本发明涉及细胞和亚细胞尺度的光学断层扫描。更具体地，本发明涉及一种用于开发一种或多种形态计量学分类器(classifier)以识别肿瘤突变负荷(tmb)的系统和方法。
背景技术：
：：在过去的140年中，核形态的改变一直是癌症检测的主要组织病理学生物标志物。在许多已发表的研究中证明了细胞核中的染色质组织与dna复制、翻译和蛋白质表达水平上的细胞功能之间的直接联系1-3。特别是，构成核3d架构基础的染色质组织被认为是影响人类癌细胞区域和全球突变率的主要因素4-5。当前治疗多种癌症的方法涉及靶向免疫系统检查点抑制剂ctla4、pd-1和pd-l1，这些蛋白质与使肿瘤逃避免疫系统反应有关6。尽管已经对许多实体瘤使用免疫疗法实现了持久的反应，但是只有一部分患者真正受益。例如，以下是对单药pd-1/pd-l1抑制的响应率：黑色素瘤为40％7、8、非小细胞肺癌(nsclc)为25％9、10、肾细胞癌19％11。此外，当前的免疫疗法具有不利副作用的强大风险12-14。因此，需要能够可靠地预测哪些患者将从免疫疗法中受益的可靠生物标志物，以减轻炎症和免疫相关不良反应对患者的不必要负荷。已识别出几种有助于预测患者对免疫疗法反应的生物标志物15。其中一种生物标志物是pd-l1的表达，这对于治疗反应是必需的，但由于肿瘤的异质性和表达水平的测量，不足以确定反应16-21。最近，人们发现错配修复(mmr)缺陷和肿瘤突变负荷(tmb；基因组dna每兆碱基的体细胞、编码、碱基取代和indel突变的数目)是对免疫疗法反应的良好预测指标。15、22-27mmr缺陷导致基因组和微卫星不稳定性(msi)和高tmb，导致新抗原的表达，这使得肿瘤细胞更容易受到细胞毒性t细胞的攻击。23从实体瘤或ctdna检测tmb的挑战包括无法进行活检、早期疾病检测的灵敏度以及使用配对组织和不同ngs(下一代测序)平台获得的数据缺乏一致性。28、29如下所述，一种更快速、微创且便宜的方法使用visiongatecell-ct技术基于tmb向结构生物标志物赋予形态计量学改变的潜力来检测癌细胞的低tmb与高tmb，其可以在3d光学显微镜下以亚微米空间范围对其进行定量。染色质组织与基因组dna突变率之间已证明的联系表明，细胞核中存在结构生物标志物，可用于检测癌症中的基因组不稳定性和/或更特定类型的基因组改变。通过测量结构生物标志物来检测mmr缺陷和tmb水平的能力得到了许多研究的支持。研究报道了mmr缺陷导致微卫星突变的结直肠癌的组织病理学差异。通常，这些肿瘤是粘液性的，并且分化较差，由相对较大、圆形且规则的细胞组成，具有丰富的两亲性细胞质。30-32另外，alexander等人33报告说，患有msi的结肠癌表现出印戒细胞和筛状形成。gisselsson等人34的一项研究发现，核形状异常是短期肿瘤细胞培养中遗传不稳定的指标。在来自58个骨骼、软组织和上皮细胞的肿瘤的培养物中，核泡、细线和微核更经常发生在含有遗传不稳定因素的肿瘤中。揭示了dna修复与核形态之间联系的其他细胞培养系统包括以下研究。bai等人35报告说，烷基化剂处理已敲除rad9表达的hela细胞会导致异常的核形态。debes等人36表明，将p300转染到培养物中的前列腺癌细胞中可引起可量化的核改变，例如直径、周长和吸光度。p300基因和高度同源的creb结合蛋白(cbp)基因一起在>85％的微卫星不稳定性(msi)+结肠癌细胞系中突变37，并且在晚期肠型胃癌中观察到p300基因座杂合性的丧失。38与肿瘤进展有关的另一种结构生物标志物是中心体。mmr缺陷和基因组不稳定性与结构异常中心体数量的增加密切相关。39、40中心体在许多微管介导的过程中起着至关重要的作用，例如确定细胞的形状和极性。41-44。如上所述，基于mmr和msi中的缺陷的形态计量学改变已经涉及多种类型的癌症。虽然下面提供的数据建立了cell-cttm平台对具有不同驱动突变的肺腺癌细胞系进行形态计量学基因分型的能力，但该技术的实用性应可用于识别多种癌症中的mmr缺陷和突变负荷。在相关的发展中，nelson已经采用光学断层扫描技术对生物细胞进行3d成像，例如在2003年2月18日发布的题目为“apparatusandmethodforimagingsmallobjectsinaflowstreamusingopticaltomography”的美国专利第6,522,775号中所公开的，其全部公开内容通过引用结合到本文中。进一步的重大发展在fauver等人的于2010年6月15日发布的题目为“methodandapparatusforpseudo-projectionformationforopticaltomography”的美国专利第7,738,945号(fauver'945)和fauver等人的于2011年3月15日发布的题目为“focalplanetrackingforopticalmicrotomography”的美国专利第7,907,765号(fauver'765)中教导，fauver'945和fauver'765的全部公开内容在此通过引用并入本文。早期的肺癌检测技术已经由亚利桑那州凤凰城的visiongate，inc.进行了全面开发和商业化，以提供测量优势，这些优势已证明在常规形态细胞学分析的操作特性方面有很大的改善。在这种光学断层扫描系统中的处理始于样品采集和准备。对于肺部疾病的诊断应用，可以在诊所或家中非侵入地采集患者样品。在临床实验室，对样品进行处理以去除非诊断性材料，将其固定然后染色。然后将染色的样品与光学凝胶混合，并将悬浮液注入微毛细管中。当细胞相对于光学断层扫描系统中的图像采集光学器件旋转360度时，采集样品中的对象(例如细胞)的图像。所得图像包括一组来自不同视角的扩展景深图像，称为“伪投影图像”。可以使用反投影和滤波技术在数学上重构伪投影图像集，以产生目标细胞的3d重构。在所有三个维度上具有等距或大致相等的分辨率是3d层析细胞成像的一个优势，特别是对于定量特征测量和图像分析。