共定位施用疫苗组分诱导针对人类免疫缺陷病毒的免疫应答的方法与流程
背景技术：
尽管抗逆转录病毒疗法(art)的进步和各种预防策略的实施，例如由于依从性差和接触不良，hiv-1感染仍然是全世界范围内死亡率和发病率的重要原因。2015年，超过200万新的hiv感染发生，且110万人死于与aids有关的疾病(http://www.who.int/hiv/data/en/)。需要一种有效的hiv预防疫苗来控制并最终结束全球aids大流行。
正在开发旨在控制和/或预防hiv感染的疫苗。例如，目前正在开发通过异源初免/加强方案提供针对所有hiv-1进化枝的保护的全球疫苗，使用旨在优化全球hiv-1序列多样性的覆盖率的表达镶嵌gag、pol和envhiv抗原的病毒载体与三聚体包膜蛋白组合以增强体液免疫。特别地，该疫苗接种方案当前是正在进行的临床试验的主题(例如，clinicaltrials.gov标识符：nct02315703和nct03060629)。还参见，barouch等人.thelancet[柳叶刀],第392卷,第10143期,第232-243页,2018年7月21日；wo2016049287。目前临床研究中正在测试的这种疫苗接种方案包括两次肌内腺病毒载体初免免疫，随后是腺病毒载体和含磷酸铝佐剂的gp140蛋白的联合加强。在加强免疫中，对侧臂给予腺病毒载体组分和含磷酸铝佐剂的gp140蛋白。
佐剂通常用于预防疫苗中，以通过诱导具有相对较低抗原量的高效价抗体应答来增强抗原免疫原性。然而，这伴随着疫苗复杂性和反应原性的增加、疫苗许可的困难以及确保稳定质量的供应的困难。在铝佐剂(例如磷酸铝)的情况下，抗原被物理吸附到佐剂上，此过程可能会影响所吸附蛋白的结构和稳定性(例如，jones等人.j.biol.chem.[生物化学杂志],280,13406-13414(2005))。
在国际专利申请公开wo08/107370中描述了腺病毒载体和含佐剂的蛋白的同时施用，并且在国际专利申请公开wo15/189425中描述了两种针对呼吸道抗原的免疫原性疫苗组分的共定位施用。但是，这些公开均未具体提及在原始组分之一中不加佐剂的施用。
因此，本领域需要控制和预防hiv感染的改进方法和疫苗方案，以解决通常与含佐剂的疫苗有关的上述困难。
技术实现要素：
本发明通过提供一种诱导针对hiv的免疫应答的方法来满足该需求，其中可以在不存在佐剂的情况下施用免疫原性疫苗组分。特别地，诸位发明人令人惊讶地发现，用在对侧臂中施用的腺病毒载体和含磷酸铝佐剂的hiv包膜多肽的组合进行的免疫可以被一种或多种腺病毒载体和不含佐剂的hiv包膜多肽的组合的共定位(即，相同部位)施用代替，以诱导高效价抗体应答以及针对hiv的有效细胞免疫应答，从而消除了对佐剂和潜在的佐剂相关反应原性的需求，从而简化了方案。
在一方面，本发明涉及通过在不存在佐剂的情况下共定位施用编码hivenv抗原的腺病毒载体和分离的hivenv多肽来诱导针对人类免疫缺陷病毒(hiv)的免疫应答的方法。
在一个实施例中，一种在受试者中诱导针对人类免疫缺陷病毒(hiv)的免疫应答的方法，该方法包括向该受试者共定位施用：
(a)免疫原性有效量的分离的hiv包膜(env)多肽；以及
(b)免疫原性有效量的编码hivenv抗原的腺病毒载体，
其中该免疫原性有效量的该分离的hivenv多肽和该免疫原性有效量的该腺病毒载体以单一组合物或不同的组合物共定位施用，并且其中该一种或多种组合物不包含佐剂。
在另一个实施例中，一种在受试者中诱导针对人类免疫缺陷病毒(hiv)的免疫应答的方法，该方法包括向该受试者共定位施用：
(a)免疫原性有效量的分离的hiv包膜(env)多肽；
以及
(b)免疫原性有效量的编码hivenv抗原的腺病毒载体，
