防治寒冷损伤的肉桂提取物和中药复方及其应用的制作方法

本发明属生物制药领域，具体涉及防治寒冷损伤的肉桂提取物和中药复方及其应用。

背景技术：

我国边境线长、寒冷地域涵盖面广，寒冷环境造成的人员损伤严重影响着人民的生产生活水平。同时，寒区与朝鲜、俄罗斯、蒙古、巴基斯坦、印度等多国接壤，不仅是国防战略要地，更是影响战争进程的攻坚地域，寒冷损伤严重制约着部队的战斗和作业能力。如何应用特异药品，如何提高寒区部队抵御寒冷的能力和提高寒冷情况下的作业能力、提高冻伤及多器官损伤预防及救治成功率，降低死亡率与伤残率，已成为卫勤系统迫切需要解决的问题。

技术实现要素：

发明目的：

本发明的目的在于：提供肉桂提取物及其中药复方在增加机体产热及冻伤防治方面的用途，并通过实验证明了肉桂提取物及其中药复方关于冻伤防治及产热方面的用途。并提取出肉桂中具有冻伤防治作用的潜在化合物六种。

技术方案：

防治寒冷损伤的肉桂提取物，肉桂提取物包括：

防治寒冷损伤的肉桂提取物的制备方法，该制备方法包括：

步骤一：粗制肉桂提取物：取干燥肉桂，粉碎后用乙醇溶液提取，合并乙醇提取液并减压回收浓缩成浸膏，得到总膏，热水将总膏分散至混悬状，依次用极性递增的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到粗制肉桂提取物；

步骤二：精提肉桂提取物：分别提取出六种化合物；

将粗制肉桂提取物经半制备hplc纯化得到化合物1；

乙酸乙酯部位硅胶拌样上柱，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇系统梯度系统10％-100％，以tlc指导分段，乙酸乙酯部位被分为7个流分fr.1～7；将流分fr.4经ods柱进行划段处理，用不同比例的甲醇/水洗脱，得到流分fr.4-1～4-4；fr.4-2以体积比为6:1的二氯甲烷/甲醇为洗脱剂进行洗脱，经过凝胶柱甲醇洗脱分离，再经半制备hplc纯化得到化合物4；

取fr.6经ods柱进行划段处理，得到fr.6-1～6-3，fr.6-3经硅胶洗脱，反复ods、凝胶sephdexlh-20纯化后，再经过半制备液相得化合物2；

取fr.7经反相mci柱色谱甲醇/水梯度洗脱，得到fr.7-1～7-8，fr.7-6经过sephadexlh20凝胶柱色谱，体积比1:1的二氯甲烷/甲醇洗脱，得到fr.7-6-1～fr.7-6-6；fr.7-6-6经过半制备液相纯化后得到化合物5；

正丁醇部位通过硅胶柱层析划段处理，用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，以tlc指导分段，得到7个流分一～七；流分一经ods层析柱划段后，反复交替使用正反相硅胶、凝胶lh-20和半制备hplc纯化得到化合物3；流分五经ods层析柱划段后，反复交替使用正反相硅胶、凝胶lh-20和半制备hplc纯化得到化合物6。

防治寒冷损伤的肉桂提取物中药复方，该中药复方包括以下重量份数的组分：

肉桂15～30份、炙甘草15～30份、五加皮15～30份、葛根15～20份、鸡血藤15～20份、吴茱萸15～20份、党参15～20份、干姜10～20份、桂枝5～20份，肉桂提取物0.0005～0.0015份。

防治寒冷损伤的肉桂提取物中药复方制备方法，该制备方法包括：

步骤一：取干姜、肉桂、葛根、鸡血藤、桂枝于乙醇溶液中回流提取，得到药液1；

步骤二：取炙甘草、五加皮、吴茱萸、党参于液相水中提取，得到药液2；

步骤三：将药液1及药液2混合后浓缩成浸膏；最后将肉桂提取物加入到浸膏中，得到肉桂提取物中药复方。

防治寒冷损伤的肉桂提取物中药复方制备方法，药液1中乙醇溶液采用60～80％浓度的乙醇水溶液，提取次数为1～4次，每次1～3小时，药材与乙醇水的比值为1:(5～20)；药液2中采用80～90℃的液相水提取1～4次，每次1～3小时，药材与液相水的比值为1:(5～20)。

防治寒冷损伤的肉桂提取物中药复方，该中药复方包括以下重量份数的：干姜20～30份，肉桂10～15份，肉桂提取物0.0005～0.0015份。

防治寒冷损伤的肉桂提取物中药复方，该中药复方包括以下重量份数的：肉桂10～20份，白芍10～20份，肉桂提取物0.0005～0.0015份。

防治寒冷损伤的肉桂提取物中药复方，该中药复方包括以下重量份数的：肉桂30～20份，甘草15～10份，肉桂提取物0.0005～0.0015份。

防治寒冷损伤的肉桂提取物在制备增加机体产热、预防寒冷损伤、改善能量代谢、预防和/或治疗代谢综合征的药物中的应用。

防治寒冷损伤的肉桂提取物中药复方在制备增加机体产热、预防寒冷损伤、改善能量代谢、预防和/或治疗代谢综合征的药物中的应用。

优点及效果：

本发明提供了一个具有提高机体御寒能力、抗寒冷损伤作用中药及其复方，且能够开发成有效的抗寒冷损伤药物。

肉桂具有补火助阳，散寒止痛，温经通脉的作用。但应用肉桂及其复方作为寒冷损伤防治作用的研究较少，且尚无文献报道其中发挥其产热作用的化合物。发明提供了具有产热作用的6种肉桂中提取的化合物，并由此制备了4种中药复方。

