一种抑菌纳米微乳液体系、制备方法、应用及应用方法与流程

本发明涉及日用化工领域，具体是涉及一种抑菌纳米微乳液体系、制备方法、应用及应用方法。

背景技术：

近年来，随着经济的快速发展和人们生活水平的不断提高，消费者对于食品、化妆品等日用消费品的需求不仅仅停留在其功能、效用等方面，而对于其感官、安全性提出了更高的要求，这就意味着生产商为迎合消费者的需要，对能够改善其产品档次的添加剂类原料的需求在不断地增长。香精作为一类重要的添加剂类原料，得到了广泛的应用。香精根据其来源可分为天然香精和合成香精，由于合成香精存在着较大的安全性争议，天然来源的香精因其天然、绿色、健康等特点备受关注。

山苍子油主要成分为柠檬醛，是我国特有的天然植物挥发性香精油，既是香精又具有抗氧化、抗菌、防腐、驱蚊避虫等多种功效，利用价值极高，应用范围广，普遍应用于食品、药品、日用化工等领域。但由于山苍子油存在挥发性强、水溶性差、刺激性强、易氧化、光敏感等多种稳定性问题，导致其香气不持久，限制了其应用深度和广度，导致我国山苍子油产业发展缓慢，高附加值产品加工水平低，大多山苍子油加工企业停留在高成本低产出的作坊模式，以初级原油为主。

龙脑油香气清新醇厚，属于高级香精油，是天然冰片生产过程中的主要副产品，其主要成分为天然右旋龙脑、乙酸龙脑酯、桉油精及其他烯萜类成分，研究表明，龙脑油具有抗炎杀菌、生肌止痒、镇痛安神、促进药物吸收等药理活性。但其同样面临水溶性较差的问题，导致其在食品、药品和日用化工等领域的应用受到限制。

天然香精油大多是各种挥发性化合物的混合平衡体，不同官能团的不同理化性质及生物活性导致大多数天然香精不稳定，在加工和储存过程中易挥发损失；且精油香气成分大多是亲脂性的，很容易被脂肪、蛋白质等吸附或掩盖，影响释放。目前大多食品、日化产品主体为水油混合体系，只有解决了天然香精油在油/水环境中的协调使用才能增加其使用范围。

乳化系统基于将精油包埋形成与外部环境隔离的分散相的原理，可以保护、控释和增溶香精。尤其是微乳化技术可将水、油、表面活性剂或者助表面活性剂混合后自发形成的分散相质点为1-100nm，具有各向同性且热力学稳定的透明或半透明分散体系，靶向性、控释性和稳定性更优，且便于工业化生产。将微乳化技术应用于香精领域不仅能保持香精乳液澄清透明的外观，便于添加在某些具有透明度要求的饮料中，同时其乳液粒径极小可使产品保持高度稳定，从而显著延长产品的保质期。此外，使用微乳液作为包埋系统，是改善许多亲脂性功能成分的水溶性和控制缓释的有效方法，可以充分保护不稳定的有效成分，使其功效最大化，具有广阔的应用前景。

目前，尚未发现市场上有采用纳米微乳化包埋技术将山苍子油与龙脑油混合制成强效抑菌纳米微乳液体系的相关报道。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，提供一种抑菌纳米微乳液体系、制备方法、应用及应用方法，本技术方案通过纳米微乳化技术将山苍子油与龙脑油包埋成纳米微乳液体系，山苍子油与龙脑油二者协同可以改善油相性质，具有优良水稀释性及稳定性，能与水以任意比例稀释，具有强效抑菌效果。

为达到以上目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供一种抑菌纳米微乳液体系，包括以下质量百分比的组分：