其中该免疫原性有效量的该分离的hivenv多肽和该免疫原性有效量的该腺病毒载体以单一组合物或不同的组合物共定位施用，并且其中该一种或多种组合物不包含佐剂，其中该佐剂为或包含磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝、氧化铝、磷酸钙、脂质体、水包油乳剂(例如mf59)、油包水乳剂、石蜡油、类毒素、皂角苷或其级分(例如quila、qs21、matrix-m、iscomatrix、iscom)、il-1、il-2、il-12、mogm-csf、脂质a或者其类似物或衍生物(例如单磷酰脂质a(mpl)、3-脱氧酰化的mpl(3d-mpl)、gla、sla、phad、rc529等)、cpg、或咪唑并喹啉(例如咪喹莫特、r848)或其任何组合。在某些实施例中，该一种或多种组合物不包含任何佐剂。
在一些实施例中，在向该受试者施用免疫原性有效量的编码hivenv抗原的腺病毒载体后，共定位施用该免疫原性有效量的该分离的hivenv多肽和该免疫原性有效量的该腺病毒载体进行加强免疫。
在一些实施例中，该方法进一步包括将免疫原性有效量的编码第二hivenv抗原的腺病毒载体与该免疫原性有效量的腺病毒载体一起施用。该第二hivenv抗原可以在与该hiv抗原相同的载体上编码，或在第二腺病毒载体上编码。
在一些实施例中，该方法进一步包括施用免疫原性有效量的一种或多种编码另外的hiv抗原的腺病毒载体。在其某些实施例中，此类另外的hiv抗原包括gag和/或pol抗原或其抗原性片段。
在一些实施例中，该一种或多种腺病毒载体是腺病毒26(rad26)载体。
在一些实施例中，该共定位施用是肌内注射到单块肌肉。
在一些实施例中，该免疫应答包括t辅助1(th1)偏向性免疫应答。
在下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。根据以下详细描述、附图和所附权利要求，其他特征和优点将变得显而易见。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的前述发明内容以及以下具体实施方式。应当理解的是本发明不限于附图中示出的准确实施例。
图1显示了在实例1中描述的研究的第56天时血清中的进化枝cgp140elisa效价；在图下方指示了实验组；正方形和圆圈代表单个动物，线条显示几何平均效价；关于诱导进化枝cgp140特异性抗体应答的研究，“铝+相同部位注射-”(即铝阳性，相同部位注射阴性)组中的动物与“铝-相同部位注射+”(即铝阴性，相同部位注射阳性)组不能区分；uloq＝定量上限，lloq＝定量下限，lob＝空白限，n.s.＝不显著；
图2显示了在实例2中描述的研究的第56天时在两种不同剂量水平的进化枝cgp140重组蛋白下血清中的进化枝cgp140elisa效价；在图下方指示了实验组；实心圆圈代表单个动物，线条显示几何平均效价；黑色三角形指示进化枝cgp140重组蛋白的不同剂量水平，高剂量为12.5μg，且低剂量为1.25μg；与“铝+相同部位注射-”(即铝阳性，相同部位注射阴性)组的动物相比，“铝-相同部位注射+”(即铝阴性，相同部位注射阳性)组的动物显示进化枝cgp140elisa效价增加；uloq＝定量上限，lloq＝定量下限，lob＝空白限；
图3显示了如实例2所述用进化枝cgp140蛋白体外再刺激的小鼠脾细胞中ifnγ与il-5的比率；黑色三角形指示进化枝cgp140重组蛋白的不同剂量水平，高剂量为12.5μg，且低剂量为1.25μg；高的ifnγ/il-5比率指示相对t辅助1(th1)偏向性免疫应答；与“铝+相同部位注射-”组的动物相比，“铝-相同部位注射+”(即，铝阴性，相同部位注射阳性)组的动物显示出更高的ifnγ/il-5比率；并且
