桑树叶水提物粉末,其制备,抗血栓作用及应用的制作方法

本发明涉及一种制备鲜桑树叶水提物粉末的方法,涉及由该方法制得的鲜桑树叶水提物粉末在制备抗静脉血栓和抗动脉血栓药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术：
：静脉栓塞已成为目前发病率高和死亡率高的疾病之一。后果最严重的静脉血栓主要是脑部静脉血栓和下肢深静脉血栓。脑部静脉血栓源自硬脑膜静脉窦道血栓形成和/或者脑部静脉纹理血栓形成,进而导致脑部静脉堵塞,颅压升高,脑部缺血或颅内出血。脑部静脉栓塞的标准治疗策略是口服抗凝剂。上/下肢深静脉血栓和肺部栓塞的发病率是0.1-0.2％。上/下肢深静脉血栓和肺部栓塞享有类似的风险因子。虽然肺部栓塞是上/下肢深静脉血栓的普遍并发症,但是肺部栓塞不容易诊断。因为肺部栓塞没有特征的临床信号。研究20年间超过4200万死亡者的身体状况发现,他们之中大约1.5％患肺部血栓。肺部栓塞是20万死亡者的死因。另一项研究发现,在血管造影确认的上/下肢深静脉血栓患者中也有50％以上肺部栓塞患者。上/下肢深静脉血栓可波及老年人,青年人及儿童。大量临床研究证明,肿瘤患者普遍并发上/下肢深静脉血栓,接受人工心脏瓣膜手术,静脉瘘手术和其他手术,以及器官移植手术的患者都面临静脉血栓风险。此外,静脉插管及缺血性中风则使得儿童静脉血栓病例日益增加。因为病因不同,所以在传统观念下静脉血栓和动脉血栓被看作两种不同的疾病。最近的流行病学研究表明,静脉血栓和动脉血栓之间的关联性难以割断。这种状况可以归结于它们的风险因子相互重叠。这样一来,静脉血栓的预防和治疗便越来越受到重视。直接口服抗凝是静脉血栓和动脉血栓临床治疗的唯一策略。尽管口服抗凝剂对静脉血栓的疗效确切,但是都有出血副作用。例如在有效的口服剂量下,阿司匹林可诱发消化道出血或颅内出血。这种风险大幅度限制了患者的受益面。临床需要疗效可与阿司匹林媲美,又没有阿司匹林样消化道出血或颅内出血风险的药物。针对这个临床需求,国内外研究人员付出了大量心血。可是,一直取得没有实质性进展。桑树叶通常在春季枝叶茂盛时采摘,晒干或新鲜食用。例如晒干的桑树叶可以泡茶,鲜嫩的桑树叶可以炖汤或凉拌。民间认为桑树叶具有疏散风热,清肺润燥及清肝明目功效。发明人长期从事鲜桑树叶水提物粉末的化学成分及治疗作用研究。发明人对鲜桑树叶水提物粉末的化学组分进行质谱分析,发现了23种未见报道的组分,主要包括桂皮酰奎尼酸和多取代懈皮素。虽然报道过鲜桑树叶水提物粉末单一组分的生物活性,但是全组分联合的生物活性并不知情。通过反复研究发明人发现,这23种组分联合可治疗静脉血栓和动脉血栓症。与所有桑树叶的已知发明相比,本发明的鲜桑树叶水提物粉末可治疗静脉血栓和动脉血栓症的发明达到了一个全新高度。根据这些认识,发明人提出了本发明。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种制备鲜桑树叶水提物粉末的方法以及由该方法制备得到的鲜桑树叶水提物粉末,实验证明,由本发明制备得到的鲜桑树叶水提物粉末具有抗静脉血栓和抗动脉血栓作用。为了达到所述目的,本发明采用了以下五方面的技术手段。第一方面的技术手段是提供了一种鲜桑树叶水提物粉末,分析鲜桑树叶水提物粉末的质谱总离子流图谱及对应的质谱峰的23种组分认定这种鲜桑树叶水提物粉末中含有11种奎尼酸类化合物及12种懈皮素类化合物；其中,所述的11种奎尼酸类化合物为3-o-[e-2-羧基正戊羰氧-3-羟基正丁酰氧-4-羧基正丙酰氧-5-羟基-6-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-羧基正丙烯羰氧-3-羟基-4-羟基正丙羰氧-5-羧基乙酰氧-6-(6-羟基-1,3-己二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-羟基乙酰氧-3-(5-羧基-1-正戊烯羰氧)-4,5,6-三(4-羧基-1-正丁烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-羟基-3-羧基乙酰氧-4-羧基正丙烯羰氧-5,6-二(4-羧基正丁羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-甲氧-3-羟基正丁烯酰氧-4-羧基正丁烯酰氧-5-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-6-(6-羟基-1-正己烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-羟基正丙烯酰氧-3,4-二羧基正丙酰氧-5-(6-羟基-1,3,5-正己三烯羰氧)-6-(5-羟基-1,3-正戊二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,5-二(5-羧基-1,3-正戊二烯羰氧)-3-(6-羧基-1,3,5-正己三烯羰氧)-4-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