在其中的教导的基础上，亚利桑那州凤凰城的visiongate，inc.开发了一种早期的肺癌检测技术，以提供测量优势，从而有可能极大地改善常规形态细胞学分析的操作特性。已发表的临床数据45、46显示，使用cell-cttm平台进行的非侵入性痰分析能够以高灵敏度(92％)和特异性(95％)检测早期肺癌。3d重构的数字图像随后仍可用于分析，以便通过测量感兴趣的亚细胞结构、分子或分子探针进行定量。诸如生物细胞之类的对象可以用至少一种吸收性造影剂或标记分子探针染色或标记，并且该生物标志物的测量的量和结构可以产生有关细胞疾病状态的重要信息，包括但不限于各种癌症，例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、胃癌和胰腺癌，以及发育不良的各阶段。然而，直到本文的公开内容为止，还没有可靠的方法用于采用光学断层扫描来检测tmb。通过在此提供用于识别目标细胞中的tmb的方法和系统，患者可以受益于用免疫调节剂(例如伊洛前列素)治疗，从而降低患肺癌的风险。技术实现要素：提供本概述是为了以简化的形式介绍一些概念，这些概念将在下面的详细描述中进一步描述。本概述不旨在标识所要求保护的主题的关键特征，也不旨在用于帮助确定所要求保护的主题的范围。在本公开内容中提出的本发明描述了一种用于开发一种或多种形态计量学分类器以识别肿瘤突变负荷(tmb)的方法。已经发现tmb对于癌症患者的分诊对适当的癌症治疗很重要。该方法提供了表征tmb的非侵入性方法，tmb在肿瘤发展的早期阶段对肿瘤有反应并且与肿瘤的大小无关。因此，本发明对于针对患者可能患有的癌症的特定表征的癌症治疗的发展实践具有重要意义，从而允许更有效的癌症管理而副作用更少。附图说明尽管在所附权利要求书中具体阐述了本发明的新颖性特征，但是根据结合以下详细说明和附图，将更好地理解和了解本发明的组织和内容以及其他目的和特征，附图中：图1示意性地显示了用于样品分析的肺癌测试的功能概述。图2示意性地显示了在肺癌测试系统中使用的3d光学断层扫描系统的基本系统部件。图3a至图3c显示了腺癌细胞的3d图像的单个透视图。图4显示了在肺柱状细胞上的纤毛。图5显示了针对异常细胞分类器的灵敏度对特异性的roc曲线。图6示意性地显示了用于识别与不同癌症类型相关联的特异性突变的分类级联的示例。图7在表中列出了实验研究的结果，该结果表明roc下的面积(aroc)以及对目标细胞的灵敏度和特异性。图8示意性地显示了用于开发一种或多种形态计量学分类器以识别肿瘤突变负荷(tmb)的方法的示例的流程图。图9示意性地显示了用于开发一种或多种形态计量学分类器以使用肿瘤突变负荷(tmb)作为基础事实(groundtruth)的方法的示例的流程图。图10示意性地显示了使用免疫疗法治疗人类受试者中的恶性肿瘤的方法的示例的流程图。在附图中，相同的附图标记表示相似的要素或部件。附图中要素的尺寸和相对位置不必按比例绘制。例如，未按比例绘制各种要素的形状和角度，并且其中一些要素被任意放大并定位以提高图形的可读性。此外，所绘出的要素的特定形状不一定旨在传达有关特定要素的实际形状的任何信息，并且仅是为了便于在附图中识别而选择的。具体实施方式以下公开内容描述了开发一种或多种形态计量学分类器以识别肿瘤突变负荷(tmb)的方法。在附图中阐述和描述了根据示例性实施方式的方法和系统的几个特征。将会理解根据其他示例性实施方式的方法和系统可以包括与图中所示的不同的附加过程或特征。本文关于光学断层扫描细胞成像系统描述了示例性实施方式。但是，应理解，这些实施例是用于说明原理的目的，并且本发明不限于此。本发明提供了一种早期的肺癌检测系统，其使用由光学断层扫描系统处理的样品检测tmb，该光学断层扫描系统产生等距、亚微米分辨率的3d细胞图像，然后通过自动特征提取和分类算法进行处理，以高精确度识别异常细胞。由于异常细胞少见且非诊断性污染物很多，因此只有能够以高灵敏度和非常高特异性进行细胞检测的系统才能在确保样品充足的同时有效地管理肺癌的检测。定义通常，如本文所用，以下术语具有以下含义，除非上下文中的使用另有规定：当在权利要求书或说明书中与术语“包括”结合使用时，词汇“一个(a)”或“一个(an)”的使用表示一种或超过一种，除非上下文另有规定。术语“约”是指所述值加上或减去测量误差范围，或者，如果未指明测量方法，则为加上或减去10％。除非明确指出仅指代替代方案或替代方案互斥，否则权利要求中术语“或”的使用用于表示“和/或”。术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”(及其变体)是开放式的连接动词，并在权利要求中使用时允许添加其他要素。在整个说明书中，提到“一个示例”或“一个示例性实施方式”、“一个实施方式”，“一个实施例”或这些术语的组合和/或变形意味着结合该实施方式描述的特定特征、结构或特性被包括在本公开内容的至少一个实施方式中。因此，在整个说明书中各处出现的短语“在一个实施方式中”或“在一实施例中”不一定都指的是同一实施方式。此外，在一种或多种实施方式中，可以以任何合适的方式组合特定的特征、结构或特性。“充足性”是指样品的含量，并定义了目标细胞确定是否已分析足够的细胞团块的限值。如本文所用的，“骨化三醇”是维生素d3(胆固醇骨化醇)的合成(人造)活性形式。“毛细管”具有其普遍接受的含义，并且意图包括透明的微毛细管和内径通常为500微米或更小的等效物，但是也可以使用更大的直径。“细胞”是指生物细胞，例如人、哺乳动物或动物细胞。“cell-cttm平台”是指由亚利桑那州凤凰城的visiongate,inc.制造的光学断层扫描系统，其结合了本文上面引用的nelson和fauver专利的教导和那些教导的改进。cell-cttm平台是用于对流动细胞成像的自动化的高分辨率3d断层扫描显微镜和计算系统。与传统的光学成像方法相比，cell-cttm平台可以在所有维度上以相等的空间分辨率(各向同性分辨率)计算3d细胞图像，从而使测量结果与方向无关。