本发明涉及植物发酵领域，尤其是关于一种植物发酵物及其制备方法与用于胃脏保健的用途。
背景技术：
：：发炎反应为血管系统的组织对致炎因子及局部损伤所发生的防御性反应，主要由组织受到外伤、出血或病原感染等刺激所激发的生理反应，其中包含红肿、发热、疼痛等症状。发炎反应是先天免疫系统为移除有害的刺激或病原体并促进组织修复等的保护措施，通常情况下，发炎反应是有益的，然而，有时发炎反应可能引起人体自身免疫系统的过敏反应，会导致如类风湿性关节炎和红斑狼疮症等免疫系统过敏病症。其中，类固醇、非固醇类抗发炎药物、以及抗组织胺等药物，是目前医药上常用于抑制发炎反应的药物，但该些药物皆有其各自的副作用。另外，若身体的发炎反应持续性且全身性的发生，免疫细胞会一直不断重复的招募、增殖、分化、迁移等，并持续释放细胞激素引起更多的发炎反应，此种现象称为慢性发炎，而目前已有许多研究证实慢性发炎与动脉硬化、心肌梗塞、糖尿病、阿兹海默症等疾病形成有关。然而，因慢性发炎的机制比急性发炎复杂许多，无法透过上述的单一药物而轻易获得改善，因此目前仅能建议患者藉由改善饮食习惯、生活作息等方式来改善慢性发炎的症状。胃脏是重要消化器官之一，若未善加保护，不但影响食物的消化，也容易引发胃病。尤其现代人在快节奏的步调下生活，加上不健康的饮食习惯，很容易与胃病为伍，不但影响健康，也影响饮生活质量。胃炎是指胃黏膜出现炎症反应，可分为急性胃炎、慢性胃炎以及特定型胃炎，常见的致病成因包括药物、饮酒以及幽门螺旋杆菌。目前，胃炎的治疗以药物为主，并合并以调整生活习惯来改善。胃幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori)是一种微需氧的革兰氏阴性细菌，可产生尿素酶(urease)分解尿素形成氨，以中和胃酸，使得其能够生长在强酸环境下的胃部黏膜层；研究已显示胃幽门螺旋杆菌为造成慢性胃炎及消化性溃疡的主因，其亦与胃癌、胃淋巴癌的形成相关。因此，若能够增加体内抗胃幽门螺旋杆菌的活性，则能够达到肠胃道保健的功效。综上所述，为能更有效抗发炎又减轻药物的副作用，特别是针对维持人体正常机能非常重要的胃脏，开发一种天然成分且能有效达到胃脏抗发炎反应的组合物，着实有其必要性。技术实现要素：缘此，本发明的一目的在提供一种用于胃脏保健的植物发酵物，其是由以下方法所制成：将莱菔子、山药及山楂以1-3∶1-5∶1-3的重量百分比混合成一混合物，并经由一溶剂萃取获得一植物萃取物，再经一发酵方法所制成。本发明的另一目的在提供一种如前所述的植物发酵物用于制备一胃脏保健的组合物的用途；且该植物发酵物的有效浓度为至少1％(v/v)。在本发明的一实施例中，该植物萃取物是将该莱菔子、该山药、及该山楂的混合物以水为溶剂在50-100℃下萃取0.5-3小时所获得；且该混合物及水是以3-11∶20-40(w/w)的比例混合。在本发明的又一实施例中，该发酵方法是包括先经由一酵母菌(saccharomycescerevisiae)与一胚芽乳杆菌(lactobacillusplantarum)进行发酵后，再经由一醋酸杆菌(acetobacteraceti)进行发酵而获得；该酵母菌的添加量为所述植物萃取物质量的0.01-0.5％(w/w)；该胚芽乳杆菌的添加量为所述植物萃取物质量的0.01-0.25％(w/w)；该醋酸杆菌的添加量为所述植物萃取物质量的1-20％(w/w)；且该酵母菌、该胚芽乳杆菌、及该醋酸杆菌的发酵时间比为1-5∶3-15。在本发明的又一实施例中，该植物发酵物是降低一胃脏细胞中介白素-1β(interleukin-1β，il-1β)基因、介白素-23(interleukin-23，il-23)基因、介白素-12a(interleukin-12a，il-12a)基因、介白素-3(interleukin-3，il-3)基因、及/或肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)基因的表现量。在本发明的另一实施例中，该植物发酵物是提升一胃脏细胞中乙型转化生长因子(transforminggrowthfactorβ，tgf-β)基因的表现量。在本发明的又一实施例中，该植物发酵物是提升抑制胃幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori)的生长。在本发明的又一实施例中，该植物发酵物是提升一胃脏细胞的抗发炎活性。本发明将莱菔子、山药、及山楂混合物的萃取物先以酵母菌及胚芽乳杆菌进行发酵，再以醋酸杆菌进行发酵而获得的植物发酵物，能直接且有效抑制胃幽门螺旋杆菌的生长，亦能有效降低胃脏细胞中会促进发炎反应的il-1β基因、il-23基因、il-12a基因、il-3基因、及tnf-α基因的表现量，并同时提升会抑制发炎反应的tgfβ基因的表现量；中医五行经络是气血运行的通道，如经络通则百病消，而本发明的植物发酵物能够提升体内抗胃幽门杆菌的活性，并同时降低胃脏的发炎反应，能有效达到胃部保健的功效。