梓醇在制备降低核苷类药物所产生的线粒体毒性的药物中的应用的制作方法

技术领域：

本发明主要涉及梓醇在制备降低核苷类药物所产生的线粒体毒性的药物中的应用，特别是在制备降低核苷类药物对肝脏产生的线粒体毒性的药物中的应用。

背景技术：
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梓醇是一种环烯醚萜葡萄糖苷类化合物，具有抗癌、神经保护、抗炎、缓泻、利尿、降血糖等多种药理活性。此外，有研究表明在暂时缺血情况下，梓醇有显著的神经保护功能，并发现梓醇能激活脑神经元，可以治疗因外伤、代谢障碍、脑缺血和帕金森氏病等引起的脑神经性疾病。

核苷类药物是临床用于治疗艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙肝病毒、疱疹病毒等感染性疾病以及肿瘤的主要药物。在目前使用的抗病毒药物中近50％是核苷类药物。扎西他滨、阿糖胞苷(cytarabine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)等抗肿瘤药都属于核苷类药物。目前核苷类药物的主要应用领域主要包括：

1.抗病毒药物

核苷类抗病毒药物品种繁多，结构多样，其抗病毒的机制是破坏病毒转录，干扰或终止病毒核酸的合成，目前主要应用于抗疱疹病毒、hiv、hbv、流感和呼吸系统病毒等dna和rna病毒的感染性治疗。

2.抗肿瘤药物

目前用于临床和正在研究的核苷类抗肿瘤药物有数十种，例如阿糖胞苷、去氧氟尿苷等，它们的主要作用是干扰肿瘤的dna合成，或者影响核酸的转录过程，抑制蛋白质的合成，从而达到治疗肿瘤的效果。

3.抗真菌类药物

具有这方面作用的核苷类化合物已经有多种用于临床应用，例如灰黄霉素、5氟胞嘧啶，其中有部分产品对多种真菌具有抑制作用，而且对哺乳动物几乎无毒性。

4.抗抑郁药物

核苷类药物，比如依非韦伦、帕罗西汀、依非韦伦等可以用于治疗神经系统疾病，有非常强的抗抑郁作用，有的药物同时可以用作治疗关节疾病的镇痛剂，对脑血管功能障碍也有效。

然而，随着核苷类似物的长期和广泛应用，不良反应已不限于病毒变异和停药反弹发生的急性肝衰竭，还可以发生与线粒体毒性相关的肌病、周围神经病、急性胰腺炎、高乳酸血症、乳酸性酸中毒、肾脏损害和横纹肌溶解症等，严重者可致死。目前已被批准进入市场的核苷类药物有拉米夫定、阿德福韦酯(贺维力)、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦、阿昔洛韦、利巴韦林、扎西他滨，长期服用都可有轻重不等的不良反应。这些不良反应包括上呼吸道感染样症状：头痛、恶心、身体不适，全身无力；胃肠道反应：轻至中度的胃肠道不适，常见的有腹泻、腹痛、食欲减退、恶心、呕吐、胃肠胀气、胰腺炎；代谢系统症状：低磷酸盐血症(1％发生率)；脂肪蓄积和重新分布：包括向心性肥胖、水牛背、末梢消瘦、乳房增大、库兴综合征，以及可能引起乳酸中毒、与脂肪变性相关的肝肿大等；皮肤症状：药疹。

上述核苷类药物的作用机理，主要是通过抑制病毒dna聚合酶的活性导致病毒dna或rna链的终止，但同时由于病毒dna聚合酶与人细胞核dna聚合酶β、抑制线粒体dna(mtdna)聚合酶γ之间的相似性，上述药物在抑制病毒的同时也会造成患者体内核dna缺陷或者细胞内线粒体mtdna降低，从而出现一些与线粒体损伤相关的不良反应，如肝毒性、中毒性肾损伤、肌病、乳酸酸中毒、周围神经病等。

本发明申请人通过大量实验和研究，发明了梓醇在用于制备降低核苷类药物所产生的线粒体毒性的药物中的应用，特别是在用于制备降低核苷类药物对肝脏产生的线粒体毒性的药物中的应用。

技术实现要素：
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本发明的目的在于梓醇用于制备降低核苷类药物所产生的线粒体毒性的药物中的应用，特别是在用于制备降低核苷类药物对肝脏产生的线粒体毒性的药物中的应用。

具体而言，本发明申请人通过大量药理实验和研究分析，在现有技术的基础上发明了梓醇在用于制备降低核苷类药物所产生的线粒体毒性的药物中的应用，特别是在用于制备降低核苷类药物对肝脏产生的线粒体毒性的药物中的应用。

具体地说，本发明是通过如下技术方案实现的。

以已上市的核苷类药物扎西他滨(ddc)作对照，在hepg2细胞模型中对中药梓醇的线粒体毒性进行评价。

一、实验材料

1.1受试药物梓醇

分子式：c11h15n5o3

分子量：265.27

名称：梓醇

批号：20161126

含量与性状：白色粉末，99.5％

提供单位：青海央宗药业有限公司

溶解性：～1g/100ml(水)at17℃。

配制方法与保存条件：溶剂dmso(sigma)；母液浓度100mm；-20℃保存；临用时用培养基稀释至所需浓度。

1.2阳性药物

扎西他滨(ddc)

名称：扎西他滨(2′，3′-dideoxycytidine)

分子量：211.22

含量与性状：白色粉末

溶解性：～1g/100ml(水)at17℃。

生产单位：tokyochemicalindustryco.，ltd.