可选的，所述山苍子油中含有75-97％的柠檬醛。

可选的，所述龙脑油中含有20-30％的天然右旋龙脑。

进一步的，本发明还提供一种抑菌纳米微乳液体系的制备方法，包括以下步骤：

向胶束溶液中加入纳米微乳液油相，搅拌均匀后进行水浴加热，再冷却至室温，静置过夜，得到抑菌纳米微乳液体系；

所述胶束溶液由吐温20、吐温40、大豆卵磷脂、吐温80和去离子水制备而成；

所述纳米微乳液油相由山苍子油和龙脑油混合均匀后制备而成。

可选的，所述胶束溶液由以下步骤制备而成：

取吐温20、吐温40、大豆卵磷脂和吐温80，加入去离子水中，得到第一混合液；

取所述第一混合液进行水浴加热并搅拌均匀，直至形成透明均匀的胶束，得到第二混合液；

取所述第二混合液冷却至室温，得到胶束溶液。

可选的，取第一混合液置于加热至70-80℃的水中水浴5-10min，搅拌速率为500-700rpm。

可选的，胶束溶液中加入纳米微乳液油相中后，搅拌速率为500-700rpm，并置于加热至70-80℃的水中水浴5-10min。

可选的，冷却至室温的方式为置于冰水中进行水浴。

进一步的，本发明还提供一种抑菌纳米微乳液体系的应用，采用如上述的抑菌纳米微乳液体系作为香精应用于化妆品、食品和抗菌药物中。

进一步的，本发明还提供一种抑菌纳米微乳液体系的应用方法，采用如上述的抑菌纳米微乳液体系制备形成纳米微乳液化妆水，应用于化妆品领域，所述纳米微乳液化妆水由以下步骤制备而成：

取甘油、1，3-丁二醇和甘油聚醚-26进行混合，搅拌均匀，得到组分a；

向所述组分a中加入组分b，余量为去离子水，搅拌均匀，得纳米微乳液化妆水；

所述组分b为马齿苋提取物、蘑菇葡聚糖和如上述的抑菌纳米微乳液体系，搅拌速率为700-1000rpm。

本发明的有益效果为：

本发明所形成的抑菌纳米微乳液体系的乳滴粒径小(＜22nm)，分散度低(pdi＜0.3)，可完全包埋油相，乳液澄清透明，有各向同性，粘度较低且为牛顿流体。同时，该抑菌纳米微乳液体系具有优良水稀释性及稳定性，能与水以任意比例稀释，具有强效抑菌效果，不仅可以达到调控气味，减少刺激性的效果，还能显著延缓精油的主要活性成分紫外降解速度，解决了单相精油水不溶性和光敏感问题，为山苍子油及龙脑油功能性产品的研发及工业化生产提供新思路。

本发明通过纳米微乳化技术将山苍子油与龙脑油包埋成纳米微乳液体系，山苍子油与龙脑油二者协同不仅可以改善油相性质，减少表面活性剂用量，提高安全性。同时，该发明还具备了更优的协同抗菌和抗生物被膜活性。

本发明所形成的抑菌纳米微乳液体系的制备所用原料均简单易得，反应条件温和，操作简便。

附图说明

图1为本发明抑菌纳米微乳液体系的制备方法的流程示意图；

图2为本发明抑菌纳米微乳液体系的制备方法中的s200)具体的流程示意图；

图3为本发明抑菌纳米微乳液体系的应用方法的流程示意图；

图4为本发明实施例1中抑菌纳米微乳液体系的制备方法的流程示意图；

图5为本发明中使用到的山苍子油的gc-ms总离子流图；

图6为本发明中使用到的龙脑油的gc-ms总离子流图。

具体实施方式

以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。

本发明中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。

本发明提供一种抑菌纳米微乳液体系，包括以下质量百分比的组分：

山苍子油及龙脑油均具有较强的疏水性，但研究发现，通过将山苍子油与龙脑精油复配成混合精油时，油相的亲水性发生了一定的改变，混合油的亲水性明显增强，这与龙脑油中含有大量的短链醇有关，研究表明为了提高油相的增溶量，在微乳液制备时可加入短链醇类作为助溶剂。