此外，消除了常规显微镜通常具有的焦平面模糊性和视图取向依赖性，从而提供了自动识别各种类型的细胞且明确地识别出主要是正常细胞群中的稀有异常细胞的信息内容。“cellgazer”指一种基于软件的实用程序，用于促进对cell-ct提供的细胞的2d和3d图像的查看。细胞检查的结果是对细胞类型进行详细的区别诊断，然后再通过luced测试确定所处理病例的最终结果。如本文所用的，“嵌合抗原受体(car)”是指人工t细胞受体(也称为嵌合t细胞受体，或嵌合免疫受体)是工程改造的受体，其将任意特异性移植到免疫效应细胞上。如本文所用的，“cis”具有其原位癌的普遍接受的含义，也称为原位肿瘤。“景深”是沿着光轴的长度，在该长度内，在为指定特征产生不可接受的图像模糊之前，焦平面可能会移动。“富集”是指从原始样品中提取目标细胞的过程。该过程产生了富集的团块，其细胞随后可以在cell-ct系统上更有效地成像。如本文所用的，“免疫疗法”适用于肿瘤学领域，并且是指改善、治疗或预防人类受试者中的恶性肿瘤的方法，其中该方法的作用在根除癌细胞方面辅助或增强免疫系统，包括施用细胞、抗体、蛋白质或核酸，它们会激活主动(或实现被动)免疫响应以破坏癌细胞。它还包括生物佐剂(如白介素、细胞因子、卡介苗(bacilluscomette-guerin)、单磷酰脂质a等)与用于治疗癌症的常规疗法的联合治疗，常规疗法如化学疗法、放射疗法或外科手术，通过激活免疫系统来预防或破坏癌细胞的生长以及体内、离体和过继免疫疗法(包括使用自体和/或异源细胞或永生化细胞系的疗法)发挥作用。如本文所用的，“伊洛前列素”是包含前列环素pgi2的合成类似物的免疫调节剂。“测试”是指采用cell-cttm平台进行的早期肺癌检测测试，该平台由亚利桑那州凤凰城的visiongate，inc.开发，并结合了上文中提及的nelson和fauver专利的教导和这些教导的改进。“过程”是指3d细胞重构、发现异常细胞的分类以及病理学确认的机制。“ldct”是指低剂量计算机断层扫描(ct)射线照相扫描。“对象”是指单个细胞、人类细胞、哺乳动物细胞、物品、事物或其他实体。“伪投影”包括单个图像，该图像表示范围大于光学系统原始景深的采样量，其中这样形成的伪投影图像包括从固定视点焦平面图像范围的积分。在fauver'945中教导了伪投影的概念。“样品”是指从单个患者的单项测试或程序中获得的完整产品(如提交进行分析的痰、活检或鼻拭子)。样品可以由一种或多种对象组成。样品诊断的结果成为病例诊断的一部分。“roc”具有其公认的接收者操作特征的含义。“试样”是指准备好进行分析的完整细胞制剂，包括全部或部分等分试样或样品。如本文所用，“受试者”是指人类患者。“目标细胞”是指来自样品的细胞，其特征或计数是特别需要的。例如，在luced测试中，目标细胞是正常的支气管上皮细胞。在测试过程中必须列举最少数量的样品，以使样品被认为是足够的。如在图像处理的上下文中使用的，“阈值”包括用于特征的任何可测量特征的判定边界值。阈值可以根据仪器规格、可接受的错误率、统计数据或根据公认的模式识别原理的其他标准进行预定或设置。“肿瘤突变负荷”(tmb)是指每兆碱基对基因组dna发生的体细胞、编码、碱基取代和indel突变的数目。“tnm阶段”以其普遍接受的含义在肺癌的上下文中使用，且指医学协会(如theinternationalassociationforthestudyoflungcancer(iaslc)定义的肿瘤、结节、转移(tnm)阶段。伏立诺他也被称为苏拉尼氨基羟肟酸，通常用作巴雷特食管中的组蛋白脱乙酰基(hdac)抑制剂。如在图像处理的上下文中使用的，“体素”是3d网格上的体积元素。概述参考图1，示意性地显示了用于样品分析的肺发育不良和癌症测试系统的功能概述。测试系统5包括用于样品采集的设备和方法10，接着是用于早期肺癌检测的测试12，如测试。早期肺癌测试12还包括用于样品染色和富集的设备和方法14、3d细胞成像20、3d细胞分类22和临床医生对异常候选细胞的检查25。如果使用痰，通常通过在患者家中自发性咳嗽或在诊所进行诱导来采集痰。可以在临床条件下进行其他类型的样品采集，例如活检。处理试样以去除污染物和非支气管上皮细胞，如通过减小白细胞和口腔鳞状细胞的体积。富集的样品在cell-cttm平台上进行处理，该平台可在等距、亚微米分辨率的真实3d中对细胞进行数字成像，如上面提到的nelson和fauver所述。在3d细胞图像上测量与癌症相关的生物特征，并将其组合成一分数，用于识别少数具有癌症特征的细胞。然后可选地显示这些细胞，以便使用检查站(如亚利桑那州菲尼克斯的visiongate，inc.开发的cellgazertm检查站)进行人工细胞学家检查。该检查站提供视觉显示，允许细胞学家以2d和3d方式查看细胞图像，从而为特定的细胞候选物建立确定的正常或异常状态。可以使用下面公开的技术来进行三维(3d)细胞分类22。细胞成像系统20包括通过计算机软件实现的过程，该计算机软件例如由与光机械设备接口的个人计算机执行以校正在图像捕获期间出现的运动。大多数细胞图像都以经过很好重构的方式从过滤后的反投影中出现。一种计算机实现的算法可以识别出不良重构的细胞，因此可以将其从后续处理中剔除。meyer等人在2012年4月10日发布的题目为“systemandmethodfordetectingpoorqualityin3dreconstructions”的美国专利第8,155,420号中教导了这种检测不良重构的方法的一个示例，其公开内容通过引用合并于此。早期开发肺癌筛查程序的尝试是基于痰细胞学检查，该检查显示人眼对疾病检测的灵敏度不足(平均约60％)，但特异性非常好(schreiber和mccrory(2003)chest123(1补编)：115)。这种经验使一些人得出结论，认为痰对于检测肺癌没有价值。仔细分析涉及石蜡包埋的痰(bookinga，biesterfelds，chatelainr，gien-gerlachg，essere.