图4显示了使用分别具有gag、pol和env的全球潜在t细胞表位(pte)肽库，在实例2中描述的研究的第56天时获得的脾细胞上进行的ifnγ酶联免疫斑点(elispot)测定的结果；黑色三角形指示进化枝cgp140重组蛋白的不同剂量水平，高剂量为12.5μg，且低剂量为1.25μg；结果显示为每106个脾细胞的平均斑点形成单位(sfu)；与“铝+相同部位注射-”(即铝阳性，相同部位注射阴性)组的动物相比，“铝-相同部位注射+”(即铝阴性，相同部位注射阳性)组动物的sfu值相似或甚至更高，指示了完整的细胞免疫应答；符号代表单个动物的值；水平线指示组的几何平均值，而虚线表示检测限(lod)。
具体实施方式
在背景技术和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献各自通过引用以其全文并入本文。包括在本说明书中的对文件、法案、材料、装置、制品等的讨论是为了提供本发明的背景的目的。这种讨论不承认任何或所有这些事项形成关于所披露或要求保护的任何发明的现有技术的一部分。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。否则，本文使用的某些术语具有如说明书中阐述的含义。本文引用的所有专利、公开的专利申请和出版物如同完全列出一样通过引用并入本文。必须注意，如本文和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“该”包括复数指示物。
除非另有说明，任何数值，如此处所述的浓度或浓度范围，应被理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，数值典型地包括列举值的±10％。例如，100μg的剂量包括90μg至110μg。除非上下文另外明确指示，否则如本文所用，数值范围的使用明确地包括所有可能的子范围，该范围内的所有单个数值，包括值的此类范围内的整数和分数。
贯穿本说明书和以下权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及变化形式如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将理解为隐含包括所陈述的整体或步骤或一组整体或步骤，但不排除任何其他整体或步骤或任何其他组整体或步骤。当在本文中使用时，术语“包含(comprising)”可以被术语“含有(containing)”或“包括(including)”替代或者当在本文中使用时有时被术语“具有(having)”替代。
当在本文中使用时，“由……组成”不包括未在权利要求要素中指定的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由……组成”并不排除不会实质性地影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。无论何时本文在本发明的一个方面或实施例的上下文中使用时，前述术语“包含(comprising)”、“含有(containing)”、“包括(including)”和“具有(having)”中的任一种可以被术语“由……组成(consistingof)”或“基本上由……组成”替代以改变本披露内容的范围。
如本文所用，多个引用的要素之间的连接术语“和/或”应被理解为涵盖单独的和组合的选项两者。例如，当两种要素由“和/或”连接时，第一选项是指在不具有第二要素的情况下第一要素的应用。第二选项是指在不具有第一要素的情况下第二要素的应用。第三选项是指第一要素和第二要素一起的应用。这些选项中的任一个应被理解为属于该含义之内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。这些选项中的多于一个的同时应用也应被理解为属于该含义之内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