中药复方1，君药为炮姜、肉桂，臣药为葛根、鸡血藤、党参，佐药为吴茱萸、桂枝、五加皮，使药为炙甘草。复方中肉桂可补元阳，暖脾胃，除积冷，通血脉。桂枝性味辛温，有温通卫阳、解肌祛风的作用。炮姜性辛温，和桂枝共同辛甘化阳。吴茱萸味辛苦而性热，可温胃暖肝祛寒。葛根解肌散邪，生津通络；党参、甘草生津养液，降血压，养血，补中益气的功效。鸡血藤味甘、辛，性温，有补血，活血，通络的作用。五加皮可强心健脾，利水消肿。诸药配伍，共奏具有解肌祛风，温中补益，调和营卫、气血、升津舒经之功效。

中药复方2源自《圣济总录》卷五十六，为古方新用。原方用于心疼，冷气造成的痛不可忍。君药为肉桂，可除积冷。其中干姜具有温中散寒，回阳通脉，温肺化饮。用于脘腹冷痛，呕吐泄泻，肢冷脉微，寒饮喘咳。

中药复方3源自《实用中医对药方》中的桂枝芍药散，又名芍药散，由桂心半两，白芍药三两组成，具有解利风寒作用。肉桂，桂心，桂枝均来源于桂树，桂心是肉桂的一种，肉桂为桂树的皮，桂心是去掉外层的粗皮，桂枝是桂树的嫩枝。肉桂的纹理作用比较强，包括桂枝的作用，如散寒，温经通脉。故选择了肉桂与白芍配伍。肉桂辛温，辛能散邪，温从阳而扶卫，能够补火助阳，引火归元，散寒止痛，温经通脉。白芍酸寒，酸能敛汗，寒走阴而益营，能够养血调经，平肝止痛，敛阴止汗。桂枝君芍药，是于发散中寓敛汗之意；芍药臣桂枝，是于固表中有微汗之道焉。二者合用能够解利风寒，调和营卫，理脾和中，缓急止痛。

中药复方4源自《伤寒论》，桂枝甘草汤，中医方剂名。具有补助心阳，生阳化气之功效。方中桂枝用量倍于炙甘草，桂枝味辛性温，人心通阳。炙甘草甘温，益气补中。二者配伍，辛甘化阳，补益心阳。本方是温心阳之基础方，药味专捷，又取“顿服”，意在急复心阳。《古今选注》：桂枝复甘草，是辛从甘化，为阳中有阴，故治胸中阳气欲失。且桂枝轻扬走表，佐以甘草留恋中宫，载还阳气，仍寓一表一里之义，故得以外止汗而内除烦。本方进行了创新，将桂枝换为肉桂，其味甘、辛，性热。归肝、肾、脾、心经。功能补火助阳，散寒止痛，活血通经。临床用治肾阳不足，阳痿宫冷，目赤眩晕；心腹冷痛，寒痹腰痛，寒疝奔豚；冲任虚寒，经闭腹痛；此外，本品能温运脾阳，通利血脉，还可用治久病体虚，气血不足之症。炙甘草：味甘，性平。功能补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药。主治发汗过多，其人叉手自冒心，心下悸。故本方对寒冷损伤的效果较好。