，diagnosisofbronchialcarcinomaonsectionsofparaffin-embeddedsputum.sensitivityandspecificityofanalternativetoroutinecytology，actacytol.1992；36(1)：37-47)显示在86％或更多的癌症患者中，样品实际上含有异常细胞。在连续三天的早晨咳嗽中采集可产生最佳结果。进一步的分析表明，痰中存在所有相关临床因素分层的异常细胞，包括肿瘤组织学类型、大小、阶段和位置(neumannt，meyerm，pattenf，johnsonf，erozany，frablej等人，premalignantandmalignantcellsinsputumfromlungcancerpatients，cancercytopathology，2009；117(6)：473-481)。基于这些样品特征，目前公开的肺癌检测测试采用自发性咳嗽痰。初步评估显示，使用cytoyt(hologic，marlborough，ma)或众所周知的saccomanno方法进行痰固定，结果令人满意。样品充分性的问题对于痰细胞学检查也很重要。尝试增加痰的量也取得了不同的成功。痰诱导可以增加痰的产生，以帮助获得足够的整体样品。试样富集和制备的示例在适用于tmb检测的肺癌检测测试的一个示例中，样品在分析之前经历了三个处理阶段：1)细胞分离和冷冻保存；2)通过荧光激活细胞分选术(facs)富集；3)将富集的细胞嵌入到光学油中，该光学油与光学断层扫描成像系统的光学组件折射率匹配。冷冻保存和facs富集(facs是一个示例)用粘液溶解剂二硫苏糖醇(dtt)(fisherscientific，waltham，ma)处理痰。在一个示例中，为了长期保存，将样品通过41μm的尼龙网过滤，并在15％二甲基亚砜(dmso)(fisherscientific，waltham，ma)中保持在-80℃。过滤后，取出多达100μl的等份试样进行肺癌检测测试分析。首先，将痰细胞用苏木精(electronmicroscopysciences，hatfield，pa)染色，用于下游肺癌检测测试成像。然后，用含有荧光偶联物的抗体混合物处理细胞，所述荧光偶联物被选择用于富集支气管上皮细胞和消耗污染性炎症细胞(嗜中性粒细胞和巨噬细胞)。抗细胞角蛋白-fitc偶联物混合物(cellsignaling，danvers,，ma)靶向在正常和恶性上皮细胞中表达的细胞角蛋白。抗cd45-apc偶联物(mylteni，bergischgladbach，德国)以炎症细胞为阴性选择。在分选细胞之前，还用dapi(lifetechnologies，grandisland，ny)对细胞进行染色。对于facs富集，创建了dapi阳性母门以排除双峰细胞和碎片，然后排除主要为口腔鳞状细胞的高侧散射事件。随后，绘制细胞角蛋白高(高fitc)和cd45低(低apc)子门。该子门中的细胞群是富集的靶向上皮细胞，使用光学断层扫描系统(例如cell-光学断层扫描系统)进行分选，以进行更有效的下游肺癌检测测试分析。富集细胞的包埋facs富集(或任何其他富集过程)后，将细胞在乙醇中脱水，然后悬浮在二甲苯中。然后将细胞转移到合适体积的光学介质中并嵌入其中。光学介质是具有与光学断层扫描系统相匹配的折射率的粘性油。一旦被嵌入，细胞被注入到一次性盒中以在光学断层扫描系统上成像。现在参考图2，显示在肺癌测试系统中使用的3d光学断层扫描成像系统的基本系统部件。细胞成像系统20是用于对流动中的细胞进行成像的自动化的高分辨率3d断层扫描显微镜和计算系统。包括与聚光镜92光学耦合的照明源90，该聚光镜与物镜94光学协作以扫描毛细管96中包含的对象1的图像。图像由振荡镜102扫描对象所占据的体积而获得，并通过分束器104传输到高速相机106。高速相机产生多个伪投影图像110。为每个对象产生一组用于多个轴向管旋转位置的伪投影图像。尽管测试系统不限于任何一种对比方法，但是在一个示例中，肺癌检测测试专门针对基于传统使用的苏木精染色剂细胞形态。在肺癌检测测试应用中，光学断层扫描系统以在所有维度上均具有相同分辨率(即各向同性分辨率)的方式来计算3d细胞图像，从而使测量结果与方向无关。此外，消除了常规显微镜通常具有的焦平面模糊性和视图取向依赖性，从而提供了自动识别各种类型的细胞且明确地识别出主要是正常细胞群中的稀有异常细胞的信息内容。光学断层扫描系统的输出将所有细胞的约0.5％确定为要使用cellgazertm(visiongate，phoenix，az)工作站进行验证的异常候选者，该工作站是一种成像软件工具，可以使人查看没有焦平面和方向模糊性的图像。光学断层扫描系统成像是在少量液体悬浮液进行的。对于肺癌检测测试，这些细胞来自上述富集的上皮细胞群。因为光学断层扫描系统可以分离紧密一致的对象，所以尽管标准流式细胞仪的要求，也不需要单个文件细胞流(singlefilecellflow)的狭窄聚焦核心。肺癌测试系统的示例性操作在上述通过引用并入的nelson和fauver文献以及其他专利中进行了描述，这些专利包括2012年8月28日发布给watson等人的题目为“opticaltomographysystemwithhigh-speedscanner”的美国专利第8,254,023号，该文件也通过引用并入到本文中。在操作中，将生物细胞1的染色核悬浮于光学介质112中，并注入内径为例如62μm的毛细管96中。毛细管系统被设计为一次性的，因此消除了样品之间交叉污染的可能性。施加到流体的压力114将对象1移到成像位置，然后在管旋转时采集3d数据。镜子102被致动以将焦点平面扫过对象，并且图像被照相机积分以从每个单个视角产生伪投影。未显示将毛细管96连接至光学断层扫描系统的玻璃保持架。保持架的中间有一个孔，该孔的直径略大于毛细管和玻璃平板(为简化图示而未显示)的外径，以便与物镜和聚光镜进行光学耦合。