图见图9。试验例5-2包含乙酰基四肽-5的pal-dp7修饰柔性脂质体的制备实验材料：大豆卵磷脂：购自lipoidgmbh公司；脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；聚山梨醇酯80：购自美国merck公司；疏水化修饰多肽pal-dp7：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；乙酰基四肽-5：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；仪器：马尔文激光粒度检测仪zen3600。本试验例研究柔性脂质体采用pal-dp7修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含乙酰基四肽-5的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8:2，疏水化修饰多肽pal-dp7比例为6％，乙酰基四肽-5终浓度为100ppm，水化介质为水，水化时间30分钟。具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素e，分别用氯仿与乙醇按体积比1∶3组成的混合物溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽pal-dp7，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入乙酰基四肽-5至终浓度为100ppm，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含乙酰基四肽-5的柔性脂质体5-3和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含乙酰基四肽-5的柔性脂质体5-4，其粒径分别为66.9nm和64.12nm左右，见表5，采用超速离心法测得产品的包封率分别为53.2％和56.5％。其中纳米粒径最小、包封率最好的为以聚山梨醇酯80为表面活性剂、pal-dp7修饰的柔性脂质体，其粒径图见图10。表5制备含乙酰基四肽-5的不同组成柔性脂质体的纳米表征情况试验例6包含肉豆蔻酰五肽-17的柔性脂质体的制备根据以上的研究思路，同时制备了肉豆蔻酰五肽-17的柔性脂质体。试验例6-1包含肉豆蔻酰五肽-17的dp7-c修饰柔性脂质体的制备实验材料：大豆卵磷脂：购自lipoidgmbh公司；脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；聚山梨醇酯80：购自美国merck公司；疏水化修饰多肽dp7-c：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；肉豆蔻酰五肽-17：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；仪器：马尔文激光粒度检测仪zen3600。本试验例研究柔性脂质体采用dp7-c修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含肉豆蔻酰五肽-17的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8.5:1.5，疏水化修饰多肽dp7-c比例为5％，肉豆蔻酰五肽-17终浓度为200ppm，水化介质为水，水化时间30分钟。具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素e，分别用氯仿与乙醇按体积比1∶1组成的混合物溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽dp7-c，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入肉豆蔻酰五肽-17至终浓度为200ppm，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含肉豆蔻酰五肽-17的柔性脂质体6-1和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含肉豆蔻酰五肽-17的柔性脂质体6-2，其粒径分别为131.4nm和120.4nm左右，见表4，采用超速离心法测得产品的包封率分别为47.4％和51.16％。