因此，本发明的植物发酵物可用于制备胃脏保健的组合物的用途，且该组合物是一医药品、或一食品，可藉由口服、涂抹等方式给予一个体。以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。附图说明图1是本发明的一实施例的植物发酵物抑制胃幽门螺旋杆菌生长的照片；图2是本发明的一实施例的植物发酵物降低胃脏细胞中il-1β基因、il-23基因、il-12a基因、及il-3基因的表现量的柱形图；*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001；图3是本发明的一实施例的植物发酵物降低胃脏细胞中tnf-α基因、及提升tgfβ基因的表现量的柱形图；*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001。具体实施方式本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。本文中涉及的菌种均为现有菌种，可由购买方式获得。使用excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(sd)表示，个此之间的差异以学生t检验(student′st-test)分析。莱菔子(raphanisemen)是萝卜(raphanussativusl.)的干燥成熟种子，萝卜为十字花科(cruciferae)莱服属(raphanus)一年或二年生草本植物。莱菔子呈卵圆形或椭圆形的扁状，长约2.5-4毫米、宽约2-3毫米，表面为黄棕色、红棕色或灰棕色，一端有深棕色的圆形种脐，一侧则有数条纵沟，种皮薄而脆，具有二呈黄白色的子叶，具有油性。莱菔子味道淡，带有微苦及辛味。莱菔子有化痰止咳的功效。山药(dioscoreabatatas)为薯蓣科(dioscoreaceae)薯蓣属(dioscorea)多年生蔓性草本植物，又称薯蓣、野脚板薯、淮山、柱薯等名。山药块茎生长于地下，呈球形或圆筒形，且表皮为黑褐色或深红色，具有密生须根，块茎的断面干时为白色，可做实用或药用，山药块茎具有清热解毒、祛痰、止泻、消渴、及降血糖的功效。山楂(crataeguspinnatifidabge.)为蔷薇科(rosaceae)山楂属(crataegus)落叶乔木植物，又称山里红、红果、酸楂、赤枣、海红等名。山楂果实呈近球形或梨形，直径约1-1.5公分，果皮为带有浅色斑点的深红色，且存有萼片；具有3-5个果小核，外表稍具棱角，内面则两侧平滑；山楂的花期为5-6月，果期则为9-10月。山楂果实味酸，可供食用，例如做成果酱或蜜饯；果实干燥后可供药用，具有降血压、降血脂的功效。如本文中所使用的，用语「植物发酵物」意为莱菔子、山药、山楂先以1-3∶1-5∶1-3(w/w)的比例混合后再与溶剂以3-11∶1∶20-40(w/w)的比例经一特定时间与温度萃取而得的萃取物，再以酵母菌、胚芽乳杆菌及醋酸杆菌依序进行一三段式发酵而获得，其中该酵母菌的添加量为0.01-0.5％(w/w)；该胚芽乳杆菌的添加量为0.01-0.25％(w/w)；该醋酸杆菌的添加量为1-20％(w/w)。本文所述的「有效浓度」是表示能有效抑制胃幽门螺旋杆菌生长、降低胃脏细胞中il-1β基因、il-23基因、il-12a基因、il-3基因、及tnf-α基因表现量、及提升其中tgfβ基因表现量所需的本发明植物发酵物的浓度。有效浓度依所作用的对象而可能不同，但可藉由例如剂量递增试验(doseescalation)以实验决定其有效浓度。依据本发明，有关微生物发酵反应的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterileaqueoussolution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterilepowder)、外部制剂(externalpreparation)以及类似物。