装有嵌入传输介质中的细胞的毛细管螺纹穿过保持架。固定细胞的传输介质、玻璃毛细管、毛细管保持架、与镜片接合的油以及镜片本身均由具有相同光学指数的材料制成。因此，当毛细管旋转360度时，当细胞可以旋转以允许捕获500个伪投影的集合时，光线穿过光学断层扫描系统的光学器件、毛细管和细胞而没有折射。由于细胞悬浮在液体介质中，因此在采集伪投影图像110时，它们易于发生少量运动。因此，伪投影中的细胞图像必须配准到一个共同的中心，以便在重构过程中细胞特征彼此增强。题目为“methodforimageprocessingandreconstructionofimagesforopticaltomography”的美国专利第7,835,561号公开了伪投影的纠错技术。美国专利第7,835,561号在此通过引用并入本文。使用类似于常规x射线ct中使用的滤波反投影算法处理校正后的伪投影集合，以计算断层扫描3d细胞重构。显示了在三个角度位置(0g、90g和180g)拍摄的伪投影图像110。光源90以585nm波长提供照明，以基于苏木精吸收光谱来优化图像对比度。在重构中，3d像素或体素是立方的，每个维度的大小约为70nm。重构体积的大小会有所不同，因为图像采集体积会围绕对象裁剪。通常，侧面的体积约为200至300像素。现在参考图3a至图3c，显示了腺癌细胞的3d图像的透视图。图3a显示了在最大强度投影中的腺癌细胞(13)。由于3d图像中的灰度值与各种细胞特征相关联，因此建立了一个将细胞结构映射到颜色和不透明度值的查找表，以在中央(如图3b所示)和右侧(如图3c所示)生成细胞图像。在这些图像的彩色复制中，半透明的白色402代表细胞质，不透明的蓝色404代表细胞核，半透明的绿色406代表疏松的染色质和核质，浓缩的染色质和核仁用不透明的红色408代表。在仅提供黑白附图的国际专利法规中，这些颜色已由相应的参考数字404、406和408标识的边框(显示为虚线边框)标识。现在参考图4，显示了肺柱状细胞上的纤毛。成像的正常支气管上皮细胞具有直径约为250nm的单个纤毛链。这进一步证明了3d细胞成像系统的分辨率。现在参考图5，显示了用于异常细胞分类器的roc曲线。roc曲线700是在垂直轴701上对发育不良细胞的灵敏度相对于在水平轴703上的特异性的图。点707表示发育不良细胞分类器以接近100％的特异性下以75％的灵敏度表现的区域。该分类器是使用数据集构建的，该数据集包含指示异常肺进程的细胞，该异常肺进程包括中度至严重的发育异常和某些非典型细胞状况。使用一组大约150个已知的发育不良细胞和大约25,000个已知的正常细胞来实施分类器的训练。单个细胞roc曲线700证明了准确性，这显示了对发育不良细胞的接近完美的检测。分类器精度通常表示为roc曲线下的面积(aroc)。当aroc为1时，可得到完美的判别力。lucedaroc值为0.991。对于单细胞检测，选择的工作点可提供75％的灵敏度和100％的特异性。细胞分类与检测病例有关，如下表所示。例如，如果在luced分析过程中遇到一个异常细胞，则病例检测概率将为0.75或75％。如果通过luced遇到两个异常细胞，那么病例检测的概率将是(1-(1-0.75)2)＝0.9375或接近94％的病例灵敏度等。1个细胞-75％病例灵敏度，2个细胞-94％病例灵敏度，以及3个细胞-98％病例灵敏度。现在参考图6，显示了用于训练适于识别与不同癌症类型相关联的特异性突变的分类器的分类级联的示例。进行训练以产生一系列二进制分类器以分离期望的细胞，包括第一分类器602、第二分类器604、第三分类器608、第四分类器609、第五分类器611和第六分类器615。在一个示例中，训练第一分类器602以将恶性细胞与其他正常细胞分离。第一分类器602将来自恶性细胞系的所有数据分组，并将其分配给一个类别(例如一组恶性细胞)。该组恶性细胞加上正常细胞作为阴性对照被用来训练第一分类器以将正常细胞与恶性细胞分开。由于痰中很少见恶性细胞，因此这一步骤尤其重要。在训练过程中，仅对痰中一小部分细胞进行人工检查。由于人工检查是过程的一部分，因此可以假定只有从过程中出现的异常细胞才是真正的恶性细胞，然后可以使用下面描述的分类器进行亚型分类。第二分类器604分离恶性亚型。任何器官系统都有与之相关的不同类型的组织。例如，肺组织包括鳞状上皮和支气管的腺瘤组织。来自神经内分泌腺的小细胞肺癌(sclc)细胞有时也明显。因此，需要分类器以分离其中发生期望的驱动突变的特定癌症亚型。这是通过首先从腺癌和鳞癌中分离小细胞肺癌，然后从鳞癌中分离腺癌来完成的。腺癌中所需突变亚型的进一步分离逐步进行。在下面的表1中给出了被选作该示例的训练集的细胞系的分组。根据第三至第六分类器608、609、611和615中的形态因素，确定特定驱动突变的分离。仍参照图6，在一个示例中，突变驱动的逐步分离从第一分类器602开始，在第一分类器602中，一组细胞被分离为正常和恶性或发育不良的类别。被识别为恶性的任何细胞在第二分类器604中进一步处理，第二分类器604将sclc：nci-h69型细胞与其他恶性细胞分离，并传递至第三分类器608。第三分类器608将腺：sw900与其他腺癌类型细胞分离并传递至第四分类器609的其他细胞。第四分类器609将adeno：alk+、nci-h2228细胞类型与其他剩余的细胞类型分离，并将剩余的细胞类型传递至第五分类器611。第五分类器611将adeno：野生类型，a549与egfr+腺细胞类型分离，并将egfr+腺亚型传递至第五分类器615。第六分类器615将腺：t790m，nci-h1975与腺：egfr-p.e746_a750del分离。本领域技术人员将认识到，这仅仅是本发明应用的一个示例，并且根据本文所述的方法，可以使用其他细胞类型和突变驱动来构建和训练包括tmb分类器的分类器。本发明绝不限于该示例。分类器决策是通过在分类器训练过程中为特征的任何可测量特性建立决策边界值来实现的。