一种PH敏感的载阿霉素PLGA微球的制备方法与流程

本发明涉及材料及临床治疗领域，具体涉及一种ph敏感的载阿霉素plga微球的制备方法。

背景技术：

恶性肿瘤即癌症，是一种对人类健康有巨大威胁的疾病，我国患者数目正处于迅速增长态势，因此寻求一种有效的癌症治疗手段显得尤为重要。目前临床的治疗手段主要有化疗，放疗和手术切除。其中化疗又称化学药物治疗，以化学药物杀灭癌细胞达到治疗目的，化学治疗药物主要有细胞毒性药物，激素类药，生物反应调节剂，单克隆抗体等，给药方式有口服，静脉注射等，给药后药物会随血液循环运送至全身。由于这类药物大部分均具有细胞毒性，在杀伤肿瘤细胞的同时也会对正常组织器官产生影响，患者常会产生脱发，恶心呕吐，骨髓抑制等症状。针对这一现状，本领域技术人员开发了不同材料作为药物载体，制成纳米、微米级的颗粒包载药物以实现缓释、靶向、等不同功能，弥补了了传统化疗药物的诸多弊端。而随着科学技术的进步和医学治疗要求的提高，是诊疗一体化可以大大缩短肿瘤的治疗周期，具有重大临床意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，合成了一种ph敏感的载阿霉素plga微球，其结构表达为nahco3@doxplga。

本发明的技术方案是一种ph敏感的载阿霉素plga微球的制备方法，采用复乳化溶剂挥发法进行制备，步骤如下：

a)配制25mg/ml的plga溶液；

b)配置5％pva溶液；

c)配置nahco3/dox混合溶液；

d)取0.5-1mlnahco3/dox混合溶液为内水相，1-3ml的plga溶液为油相混合，冰浴条件下使用超声发生器超声2-8min，得到w1/o型初乳；

e)向w1/o初乳中加入6-10ml，5％pva溶液作为外水相，混合均匀，冰浴条件下使用超声发生器超声2-6min，得到w1/o/w2型复乳；

f)将w1/o/w2型复乳置于磁力搅拌器，常温下搅拌过夜，使有机溶剂挥发，微球固化成型；

g)8000rpm离心5min后，弃上清即得到nahco3@doxplga微球。

所述步骤a)具体：称取plga(75：25)0.5g，按1：1的体积比分别加入10ml二氯甲烷和丙酮溶解，4℃保存备用。

所述步骤b)具体：称取pva(mw31000)2g，加入蒸馏水90℃加热溶解，定容至40ml保存备用。

所述步骤c)具体：称取nahco36.25-12.5mg，dox5mg溶解于5ml蒸馏水中，得到1.25-2.5mg/ml的nahco3以及1mg/ml的dox溶液，4℃保存备用。

所述步骤g)用pbs重悬反复冲洗三次，保存于4℃冰箱。

原理如下：nahco3是一种常见的食品添加剂，可以与h+反应生成二氧化碳气体，当药物到达肿瘤组织时，利用肿瘤组织的微酸环境，酸性介质逐渐渗透到颗粒内部与nahco3反应产气，利用该气体进行超声造影，确认肿瘤组织的位置，起诊断作用；再施以一定强度的超声，二氧化碳微气泡在声场中发生收缩、膨胀、内爆，产生的冲击波逐渐破坏plga颗粒骨架，同时超声的热效应也可以加速共聚物的降解，最后使plga球壳破损，引起药物的集中释放，集诊断与治疗于一体。

本发明有如下有益效果：

上述ph敏感的载阿霉素plga微球的制备方法，操作简单，成本低，制得的微球形貌稳定，冻干后可保存较长时间。

相对于传统化疗药物，使用plga包载药物的优点有：①可以改善抗癌药物的水溶性和化学稳定性，提高递药效率；②有良好的生物相容性，防止药物过早地降解被代谢出体外；③提高抗癌药物的靶向性，降低药物在正常组织的浓度，提高靶区域药物的吸收；④可以实现药物的控释；⑤降低肿瘤组织对抗癌药物的抗性，延长药物在体内的循环时间。