附图说明：

图1为不同浓度的肉桂提取物对棕色脂肪细胞脂滴变化的影响；

图2为不同浓度肉桂提取物对棕色脂肪细胞线粒体膜电位变化的影响；

图3为不同浓度肉桂提取物对棕色脂肪细胞线粒体氧化呼吸的影响；

图4为不同浓度肉桂提取物对棕色脂肪细胞中atp含量的影响；

图5为不同浓度肉桂提取物对棕色脂肪细胞中ucp1蛋白表达的影响；

图6为不同浓度肉桂提取物对棕色脂肪细胞中pgc1-肉蛋白表达的影响；

图7为不同浓度肉桂提取物对棕色脂肪细胞中prdm16蛋白表达的影响；

图8为不同浓度肉桂提取物对棕色脂肪细胞中sirt1蛋白表达的影响；

图9为不同浓度肉桂提取物对棕色脂肪细胞中hsl蛋白表达的影响；

图10为不同剂量肉桂提取物对4℃寒冷环境下昆明小鼠肛温的影响；

图11为不同剂量肉桂提取物对4℃寒冷环境下昆明小鼠体表温度影响的红外热成像；

图12为不同剂量肉桂提取物对4℃寒冷环境下昆明小鼠体表温度的影响柱状图；

图13为不同剂量肉桂提取物对-20℃寒冷环境下昆明小鼠肛温的影响；

图14为不同剂量肉桂提取物对-20℃寒冷环境下昆明小鼠体表温度影响的红外热成像；图15为不同剂量肉桂提取物对-20℃寒冷环境下昆明小鼠体表温度的影响柱状图；

图16为不同剂量肉桂提取物对棕色脂肪组织脂滴大小的影响；

图17为不同剂量肉桂提取物对棕色脂肪组织线粒体含量及ucp1的免疫组化结果；

图18为不同剂量肉桂提取物对棕色脂肪组织内ucp1表达的影响；

图19为不同剂量肉桂提取物对棕色脂肪组织中pgc1-α蛋白表达量的影响；

图20为不同剂量肉桂提取物对白色脂肪组织脂滴大小的影响；

图21为不同剂量肉桂提取物对白色脂肪组织线粒体含量及ucp1的表达影响；

图22为不同剂量肉桂提取物对体内甘油三酯代谢水平的影响；

图23为不同剂量肉桂提取物对体内游离脂肪酸代谢水平的影响；

图24为不同剂量肉桂提取物对血清alt的影响；

图25为不同剂量肉桂提取物对血清ast的影响；

图26为不同剂量肉桂提取物对血清bun的影响；

图27为不同剂量肉桂提取物对血清cre的影响；

图28为不同剂量肉桂提取物对寒冷环境下昆明小鼠生存时间的影响；

图29为肉桂中6种产热活性化合物的结构；

图30为肉桂中具有潜在产热活性化合物的与ucp1的分子对接结果；

图31为含肉桂中药复方1给药后90min对昆明小鼠肛温的影响；

图32为肉桂中药复方1在给药16天期间对肛温的影响；

图33为含肉桂中药复方1对-20℃冷暴露后小鼠肛温的影响；

图34为含肉桂中药复方1对小鼠棕色脂肪组织重量的影响；

图35为含肉桂中药复方1对小鼠白色脂肪组织重量的影响；

图36为含肉桂中药复方1对棕色脂肪细胞脂滴大小的影响；

图37为含肉桂中药复方1对白色脂肪细胞脂滴大小的影响；

图38含肉桂中药复方1对棕色脂肪组织ucp1表达的影响；

图39含肉桂中药复方1对白色脂肪组织ucp1表达的影响；

图40各组冷暴露1次后肝损伤的情况；

图41各组冷暴露1次后肾损伤的情况；

图42含肉桂中药复方1对棕色脂肪及白色脂肪组织内的产热蛋白ucp1表达的影响；

图43含肉桂中药复方1对棕色脂肪及白色脂肪组织内相关蛋白pparγ表达的影响；

图44为含肉桂中药复方1对棕色脂肪及白色脂肪组织内相关产热蛋白pgc1α表达的影响；

图45为含肉桂中药复方1对棕色脂肪及白色脂肪组织内相关蛋白sirt1表达的影响；

图46为含肉桂中药复方1对棕色脂肪及白色脂肪组织内相关蛋白hsl表达的影响；

图47为含肉桂中药复方1作用48小时对棕色脂肪细胞存活率的影响；

图48为含肉桂中药复方1对脂滴形成的影响；

图49为含肉桂中药复方1对棕色脂肪细胞内atp生成水平的影响；

图50为含肉桂中药复方1对棕色脂肪细胞产热相关蛋白ucp1表达的影响；

图51为含肉桂中药复方1对棕色脂肪细胞产热相关蛋白pgc1α表达的影响；；

图52为含肉桂中药复方1对棕色脂肪细胞相关蛋白pparγ表达的影响；

图53为含肉桂中药复方1对棕色脂肪细胞相关蛋白hsl表达的影响；

图54为含肉桂中药复方1对棕色脂肪细胞相关蛋白sirt1表达的影响；

图55含肉桂提取物中药复方1的主要成分指认的液相图谱；

图56为含肉桂提取物中药复方2对冷暴露下昆明小鼠肛温情况(左)、肛温下降情况(右)的影响；

图57为含肉桂提取物中药复方3对冷暴露下昆明小鼠肛温情况(左)、肛温下降情况(右)的影响；

图58为含肉桂提取物中药复方4对冷暴露30min(左)、120min(右)昆明小鼠肛温下降情况的影响；

图59为含肉桂提取物中药复方2对冷暴露下昆明小鼠血生化指标的影响；

图60为含肉桂提取物中药复方3对冷暴露下昆明小鼠血生化指标的影响；

图61为含肉桂提取物中药复方4对冷暴露下昆明小鼠血生化指标的影响。

具体实施方式：

本发明提供了肉桂提取物在增加寒冷环境下机体产热方面的作用，旨在将肉桂提取物及其中药复方开发成较好的增加机体产热和预防寒冷损伤的新型药物。

肉桂提取物，肉桂提取物包括：

本发明采用原代前棕色脂肪细胞通过线粒体膜电位测定试剂盒、线粒体氧化呼吸seahorse实验、atp含量测定试剂盒及westernblot等试验证明肉桂提取物及中药复方可能通过抑制atp合成使能量转化为热量，并通过提高ucp1及通路蛋白表达水平提升bat的产热能力。而且肉桂提取物通过增加bat与wat中线粒体含量及提高ucp1蛋白表达水平而促进bat产热，提高机体御寒能力。

防治寒冷损伤的肉桂提取物的制备方法，该制备方法包括：

步骤一：粗制肉桂提取物：取干燥肉桂，粉碎后用乙醇溶液提取，合并乙醇提取液并减压回收浓缩成浸膏，得到总膏，热水将总膏分散至混悬状，依次用极性递增的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到粗制肉桂提取物；

步骤一中的乙醇溶液采用60～80％的乙醇水溶液，室温下提取次数为1～5次，每次提取时长是3～10天，每次7天。

步骤二：精提肉桂提取物：分别提取出六种化合物；

将粗制肉桂提取物经半制备hplc纯化得到化合物1；

乙酸乙酯部位硅胶拌样上柱，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇系统梯度系统10％-100％，以tlc指导分段，乙酸乙酯部位被分为7个流分fr.1～7；将流分fr.4经ods柱进行划段处理，用不同比例的甲醇/水(0～70％)洗脱，得到流分fr.4-1～4-4；fr.4-2以体积比为6:1的二氯甲烷/甲醇为洗脱剂进行洗脱，经过凝胶柱甲醇洗脱分离，再经半制备hplc纯化得到化合物4；

取fr.6经ods柱进行划段处理，得到fr.6-1～6-3，fr.6-3经硅胶洗脱，反复ods、凝胶sephdexlh-20(甲醇)纯化后，再经过半制备液相得化合物2；

取fr.7经反相mci柱色谱甲醇/水(20～80％)洗脱，得到fr.7-1～7-8，fr.7-6经过sephadexlh20凝胶柱色谱，体积比1:1的二氯甲烷/甲醇洗脱，得到fr.7-6-1～fr.7-6-6；fr.7-6-6经过半制备液相纯化后得到化合物5；

正丁醇部位通过硅胶柱层析划段处理，用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，也就是说按照二氯甲烷/甲醇的比列15:1逐渐洗脱至0:15，以tlc指导分段，得到7个流分fr.1～7；流分fr.2经ods层析柱划段后，反复交替使用正反相硅胶、凝胶lh-20和半制备hplc纯化得到化合物3；

流分fr.5经ods层析柱划段后，反复交替使用正反相硅胶、凝胶lh-20和半制备hplc纯化得到化合物6。

由于六种化合物功能和效果相同或相类似，因此后续的中药复方中使用的肉桂提取物是指代该六种化合物的混合物，该混合物按照防治寒冷损伤的肉桂提取物的制备方法中采用干燥肉桂25kg，70％乙醇提取3次，每次7天，再经过精提肉桂提取物得到六种化合物，得到的六种化合物的总和为肉桂质量的，六种化合物的比例关系为1：4：5：7：2：3。