配制方法与保存条件：溶剂dmso(sigma)；母液浓度1m；-20℃保存；临用时用培养基稀释至所需浓度。

扎西他滨临床主要用于不能耐受拉米夫定治疗的艾滋病及艾滋病相关综合征患者，与拉米夫定合用对hiv有相加或协同作用，并可阻止耐药病毒株的出现及减少毒性反应。其不良反应主要是周围感觉神经病变，以双足刺灼痛为突出症状，半数患者并累及双手。神经系统反应轻重程度与剂量大小有关，剂量越大、发生越早，病情越重，恢复越慢。其他不良反应有皮疹、发热、踝、唇水肿。本品无明显血液系毒性，偶有血小板或中性粒细胞下降。

1.3细胞模型

细胞株：人肝癌hepg2细胞株，购自武汉大学典型培养物收藏中心(批号：cctcc，gdc024)，订购日期2008年6月10日。

1.4细胞培养基及其相关试剂

低糖mem培养基，购自hyclone；新生胎牛血清，购自bi公司(以色列)；trypsin1∶250，购自merk(批号t0012-25g)；dmso购自sigma(批号038k0710)。

1.5药物浓度设置

梓醇细胞毒浓度200μm，100μm，50μm，25μm，12.5μm；ddc50μm。

二.实验内容

2.1细胞增殖抑制试验

取处于对数生长期的hepg2细胞，按1万每孔，接种于一次性96孔细胞培养板(corning)中进行培养，于24小时后加入不同浓度的药物，放入37℃、5％co2培养箱内培养，药物处理5天后，加入20μlmtt(噻唑蓝)作用处理4小时，然后弃去上清，加入适量dmso检测各孔的od值，根据对照比较统计各药物浓度组细胞生长百分比。结果显示梓醇在200μm，100μm，50μm，25μm，12.5μm等5个浓度均无明显细胞毒性，ic50(半数抑制浓度)＞200μm。

2.2乳酸产生水平的影响

取处于对数生长期的hepg2细胞，按10万每孔，接种于一次性6孔细胞培养板中进行培养，加入不同浓度的药物，放入37℃、5％co2培养箱内培养15天，每3天换液一次，于第15天后收集细胞上清，直接用乳酸测定试剂盒进行测定。结果见说明书附图中的图1(梓醇对ddc诱导线粒体毒性所致乳酸分泌的影响(*p＜0.05))。从图1可以看出，与对照相比较，阳性药ddc50μm能显著促进hepg2细胞乳酸水平的升高(p＜0.01)；而受试药梓醇50μm无此作用。梓醇与ddc联合给药细胞上清乳酸水平与正常对照组基本相当，表明梓醇可显著降低ddc诱导线粒体毒性所致乳酸含量的增加。

2.3mtdna含量的比较

取处于对数生长期的hepg2细胞，按10万每孔，接种于一次性6孔细胞培养板中进行培养，加入不同浓度的药物，放入37℃、5％co2培养箱内培养15天，每3天换液一次，于第15天后收集细胞，按qiagen的细胞组织dna提取试剂盒进行细胞总dna提取。对提取的dna在核酸蛋白测定仪上进行定量，然后置-70℃冰箱冻存。采用荧光定量pcr对mtdna与核dna进行定量，比较两者之比值的差异。结果见说明书附图中的图2(梓醇对细胞线粒体mtdna的影响)和图3(梓醇对ddc降低线粒体mtdna的影响(*p＜0.05，**p＜0.01))。从图2可以看出，受试药梓醇各给药组(12.5-200μm)作用处理15天后细胞内线粒体dna(mtdna)的含量与空白对照组基本相当，而阳性药ddc50μm给药组mtdna含量显著降低，与空白对照组存在极显著差异(p＜0.001)。以上结果表明梓醇本身对线粒体mtdna含量无明显影响。

梓醇与ddc联合给药对mtdna影响的结果见图3。从图3可以看出，与ddc单独给药组相比，梓醇与ddc联合给药组mtdna的含量显著上升，与ddc单独给药组存在统计学差异(p＜0.01)。

三、结论：

在hepg2细胞模型中，以扎西他滨(ddc)为阳性药，从细胞增殖抑制试验、细胞上清乳酸水平，线粒体mtdna含量等3个方面对受试药梓醇降低核苷类药物的线粒体毒性的作用进行了研究。

试验结果表明，在受试药梓醇200μm高剂量条件下，与对照组相比，对细胞增殖以及细胞上清乳酸水平影响不明显，表明梓醇在200μm高剂量条件下无线粒体毒性。而同期比较的阳性药ddc50μm，在上述检测指标中表现出明显的线粒体毒性。梓醇与ddc联合给药后，可显著降低ddc诱导线粒体毒性所致的乳酸水平，可有效抑制ddc降低细胞mtdna含量的作用。综上所述，以上体外试验结果表明受试药梓醇具有降低核苷类药物线粒体毒性的作用。

同时，需要注意的是，对本领域技术人员而言，在梓醇降低线粒体毒性的功效的实验中，扎西他滨只是一个阳性工具药，不能狭隘的理解为梓醇仅只对扎西他滨导致的线粒体毒性有效，而是对核苷类药物的功效作用。

综上，发明人通过大量的实验研究和分析得出梓醇对于降低核苷类药物导致的线粒体毒性具有显著降低效果。梓醇在用于制备降低核苷类药物所产生的线粒体毒性的药物，特别是在用于制备降低核苷类药物对肝脏产生的线粒体毒性的药物时，可按照药剂学上常规的制剂方法制成临床治疗可接受的剂型，包括片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、口服液、贴剂等等。