在本实施例中，山苍子油中含有75-97％的柠檬醛，龙脑油中含有20-30％的天然右旋龙脑。

作为一种优选方案，本发明中所用的山苍子油购于吉安市中香天然植物有限公司，其gc-ms总离子流图如图5所示，从图5可以看到，天然来源的山苍子精油中，除了最大抑菌成分柠檬醛(75％)，还含有橙花醛、香叶醛、少量的右旋柠檬烯、桉油精及甜没药烯等天然烯萜类化合物，这些成分均具有较好的芳香性和抑菌作用。

作为一种优选方案，本发明中所用的龙脑剩油购于广东华清园生物科技有限公司，其gc-ms总离子流图如图6所示，从图6可以看到，龙脑油含有44种主要组成成分，除了最大抑菌成天然右旋龙脑(21.25％)，还含有桉油精(13.19％)、乙酸龙脑酯(7.86％)、右旋柠檬烯(6.34％)、β-月桂烯(5.52％)、α-松油醇(3.96％)、萜品醇(2.42％)及α-右旋蒎烯(4.25％)等天然烯萜类或醇类化合物，这些成分均具抑菌作用。

请参阅图1，该抑菌纳米微乳液体系的制备方法包括以下步骤：

s100)取如上述质量百分比的山苍子油和龙脑油，将两者混合均匀后制备形成纳米微乳液油相；

s200)取如上述质量百分比的吐温20、吐温40、大豆卵磷脂、吐温80和去离子水制备形成胶束溶液，具体的，请参阅图2，胶束溶液由以下步骤制备而成：

s201)取吐温20、吐温40、大豆卵磷脂和吐温80，加入去离子水中，得到第一混合液。

s202)取第一混合液进行水浴加热并搅拌均匀，直至形成透明均匀的胶束，得到第二混合液。

s203)取第二混合液冷却至室温，得到胶束溶液。

s300)向胶束溶液中加入纳米微乳液油相，搅拌均匀后进行水浴加热，再冷却至室温，静置过夜，得到抑菌纳米微乳液体系。

在本实施例中，搅拌速率500-700rpm，为水浴加热的方式为置于加热至70-80℃的水中水浴5-10min，例如取第一混合液置于加热至70-80℃的水中水浴5-10min，胶束溶液中加入纳米微乳液油相后置于加热至70-80℃的水中水浴5-10min。

在本实施例中，冷却至室温的方式为置于冰水中进行水浴。

进一步的，本发明还提供一种抑菌纳米微乳液体系的应用，采用如上述的抑菌纳米微乳液体系作为精油应用于化妆品、食品和抗菌药物中。

进一步的，本发明还提供一种抑菌纳米微乳液体系的应用方法，采用如上述的抑菌纳米微乳液体系制备形成纳米微乳液化妆水，应用于化妆品领域，请参阅图3，纳米微乳液化妆水由以下步骤制备而成：

b100)取甘油、1，3-丁二醇和甘油聚醚-26进行混合，搅拌均匀，得到组分a。

b200)向组分a中加入组分b，余量为去离子水，搅拌均匀，得纳米微乳液化妆水，其中组分b为马齿苋提取物、蘑菇葡聚糖和如上述的抑菌纳米微乳液体系，搅拌速率为700-1000rpm。

由于山苍子油及龙脑油均具有较强的疏水性，在水相体系的化妆品中直接加入油相的山苍子油、龙脑油很难形成一个稳定的体系。因此，在化妆水应用中，优选的，本发明的抑菌纳米微乳液体系是由山苍子油、龙脑油经微乳化包埋技术制得的，纳米微乳液体系是粒径均小于22nm的o/w体系，可与水以任意比例稀释，能更有效的发挥强效抑菌、抗氧化和清除自由基的作用。