可以根据仪器规格、可接受的错误率、统计数据或根据公认的模式识别原理的其他标准来选择或设置阈值。实验结果现在参考图7，总结了一项实验研究的结果。表650指示由通过根据上述训练方法训练的分类器分类的目标细胞的roc(aroc)652下的区域以及灵敏度654和特异性656。特异性与旨在分离特定驱动突变的分类器对恶性细胞的误识别有关。例如，从小细胞肺癌(sclc)肿瘤中识别细胞的特异性为99.98％。少数被称为sclc的细胞实际上来自表650中列出的其他一些细胞系。由于仅0.02％的恶性细胞被误认，因此可以计算阳性预测值以将sclc识别为ppv＝tp/(tp+fp)＝100*0.748/(0.748+0.002)＝99.7。对过程的证据中的正常细胞与异常细胞之间的出色区分，再加上已公开的证据显示恶性细胞的形态变化与细胞的基因组特征相关，这表明可能通过纯粹的形态学方法识别了负责驱动癌症进程的基因突变52。在本公开中，扩展了形态计量学基因组学概念，并用于将癌症驱动检测到肿瘤突变负荷的域中。产生cell-cttm系统用于产生肿瘤突变程度的形态计量学基础，其思想是提供表征tmb的非侵入性手段。算法以相同的灵敏度检测癌症，而与肿瘤的组织学、阶段和大小无关46。因此，基于cell-ct的tmb测量将具有非侵入地表征tmb的潜力，而与组织学、阶段和大小因素无关。现在参考图8，显示了用于开发一种或多种形态计量学分类器以识别肿瘤突变负荷(tmb)的方法的实施例的示图。该方法包括以下行动：从转导细胞中获得所选克隆830；分析所选克隆的mlh1表达，以筛选具有与亲本细胞系相当水平的克隆832；在培养基中扩展所选克隆842；收获所选克隆843；确定收获的克隆的tmb水平850；在3d显微镜光学断层扫描系统上分析所选克隆852；和将所选克隆与一组对照细胞系比较854。在一个示例中，该组对照细胞系包含亲本nci-h23和表达加扰的shrna的克隆。此外，分析动作为每个细胞生成多个形态计量学生物特征。tmb数据可以通过使用全外显子组测序或使用ngs或靶基因组进行靶向外显子组测序的基因组分析来确定。现在参考图9，显示了用于开发一种或多种形态计量学分类器以使用肿瘤突变负荷(tmb)作为基础事实的方法的示例的流程图。该方法可以与以上关于图8描述的方法结合使用。低tmb和高tmb可用作基础事实，用于为等基因细胞系(isogeniccellline)中的每个细胞开发细胞分类器并确定每个细胞分类器的roc面积930。为等基因细胞系中的每个细胞定义与基础事实相匹配的分数932。通过使用自适应增强逻辑回归算法来定义一组通过逻辑函数使用的投影轴以产生从0到1的分数来训练用于产生与基础事实紧密匹配的分数的分类器。自适应增强逻辑回归算法可以通过使用基础事实与当前分数之间的差对每个观察值进行加权的连续试验来迭代，以自适应地收敛于逐渐将一组更广泛的细胞表征转化为解决方案的解决方案。可替代地，分析所选克隆可以包括使用随机森林算法来使用针对特征分布的非参数假设来产生分类器。此外，可以通过修剪可能的特征树集以优化判别来改善对分类器判别的评估950。roc曲线下的面积aroc用于判断分类器功效，其中接收者操作特征曲线或aroc下的面积是通过计算roc曲线的积分来计算的，这表示就分类灵敏度和特异性而言的二进制分类器输出的总体性能952。建立阈值以与分类器分数一起使用以创建以高精度与基础tbm相关联的二进制输出954。可以产生一个数字分数，该数字分数表示细胞属于目标类别的概率。通过将阈值应用于分布使分数进一步变成二进制可以将目标细胞与非目标细胞分离。在一个有用的示例中，可以确定阈值以提供0.95或更高的精度，以分离具有低tmb的细胞与具有高tmb的细胞。现在参考图10，显示了使用免疫疗法治疗人类受试者的恶性肿瘤的方法的示例的流程图。该方法包括以下行动：基于从受试者获得的样品获得的伪投影来分析细胞的3d图像1030；操作生物样品分类器以从样品中识别出正常或异常细胞1032；确定来自每个异常细胞的tmb分数1042；将预定阈值应用于tmb分数1052；当发现癌症时，应进行外科手术以去除癌症病变；当tmb分数超过预定阈值时，通过在预定时间段内向人类受试者施用免疫调节剂来辅助该受试者作为进行免疫疗法的候选者，以协助受试者免疫系统消灭癌细胞1054。免疫调节剂可以有利地是选自由嵌合免疫受体、前列环素类似物、伊洛前列素、t细胞的嵌合抗原受体(car)、伏立诺他、hdac抑制剂、胆钙化醇、骨化三醇及其组合组成的组的药物。支持这一概念的数据目前正在开发中。该方法将包含以下行动：1.bailis等人53(plosone.2013oct29；8(10)：e78726)敲除了nci-h23肺腺癌细胞中mlh1基因的表达，以生成等基因系，用于直接比较mmr-熟练(proficient)细胞和mmr-缺陷细胞。bailis等人的论文报道，培养数周后，mmr-缺陷细胞表现出微卫星不稳定性，这是癌细胞获得高tmb的常见机制。通过用mlh1shrna慢病毒颗粒(santacruzbiotechnology，sc-35943-v)或加扰的shrna慢病毒颗粒(santacruzbiotechnology，sc-108080)转导nci-h23细胞并选择使用嘌呤霉素进行整合，可以使用类似的方法。可以通过蛋白质印迹分析来分析源自单个嘌呤霉素抗性细胞的mlh1shrna转导的克隆，以筛选mlh1表达降低>90％的克隆。克隆也可以衍生自对照加扰的shrna转导的细胞，并分析mlh1表达以筛选水平与亲本nci-h23细胞系相当的克隆。所选克隆可通过每周收获的等份试样进行培养扩增，并固定在基于乙醇的固定剂中进行进一步分析。可以使用foundationone分析(foundationmedicine，inc.)对固定细胞进行初步分析以确定tmb水平，该分析可生成300多种癌症相关基因的全面基因组图谱。一旦识别出具有不同tmb水平的细胞系，就可以在visiongatecell-ct平台上对其进行分析，并与对照细胞系(亲本nci-h23和表达加扰的shrna的克隆)进行比较，以验证所识别细胞的准确性。