依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceuticallyacceptablecarrier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种但不限于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspendingagent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegratingagent)、分散剂(dispersingagent)、黏结剂(bindingagent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelatingagent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wettingagent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelayingagent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normalsaline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebufferedsaline，pbs)、含有醇的水性溶液(aqueoussolutioncontainingalcohol)以及它们的组合。依据本发明，该医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteralroutes)来投药：皮下注射(subcutaneousinjection)、表皮内注射(intraepidermalinjection)、皮内注射(intradermalinjection)以及病灶内注射(intralesionalinjection)。依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(foodadditive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermentedfoods)、烘培产品(bakeryproducts)、健康食品(healthfoods)以及膳食补充品(dietarysupplements)。本发明提供一种植物发酵物及其制备方法与其用于护胃保健的用途，本发明的植物发酵物是将莱菔子、山药、山楂与溶剂以1-3∶1-5∶1∶20-40(w/w)的比例经一特定时间与温度萃取而得的萃取物，先以酵母菌及胚芽乳杆菌进行发酵，再以醋酸杆菌进行发酵而获得，其中该酵母菌为bcrc20271的菌株、该胚芽乳杆菌为bcrc910805的菌株、该醋酸杆菌为bcrc11688的菌株。本发明的植物发酵物可有效抑制体内胃幽门螺旋杆菌的生长；降低胃脏细胞中il-1β基因、il-23基因、il-12a基因、il-3基因、及tnf-α基因表现量；并能提升其中tgfβ基因表现量。同时，本发明用于护胃保健的组合物，亦可包含一有效量的植物发酵物及一医药上可接受的载体，该组合物是一医药品、或一食品。以下将详细说明本发明植物发酵物的详细制备方法、该植物发酵物提升肝脏细胞抗氧化活性的功效的测试、以及该植物发酵物提升肝脏细胞中抗老化基因表现量的功效的测试，以证实本发明的植物发酵物可有效抑制体内胃幽门螺旋杆菌的生长、降低胃脏细胞中会促进发炎反应的基因的表现量、并能同时提升其中会抑制发炎反应的基因的表现量，以达到护胃保健的功效。实施例1本发明的植物发酵物的制备方法在本发明一实施例中，将莱菔子、山药的块茎、山楂的果实以1-3∶1-5∶1-3的重量百分比混合后，再将该混合物与水、醇、或醇水混合物的萃取溶剂以3-11∶20-40重量百分比均匀混合，其中萃取溶剂较佳为水，并于50-100℃下同时灭菌萃取0.5-3小时后，将该植物水萃取物冷却至室温供后续二阶段式发酵使用，以下列三种菌依序进行二阶段发酵：酵母菌及胚芽乳杆菌共同殖菌发酵后，再殖以醋酸杆菌进行发酵，此发酵顺序无法前后对调，且其发酵时间比为1-5∶3-15。在本发明一较佳实施例中，首先于该萃取溶液中植入0.01-0.5％(w/w)的酵母菌(saccharomycescerevisiae，购买于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为bcrc20271)以及0.01-0.25％(w/w)的胚芽乳杆菌(lactobacillusplantarumtci028，专利寄存于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为bcrc910805)，于25-35℃下进行前发酵1-5天，实际时间视发酵状态而异。接着直接植入1-20％(w/w)的醋酸杆菌(acetobacteraceti，购买于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为bcrc11688)，于25-35℃下进行后发酵3-15天，实际时间视发酵状态而异；其中，胚芽乳杆菌tci028是已于中国台湾专利申请号第106145146号完成专利寄存。