超声诊断和超声治疗是已经得到认可并被广泛应用到临床的技术。nahco3@doxplga微球利用了肿瘤组织的微酸环境，当药物到达肿瘤组织时，nahco3发生反应生成co2微气泡，可以在超声成像仪中观测到靶区域显影增强，起到治疗作用。再施以一定强度的超声，二氧化碳微气泡在声场中发生收缩、膨胀、内爆，产生的冲击波逐渐破坏plga颗粒骨架，引起药物的释放。达到在时间和空间上精准控制释药的目的，大大降低了传统化疗药物对于正常组织的损害，提高了药效，具有临床意义。

附图说明

图1：按照实施例1制备的正常条件下nahco3@doxplga微球的扫描电子显微镜照片；

图2：按照实施例1制备的弱酸(ph＝6.4)溶液中nahco3@doxplga微球的扫描电子显微镜照片；

图3：实施例1中在a.双蒸水、b.ph＝7.4、c.ph＝6.4溶液中nahco3@doxplga微球的造影效果对比；

图4：按照实施例1制备的制备的nahco3@doxplga微球的粒径分析；

图5：按照实施例1制备的制备的nahco3@doxplga微球的明场微镜照片；

图6：按照实施例1制备的制备的nahco3@doxplga微球的荧光显微镜照片；

图7：按照实施例2超声处理后nahco3@doxplga微球药物释放被细胞摄取的荧光显微镜照片。

具体实施方式

以下结合附图和实施例来对本发明做进一步的说明。应当理解的是，这里所讨论的实施例只是为了说明，对本领域技术人员来说，可以加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

实施例1

i.采用复乳化溶剂挥发法进行制备nahco3@doxplga微球，步骤如下：

a)配制25mg/ml的plga溶液：称取plga(75：25)0.5g，按1：1的体积比分别加入10ml二氯甲烷和丙酮溶解，4℃保存备用。

b)配置5％pva溶液：称取pva(mw31000)2g，加入蒸馏水90℃加热溶解，定容至40ml保存备用。

c)配置nahco3/dox混合溶液：称取nahco312.5mg，dox5mg溶解于5ml蒸馏水中，得到2.5mg/ml的nahco3以及1mg/ml的dox溶液，4℃保存备用。

d)取1mlnahco3/dox混合溶液为内水相，2ml的plga溶液为油相混合，冰浴条件下使用超声发生器超声6min，得到w1/o型初乳。

e)向w1/o初乳中加入6ml，5％pva溶液作为外水相，混合均匀，冰浴条件下使用超声发生器超声3min，得到w1/o/w2型复乳。

f)将w1/o/w2型复乳置于磁力搅拌器，常温下搅拌过夜，使有机溶剂挥发，微球固化成型。8000rpm离心5min后，弃上清即得到nahco3@doxplga微球，用pbs重悬反复冲洗三次，保存于4℃冰箱。

ii.体外超声成像模型的构建：

称取2g琼脂糖于烧杯中，加200ml双蒸水，微波炉加热溶解排净气泡，倒入模具中，凝固后形成带孔的琼脂糖凝胶；分别配置ph为6.4、7.4的pbs缓冲液，保存备用。

iii.体外超声成像实验：

在凝胶模型中分别加入1ml的双蒸水、ph＝6.4、ph＝7.4的pbs缓冲液，静止待溶液中微气泡排尽，加入200μlnahco3@doxplga微球悬液，混合均匀，使用超声成像仪观测成像情况。

图1：按照实施例1制备的正常条件下nahco3@doxplga微球的扫描电子显微镜照片；

图2：按照实施例1制备的弱酸(ph＝6.4)溶液中nahco3@doxplga微球的扫描电子显微镜照片；

图3：实施例1中在a.双蒸水、b.ph＝7.4、c.ph＝6.4溶液中nahco3@doxplga微球的造影效果对比；

图4：按照实施例1制备的制备的nahco3@doxplga微球的粒径分析；

图5：按照实施例1制备的制备的nahco3@doxplga微球的明场微镜照片；

图6：按照实施例1制备的制备的nahco3@doxplga微球的荧光显微镜照片。

实施例2

i.采用复乳化溶剂挥发法进行制备nahco3@doxplga微球，步骤如下：

a)配制25mg/ml的plga溶液：称取plga(75：25)0.5g，按1：1的体积比分别加入10ml二氯甲烷和丙酮溶解，4℃保存备用。

b)配置5％pva溶液：称取pva(mw31000)2g，加入蒸馏水90℃加热溶解，定容至40ml保存备用。

c)配置nahco3/dox混合溶液：称取nahco312.5mg，dox5mg溶解于5ml蒸馏水中，得到2.5mg/ml的nahco3以及1mg/ml的dox溶液，4℃保存备用。