该抑菌纳米微乳液体系作为精油应用于化妆品具有以下应用效果：该纳米微乳液化妆水为澄清透明的水剂体系，有淡淡的山苍子油、龙脑油的清香味，该化妆水中含有山苍子油和龙脑油能有效延长其保质期，同时具有抗氧化、抗衰老和清除自由基的作用。甘油聚醚-26、马齿苋提取物和蘑菇葡聚糖的添加为肌肤提供多功能的抗炎、抗衰老、晒后修复和美白等活性成分，能有效锁住水分，减少水分流失，增加皮肤含水量和紧致度，并促进细胞生长、伤口愈合和增强免疫力。甘油、1，3-丁二醇的添加可以作为良好的保湿剂，在使用过程中可以提高强有力的保湿屏障，便于其他有效成分被皮肤吸收。

实施例1

(1)抑菌纳米微乳液的制备，请参阅图4，包括以下步骤：

a100)向1号烧杯中加入2.50％山苍子油和2.50％龙脑油进行混合，搅拌均匀，制备形成纳米微乳液油相。

a200)随后，向2号烧杯中加入66.50-73.00％去离子水，再加入20.00％吐温20、2.00-3.50％大豆卵磷脂、1.00％吐温80，得到第一混合液；

a300)取第一混合液置于70-80℃的水中水浴加热5-10min，500-700rpm的速率进行搅拌直至形成透明均匀的胶束，制备形成第二混合液；

a400)取第二混合液采用冰水水浴的方式冷却至室温，制备形成胶束溶液。

a500)然后，将1号烧杯中的纳米微乳液油相加入到2号烧杯的胶束溶液中，500-700rpm的速率搅拌均匀，置于70-80℃的水中水浴加热5-10min，立即取出至冰水中水浴冷却，直至冷却至室温，静置过夜，得具有强效抑菌功效的抑菌纳米微乳液。

(2)抑菌检测

①分别将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌划线培养于lb平板上，在30℃培养箱中倒置培养24h；白色念珠球菌划线培养于ypd平板上，在37℃培养箱中倒置培养48h。

②将山苍子油(编号：on)乙醇溶液及其微乳液、龙脑油(编号：o1)乙醇溶液及其微乳液、实施例1制备得到的抑菌纳米微乳液油相(编号：on1)乙醇溶液及其微乳液、表面活性剂胶束溶液(乳化剂)均用无菌水配制，并用二倍稀释法将浓度分别稀释至100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.125、1.5625、0.78125mg/ml。

③最小抑菌浓度(mic)的测定：取20μl步骤②配制的不同浓度的相关物质溶液分别加入96孔板；取浓度相当于0.5麦氏标准浊度的各类菌株的菌悬液，取无菌lb肉汤(针对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)或ypd肉汤(针对白色念珠菌)，按1∶1000稀释后得到相应含菌稀释液，然后取稀释液180μl加入到上述96孔板中，重复三行作为平行试验，再做三行同样的加药处理但不接种菌液作为加药培养基空白对照，其余孔加入200μl无菌培养基，封口膜密封后培养。培养条件：接有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的mic板置于37℃培养箱培养24h；接有白色念珠球菌的mic板置于37℃培养箱培养48h；以微孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为该物质的mic值。测定结果如表1所示。

表1最小抑菌浓度测定结果

④最小杀菌浓度(mbc)的测定：同上述mic的测定方法得各微乳液的mic值，取4mic、2mic、mic、1/2mic的带药菌液接种于lb(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)、ypd(白色念珠球菌)平板，用封口膜密封后倒置培养在30℃培养箱24h(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)和37℃培养箱48h(白色念珠球菌)，观察菌落生长状况，以平板中小于5个单菌落生长的药物浓度为该物质的最小杀菌浓度值(mbc)。测定结果如表2所示。