将提取出的六种化合物重新混合，为后续中药复方中加入的肉桂提取物，之后不再说明。

中药复方一

防治寒冷损伤的肉桂提取物中药复方，该中药复方包括以下重量份数的组分：

肉桂15～30份、炙甘草15～30份、五加皮15～30份、葛根15～20份、鸡血藤15～20份、吴茱萸15～20份、党参15～20份、干姜10～20份、桂枝5～20份，肉桂提取物0.0005～0.0015份。

其中肉桂、肉桂提取物，为君药，炙甘草、五加皮、葛根、鸡血藤，为臣药，辅以吴茱萸、党参、干姜、桂枝。

本发明制备的防治寒冷损伤的肉桂提取物中药复方一，符合中国药典2015版各项规定。

药性：

肉桂：补火助阳，引火归元，散寒止痛，温通经脉。用于阳痿宫冷，腰膝冷痛，肾虚作喘，虚阳上浮，眩晕目赤，心腹冷痛，虚寒吐泻，寒疝腹痛，痛经经闭。

炙甘草：补脾和胃，益气复脉。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心动悸，脉结代。

五加皮：祛风除湿，补益肝肾，强筋壮骨，利水消肿。用于风湿痹病，筋骨痿软，小儿行迟，体虚乏力，水肿，脚气。

葛根：解肌退热，生津止渴，透疹，升阳止泻，通经活络，解酒毒。用于外感发热头痛，项背强痛，口渴，消渴，麻疹不透，热痢，泄泻，眩晕头痛，中风偏瘫，胸痹心痛，酒毒伤中。

鸡血藤：活血补血，调经止痛，舒筋活络。用于月经不调，痛经，经闭，风湿痹痛，麻木瘫痪，血虚萎黄。

吴茱萸：散寒止痛，降逆止呕，助阳止泻。用于厥阴头痛，寒疝腹痛，寒湿脚气，经行腹痛，脘腹胀痛，呕吐吐酸，五更泄泻。

党参：健脾益肺，养血生津。用于脾肺气虚，食少倦怠，咳嗽虚喘，气血不足，面色萎黄，心悸气短，津伤口渴，内热消渴。

干姜：温中散寒，回阳通脉，温肺化饮。用于脘腹冷痛，呕吐泄泻，肢冷脉微，寒饮喘咳。

桂枝：发汗解肌，温通经脉，助阳化气，平冲降气。用于风寒感冒，脘腹冷痛，血寒经闭，关节痹痛，痰饮，水肿，心悸，奔豚。

防治寒冷损伤的肉桂提取物中药复方的制备方法包括：

步骤一：取干姜、肉桂、葛根、鸡血藤、桂枝，置于乙醇溶液中回流提取，得到药液1；

步骤二：取炙甘草、五加皮、吴茱萸、党参于液相水中提取，得到药液2；

步骤三：将药液1及药液2混合后置于旋转蒸发仪中浓缩成浸膏；再将肉桂提取物加入到浸膏中，得到肉桂提取物中药复方。

步骤一中的药液1中乙醇溶液采用60～80％浓度的乙醇水溶液，提取次数为1～4次，每次1～3小时，药材与乙醇水的比值为1:(5～20)；药液2中采用80～90℃的液相水提取1～4次，每次1～3小时，药材与液相水的比值为1:(5～20)。

中药复方二

防治寒冷损伤的肉桂提取物中药复方，包括以下重量份数的：干姜20～30份，肉桂10～15份，肉桂提取物0.0005～0.0015份。

防治寒冷损伤的肉桂提取物中药复方二的制备方法是：取干姜、肉桂，置于70％乙醇中85℃回流提取1～4次每次1～3小时，1:(5～20)倍溶剂，得到药液。喷雾干燥后得干粉，出膏率约12％。最后加肉桂提取物。

中药复方三

防治寒冷损伤的肉桂提取物中药复方，包括以下重量份数的：肉桂10～20份，白芍10～20份，肉桂提取物0.0005～0.0015份。

防治寒冷损伤的肉桂提取物中药复方三的制备方法是：

取肉桂、白芍，置于70％乙醇中85℃回流提取1～4次每次1～3小时，1:(5～20)倍溶剂，得到药液。喷雾干燥后得干粉，出膏率约10.31％。最后加入肉桂提取物。

中药复方四

防治寒冷损伤的肉桂提取物中药复方，包括以下重量份数的：肉桂30～20份，甘草15～10份，肉桂提取物0.0005～0.0015份。

防治寒冷损伤的肉桂提取物中药复方四的制备方法是：

取肉桂、甘草，置于70％乙醇中85℃回流提取1～4次每次1～3小时，1:(5～20)倍溶剂，得到药液。喷雾干燥后得干粉，出膏率约17.02％。最后加入肉桂提取物。

通过以下实施例进一步详细说明本发明。

实施例1

制备肉桂提取物。具体制备方法是：

步骤一：粗制肉桂提取物：取干燥肉桂25kg，粉碎后用70％的乙醇溶液室温下提取3次，每次7天，合并乙醇提取液并减压回收浓缩成浸膏，得到总膏，热水将总膏分散至混悬状，依次用极性递增的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到粗制肉桂提取物；出膏率约为16％。

步骤二：精提肉桂提取物：分别提取出六种化合物；

将粗制肉桂提取物经半制备hplc纯化得到化合物1；具体方法是石油醚部位硅胶拌样上柱，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯系统梯度系统10％-100％，以tlc指导分段，分为5个流分fr.1～5。将流分fr.3经柱层析，石油醚/乙酸乙酯系统梯度系统10％-100％洗脱，得流分fr.3-1～3.4。fr.3-2经半制备hplc纯化得到化合物1。