-6-(8-羟基-1,3,5,7-正辛四烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,3,6-三(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-4-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-5-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,5-二羟基正丙烯酰氧-3-羧基正丙烯酰氧)-4-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-6-羧基正丙羰氧桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,5-二甲氧-3-(4-羧基正丁羰氧)-4-(6-羟基-1-正己烯羰氧)-6-(5-羧基正戊羰氧)桂皮酰]奎尼酸和3-o-[e-2,5-二甲氧-3-羧基正丙羰氧-4,5-二(5-羧基正戊羰氧)桂皮酰]奎尼酸；其中,所述的12种懈皮素类化合物为3-o-葡萄糖苷-2’,3’-二甲氧-4’,5’-二(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-6’-(6-羟基-1,3-正己二烯羰氧)懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-(6-羧基正己羰氧)-4’-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-5’-(3-羧基正丁羰氧)-6’-(5-羧基正戊羰氧)懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-(4-羟基正丁羰氧)-4’-(5-羟基正戊羰氧)-5’-羧基乙酰氧-6’-羟基乙酰氧懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’,6’-二甲氧基-3’-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)-4’,5’-二(4-羟基-1-正丁烯羰氧)懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’-甲氧基-3’-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)-4’-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-5’-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-6’-甲酰氧懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-4’-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-5’,6’-二(3-羧基正丙羰氧)懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’-甲酰氧-3’-(3-羟基正丙羰氧)-4’-(3-羧基正丙羰氧)-5’-羧基正丙酰氧-6’-羟甲氧懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’-甲氧基-3’-(6-羧基-1,3,5-正己三烯羰氧)-4’,5’-二(3-羧基-1-正丁烯羰氧)-6’-甲酰氧懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’,3’,6’-三甲氧基-4’-羟甲基-5’-(6-羟基正己羰氧)懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-4’-(3-羟基正丙羰氧)-5’,6’-二羟基正丙酰氧懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’,3’-二甲氧基-4’-羟甲基-5’-(6-羟基正己羰氧)-6’-(3-羟基正丙羰氧)懈皮素和3-o-葡萄糖苷-2’-甲酰氧-3’,4’-二羧基乙酰氧基-5’-(7-羧基-1,3,5-正庚三烯羰氧)-6’-(9-羧基-1,3,5-正壬三烯羰氧)懈皮素。第二方面的技术手段是提出一种制备所述的鲜桑树叶水提物粉末的方法,使鲜桑树叶水提物粉末可以这样制得:鲜桑树叶用自来水洗净,在蒸馏水中于60℃-90℃加热0.5-4小时,过滤,残饼用蒸馏水洗,合并的滤液减压浓缩,得到的粉末即为鲜桑树叶水提物粉末。第三方面的技术手段是提出一种制备所述的鲜桑树叶水提物粉末的优选方法,其特征在于取鲜桑树叶,用自来水洗净,在蒸馏水中于70℃加热2小时,过滤,残饼用蒸馏水洗,合并的滤液减压浓缩,得到的粉末即为鲜桑树叶水提物粉末。