表2最小杀菌浓度测定结果

⑤96孔板生物膜形成试验：取相当于0.5麦氏浊度的菌悬液，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌用tsb液体培养基按1:1000稀释，白色念珠球菌用ypd液体培养基按1:1000稀释。之后，将稀释好的菌液加入到无菌96孔板中，每孔200μl，每种菌至少培养3孔，同时分别用无菌tsb和ypd培养基做阴性对照，封口膜密封，30℃(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)或37℃(白色念珠球菌)静置培养48h。

⑥对成熟生物被膜消除作用的测定：向步骤⑤形成的生物膜中加入步骤②配制的不同浓度的相关物质溶液，用封口膜密封，30℃(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)或37℃(白色念珠球菌)静置培养4h。之后，快速倒掉培养基，加入200μl/孔无菌生理盐水洗涤，共2次，以除去杂质和浮游菌；针对细菌用0.01％，200μl/孔的无菌结晶紫染色15min；真菌用0.04％，200μl/孔的无菌结晶紫染色15min。染色结束后，用200μl/孔无菌水洗涤2次。最后采用200μl/孔，95％的乙醇将附着的结晶紫洗脱15min。移取125μl洗脱液于新的无菌酶标板，用酶标仪于540nm处测定吸光值。测定结果表3所示。

表3生物被膜半数消除剂量测定结果

⑦对成熟生物被膜活性作用的测定：向步骤⑤形成的生物膜中加入步骤②配制的不同浓度的相关物质溶液，用封口膜密封，30℃(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)或37℃(白色念珠球菌)静置培养4h。之后，快速倒掉培养基，用200μl的pbs液洗涤两次，再向每个孔中加入新鲜的200μl新鲜的xtt试剂；用锡箔纸避光、30℃(细菌)或37℃下静置培养4h，将其中100μl的菌液转移至新的96孔板中，在490nm下读吸光值。根据酶标仪软件测试结果，计算出菌株的od值。测定结果表4所示。

表4生物被膜活性降低90％所需剂量测定结果

由表1、表2、表3、表4可知，对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌及其生物被膜，本发明的纳米微乳液体系均具有强效的抑菌杀菌作用。同时，本发明的纳米微乳液体系的mic、mbc、生物被膜半数消除剂量及活性降低90％所需剂量均低于或等于与其相对应的精油乙醇溶液，显示了本发明的抑菌纳米微乳液体系对于精油本身杀菌功效产生了增效的作用。此外，本发明的实施例1抑菌纳米微乳液体系(山苍子油-龙脑油纳米微乳液体系，即on1微乳液体系)相较于山苍子油(on)、龙脑油(o1)等单一组分微乳液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌及其生物被膜的抑制效果上，均具有更优的抑制效果，显示了本发明的山苍子油-龙脑油复配纳米微乳液体系在协同抑菌杀菌效果及抗生物被膜的优越性。

本实施例中所用的大肠杆菌atcc25922、金黄色葡萄球菌atcc25923、白色念珠菌sc5314均购于北京北纳开创生物技术有限公司。

本发明的有益效果为：

本发明所形成的抑菌纳米微乳液体系的乳滴粒径小(＜22nm)，分散度低(pdi＜0.3)，可完全包埋油相，乳液澄清透明，有各向同性，粘度较低且为牛顿流体。同时，该抑菌纳米微乳液体系具有优良水稀释性及稳定性，能与水以任意比例稀释，具有强效抑菌效果，不仅可以达到调控气味，减少刺激性的效果，还能显著延缓精油的主要活性成分紫外降解速度，解决了单向精油水不溶性和光敏感问题，为山苍子油及龙脑油功能性产品的研发及工业化生产提供新思路。

本发明通过纳米微乳化技术将山苍子油与龙脑油包埋成纳米微乳液体系，山苍子油与龙脑油二者协同不仅可以改善油相性质，减少表面活性剂用量，提高安全性。同时，该发明还具备了更优的协同抗菌和抗生物被膜活性。

本发明所形成的抑菌纳米微乳液体系的制备所用原料均简单易得，反应条件温和，操作简便。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。