最后在不移除此三种菌的情况下，使用设定的糖度范围2-4°、ph＜4、酒精＞5％等规格，如检验符合该规格，则判定发酵完成并得到发酵液。接着，将该发酵液于45-70℃进行减压浓缩，并以200-400目网筛过滤，再添加40-70％异麦芽寡糖调整规格后，于95-105℃下加热90分钟进行灭菌，即得到本发明的植物发酵物。实施例2本发明的植物发酵物抑制胃幽门螺旋杆菌生长的功效本发明的一实施例为进行本发明的发酵二阶段步骤提高植物发酵物抑制胃幽门螺旋杆菌生长的功效测试，利用抑菌圈法试验其抑菌功效，其中抑菌圈法又称扩散法，是利用待测物在洋菜胶中扩散使其周围的细菌生长受到抑制而形成透明圈，即抑菌圈，并根据抑菌圈的大小以判定待测物的抑菌效用的方法，常用于抗生素产生菌的分离筛选。首先，将1％的胃幽门螺旋杆菌(购买于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为bcrc15415)接种于含有5％羊血(sheepblood，购自启新生物科技公司，中国台湾)的mrsbroth(deman，rogosaandsharpe，bddifcotmlactobacillimrsbroth)中，于37℃下培养4天后，取500μl的该胃幽门螺旋杆菌的菌液涂布于血盘(ppmbloodagarplate(bap)(tsawith5％sheepblood)，购自启新生物科技公司，中国台湾)上。确认菌液接吸收后，使用1mm的玻璃棒在血盘上打一洞，并将血盘分成以下三组：(1)仅加入水的空白控制组、(2)加入50-100μl经过适当稀释(1-5倍稀释)的前述植物水萃取物的比较组、及(3)加入50-100μl经过适当稀释(1-5倍稀释)的本发明植物发酵物的实验组，其中第(2)组及第(3)组的稀释倍率相同，接着将各组于37℃下培养3-4天后，观察各组产生抑菌圈的拮抗结果。本发明的植物发酵物抑制胃幽门螺旋杆菌生长的的实验结果如图1所示。经本发明的植物发酵物作用后，在血盘的洞周围形成一明显的抑菌圈；经植物水萃取物作用后，与空白控制组相同，皆未产生抑菌圈。此结果显示本发明的植物发酵物在经过本发明的微生物二阶段发酵步骤后，能有效抑制胃幽门螺旋杆菌的生长，能够提升体内抗胃幽门杆菌的活性，以达到胃部保健的功效。实施例3本发明的植物发酵物调控胃脏细胞中基因表现量的功效本发明的一实施例为使用人类胃脏上皮细胞ags细胞进行本发明的发酵二阶段步骤提高植物发酵物调控胃脏细胞中抗发炎基因表现量的功效测试。该ags细胞是购自美国典型培养物保藏中心，编号crl-1739tm，且该细胞是培养于含有10％的胎牛血清(fetalbovineserum，购自gibco，美国)以及90％的rpmi-1640细胞培养液(购自gibco，美国)中，其中加入1％的青霉素-链霉素。首先，将1×106个ags细胞培养于含有2ml上述细胞培养液的6孔培养盘中，于37℃培养16-18小时，接着将细胞分成以下六组：(1)仅加入细胞培养液的空白控制组、(2)加入lps(购自sigma，美国，编号l2880-25mglot#044m4004v)的负控制组、(3)加入1％(v/v)本发明的植物发酵物的实验组、(4)加入1％(v/v)山楂发酵物的比较组、(5)加入1％(v/v)莱菔子发酵物的比较组、及(6)加入1％(v/v)山药发酵物的比较组，并将该些组别的细胞分别于37℃下作用6小时后，测试各组ags细胞中目标基因的表现量；其中，山楂发酵物是将山楂与水以1∶1-1.5的比例混合，并于50-100℃下同时灭菌萃取0.5-3小时后，再以实施例1中相同的二阶段发酵步骤制备所得；莱菔子发酵物是将莱菔子与水以1∶1.5-2.5比例混合，并于50-100℃下同时灭菌萃取0.5-3小时后，再以实施例1中相同的二阶段发酵步骤制备所得；山药发酵物是将山药与水以1∶1.5比例混合，并于50-100℃下同时灭菌萃取0.5-3小时后，再以实施例1中相同的二阶段发酵步骤制备所得。首先，将ags细胞以细胞裂解液(rbbuffer，购自geanaid公司，中国台湾，catno.rbd300)回收细胞后，使用rna萃取试剂套组(购自geneaid公司，中国台湾，catno.rbd300)分别收集该六组细胞内的rna，接着利用iii反转录酶(购自invitrogene公司，美国，编号18080-051)以2000ng的萃取rna为模板，并以表1的组合引物及反转录酶进行反转录作用，以产生该些基因的mrna所相应的cdna产物，接着利用abisteponeplustmreal-timepcrsystem(thermofisherscientific公司，美国)，以及kapasybrfast(购自sigma公司，美国，编号38220000000)将该六组反转录后产物分别以表1的组合引物进行定量实时聚合酶连锁反应(quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qpcr)试验，条件为95℃反应1分钟预热后，再进行以下95℃反应15秒、58℃反应15秒、72℃反应30秒的总共40个循环的程序。