其中，以聚山梨醇酯80为表面活性剂、dp7-c修饰的柔性脂质体，其粒径图见图11。试验例6-2包含肉豆蔻酰五肽-17的pal-dp7修饰柔性脂质体的制备实验材料：大豆卵磷脂：购自lipoidgmbh公司；脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；聚山梨醇酯80：购自美国merck公司；疏水化修饰多肽pal-dp7：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；肉豆蔻酰五肽-17：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；仪器：马尔文激光粒度检测仪zen3600。本试验例研究柔性脂质体采用pal-dp7修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含肉豆蔻酰五肽-17的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8:2，疏水化修饰多肽pal-dp7比例为6％，肉豆蔻酰五肽-17终浓度为200ppm，水化介质为水，水化时间30分钟。具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素e，分别用氯仿与乙醇按体积比1∶1组成的混合物溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽pal-dp7，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入肉豆蔻酰五肽-17至终浓度为200ppm，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含肉豆蔻酰五肽-17的柔性脂质体6-3和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含肉豆蔻酰五肽-17的柔性脂质体6-4，其粒径分别为121.4nm和114.1nm左右，见表6，采用超速离心法测得产品的包封率分别为49.2％和54.1％。其中纳米粒径最小、包封率最好的为以聚山梨醇酯80为表面活性剂、pal-dp7修饰的柔性脂质体，其粒径图见图12。表6制备含肉豆蔻酰五肽-17的不同组成柔性脂质体的纳米表征情况实施例2本发明含活性多肽的柔性脂质体的透皮效果验证体外透皮实验采用改良的单室franz扩散池，以小鼠皮肤作为体外透皮实验皮肤，对不同的含活性多肽柔性脂质体的透皮吸收结果进行对比，分别在不同时间点取样，通过hplc方法测定透皮接收液中药物的浓度，计算累积透皮量。试验例2-1包含乙酰基六肽-8的柔性脂质体的透皮效果验证1、材料样品：试验例1制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂、pal-dp7修饰的含乙酰基六肽-8的柔性脂质体冻干粉(1-1，1-2，1-3，1-4)以及未经dp7-c或pal-dp7修饰的包含乙酰基六肽-8的柔性脂质体作为普通柔性脂质体对照；仪器：药物透皮试验扩散仪(上海黄海药检，型号ryj-6b)；hplc(agilent，型号1260)；色谱柱：zorbax300sb-c18；材料：剥离后的小鼠皮肤。2、方法2.1按透皮试验扩散仪的使用说明进行待试样品的透皮实验，同时设置一个上方只加缓冲液的空白对照，分别于试验的0hr、1hr、2hr、4hr、8hr收获接收池里的样品。2.2hplc检测：紫外检测波长：220nm；流动相：a液：100％acn+0.1％tfa；b液：100％h2o+0.1％tfa；试验条件见下表7：表7hplc检测条件表时间(min)a液b液043％57％2063％37％20.543％57％2743％57％3、结果分别将乙酰基六肽-8的多肽作为标准品和样品进行hplc测定，根据乙酰基六肽-8标准品峰面积建立标准曲线，将待测样品的峰面积代入公式，计算出样品的累计透皮量，见图13。结果表明，随着时间的延长，透过小鼠皮肤的乙酰基六肽-8量逐步增加，与未经修饰的柔性脂质体相比，dp7-c和pal-dp7修饰的柔性脂质体均具有更好的透皮性能。