乙酸乙酯部位硅胶拌样上柱，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇系统梯度系统10％-100％，以tlc指导分段，乙酸乙酯部位被分为7个流分fr.1～7；将流分fr.4经ods柱进行划段处理，用不同比例的甲醇/水洗脱，得到流分fr.4-1～4-4；fr.4-2以体积比为6:1的二氯甲烷/甲醇为洗脱剂进行洗脱，经过凝胶柱甲醇洗脱分离，再经半制备hplc纯化得到化合物4；

取fr.6经ods柱进行划段处理，得到fr.6-1～6-3，fr.6-3经硅胶洗脱，反复ods、凝胶sephdexlh-20纯化后，再经过半制备液相得化合物2；

取fr.7经反相mci柱色谱甲醇/水梯度洗脱，得到fr.7-1～7-8，fr.7-6经过sephadexlh20凝胶柱色谱，体积比1:1的二氯甲烷/甲醇洗脱，得到fr.7-6-1～fr.7-6-6；fr.7-6-6经过半制备液相纯化后得到化合物5；

正丁醇部位通过硅胶柱层析划段处理，用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，以tlc指导分段，得到7个流分一～七；流分一经ods层析柱划段后，反复交替使用正反相硅胶、凝胶lh-20和半制备hplc纯化得到化合物3；流分五经ods层析柱划段后，反复交替使用正反相硅胶、凝胶lh-20和半制备hplc纯化得到化合物6。

在实际测试肉桂提取物研究中为了后续应用的简便，后续的提及的测试过程是将上述六种化合物混合，混合比例按照肉桂25kg中提取的六种化合物的量直接混合，即为肉桂提取物。

实施例2

肉桂提取物促进棕色脂肪细胞产热的研究

1)仪器与试剂：dmem培养基(hyclone公司)；胎牛血清(hyclone公司)；ckx31型倒置显微镜(菲律宾奥林巴斯公司)；恒温co2培养箱(美国thermo公司)；5810r型台式高速低温离心机(德国eppendorf公司)。

2)细胞培养：原代培养得到的前脂肪细胞生长在含10％fbs的dmem完全培养基，接近单层融合(汇合度大于90％)时更换为诱导分化液i(dmem完全培养基加入0.5mmol/libmx、1μmol/l地塞米松、10μg/ml胰岛素)，记为诱导分化第0天，继续培养；于诱导分化第2天，即48h后将培养液换为诱导分化液ii(dmem完全培养基加入10μg/ml胰岛素)，继续培养。以后每2天更换成dmem培养液1次并在显微镜下观察细胞形态变化。37℃培养箱中培养(5％co2，相对湿度90％)，待细胞诱导分化成熟后，进行下步试验。

3)油红o染色：原代前棕色脂肪细胞诱导分化成熟后，分别加入相应浓度肉桂提取物，48h后弃去原培养液，每孔加入1ml10％中性甲醛溶液固定细胞，室温约1h，向固定好的细胞中加入油红o应用液染色。每孔加入1ml异丙醇萃取油红，于微量振荡仪振荡10min，在酶联免疫检测仪波长为570nm处测od值(记为吸光度a值)。计算脂滴消耗率(脂滴消耗率＝1-a样品/a对照)，实验重复3次。结果显示：与对照组相比，肉桂提取物可以提高原代棕色脂肪细胞的脂滴消耗率。结果表明：肉桂提取物可能通过消耗棕色脂肪组织中脂滴而增加能量消耗。具体结果如图1所示。

4)线粒体膜电位测定：原代前棕色脂肪细胞诱导分化成熟后，分别加入相应浓度的肉桂提取物及cl-316243作用48h后进行实验。具体实验步骤按照碧云天生物公司“线粒体膜电位检测试剂盒(jc-1)”说明书进行。具体结果如图2所示。结果：与对照组相比，cl-316243阳性药组可显著降低原代棕色脂肪细胞中的线粒体膜电位，肉桂提取物呈浓度依赖性减少细胞中线粒体膜电位。结果说明：肉桂提取物可能改变线粒体膜内外的电子转运。

5)线粒体氧化呼吸水平测定：实验采用“agilentseahorsexfpcellmitostresstestkit”试剂盒测定棕色脂肪细胞的线粒体氧化呼吸水平。在试剂盒配置的培养板中接种原代前棕色脂肪细胞，诱导分化成熟后加入各相应浓度的肉桂提取物、cl316243，作用48小时后按照试剂盒说明书进行实验。具体结果如图3所示。结果：与对照组相比，cl316243阳性药组可显著降低原代棕色脂肪细胞的最大氧化呼吸速率，肉桂提取物呈浓度依赖性减少细胞的最大氧化呼吸能力。结果说明：肉桂提取物可能改变了棕色脂肪细胞的线粒体氧化呼吸水平，从而发生了氧化呼吸与atp生成的解偶联。

6)atp含量测定：实验采用北京索莱宝科技有限公司的“atp含量检测试剂盒”测定棕色脂肪细胞的atp生成量。原代前脂肪细胞经诱导分化成熟后，加入相应浓度的肉桂提取物和cl316243，作用48小时后，按照说明书完成atp含量测定。结果：与对照组相比，肉桂提取物与cl316243可显著降低atp的生成量，且肉桂提取物组呈剂量依赖性。具体结果如图4所示。结果说明：肉桂提取物减少了棕色脂肪细胞内的atp生成，可能发生了线粒体内膜上的质子传递与atp生成的解偶联，从而把势能转化为热能。

7)产热蛋白ucp1及通路相关蛋白的含量测定：原代脂肪细胞经诱导分化成熟后，加入阳性药cl316243和相应浓度的肉桂提取物，作用48小时后，提细胞蛋白，采用上海碧云天生物技术有限公司的“bca蛋白浓度测定试剂盒”进行蛋白定量，按照说明书完成蛋白浓度测定。采用westernblot法测定给药后的棕色脂肪细胞中ucp1、pgc1-α、prdm16、sirt1、hsl蛋白表达情况。具体结果如图5-图9所示。结果显示：肉桂提取物可以增加棕色脂肪细胞中ucp1、pgc1-α、prdm16、hsl的蛋白表达，且呈浓度依赖性升高。结果说明：肉桂提取物可能通过增加bat中产热相关蛋白ucp1、pgc1-α、prdm16及脂肪降解相关蛋白hsl的表达水平而提高bat的产热能力，且这一过程与sirt1的上调密切相关。