第四方面的技术手段是提出了鲜桑树叶水提物粉末在制备抗静脉血栓药物中的应用。第五方面的技术手段是提出了鲜桑树叶水提物粉末在制备抗动脉血栓药物中的应用。附图说明图1.鲜桑叶水提物粉末的uplc-质谱总离子流图谱。图2.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-[e-2-羧基正戊羰氧-3-羟基正丁酰氧-4-羧基正丙酰氧-5-羟基-6-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图3.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-[e-2-羧基正丙烯羰氧-3-羟基-4-羟基正丙羰氧-5-羧基乙酰氧-6-(6-羟基-1,3-己二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图4.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-[e-2-羟基乙酰氧-3-(5-羧基-1-正戊烯羰氧)-4,5,6-三(4-羧基-1-正丁烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图5.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-[e-2-羟基-3-羧基乙酰氧-4-羧基正丙烯羰氧-5,6-二(4-羧基正丁羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图6.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-[e-2-甲氧-3-羟基正丁烯酰氧-4-羧基正丁烯酰氧-5-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-6-(6-羟基-1-正己烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图7.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-[e-2-羟基正丙烯酰氧-3,4-二羧基正丙酰氧-5-(6-羟基-1,3,5-正己三烯羰氧)-6-(5-羟基-1,3-正戊二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图8.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-[e-2,5-二(5-羧基-1,3-正戊二烯羰氧)-3-(6-羧基-1,3,5-正己三烯羰氧)-4-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-6-(8-羟基-1,3,5,7-正辛四烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图9.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-[e-2,3,6-三(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-4-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-5-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图10.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-[e-2,5-二羟基正丙烯酰氧-3-羧基正丙烯酰氧)-4-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-6-羧基正丙羰氧桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图11.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-[e-2,5-二甲氧-3-(4-羧基正丁羰氧)-4-(6-羟基-1-正己烯羰氧)-6-(5-羧基正戊羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图12.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-[e-2,5-二甲氧-3-羧基正丙羰氧-4,5-二(5-羧基正戊羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图13.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-葡萄糖苷-2’,3’-二甲氧-4’,5’-二(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-6’-(6-羟基-1,3-正己二烯羰氧)懈皮素及裂解产物。