试验例2-2包含棕榈酰四肽-7的柔性脂质体的透皮效果验证1、材料样品：试验例2制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂、pal-dp7修饰的含棕榈酰四肽-7的柔性脂质体冻干粉(2-1，2-2，2-3，2-4)以及未经dp7-c或pal-dp7修饰的包含棕榈酰四肽-7的柔性脂质体作为普通柔性脂质体对照；仪器：药物透皮试验扩散仪(上海黄海药检，型号ryj-6b)；hplc(agilent，型号1260)；色谱柱：zorbax300sb-c18；材料：剥离后的小鼠皮肤。2、方法2.1按透皮试验扩散仪的使用说明进行待试样品的透皮实验，同时设置一个上方只加缓冲液的空白对照，分别于试验的0hr、1hr、2hr、4hr、8hr收获接收池里的样品。2.2hplc检测：紫外检测波长：220nm；流动相：a液：100％acn+0.1％tfa；b液：100％h2o+0.1％tfa；试验条件见下表8：表8hplc检测条件表时间(min)a液b液050％50％2575％25％25.01100％030100％030.0150％50％3550％50％3、结果分别将棕榈酰四肽-7的多肽作为标准品和样品进行hplc测定，根据棕榈酰四肽-7标准品峰面积建立标准曲线，将待测样品的峰面积代入公式，计算出样品的累计透皮量，见图14。结果表明，随着时间的延长，透过小鼠皮肤的棕榈酰四肽-7量逐步增加，与未经修饰的柔性脂质体相比，dp7-c和pal-dp7修饰的柔性脂质体均具有更好的透皮性能。试验例2-3包含棕榈酰五肽-4的柔性脂质体的透皮效果验证1、材料样品：试验例3制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂、pal-dp7修饰的含棕榈酰五肽-4的柔性脂质体冻干粉(3-1，3-2，3-3，3-4)以及未经dp7-c或pal-dp7修饰的包含棕榈酰五肽-4的柔性脂质体作为普通柔性脂质体对照；仪器：药物透皮试验扩散仪(上海黄海药检，型号ryj-6b)；hplc(agilent，型号1260)；色谱柱：zorbax300sb-c18；材料：剥离后的小鼠皮肤。2、方法2.1按透皮试验扩散仪的使用说明进行待试样品的透皮实验，同时设置一个上方只加缓冲液的空白对照，分别于试验的0hr、1hr、2hr、4hr、8hr收获接收池里的样品。2.2hplc检测：紫外检测波长：220nm；流动相：a液：100％acn+0.1％tfa；b液：100％h2o+0.1％tfa；试验条件见下表9：表9hplc检测条件表时间(min)a液b液050％50％2575％25％25.01100％030100％030.0150％50％3550％50％3、结果分别将棕榈酰五肽-4的多肽作为标准品和样品进行hplc测定，根据棕榈酰五肽-4标准品峰面积建立标准曲线，将待测样品的峰面积代入公式，计算出样品的累计透皮量，见图15。结果表明，随着时间的延长，透过小鼠皮肤的棕榈酰五肽-4量逐步增加，与未经修饰的柔性脂质体相比，dp7-c和pal-dp7修饰的柔性脂质体均具有更好的透皮性能。试验例2-4包含九肽-1的柔性脂质体的透皮效果验证1、材料样品：试验例4制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂、pal-dp7修饰的含九肽-1的柔性脂质体冻干粉(4-1，4-2，4-3，4-4)以及未经dp7-c或pal-dp7修饰的包含九肽-1的柔性脂质体作为普通柔性脂质体对照；仪器：药物透皮试验扩散仪(上海黄海药检，型号ryj-6b)；hplc(agilent，型号1260)；色谱柱：zorbax300sb-c18；材料：剥离后的小鼠皮肤。2、方法2.1按透皮试验扩散仪的使用说明进行待试样品的透皮实验，同时设置一个上方只加缓冲液的空白对照，分别于试验的0hr、1hr、2hr、4hr、8hr收获接收池里的样品。2.2hplc检测：紫外检测波长：220nm；流动相：a液：100％acn+0.1％tfa；b液：100％h2o+0.1％tfa；试验条件见下表10：表10hplc检测条件表3、结果分别将九肽-1的多肽作为标准品和样品进行hplc测定，根据九肽-1标准品峰面积建立标准曲线，将待测样品的峰面积代入公式，计算出样品的累计透皮量，见图16。结果表明，随着时间的延长，透过小鼠皮肤的九肽-1量逐步增加，与未经修饰的柔性脂质体相比，dp7-c和pal-dp7修饰的柔性脂质体均具有更好的透皮性能。