以下为结合附图，简要说明实验现象及结果：

由图1油红o染色的结果可知，与对照组比较，不同浓度肉桂提取物的脂滴数量明显少于对照组，作用48h后，肉桂提取物可呈浓度依赖性消耗棕色脂肪细胞生成的脂滴，0.3g/l、0.6g/l、1.2g/l肉桂提取物(按生药量计)均可消耗脂滴，且具有统计学意义。“*”p<0.5，“*”p<0.01，代表两组间具有显著差异。

由图2结果可知肉桂提取物可显著降低棕色脂肪细胞的线粒体膜电位水平，且呈浓度依赖性。线粒体膜电位检测以jc-1为探针，通过荧光强度检测线粒体膜电位的变化。线粒体膜电位高时，jc-1聚集在线粒体基质、形成聚合物，产生红色荧光；线粒体膜电位低时，jc-1不能聚集在线粒体基质，不能形成聚合物而为单体，产生绿色荧光。由此，可通过荧光颜色的变化来检测线粒体膜电位的变化。通过红绿荧光的比例来衡量线粒体内膜的电子转运变化。

由图3结果可知肉桂提取物在给药棕色脂肪细胞48小时后，呈浓度依赖性的减少线粒体氧化呼吸水平，提示可能发生了线粒体氧化呼吸与atp生成的解偶联。

由图4结果可知，与对照组相比，cl-316243可显著降低细胞中的atp含量，不同浓度的肉桂提取物呈浓度依赖性减少棕色脂肪细胞中的atp含量。

由图5-图9可知，与对照组相比，肉桂提取物可呈浓度依赖性的增加棕色脂肪细胞中ucp1、pgc1-α、prdm16、sirt1及hsl的蛋白水平，且浓度为1.2g/l肉桂提取物(按生药量计)可显著提高相关蛋白的表达。结果说明：肉桂提取物可提高棕色脂肪细胞中的产热蛋白水平，如ucp1、pgc1-α、prdm16，且可提高上游信号sirt1及脂肪代谢相关蛋白hsl的表达。

实施例3

肉桂提取物对昆明小鼠冷暴露条件下产热能力的提高。

1)仪器与试剂：cl-316243(美国sigma公司，纯度>98％)；af-023minute^tm脂肪蛋白组分分离试剂盒(invent，美国)；细胞线粒体氧化呼吸测定试剂盒(agilentseahorsexfpcellmitostresstestkit，美国)；bca蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司的)；甘油三脂含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；小鼠肛温计(北京众实迪创科技发展有限责任公司)；红外热像仪(e5，美国flir)；石蜡切片机(rm2145，德国leica)；恒温实验动物冰箱(rxz-0250，海尔公司)。

2)实验动物分组及给药方法：昆明小鼠56只，按体重随机分成7组：空白对照组、模型对照组、cl-316243组(1mg/kg)、肉桂提取物0.5625g/kg、1.125g/kg、2.25g/kg剂量组(按生药量计)，每组10只。小鼠以0.1ml/10g的体积灌胃给药，空白对照组和模型对照组分别灌胃给予等体积生理盐水，连续给药14天。

3)冷暴露实验：各实验组小鼠连续给药14d后，把各给药组小鼠放至4℃恒温实验冰箱中，240min后取出测定各组小鼠冷暴露后肛温及体表温度。另取平行给药组小鼠，放至-20℃恒温实验冰箱中，60min后测量小鼠取出后肛温及体表温度。结果说明：肉桂提取物能显著提高冷暴露下(4℃、-20℃)小鼠的肛温及体表温度，且呈剂量依赖性。具体结果如图10-图15所示。

4)昆明小鼠的脂肪组织形态学改变：采用he染色法考察脂肪组织的形态学改变，免疫组化法检测脂肪组织中产热蛋白ucp1的表达：取组织样本经固定、脱水透明、浸蜡包埋、切片、脱蜡染色，获得he染色结果，观察脂肪组织脂滴变化；组织固定、脱蜡、抗原修复、背景封闭、孵育抗体、显微镜观察，获得免疫组化结果，观察脂肪组织内线粒体含量及ucp1的表达情况。结果说明：肉桂提取物可增加具体结果如图16、图17、图20、图21所示。

5)产热相关蛋白的含量测定：昆明小鼠经冷暴露后，取棕色脂肪组织，采用英文特生物技术股份有限公司的“af-023minute^tm脂肪蛋白组分分离试剂盒”提组织蛋白，并采用上海碧云天生物技术有限公司的“bca蛋白浓度测定试剂盒”进行蛋白定量，按照说明书完成蛋白浓度测定。采用westernblot法测定给药后的脂肪组织中ucp1、pgc1-α蛋白表达情况。结果说明：肉桂提取物可提高昆明小鼠棕色中产热蛋白的表达水平。具体结果如图18、图19所示。

6)小鼠脂质代谢水平测定：甘油三酯(tg)及游离脂肪酸(ffa)作为脂肪组织的底物，当棕色脂肪被激活后、ucp1上调，tg作为燃料降解为游离脂肪酸，从而发挥体内的产热作用。采用北京索莱宝科技有限公司的“甘油三脂含量检测试剂盒”测定血清的tg水平。采用南京建成生物工程研究所有限公司的“游离脂肪酸测定试剂盒(比色法)”测定血清中ffa水平。结果说明：肉桂提取物可呈剂量依赖性的降低血清中的tg水平、提高血清中的ffa水平。具体结果如图22、图23所示。