用以定量il-1β基因、il-8基因、il-6基因、il-10基因、il-18基因、tnf-α基因、il-16基因、il-23基因、il-12a基因、ifng基因、tgfβ基因、il-3基因、及il-4基因的mrna的表现量，其中定量数值是取由阈值循环数(ct)，而目标基因的mrna相对量是推导自方程式2-δδct，其中δct＝ct比较组或实验组目标基因/控制组目标基因-cttbp(tata结合蛋白，tata-bindingprotein)；δδct＝ct比较组或实验组目标基因-ct控制组目标基因；各组中各基因的foldchange则为2-δδct。接着，再利用excel软件决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001)。表1、定量实时反转录聚合酶连锁反应的组合引物本发明的植物发酵物降低胃脏细胞中il-1β基因、il-23基因、il-12a基因、及il-3基因的表现量的实验结果如图2所示。其中，il-1β基因、il-23基因、il-12a基因、及il-3基因所编码的蛋白质，皆是会促进发炎反应的细胞介质，因此降低该些基因的表现量，能够减缓发炎反应的发生。经本发明的植物发酵物作用后，相较于空白控制组，能分别显著降低ags细胞中il-1β基因、il-23基因、il-12a基因、及il-3基因的表现量达0.84倍、0.82倍、0.74倍、及0.96倍；经负控制组的lps作用后，ags细胞中il-1β基因、ll-23基因、il-12a基因、及il-3基因的表现量皆会上升；经山楂水萃取物后，ags细胞中il-1β基因、il-23基因、il-12a基因、及il-3基因的表现量亦皆会上升；经莱菔子水萃取物作用后，ags细胞中il-1β基因、il-12a基因、及il-3基因的表现量皆会上升，而相较于空白控制组，il-23基因的表现量则会显著降低至0.92倍；经山药水萃取物作用，ags细胞中il-1β基因、il-23基因、il-12a基因、及il-3基因的表现量皆会上升。此些结果显示本发明的植物发酵物在经过本发明的微生物二阶段发酵步骤后，因此能有效降低胃脏上皮细胞中会促进发炎反应的的il-1β基因、il-23基因、il-12a基因、及il-3基因的表现量，能够有效降低胃脏的发炎反应，达到胃部保健的功效。本发明的植物发酵物降低胃脏细胞中tnf-α基因、及提升tgfβ基因的表现量的实验结果如图3所示。经本发明的植物发酵物作用后，相较于空白控制组，能分别显著降低ags细胞中tnf-α基因的表现量达0.6倍，并同时显著提升tgfβ基因的表现量达1.53倍，其余基因的表现量则与控制组相似或差异不大(数据未显示)；经负控制组的lps作用后，ags细胞中tnf-α基因的表现量上升达空白控制组的1.72倍，且tgfβ基因的表现量降低为空白控制组的0.9倍，其余基因的表现量则与控制组相似或差异不大(数据未显示)；经山楂水萃取物后，ags细胞中tnf-α基因的表现量上升达空白控制组的2.1倍，且tgfβ基因的表现量降低为空白控制组的0.89倍，其余基因的表现量则与控制组相似或差异不大(数据未显示)；经莱菔子水萃取物作用后，ags细胞中tnf-α基因、及tgfβ基因的表现量分别上升达空白控制组的1.2倍、及1.04倍，其余基因的表现量则与控制组相似或差异不大(数据未显示)；经山药水萃取物作用，ags细胞中tnf-α基因、及tgfβ基因的表现量分别上升达空白控制组的2.34倍、及1.09倍，其余基因的表现量则与控制组相似或差异不大(数据未显示)。此些结果显示本发明的植物发酵物在经过本发明的微生物二阶段发酵步骤后，能有效降低胃脏上皮细胞中会促进发炎反应的tnf-α基因的表现量，并能同时提升会抑制发炎反应的tgfβ基因的表现量，因此能够有效降低胃脏的发炎反应，达到胃部保健的功效。综上所述，本发明将莱菔子、山药、及山楂混合物的萃取物先以酵母菌及胚芽乳杆菌进行发酵，再以醋酸杆菌进行发酵而获得的植物发酵物，能直接且有效抑制胃幽门螺旋杆菌的生长，亦能有效降低胃脏细胞中会促进发炎反应的il-1β基因、il-23基因、il-12a基因、il-3基因、及tnf-α基因的表现量，并同时提升会抑制发炎反应的tgfβ基因的表现量；中医五行经络是气血运行的通道，如经络通则百病消，而本发明的植物发酵物能够提升体内抗胃幽门杆菌的活性，并同时降低胃脏的发炎反应，能有效达到胃部保健的功效。因此，本发明的植物发酵物可用于制备胃脏保健的组合物的用途，且该组合物是一医药品、或一食品，可藉由口服、涂抹等方式给予一个体。当前第1页12当前第1页12