试验例2-5包含乙酰基四肽-5的柔性脂质体的透皮效果验证1、材料样品：试验例5制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂、pal-dp7修饰的含乙酰基四肽-5的柔性脂质体冻干粉(5-1，5-2，5-3，5-4)以及未经dp7-c或pal-dp7修饰的包含乙酰基四肽-5的柔性脂质体作为普通柔性脂质体对照；仪器：药物透皮试验扩散仪(上海黄海药检，型号ryj-6b)；hplc(agilent，型号1260)；色谱柱：zorbax300sb-c18；材料：剥离后的小鼠皮肤。2、方法2.1按透皮试验扩散仪的使用说明进行待试样品的透皮实验，同时设置一个上方只加缓冲液的空白对照，分别于试验的0hr、1hr、2hr、4hr、8hr收获接收池里的样品。2.2hplc检测：紫外检测波长：220nm；流动相：a液：100％acn+0.1％tfa；b液：100％h2o+0.1％tfa；试验条件见下表11：表11hplc检测条件表时间(min)a液b液043％57％2063％37％20.543％57％2743％57％3、结果分别将乙酰基四肽-5的多肽作为标准品和样品进行hplc测定，根据乙酰基四肽-5标准品峰面积建立标准曲线，将待测样品的峰面积代入公式，计算出样品的累计透皮量，见图17。结果表明，随着时间的延长，透过小鼠皮肤的乙酰基四肽-5量逐步增加，与未经修饰的柔性脂质体相比，dp7-c和pal-dp7修饰的柔性脂质体均具有更好的透皮性能。试验例2-6包含肉豆蔻酰五肽-17的柔性脂质体的透皮效果验证1、材料样品：试验例6制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂、pal-dp7修饰的含肉豆蔻酰五肽-17的柔性脂质体冻干粉(6-1，6-2，6-3，6-4)以及未经dp7-c或pal-dp7修饰的包含肉豆蔻酰五肽-17的柔性脂质体作为普通柔性脂质体对照；仪器：药物透皮试验扩散仪(上海黄海药检，型号ryj-6b)；hplc(agilent，型号1260)；色谱柱：zorbax300sb-c18；材料：剥离后的小鼠皮肤。2、方法2.1按透皮试验扩散仪的使用说明进行待试样品的透皮实验，同时设置一个上方只加缓冲液的空白对照，分别于试验的0hr、1hr、2hr、4hr、8hr收获接收池里的样品。2.2hplc检测：紫外检测波长：220nm；流动相：a液：100％acn+0.1％tfa；b液：100％h2o+0.1％tfa；试验条件见下表12：表12hplc检测条件表时间(min)a液b液043％57％2063％37％20.543％57％2743％57％3、结果分别将肉豆蔻基五肽-4的多肽作为标准品和样品进行hplc测定，根据肉豆蔻基五肽-4标准品峰面积建立标准曲线，将待测样品的峰面积代入公式，计算出样品的累计透皮量，见图18。结果表明，随着时间的延长，透过小鼠皮肤的乙酰基五肽-4量逐步增加，与未经修饰的柔性脂质体相比，dp7-c和pal-dp7修饰的柔性脂质体均具有更好的透皮性能。实施例3本发明含活性多肽的柔性脂质体冻干粉的稳定性研究将实施例1制备的含活性多肽的柔性脂质体冻干粉进行稳定性研究(包括加速试验和长期试验等三方面)。将样品置于37℃药品稳定性试验箱进行加速试验，分别放置1、2、3、6个月，测定冻干粉的性状，包括颜色、含量和溶解性，结果见表13。再将样品置于25℃药品稳定性试验箱进行长期试验，分别放置3、6、9、12、15、18、21、24个月，分别检测冻干粉的颜色、hplc含量和溶解性，结果见表14。表13含活性多肽的柔性脂质体冻干粉的稳定性加速试验(37℃)表14含活性多肽的柔性脂质体冻干粉的稳定性长期试验(25℃)结果表明，冻干粉在加速试验的前3个月保持了样品的性状和活性，第6个月活性有所下降，应尽量避免高温存放。而冻干粉在25℃的长期试验中保持了较好的性状和活性，能保证2年存放活性不丢失。实施例4本发明含活性多肽的柔性脂质体的精华素的制备本发明含活性多肽的柔性脂质体可以用溶媒配制成精华素使用。溶媒的配方为：透明质酸0.3％，尿囊素0.1％，胶原蛋白0.5％，edta0.1％，多种维生素0.15％。上述配方无菌分装成10～30ml瓶装溶媒。使用时，1瓶冻干的柔性脂质体用1瓶溶媒进行溶解，得到精华素，在早晚洁面后直接涂抹于脸上。试验例4-1含乙酰基六肽-8的柔性脂质体的精华素的使用效果验证：实验对象：年龄段在40-60岁的志愿者108人；实验方法：志愿者随机分为两组，一组为实施例4制备的含乙酰基六肽-8的柔性脂质体的精华素，另一组为不含柔性脂质体的溶媒。每日早晚洁面后，分别将两组精华素涂于脸部，轻轻按摩至吸收，不再涂抹其他护肤品。试用周期2-6周，试用后填写使用效果统计表，主要指标包括皮肤护理、去除细纹等功能。