7)小鼠血生化指标的测定：小鼠于-20℃冷暴露60min，连续14天后，测定小鼠血清肝肾功能指标，采用南京建成生物工程研究所有限公司的“尿酸测试盒(酶比色法)”、“肌酐测定试剂盒”、“天门冬氨酸氨基转移酶测试盒”、“丙氨酸氨基转移酶测试盒”测定冷暴露后肝肾功能水平变化，考察不同给药剂量肉桂提取物对寒冷损伤的保护作用、以及冷暴露环境下对肝肾损伤的保护作用。结果说明：给药组小鼠的肝肾功能与模型对照组具有显著差异，肉桂提取物可降低由冷暴露造成的肝肾损伤。具体结果如图24-图27所示。

8)冷暴露下小鼠生存时间的考察：本发明通过比较各组小鼠生存时间，探讨肉桂对耐寒能力的改善作用。小鼠给药14天后，将模型对照组及给药组小鼠置于-20℃恒温实验冰箱内，每隔10min观察一次小鼠状态，记录各组小鼠的死亡时间。结果：与模型组相比，肉桂提取物可显著延长冷暴露环境下小鼠的生存时间。具体结果如图28所示。

9)分子对接：是通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法。主要研究分子间(如配体和受体)相互作用，并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法。

在rcsb网站(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中搜索并下载ucp2蛋白晶体结构(pdbid：2lck)；在unitprot网站中(http://www.uniprot.org/)搜索并下载ucp1蛋白氨基酸序列(p25874.fasta)；将2lck蛋白结构及p25874.fasta序列导入discoverystudio3.0软件中，利用protocolexplorer|proteinmodeling|homologybuilding模块在ucp2结构(2lck)的基础上构建出ucp1的结构，并将其命名为ucp1.pdb。将构建好的ucp1.pdb蛋白导入sybyl8.1软件中并对其进行结构优化。将优化好的蛋白导入discoverystudio3.0，通过其关键氨基酸设定活性腔，并将肉桂中的主要天然产物见图29，导入discoverystudio3.0经过小分子优化后与同源模建出的ucp1进行分子对接，随后分析与ucp1的关键氨基酸结合的情况。结果表明：6种化合物均能与ucp1的关键氨基酸结合，结果见图30。

以下为结合附图，简要说明实验现象及结果：

由图10-图15，与模型组相比，在-20℃冷暴露60min后，肉桂提取物各给药组的小鼠具有较高的肛温及体表温度。同时，在-4℃冷暴露240min，肉桂提取物仍可以维持小鼠的肛温及体表温度水平。结果表明：肉桂提取物可在冷暴露环境下维持小鼠的肛温及体表温度，提高小鼠的耐寒能力。

由图16、图17、图20、图21可知，与模型组相比，肉桂提取物组可在冷暴露下减少棕色和白色脂肪组织中脂滴的体积，增加线粒体含量。免疫组化结果显示，肉桂提取物组和阳性药组均可以增加脂肪组织上的ucp1表达水平。

由图18、图19可知，与模型组相比，肉桂提取物组可提高棕色脂肪组织内的产热相关蛋白ucp1、pgc1-α的表达，且呈剂量依赖性。提示：肉桂提取物可通过增加棕色脂肪内的产热特异性蛋白，从而发挥产热作用。

由图22、图23可知，与模型组相比，给药后急性冷暴露小鼠血清中tg水平下降，且呈剂量依赖性，而ffa的水平显著增加。结果表明：肉桂提取物可以通过减少体内的tg，代谢为ffa，从而发挥产热作用。

由图24-图27可知，与模型相比，肉桂给药组及阳性药组均能降低冷暴露后小鼠血清的alt、ast、scr、bun，且呈剂量依赖性。结果表明：肉桂提取物给药组可降低寒冷环境对肝脏及肾脏的生化指标改变，从而能够抵抗由于寒冷造成的损伤。

由图28可知，在-20℃条件下，肉桂提取物不同给药组均能延长昆明小鼠在寒冷环境下的生存时间，且呈剂量依赖性。结果表明：肉桂提取物可延长冷暴露条件下的小鼠生存时间。

由图29可知，经查阅文献，获取肉桂中6种化合物。

由图30可知，进行分子对接，得到肉桂中的六种化合物能与ucp1的关键氨基酸结合。结果表明：肉桂提取物中发挥产热作用的化合物有为6种酚酸类化合物，且可与ucp1的关键氨基酸结合。

实施例4

中药复方一的具体组分含量：

肉桂15g、肉桂提取物0.010份、炙甘草15g、五加皮15g、葛根15g、鸡血藤15g、吴茱萸15g、党参15g、干姜10g、桂枝10g。

中药复方一的具体制备工艺：

步骤一：取干姜、肉桂、葛根、鸡血藤、桂枝，置于75％乙醇中85℃回流提取2次每次2小时，药材与乙醇溶液的比值为1:10，得到药液1。

步骤二：取炙甘草、五加皮、吴茱萸、党参于液相水中85℃提取2次，每次2小时，药材与液相水的比值为1:10，得到药液2。

步骤三：将药液1及药液2混合后置于旋转蒸发仪中浓缩成浸膏。浸膏得率约为28％。最后将肉桂提取物加入到浸膏中，得到肉桂提取物中药复方。

实施例5

中药复方二的具体组分含量：

干姜20份、肉桂10份，肉桂提取物0.010份。

中药复方二的具体的制备方法是：

取干姜、肉桂，置于70％乙醇中85℃回流提取2次每次2小时，药材与乙醇溶液的比值为1:10，得到药液。喷雾干燥后得干粉，出膏率约12％。最后加入0.010份的肉桂提取物。

实施例6

中药复方三的具体组分含量：

肉桂20份，白芍10份，肉桂提取物0.010份。

中药复方三的具体的制备方法是：

取肉桂、白芍，置于70％乙醇中85℃回流提取2次每次2小时，药材与乙醇溶液的比值为1:10，得到药液。喷雾干燥后得干粉，出膏率约10.31％。最后加入0.010份的肉桂提取物。