如本文所使用，“受试者”是指将向其施用或已经施用根据本发明的免疫原性组分和/或组合物的任何动物，优选地是哺乳动物，最优选地是人类。如本文所用的术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、非人类灵长类动物(nhp)(诸如猴或猿猴)、和人类等，更优选的是人类。
本发明涉及在受试者中诱导针对人类免疫缺陷病毒(hiv)的免疫应答的方法。根据本发明的实施例，该方法包括向该受试者共定位施用：
(a)免疫原性有效量的分离的hiv包膜(env)多肽；以及
(b)免疫原性有效量的编码hivenv抗原的腺病毒载体，
其中该免疫原性有效量的该分离的hivenv多肽和该免疫原性有效量的该腺病毒载体以单一组合物或不同的组合物共定位施用，并且其中该一种或多种组合物不包含佐剂。
如本文所用，术语“共定位施用(co-locallyadministering、co-localizedadministration和co-localadministration)”是指在受试者的相同或基本相同的位置(诸如该受试者的相同肌肉或相同部位，例如，皮肤)，向该受试者施用多种疫苗组分或组合物。相同的位置表示相同或近似相同的位点。例如，在肠胃外施用(例如，肌内注射)的情况下，共定位施用是指在受试者的身体的相同或基本相同的部位上施用，诸如到相同的部位(例如，通过相同的装置，例如注射器或多室注射器)，或者在使用多于一个装置(例如，两个注射器)时，在相同位置(例如，肌肉)中大约10cm以内，更优选在大约5cm以内或更短、2cm以内或更短、或1cm以内或更短、或之间的任何距离。共定位施用可以通过在施用之前使用两个注射器、多室注射器或透皮贴剂或其他无针装置将疫苗组分(例如，分离的多肽和腺病毒载体)预混合来实现。例如，可以将疫苗组分或组合物预混合并以单一配制品施用，疫苗组分可以为单一组合物形式，或者可以通过多室注射器以两种不同的配制品形式施用疫苗组分或组合物。当使用两个或更多个注射器时，共定位施用应基本上同时发生，例如，在一小时内，诸如在1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟或一小时内。共定位施用不同于对侧施用和同侧施用，其中将多种疫苗组分或组合物共施用给受试者的两个不同的部位，例如在身体同一侧的两个独立的部位，例如右臂上的两个不同的位置(同侧施用)或身体相对侧的两个不同的位置，例如两个不同的臂(对侧施用)。
wo2011/106705披露了与其中在dna初免疫苗后施用蛋白加强疫苗的初免/加强策略相比，当同时共定位施用(例如在相同部位)编码目的抗原的核酸疫苗和包含该抗原的蛋白疫苗的组合时导致增强的免疫应答；因此，它披露了将蛋白和dna共注射到同一肌肉中具有免疫原性，但是没有披露其比同时共注射到不同肌肉中具有更高的免疫原性，因此充其量这暗示着dna和蛋白共定位施用等同于在不同部位的共施用。此外，wo2011/106705中的所有实例均包括至少一种佐剂(例如dna疫苗编码的il-12；以及例如wo2011/106705实例3证明佐剂idriem005是诱导有效的env特异性抗体效价所必需的(图10))。相比之下，诸位发明人在本文中令人惊讶地描述了：hivenv蛋白和编码hivenv的腺病毒载体的共定位施用比在不同部位的共施用(即，同时)更具免疫原性，而且，共定位施用是令人惊讶地如此有效，以至于有效免疫不再需要佐剂。
根据本发明的实施例，包含分离的hivenv蛋白和腺病毒载体的一种或多种组合物不包含佐剂。术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文可互换使用，并且被定义为一种或多种物质，该一种或多种物质被添加到或包括在具有免疫原性组分(例如，分离的多肽和/或腺病毒载体)的组合物中，用于刺激或增强对免疫原性组分(例如，分离的多肽和/或腺病毒载体)的免疫应答的特定目的。在这种背景下，佐剂是已知安全且耐受性良好的物质，其对于增强或刺激针对hiv抗原(例如分离的hiv包膜多肽和/或表达hiv抗原特别是hivenv抗原的腺病毒载体)的免疫应答的特定目的具有已知功效(以本发明的方法施用)。