d)取1mlnahco3/dox混合溶液为内水相，2ml的plga溶液为油相混合，冰浴条件下使用超声发生器超声6min，得到w1/o型初乳。

e)向w1/o初乳中加入6ml，5％pva溶液作为外水相，混合均匀，冰浴条件下使用超声发生器超声3min，得到w1/o/w2型复乳。

f)将w1/o/w2型复乳置于磁力搅拌器，常温下搅拌过夜，使有机溶剂挥发，微球固化成型。8000rpm离心5min后，弃上清即得到nahco3@doxplga微球，用pbs重悬反复冲洗三次，保存于4℃冰箱。

ii.体外细胞药物摄取实验

阿霉素在荧光显微镜下被488nm波长激发出红色荧光，药物被细胞摄取后，在荧光显微镜下则会观察到细胞发出红色荧光，用以考察细胞对药物的摄取情况。

取生长状况好的293t细胞进行铺板培养，取50μl制备的nahco3@doxplga微球悬液于ep管中，加2ml细胞培养基稀释后加入到细胞培养皿中。使用低频聚焦超声探头处理3min后将细胞放回细胞培养箱继续培养3h。

随后在荧光显微镜下观察细胞对药物的摄取情况。

图7：按照实施例2超声处理后nahco3@doxplga微球药物释放被细胞摄取的荧光显微镜照片。

实施例3

i.采用复乳化溶剂挥发法进行制备nahco3@doxplga微球，步骤如下：

a)配制25mg/ml的plga溶液：称取plga(75：25)0.5g，按1：1的体积比分别加入10ml二氯甲烷和丙酮溶解，4℃保存备用；

b)配置5％pva溶液：称取pva(mw31000)2g，加入蒸馏水90℃加热溶解，定容至40ml保存备用；

c)配置nahco3/dox混合溶液：称取nahco36.25mg，dox5mg溶解于5ml蒸馏水中，得到1.25mg/ml的nahco3以及1mg/ml的dox溶液，4℃保存备用；

d)取0.5mlnahco3/dox混合溶液为内水相，1ml的plga溶液为油相混合，冰浴条件下使用超声发生器超声2min，得到w1/o型初乳；

e)向w1/o初乳中加入10ml，5％pva溶液作为外水相，混合均匀，冰浴条件下使用超声发生器超声2min，得到w1/o/w2型复乳；

f)将w1/o/w2型复乳置于磁力搅拌器，常温下搅拌过夜，使有机溶剂挥发，微球固化成型；

g)8000rpm离心5min后，弃上清即得到nahco3@doxplga微球，用pbs重悬反复冲洗三次，保存于4℃冰箱。

实施例4

i.采用复乳化溶剂挥发法进行制备nahco3@doxplga微球，步骤如下：

a)配制25mg/ml的plga溶液：称取plga(75：25)0.5g，按1：1的体积比分别加入10ml二氯甲烷和丙酮溶解，4℃保存备用；

b)配置5％pva溶液：称取pva(mw31000)2g，加入蒸馏水90℃加热溶解，定容至40ml保存备用；

c)配置nahco3/dox混合溶液：称取nahco310mg，dox5mg溶解于5ml蒸馏水中，得到2mg/ml的nahco3以及1mg/ml的dox溶液，4℃保存备用；

d)取0.75mlnahco3/dox混合溶液为内水相，3ml的plga溶液为油相混合，冰浴条件下使用超声发生器超声8min，得到w1/o型初乳；

e)向w1/o初乳中加入8ml，5％pva溶液作为外水相，混合均匀，冰浴条件下使用超声发生器超声6min，得到w1/o/w2型复乳；

f)将w1/o/w2型复乳置于磁力搅拌器，常温下搅拌过夜，使有机溶剂挥发，微球固化成型；

g)8000rpm离心5min后，弃上清即得到nahco3@doxplga微球，用pbs重悬反复冲洗三次，保存于4℃冰箱。

尽管上面结合附图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以做出很多变形，这些均属于本发明的保护之内。