2.在cell-cttm平台上进行处理，以为每个等基因细胞系每个细胞生成704个形态计量学生物特征-可以使用3d显微镜光学断层扫描系统平台，使用本文所述的训练技术和功能进行成像处理和细胞分类，以完成此操作。3.使用低tmb和高tmb作为基础事实，可以为每个等基因细胞系开发细胞分类器，并为每个分类器确定roc面积。通常，此过程涉及定义一个分数，该分数与所讨论的细胞的基础事实相匹配。在本应用中基础事实是通过上述第2点定义的高tmb和低tmb。分类过程旨在产生一个与实际情况非常接近的分数。有几种方法可以用来实现此目的，包括：a.自适应增强逻辑回归50。该方法使用主成分投影来定义投影轴，然后通过logit函数使用该投影轴以产生0到1的分数。该算法通过使用基础事实与当前分数之间的差对每个观察值进行加权的连续试验来迭代。这种适应性过程收敛于逐渐将一组更广泛的细胞表征转化为解决方案的解决方案。b.随机森林51。在这种方法中，使用针对特征分布的非参数假设来生成分类器。自适应增强的一个局限性在于假设了主成分处理背后的特征分布。这是潜在的问题，因为特征可能不严格符合假定的分布，从而导致投影不准确。在这种方法中，定义了随机长度的随机向量。评估区分度，并修剪潜在的特征树集以优化区分度。4.roc曲线下的面积aroc可用于判断分类器功效。接收者操作特征曲线或aroc下的面积是通过计算roc曲线的积分来计算的，其代表了就分类灵敏度和特异性而言的二进制分类器输出的整体性能。术语“灵敏度”是指分类器正确分类具有被分类器训练为检测为“目标”或阳性对象的属性(或一组属性)的对象的能力。类似地，特异性表示分类器将不具有目标属性的对象正确分类为“非目标”或“阴性”的能力。灵敏度和特异性都可以在0到1的范围内，并且希望有一个分类器来执行，并且两个参数都尽可能接近1。尽管分类器为每个对象(在我们的情况中为细胞)生成一个连续的数字(分数，即对象属于目标类别的概率)作为输出，但是通过对分隔阳性和阴性类别的分数应用阈值可以进一步对输出进行二进制化。一旦开发了分类器，就可以通过计算灵敏度和特异性值来生成roc曲线，该灵敏度和特异性值是阈值的函数，该阈值用于分离两个对象类。aroc值的范围可以从0到1，aroc值表示通过分类器正确分类的真实阳性对象和真实阴性对象的百分比。在一个示例中，真实阳性对象是具有高tmb的细胞，而真实阴性对象是具有低tmb的细胞。因此，aroc>0.95意味着分类器将正确地将95％以上具有低tmb或高tmb的所有细胞正确分类。5.建立与分类器分数一起使用的阈值，以创建与基础tbm高度相关的二进制输出。如前面的部分所述，分类器通常会产生一个数字分数，代表一个细胞属于目标类别的概率。为了将目标细胞与非目标细胞分开，通过对分数分布施加阈值，使分数进一步二进制化。通常，将高于阈值的分数视为“阳性”或目标细胞，而将分数低于阈值的对象视为“阴性”或非目标细胞。由于分类器阈值的值可以在分数分布的整个范围内变化，因此选择适当数值的最终度量标准是分类器用于正确区分(分类)细胞的最高准确性。在我们的情况下，将确定阈值以提供0.95或更高的精度，以将低tmb的细胞与高tmb的细胞分离。为了通过使用全外显子组测序或使用ngs或靶向基因组进行靶向外显子组测序进行的基因组分析来确定tmb数据。高的tmb值和低的tmb值将基于tmb分布确定。通常，高于80％的tmb被认为是很高的，尽管也可以根据分布特征应用其他指标。分类器训练-输入和方法细胞检测分类器的创建和优化通常称为“分类器训练”，因为该过程旨在根据参考或基础事实准确诊断细胞。使用本文所述的分类方法，可以将细胞分类为包括但不限于正常、癌性和发育不良的类型。准确性有两个主要方面：第一是特异性(分类器将正常细胞称为正常的)，第二是灵敏度(分类器将异常细胞称为异常的)。算法训练方法包括自适应增强逻辑回归和随机森林。本领域技术人员将熟悉如何将其他经典训练技术应用于分类器，例如模板方法、自适应处理等。用于训练分类器的方法在将数据用作输入的情况下确保了非常好的结果。首先，当分类器训练过程的输入准确描述细胞的临床相关方面并且对可能影响光学断层扫描系统结果的环境因素具有鲁棒性时，可确保分类器准确性：1.cell-cttm光学断层扫描系统生成的三维细胞图像具有高分辨率，可以精确测量支持正确分类的关键特征。2.在分类中有用的某些功能仅出现在3d图像中。因此，与2d成像相比，3d特征集不仅可以更好地描述细胞，而且可以使基于三维成像的分类更加准确。3.已经开发出三维图像分割算法，以将整个细胞与背景分离，将细胞核与细胞分离。通过将分割后的迹线与人类衍生的细胞或核包膜迹线进行比较，验证了这些分割算法的准确性。4.特征测量描述了细胞、细胞核、细胞质和细胞核仁的各个方面。在测试系统的一个示例中，为每个3d细胞图像计算594个特征，这些特征表示对象的形状、体积、染色质分布以及其他更微妙的形态要素。这些特征的计算已被证实与细胞的方向无关。5.用于分类器训练的诊断真相(病理学的金标准)通常基于两位细胞技术人员和一位细胞病理学家提供的分级细胞诊断。分类器训练-统计考虑其次，在本文发明人进行的一项测试中，通过涵盖三个方面的严格过程确保了分类器训练过程的准确性：1.用来训练分类器的数据库被公式化为包含足够的材料，以确保二项式95％置信区间将性能估计的方差保持在可接受的范围内。2.过度训练是训练过程中的一个潜在陷阱，在该过程中，分类器中可能包含太多信息，因此结果可能令用于训练中使用的数据变得过于专业化。这种情况对分类器的性能产生了过于乐观的估计。可以通过交叉验证来减轻过度训练的风险，交叉验证涉及获取一部分训练数据并将其用作测试数据。当基于训练数据的性能估计超过测试数据的估计时，就达到了可在分类器中使用的信息量的限制；3.最后，作为进一步防止过度训练的保证，对分类器进行了测试，该分类器来自第二组细胞的数据，这些数据不属于训练过程。