图14.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-(6-羧基正己羰氧)-4’-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-5’-(3-羧基正丁羰氧)-6’-(5-羧基正戊羰氧)懈皮素及裂解产物。图15.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-(4-羟基正丁羰氧)-4’-(5-羟基正戊羰氧)-5’-羧基乙酰氧-6’-羟基乙酰氧懈皮素及裂解产物。图16.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-葡萄糖苷-2’,6’-二甲氧基-3’-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)-4’,5’-二(4-羟基-1-正丁烯羰氧)懈皮素及裂解产物。图17.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-葡萄糖苷-2’-甲氧基-3’-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)-4’-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-5’-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-6’-甲酰氧懈皮素及裂解产物。图18.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-4’-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-5’,6’-二(3-羧基正丙羰氧)懈皮素及裂解产物。图19.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-葡萄糖苷-2’-甲酰氧-3’-(3-羟基正丙羰氧)-4’-(3-羧基正丙羰氧)-5’-羧基正丙酰氧-6’-羟甲氧懈皮素及裂解产物。图20.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-葡萄糖苷-2’-甲氧基-3’-(6-羧基-1,3,5-正己三烯羰氧)-4’,5’-二(3-羧基-1-正丁烯羰氧)-6’-甲酰氧懈皮素及裂解产物。图21.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-葡萄糖苷-2’,3’,6’-三甲氧基-4’-羟甲基-5’-(6-羟基正己羰氧)懈皮素及裂解产物。图22.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-4’-(3-羟基正丙羰氧)-5’,6’-二羟基正丙酰氧懈皮素及裂解产物。图23.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-葡萄糖苷-2’,3’-二甲氧基-4’-羟甲基-5’-(6-羟基正己羰氧)-6’-(3-羟基正丙羰氧)懈皮素及裂解产物。图24.鲜桑叶水提物粉末中的3-o-葡萄糖苷-2’-甲酰氧-3’,4’-二羧基乙酰氧基-5’-(7-羧基-1,3,5-正庚三烯羰氧)-6’-(9-羧基-1,3,5-正壬三烯羰氧)懈皮素及裂解产物。具体实施方式为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。实施例1制备鲜桑树叶水提物粉末鲜桑树叶用自来水洗净,取100g洗净的鲜桑树叶在900ml蒸馏水中于60℃-90℃加热0.5-4小时,优选为70℃加热2小时,过滤,残饼用蒸馏水洗,合并的滤液减压浓缩,得到的7.3g粉末即为鲜桑树叶水提物粉末。实施例2测定鲜桑树叶水提物粉末的色谱和质谱离子流谱2-1.样品溶液的制备(10mg/ml)称取26.7mg鲜桑树叶水提物粉末,用2.67ml超纯水中将粉末溶解。得到的溶液经超声震荡1分钟,之后再于13000r/min离心10分钟。取上清液,过0.22μm滤膜,置于样品瓶中供色谱和质谱测定用。2-2.色谱条件色谱条件色谱柱:waters，acquityhsst3柱(2.1×100mmi.d.,1.7μm)；进样体积:2μl；流动相:水(0.1％甲酸),乙腈；按照表1的梯度用流动相洗色谱柱。表1流动相梯度表2-3.测定色谱图按照上面的色谱测定条件测定并记录鲜桑树叶水提物粉末的uplc色谱图(见说明书附图1)。2-4.测定离子流谱和质谱的条件电喷雾离子化模式为正(pi)及负(ni)模式。