根据本发明的实施例，根据本文所述的方法，可从要施用给受试者的一种或多种组合物中省略(即不存在)的佐剂包括但不限于铝基佐剂，诸如铝盐，包括磷酸铝(例如
根据本发明的实施例，本文所述的方法可用于诱导针对人类免疫缺陷病毒(hiv)的一个或多个进化枝的免疫应答。hiv是慢病毒属(lentivirinae)的成员，其是逆转录病毒科(retroviridae)的一部分。两种hiv感染人类：hiv-1和hiv-2。hiv-1是最常见的hiv病毒毒株，并且已知比hiv-2更致病。如在此所使用，术语“人类免疫缺陷病毒”和“hiv”是指但不限于hiv-1和hiv-2，优选hiv-1。hiv被分类为具有高度遗传趋异的多个进化枝。如本文所使用，术语“hiv进化枝”或“hiv亚型”是指根据它们的遗传相似性程度进行分类的相关人类免疫缺陷病毒。当前有三群hiv-1分离株：m、n和o。m群(主要株)由至少十个进化枝(a到j)组成。o群(外部株)可以由相似数目的进化枝组成。n群是尚未归入m群或o群的新hiv-1分离株。在某些实施例中，本发明的方法产生针对hiv-1多个进化枝(优选包括至少进化枝a、b和/或c)的免疫应答。
hiv抗原
如在此所使用，术语“hiv抗原性多肽”、“hiv抗原性蛋白”、“hiv抗原”、和“hiv免疫原”是指能够在受试者中诱导针对hiv的免疫应答，例如体液和/或细胞介导的应答的多肽。该抗原性多肽或抗原可以是hiv的蛋白质、其片段或表位、或其多个hiv蛋白或部分的组合，其可以在受试者中诱导针对hiv的免疫应答或产生免疫，例如保护性免疫。
hiv抗原可以是任何hiv-1或hiv-2抗原或者其片段。hiv抗原的实例包括但不限于gag、pol、和env基因产物，这些基因产物编码结构蛋白和必需酶。特别地，gag、pol、和env基因产物被合成为多蛋白，这些多蛋白被进一步加工成多个其他蛋白产物。该gag基因的初级蛋白产物是病毒结构蛋白gag多蛋白，其被进一步加工成ma、ca、sp1、nc、sp2以及p6蛋白产物。该pol基因编码病毒酶(pol，聚合酶)，并且该初级蛋白产物被进一步加工成rt、rna酶h、in、以及pr蛋白产物。该env基因编码结构蛋白，尤其病毒体包膜的糖蛋白。该env基因的初级蛋白产物是gp160，gp160被进一步加工成gp120和gp41。hiv抗原的其他实例包括基因调节蛋白tat和rev；辅助蛋白nef、vpr、vif和vpu；衣壳蛋白、核衣壳蛋白和p24病毒蛋白。优选地，hiv抗原是hivgag、pol或env抗原或其任何部分或组合，更优选地，hiv-1gag、pol或env抗原或其任何部分或组合。
hiv抗原还可以是镶嵌hiv抗原。如本文所使用，“镶嵌抗原”是指自天然序列的片段组装的重组蛋白。镶嵌抗原类似于天然抗原，但被优化以最大化在天然序列中发现的潜在t细胞表位的覆盖，这改善了免疫应答的宽度和覆盖。用于本发明的镶嵌hiv抗原可以是镶嵌gag、pol和/或env抗原，优选镶嵌hiv-1gag、pol和/或env抗原，其中gag、pol和env基因产物的序列可以衍生自一个或多个进化枝。例如，镶嵌hivenv抗原特别是指包含多个表位的镶嵌抗原，这些表位衍生自来自一个或多个hiv进化枝的env多蛋白序列。可以在本发明中使用的镶嵌hivgag、pol和/或env抗原的实例包括例如在us20120076812；barouch等人,自然方法(natmed)2010,16:319-323；和barouch等人,细胞(cell)155:1-9,2013中描述的那些，将其全部通过引用以其全文并入本文。特别地，适合用于本发明中的镶嵌hiv抗原的实例包括但不限于具有衍生自env基因产物的序列(诸如seqidno:1-3中所示的那些)的表位的镶嵌hivenv抗原；以及具有衍生自gag和pol基因产物的序列(诸如seqidno:4和5所示的那些)的表位的镶嵌gag-pol抗原，以及其组合。