实施例7

中药复方四的具体组分含量：

肉桂20份、甘草10份，肉桂提取物0.010份。

中药复方四的具体的制备方法是：

取肉桂、甘草，置于70％乙醇中85℃回流提取2次每次2小时，药材与乙醇溶液的比值为1:10，得到药液。喷雾干燥后得干粉，出膏率约17.02％。最后加入0.010份的肉桂提取物。

实施例8

含肉桂提取物的中药复方一、二、三、四对棕色脂肪细胞及昆明小鼠产热能力的影响。

相关实验方法与肉桂提取物一致。

以下为结合附图，简要说明实验现象及结果：

由图31-图35可知，含肉桂中药复方1可显著提高冷暴露后(-20℃)的小鼠肛温水平、改善肛温下降情况。同时，降低小鼠白色脂肪组织和棕色脂肪组织的重量。

由图36-39可知，含肉桂中药复方1可减少脂肪组织的脂滴大小，同时，免疫组化结果可知，可增加脂肪组织的ucp1表达。

由图40-41可知，经过单次冷暴露实验，未发生肝肾损伤的情况。

由图42-图46可知，含肉桂中药复方1可提高棕色脂肪及白色脂肪组织内的产热相关蛋白ucp1、pgc1的表达，且这与pparγ和sirt1等的信号相关。同时，在白色脂肪组织中，含肉桂中药复方1可提高hsl的表达，说明产热作用可能与脂肪的代谢相关。

由图47可知，肉桂中药复方1可延长小鼠在寒冷环境下的存活率。

由图48-图49可知，通过油红o染色结果可知，含肉桂中药复方1可呈剂量依赖性的降低脂滴的形成。同时，含肉桂中药复方1可显著降低棕色脂肪细胞内的atp生成水平，这说明含肉桂中药复方1发挥了影响线粒体内atp生成的作用。

由图50-图54可知，含肉桂中药复方1可呈剂量依赖性的提高棕色脂肪细胞内的ucp1、pgc1等产热蛋白表达，且与pparγ、hsl和sirt1等信号的上调有关。

由图55可知，在液相图谱中显示，含肉桂中药复方1含肉桂醛，葛根素，6-姜辣素，甘草次酸。

由图56-图58可知，含肉桂提取物复方中药2、3、4可显著改善冷暴露(-20℃)环境下的肛温下降情况，能提高寒冷环境下的肛温水平。

由图59-图61可知，含肉桂提取物复方中药2、3、4能改善连续14天冷暴露造成的肝肾功能生化指标。结果说明，含肉桂提取物复方中药2、3、4能抵抗寒冷环境造成的脏器损伤。

实施例9

中药复方一的具体组分含量：

肉桂30g、肉桂提取物0.0015份、炙甘草30g、五加皮30g、葛根20g、鸡血藤20g、吴茱萸20g、党参20g、干姜20g、桂枝20g。

中药复方一的具体制备工艺：

步骤一：取干姜、肉桂、葛根、鸡血藤、桂枝，置于80％乙醇中85℃回流提取4次每次1小时，药材与乙醇溶液的比值为1:5，得到药液1。

步骤二：取炙甘草、五加皮、吴茱萸、党参于液相水中80℃提取4次，每次3小时，药材与液相水的比值为1:5，得到药液2。

步骤三：将药液1及药液2混合后置于旋转蒸发仪中浓缩成浸膏。浸膏得率约为20％。最后将肉桂提取物加入到浸膏中，得到肉桂提取物中药复方。

实施例10

中药复方一的具体组分含量：

肉桂20g、肉桂提取物0.0005份、炙甘草20g、五加皮20g、葛根16g、鸡血藤18g、吴茱萸18g、党参18g、干姜18g、桂枝5g。

中药复方一的具体制备工艺：

步骤一：取干姜、肉桂、葛根、鸡血藤、桂枝，置于60％乙醇中80℃回流提取1次每次3小时，药材与乙醇溶液的比值为1:20，得到药液1。

步骤二：取炙甘草、五加皮、吴茱萸、党参于液相水中90℃提取1次，每次1小时，药材与液相水的比值为1:20，得到药液2。

步骤三：将药液1及药液2混合后置于旋转蒸发仪中浓缩成浸膏。浸膏得率约为18％。最后将肉桂提取物加入到浸膏中，得到肉桂提取物中药复方。

实施例11

中药复方二的具体组分含量：

干姜30份、肉桂15份，肉桂提取物0.0015份。

中药复方二的具体的制备方法是：

取干姜、肉桂，置于70％乙醇中85℃回流提取1次每次3小时，药材与乙醇溶液的比值为1:20，得到药液。喷雾干燥后得干粉，出膏率约10％。最后加入0.0015份的肉桂提取物。

实施例12

中药复方三的具体组分含量：

肉桂15份，白芍20份，肉桂提取物0.0015份。

中药复方三的具体的制备方法是：

取肉桂、白芍，置于70％乙醇中80℃回流提取4次每次1小时，药材与乙醇溶液的比值为1:20，得到药液。喷雾干燥后得干粉，出膏率约8％。最后加入0.0015份的肉桂提取物。

总结：肉桂提取物与其中药复方可促进棕色脂肪细胞激活，增加产热蛋白的表达，同时降低线粒体膜电位，使atp生成与线粒体氧化呼吸解偶联，从而产热的作用。肉桂提取物与其中药复方可显著提高冷暴露后(-20℃、4℃)小鼠的肛温及体表温度，显著延长冷暴露环境下小鼠的生存时间。此外，肉桂提取物及其中药复方可通过增加bat及wat中线粒体含量及ucp1表达量，从而提高产热能力，增强机体抵御寒冷能力。再有，经分子对接可见，肉桂中6种化合物可与ucp1关键氨基酸直接作用。液相色谱条件下，肉桂复方1中的主要化合物为：葛根素，肉桂醛，6-姜辣素，甘草次酸。肉桂中药复方1、2、3、4均能改善寒冷环境造成的体温下降和脏器损伤情况。