异常细胞分类器训练概述以下考虑因素用于定义控制异常细胞分类器训练的参数：1.由于异常细胞试样稀少，且非诊断要素丰富，因此分类器必须以高灵敏度和非常高的特异性运行。如表2所述，当单个细胞分类器的灵敏度为75％且样品中包含一个以上异常细胞时，可以保持较高的病例检测灵敏度。2.为了确保工作量保持在合理的范围内，将特异性目标定为99％。3.下二项式95％置信区间(21)的间隔应保持高于70％的灵敏度和98.5％的特异性。最终，对于每个阳性病例都希望有较高的检测率。单细胞检测的灵敏度转化为对异常情况的检测，如表2所示。表2表2的含义对于肺癌检测测试很重要。该表中显示的结果表明，如果在通过肺癌检测测试分析的组中存在异常细胞，则可以确信地检测到该异常细胞，从而可以高度灵敏地识别出该病例。剩下的问题是肺癌检测测试分析中异常细胞的存在，这是决定癌症检测率的剩余因素。分类器的发展和特征通常，对特征进行计算以提供3d断层图各个方面的数值表示。计算出的特征与对象的专家诊断一起使用，以开发可区分对象类型的分类器。例如，可以针对第二类型、类型2的对象(诸如正常和异常细胞)计算具有为第一类型、类型1的对象计算的m3d断层图和n3d断层图像的数据集。此处“m”和“n”分别代表类型1值和类型2值的数目。该数据集优选地由光学断层扫描系统生成。光学断层扫描系统提供包括对象(例如细胞)的3d图像的3d断层扫描。细胞通常包括其他特征，例如具有例如核仁的细胞器的细胞核。对象类型可以包括不同类型的细胞、细胞器，表现出选定疾病状态的细胞、探针、正常细胞或其他感兴趣的特征，例如与tmb有关的特征。基于所有m+n对象的3d断层扫描图计算出一组x3d图像特征。接下来，找到最佳区分对象类型的y3d图像特征的精炼特征集，其中“x”和“y”代表每个阶段的3d图像特征数。y3d图像特征的精炼3d图像特征集用于构建分类器，该分类器的输出与对象类型相关。在一个示例性实施方式中，在阶段102，组装了一组3d断层扫描图，其中组装的集合表示基本上所有重要的标志物，这些标志物将被专家用来区分3d生物对象类型。组装了一组代表性的3d断层扫描图后，可以为每个表征重要标志物的对象计算一个3d图像特征集。特征诸如细胞之类的生物对象的断层扫描图表现出多种可观察和可测量的特征，其中一些可以用作分类的特征。下表3提供了特征的摘要，即用于促进分类目标的重要标志物。表3特征通过进一步的解释，在一个有用的示例中，现已发现基于3d生物对象中出现的空隙是基于测量标准的有用分类特征，测量标准包括与计算或所选的阈值进行比较。与空隙有关的另一个特征可以包括对象中空隙的数量。与空隙有关的另一特征包括空隙的体积或空隙的数量。另一个特征包括空隙的表面积或空隙的数量。核间空隙的形状和位置也可以用作有用的特征。另外，特征表征的组合也可以用于构建如上所述的分类器。类似地，现已发现3d生物对象中的内陷(invagination)是基于测量标准的有用分类特征，包括与计算或所选的阈值进行比较。与内陷相关的另一个特征可以包括对象中内陷的数量。与内陷相关的另一个特征包括内陷的体积或内陷的数目。另一个特征包括内陷的尺寸或内陷的数目。核内陷的位置也包括有用的特征。另外，特征表征的组合也可以用于构建如上所述的分类器。现已发现，基于3d生物对象中的内陷是基于测量标准的有用分类特征，包括与计算的或所选的阈值进行比较。内陷空隙的体积、表面积、形状、连接到内陷的空隙的位置以及内陷特征的组合也可以有利地用于构建如上所述的分类器。现已发现，基于测量标准(包括与计算出的或所选的阈值进行比较)，存在于3d生物对象中的核仁是有用的分类特征。如上所述，可能是核仁或染色质缩合的对象的体积、表面积、形状、位置以及上述特征的组合也可以有利地用于构建分类器。现在已经发现3d生物对象中出现的核纹理特征是有用的分类特征。使用各种大小的结构元素，模糊残留技术可用于分离原子核内的各种大小的特征。模糊残留技术通常需要使用滤镜模糊图像，并通过应用标记操作来测量所得的模糊残留。然后计算总3d体积、离散分量的数量、体积直方图、平均体积和方差、以及形状直方图。现已发现描述核仁、内陷、空隙和核包膜之间的空间关系的距离度量是有用的分类特征。例如，如果找到三个核仁的均值和方差，则可以找到最小和最大核仁间距离。同样，可以找到核仁簇的平均坐标与整个对象的质量中心之间的距离。通过将以上任何实体替换为核仁和核的质量中心，可以形成类似的计算。现在还发现快速傅立叶变换(fft)特征是有用的分类特征。fft特征由3d断层图的快速傅立叶变换形成。fft特征表征fft分类的突出表征和平均表征。在此已经相当详细地描述了本发明，以便遵守专利法规并向本领域技术人员提供应用本发明的新颖原理以及构造和使用这种示例性和专用部件所需的信息。然而，应当理解，可以通过不同的设备和装置来实施本发明，并且在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可以对设备的细节和操作过程进行各种修改。以下出版物的公开内容通过引用并入本文。1.reddyk.,feinberga.higherorderchromatinorganizationincancer；seminarsincancerbiol.2013:23:109-115。2.mattouta.,cabiancad.,gassers.,chromatinstatesandnuclearorganizationindevelopment-aviewfromthenuclearlamina.genomebiol.,2015；16:174。3.zink,d.,fischer,a.,nickersonj.nuclearstructureincancercells.nat.rev.；cancer.2004:4:677-687。4.polak,p.,karlic,r.,koren,a.,t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