根据本发明的实施例，鉴于本披露内容，腺病毒载体可以编码本领域已知的任何hivenv抗原。
在一个实施例中，用于本发明的由腺病毒载体(例如，rad26载体)编码的hivenv抗原包含seqidno:1的氨基酸序列。
在又另一个实施例中，用于本发明的由腺病毒载体(例如，rad26载体)编码的hivenv抗原包含seqidno:3的氨基酸序列。
在一些实施例中，编码hivenv抗原的腺病毒载体进一步编码一种或多种其他hiv抗原。例如，腺病毒载体可以编码一种或多种其他env抗原，或一种或多种其他hiv抗原，诸如hivgag和/或pol抗原。此类其他hiv抗原可以与hivenv抗原在相同的腺病毒载体上编码，或在一个或多个不同的腺病毒载体上编码。
在其他实施例中，将编码hivenv抗原的腺病毒载体与一种或多种编码一种或多种其他hiv抗原(例如，一种或多种其他hiv、env、gag、和/或pol抗原)的其他腺病毒载体(例如，1、2、3、4或多种其他腺病毒载体)组合施用。适合用于本发明的方法中的其他腺病毒载体的实例包括编码gag-pol抗原的腺病毒载体，诸如包含seqidno:4和/或seqidno:5的氨基酸序列的那些。
hiv包膜多肽
如本文所使用，术语“包膜蛋白”、“env蛋白”、“包膜多肽”和“env”各自是指在hiv病毒体的包膜上表达，并且使得hiv靶向并附着于hiv感染的细胞的质膜上的蛋白质或其片段或衍生物，这些蛋白质或片段或衍生物可以在受试者中诱导针对hiv的免疫应答或产生针对hiv的免疫。该hivenv基因编码前体蛋白gp160，该前体蛋白gp160被蛋白质裂解地切割成两种成熟的包膜糖蛋白，即gp120和gp41。该切割反应由宿主细胞蛋白酶(弗林蛋白酶)在逆转录病毒包膜糖蛋白前体中的高度保守的序列处介导。更具体地，gp160三聚化为(gp160)3，并且然后经历切割成为两个非共价缔合的gp120和gp41。病毒进入随后由gp120/gp41异源二聚体的三聚体介导。gp120是受体结合片段，并且结合到靶细胞上的cd4受体上，该靶细胞具有这样的受体如，例如t辅助细胞。非共价结合至gp120的gp41是融合片段并且提供hiv进入细胞的第二步骤。gp41最初埋在该病毒包膜内，但当gp120与cd4受体结合时，gp120改变其构象，从而导致gp41暴露，其中它可以帮助与宿主细胞融合。gp140是三聚gp160，即(gp160)3的未切除的胞外结构域，其被用作天然状态的切割的病毒刺突的替代物。
根据本发明的实施例，“hiv包膜多肽”可以是gp160、gp140、gp120、gp41蛋白，其组合、融合物、截短物或衍生物。例如，“hiv包膜多肽”可以包括与gp41蛋白非共价缔合的gp120蛋白。它还可以包括稳定的三聚gp140蛋白，该三聚gp140蛋白可以具有或可以被修饰以包括三聚结构域，该三聚结构域稳定gp140的三聚体。三聚化结构域的实例包括但不限于t4-纤维蛋白“折叠子(foldon)”三聚化结构域；衍生自gcn4的卷曲螺旋三聚化结构域；以及作为三聚体标签的大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶的催化亚基。“hiv包膜多肽”还可以是截短的hiv包膜蛋白，该截短的hiv包膜蛋白包括但不局限于包含在胞外结构域(即，延伸至细胞外空间的结构域)中的c-末端截短、在gp41中的截短物(如在gp41的跨膜结构域中的截短物，或在gp41的细胞质结构域中的截短物)的包膜蛋白。“hiv包膜多肽”还可以是天然存在的hiv包膜蛋白的衍生物，该hiv包膜蛋白的衍生物具有例如在弗林蛋白酶切割位点中序列突变、和/或所谓的sosip突变。