实验结果：该精华素在全国各地，如成都、西昌、西藏、重庆、武汉、海南、深圳等试用108人次，试用效果评价较好(详见表15)，同时未出现1例过敏症状，表明该精华素的安全性良好。表15本发明含乙酰基六肽-8的柔性脂质体的精华素使用结果项目试用人数使用时间(周)效果明显(％)效果不明显(％)皮肤护理1082-68218去除皱纹1084-68812由上述结果可知：本发明含乙酰基六肽-8的柔性脂质体可以在化妆品上应用，其透皮效率高，效果好，制备的化妆品在护理、抗皱面都显示了好的效果，具有广阔的应用前景。试验例4-2含棕榈酰四肽-7的柔性脂质体的精华素的使用效果验证：实验对象：年龄段在40-60岁的志愿者188人；实验方法：志愿者随机分为两组，一组为实施例4制备的含棕榈酰四肽-7的柔性脂质体的精华素，另一组为不含柔性脂质体的溶媒。每日早晚洁面后，分别将两组精华素涂于脸部，轻轻按摩至吸收，不再涂抹其他护肤品。试用周期2-6周，试用后填写使用效果统计表，主要指标包括皮肤护理、去除细纹等功能。实验结果：该精华素在全国各地，如成都、西昌、西藏、重庆、武汉、海南、深圳等试用近200人次，试用效果评价较好(详见表16)，同时未出现1例过敏症状，表明该精华素的安全性良好。表16本发明含棕榈酰四肽-7的柔性脂质体的精华素使用结果由上述结果可知：本发明含棕榈酰四肽-7的柔性脂质体可以在化妆品上应用，其透皮效率高，效果好，制备的化妆品在抗自由基、抗氧化方面表现出众，祛痘消斑、晒伤修复和抗敏方面都显示了好的效果，具有广阔的应用前景。试验例4-3含棕榈酰五肽-4的柔性脂质体的精华素的使用效果验证：实验对象：年龄段在40-60岁的志愿者90人；实验方法：志愿者随机分为两组，一组为实施例4制备的含棕榈酰五肽-4的柔性脂质体的精华素，另一组为不含柔性脂质体的溶媒。每日早晚洁面后，分别将两组精华素涂于脸部，轻轻按摩至吸收，不再涂抹其他护肤品。试用周期2-6周，试用后填写使用效果统计表，主要指标包括皮肤护理、去除细纹、弹性光滑等功能。实验结果：该精华素在全国各地，如成都、西昌、西藏、重庆、武汉、海南、深圳等试用近100人次，试用效果评价较好(详见表17)，同时未出现1例过敏症状，表明该精华素的安全性良好。表17本发明含棕榈酰五肽-4的柔性脂质体的精华素使用结果项目试用人数使用时间(周)效果明显(％)效果不明显(％)皮肤护理902-6928去除皱纹904-68416弹性光滑902-69010由上述结果可知：本发明含棕榈酰五肽-4的柔性脂质体可以在化妆品上应用，其透皮效率高，效果好，制备的化妆品在皮肤护理、抗皱、弹性光滑方面都显示了好的效果，具有广阔的应用前景。试验例4-4含九肽-1的柔性脂质体的精华素的使用效果验证：实验对象：年龄段在20-40岁的志愿者80人；实验方法：志愿者随机分为两组，一组为实施例4制备的含九肽-1的柔性脂质体的精华素，另一组为不含柔性脂质体的溶媒。每日早晚洁面后，分别将两组精华素涂于脸部，轻轻按摩至吸收，不再涂抹其他护肤品。试用周期4-8周，试用后填写使用效果统计表，主要指标包括皮肤护理、美白、祛斑等功能。实验结果：该精华素在全国各地，如成都、西昌、西藏、重庆、武汉、海南、深圳等试用近100人次，试用效果评价较好(详见表18)，同时未出现1例过敏症状，表明该精华素的安全性良好。表18本发明含九肽-1的柔性脂质体的精华素使用结果项目试用人数使用时间(周)效果明显(％)效果不明显(％)皮肤护理804-88515美白804-88812祛斑304-88020由上述结果可知：本发明含九肽-1的柔性脂质体可以在化妆品上应用，其透皮效率高，效果好，制备的化妆品在美白、祛斑方面都显示了好的效果，具有广阔的应用前景。序列表<110>深圳高尚科美生物科技有限公司<120>包含活性多肽的柔性脂质体化妆品及其制备方法<130>a190061k<141>2019-01-30<150>201810150521.3<151>2018-02-13<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>12<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1valglntrpargileargvalalavalilearglys1510<210>2<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2metpropheargtrpphelysproval15当前第1页12