离子模式参数:毛细管电压为1000v,去溶剂气流速为800l/h,温度450℃,源温度为120℃,锥孔气流速为50l/h,喷雾气压为6bar,碎裂电压为20-45v,取样锥电压为6v,采集模式为msecontinuum分辨率模式,带电粒子的质量数与电荷数之比(m/z)数据采集范围为100-1500,低能量通道trap碎裂电压为6v,高能量通道trap碎裂电压选择梯度电压为20-60v,选取le(亮氨酸脑啡肽)为质量锁采集m/z,范围为100-1500。实施例3指定鲜桑树叶水提物粉末中23种组分的结构将实施例2的uplc色谱与质谱联接,测定鲜桑树叶水提物粉末的uplc-质谱。质谱条件是电喷雾离子化的正离子和负离子两种模式。离子模式参数:毛细管电压为1000v,去溶剂气流速为800l/h,温度450℃,源温度为120℃,锥孔气流速为50l/h,喷雾气压为6bar,碎裂电压为20-45v,取样锥电压为6v,采集模式为msecontinuum分辨率模式,带电粒子的质量数与电荷数之比(m/z)数据采集范围为100-1500,低能量通道trap碎裂电压为6v,高能量通道trap碎裂电压选择梯度电压为20-60v,选取le(亮氨酸脑啡肽)为质量锁采集m/z,范围为100-1500。在45分钟内分出23个独立峰。根据质谱裂解规律,这些峰(按照总离子流图谱从左到右的峰顺序)的指定见表2。这23种组分在质谱条件下的裂解产物见说明书附图2-24。表2总离子流图谱中峰对应组分保留时间,负离子质量数,结构及名称实施例4评价鲜桑树叶水提物粉末的抗静脉血栓作用实验动物与方法sd品系雄性大鼠(250±20g),购自北京维通利华实验动物技术有限公司,用于制作大鼠下腔静脉结扎模型。实验分组和剂量sd雄性大鼠在实验前适应25-28℃的环境并禁食一天。之后,随机分为阳性对照华法林组,口服剂量为4.87μmol/kg；阴性对照生理盐水组,口服剂量为10ml/kg；鲜桑树叶水提物粉末,口服剂量为50mg/kg。评价方法最后一次给药30min后大鼠腹腔注射20％乌拉坦溶液使麻醉。在手术板上将麻醉大鼠仰卧位固定,备皮和消毒。然后,沿大鼠腹白线打开腹腔。开腹切口为下至凝固腺上至露出肝脏一角。将小肠等器官从腹腔内移出并用浸润过生理盐水的纱布包裹。钝性分离血管周围结缔组织,暴露下腔静脉及分支。在肾静脉下方将腹主动脉和下腔静脉剥离开,然后用生理盐水浸湿的缝合线在下腔静脉与左肾静脉交汇处将下腔静脉结扎。将从腹腔内移出并用浸润过生理盐水的纱布包裹的肠等器官按解剖位置移回腹腔内,用缝合线逐层缝合腹腔。由于华法林治疗的大鼠随时可死亡,所以30min之后便打开腹腔,逐个将分支结扎,从下腔静脉与左肾静脉的交汇处的结扎处取出2cm下腔静脉,再从下腔静脉中取出血栓称重,数据见表3。本发明的结论是口服剂量为50mg/kg的鲜桑树叶水提物粉末不仅可有效地抑制静脉血栓,而且活性与出血副作用严重的华法林无显著性差异。可见,鲜桑树叶水提物粉末对静脉血栓有优秀的抑制作用。表3鲜桑树叶水提物粉末对静脉血栓的影响静脉血栓大鼠的治疗剂剂量静脉血栓重:均值±sdmg生理盐水10ml/kg11.8±4.0华法林4.87μmol/kg7.1±2.3鲜桑树叶水提物粉末50mg/kg6.6±1.7aa)与生理盐水比p<0.01,与华法林比p>0.05；n＝8.实施例5评价鲜桑树叶水提物粉末的抗动脉血栓作用1)将聚乙烯管拉成一端为斜口的细管,定长为10.0cm,分别为右颈静脉(管径较粗)及左颈动脉(管径较细)插管；中段聚乙烯管定长为8.0cm,血栓线压在颈动脉插管方向,插管前需在管中充满肝素。2)将体重200±20g雄性大鼠在手术前适应环境并禁食一天。随机分为5‰cmc-na(含3ml/kg,10只大鼠)组,阿司匹林(阿司匹林与5‰cmc-na悬浮液，阿司匹林含量167μmol/kg,10只大鼠)组,鲜桑树叶水提物粉末(鲜桑树叶水提物粉末与5‰cmc-na悬浮液，鲜桑树叶水提物粉末含量50mg/kg,10只大鼠)组。按照规定剂量给大鼠口服药物。给药30min后,大鼠腹腔注射20％乌拉坦溶液麻醉(3ml/kg),2min之后开始手术。手术中将大鼠仰卧位于固定板上,剪开颈部皮肤,分离右颈总动脉及左颈静脉,血管下压线,结扎远心端,在静脉靠远心端处剪一小口,将插管插入静脉端,注射肝素,而后取下注射肝素的注射器,系线固定,再用动脉夹夹住动脉近心端,在靠近远心端方向剪一小口,将动脉端结扎,系线固定后松开动脉夹,建立体外循环旁路。循环15分钟后先剪断静脉端观察血液循环是否正常,若正常从动脉端取出血栓线,在纸上沾干浮血后称重,以血栓重表示活性,数据列入表4。表中的血栓重量表明,在167μmol/kg口服剂量下阿司匹林有效地抑制大鼠患动脉血栓症,在50mg/kg口服剂量下鲜桑树叶水提物粉末同样有效抑制大鼠患动脉血栓症。也就是说,鲜桑树叶水提物粉末和阿司匹林的抗动脉血栓活性无显著性差异。可见,鲜桑树叶水提物粉末对动脉血栓有优秀的抑制作用。表4鲜桑树叶水提物粉末对大鼠动脉血栓的影响动脉血栓大鼠的治疗剂剂量血栓湿重:均值±sdmg5‰cmc-na-35.75±10.15阿司匹林167μmol/kg20.25±3.37鲜桑树叶水提物粉末50mg/kg25.33±5.09aa)与5‰cmc-na相比p<0.01；与阿司匹林比p>0.05；n＝10。当前第1页12