鉴于本披露内容，可以使用本领域已知的任何方法来产生和分离hiv包膜多肽。例如，hiv包膜多肽可以从宿主细胞表达，优选地针对包膜多肽的产生而优化的重组宿主细胞。前导/信号序列可以可操作地连接到包膜多肽的n末端，以最大程度地表达蛋白。该前导/信号序列通常在转运到内质网腔中时从新生多肽上切割下来。可以使用适合于目的宿主细胞的任何前导/信号序列。
在一些实施例中，该分离的hiv包膜多肽是稳定化的三聚体gp140多肽，诸如在nkolola等人2010,j.virology[病毒学杂志]84(7):3270-3279；kovacs等人,pnas[美国科学院院报]2012,109(30):12111-6、wo2010/042942和wo2014/107744中描述的那些，将其全部通过引用以其全文并入。
在一些实施例中，hivenv多肽是进化枝cgp140蛋白，例如具有seqidno:6的氨基酸序列的进化枝cgp140多肽。
在一些实施例中，hivenv多肽是镶嵌env多肽，其包含衍生自一个或多个hiv进化枝的一个或多个env序列的多个表位，例如具有seqidno:7的氨基酸序列的镶嵌gp140多肽。
在其他实施例中，将一种或多种(例如，两种)hivenv多肽(诸如两种gp140多肽)一起施用。例如，可以组合施用具有seqidno:6的氨基酸序列的进化枝cgp140多肽和具有seqidno:7的氨基酸序列的镶嵌gp140多肽。
腺病毒载体
根据本发明的腺病毒属于腺病毒(adenoviridae)科，并且优选地是属于哺乳动物腺病毒(mastadenovirus)属的一种。它可以是人类腺病毒，但还可以是感染其他物种的腺病毒，包括但不限于牛腺病毒(例如牛腺病毒3、badv3)、犬腺病毒(例如cadv2)、猪腺病毒(例如padv3或padv5)、或猿猴腺病毒(其包括猴腺病毒和猿腺病毒，如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒)。优选地，该腺病毒是人类腺病毒(hadv、或adhu)、或猿猴腺病毒如黑猩猩或大猩猩腺病毒(chad、adch、或sadv)。在本发明中，人类腺病毒是指如果称为ad而不指明物种，例如该简短符号“ad26”指示与hadv26相同，该hadv26是人腺病毒血清型26。还如在此所使用的，符号“rad”是指重组腺病毒，例如，“rad26”是指重组人类腺病毒26。
腺病毒载体可以基于任何腺病毒血清型，优选人类腺病毒血清型，包括但不限于腺病毒血清型11、26、34、35、48、49、50、52等，优选rad11、rad26、rad34、rad35、rad48、rad49、rad50、rad52等。在某些优选的实施例中，该腺病毒载体是腺病毒26(ad26)。人类腺病毒血清型26的一个优点是在人类群体中血清阳性率低和/或预先存在的中和抗体效价低，并且此类载体在人类临床试验中已显示出产生针对不同抗原的良好免疫应答。
在一个优选的实施例中，腺病毒载体是腺病毒26载体，特别是重组腺病毒26(rad26)载体。
“腺病毒衣壳蛋白”是指在腺病毒(例如，ad26载体)的衣壳上的蛋白，该腺病毒衣壳蛋白参与确定特定的腺病毒的血清型和/或趋向性。腺病毒衣壳蛋白典型地包括纤维、五邻体和/或六邻体蛋白。rad26载体包含至少ad26的六邻体，优选至少ad26的六邻体和纤维。在优选实施例中，该六邻体、五邻体和纤维都是ad26的。优选地，非衣壳蛋白也来自ad26。
本领域的普通技术人员将认识到衍生自多个血清型的元件可以被组合在单一的重组腺病毒载体中。因此，可以产生组合了来自不同血清型的所希望性质的嵌合腺病毒。因此，在一些实施例中，本发明的嵌合腺病毒可以将第一血清型的预先存在的免疫的缺失与以下特征相结合：如温度稳定性、组装、锚定、产量、重定向或改善的感染、靶细胞中dna的稳定性等。
在某些实施例中，本发明中有用的重组腺病毒载体主要或完全衍生自ad26(即，该载体是rad26)。在一些实施例中，该腺病毒是复制缺陷的，例如，因为它包含基因组的e1区域中的缺失。对于衍生自ad26的腺病毒或其他非c亚组的腺病毒，将腺病毒的e4-orf6编码序列与人类c亚组(诸如ad5)的腺病毒的e4-orf6交换是有用的。这允许在表达ad5的e1基因的熟知的补充细胞系中此类腺病毒的繁殖，诸如例如293细胞、per.c6细胞等(参见，例如havenga,等人.,2006,jgenvirol[普通病毒学杂志]87:2135-43；wo03/104467)。然而，这样的腺病毒将不能在不表达ad5的e1基因的非补充细胞中复制。因此，在某些实施例中，腺病毒是血清型26的人腺病毒，其具有已经将编码一种或多种镶嵌hiv抗原的核酸克隆到其中的e1区中的缺失，并具有ad5的e4orf6区。
重组腺病毒载体的制备在本领域是熟知的。例如在wo2007/104792中和在abbink等人，(2007)virol[病毒学]81(9):4654-63中描述了rad26载体的制备。ad26的示例性基因组序列发现于genbank登录号ef153474中和wo2007/104792的seqidno:1中。用于本发明的载体的实例例如包括描述于wo2012/082918中的那些，将其披露内容通过引用以其全文并入本文。典型地，使用一种核酸来产生本发明中有用的腺病毒载体，该核酸包含整个重组腺病毒基因组(例如，质粒、粘粒、或杆状病毒载体)。
在一些实施例中，腺病毒载体是复制缺陷的。在这些实施例中，该病毒通过使对病毒复制关键的区域(例如e1区域)缺失或失活而变得复制缺陷。可以通过在该区域内例如插入目的基因，诸如编码hiv抗原的基因(通常连接至启动子)，来使这些区域基本上缺失或失活。在一些实施例中，本发明的这些载体可以包含其他区域诸如e3区域中的缺失，或此类区域中的连接至启动子的异源基因的插入。该腺病毒的e3区域中的突变不需要被细胞系补充，因为e3不是复制需要的。
典型地使用包装细胞系来生产足够量的腺病毒载体。包装细胞是包含在复制缺陷型载体中缺失或失活的那些基因的细胞，因此允许了该病毒在该细胞中复制。合适的包装细胞系包括，例如，per.c6、911和hek293。
根据本发明的实施例，本文所述的任何hiv抗原，诸如hivenv抗原，可以由腺病毒载体编码。任选地，可以对编码hiv抗原的异源基因进行密码子优化以确保在治疗的宿主(例如，人类)中的正确表达。密码子优化是广泛应用于本领域的技术。可以在本发明的腺病毒载体中使用的编码hiv抗原的核酸的实例包括seqidno:8-12中所示的那些。典型地，编码该hiv抗原的异源基因被克隆到该腺病毒基因组的e1和/或e3区域。编码该hiv抗原的异源基因可以在腺病毒衍生的启动子(例如，主要晚期启动子)的控制下(即，可操作地连接)，或者可以在异源启动子的控制下。合适的异源启动子的实例包括巨细胞病毒(cmv)启动子和劳氏肉瘤病毒(rsv)启动子。优选地，该启动子位于表达盒内编码hiv抗原的异源基因的上游。
组合物和免疫原性组合物
根据本发明的实施例，将免疫原性有效量的分离的hiv包膜多肽与免疫原性有效量的编码hivenv抗原的腺病毒载体共定位施用于受试者。如在此所使用的，“免疫原性有效量”或“免疫有效量”是指足以在受试者中诱导所需免疫效应或免疫应答的量。关于编码hiv抗原或分离的hiv包膜多肽的腺病毒载体，免疫原性有效量或免疫有效量是指足以在受试者中诱导所需的针对hiv的免疫效果或免疫应答的腺病毒载体或分离的hiv包膜多肽的量。
在一个实施例中，免疫原性有效量是指足以在受试者中诱导针对hiv的免疫应答的量。在另一个实施例中，免疫原性有效量是指足以在受试者中产生免疫，例如，提供对抗针对hiv感染的保护效应的量。免疫原性有效量可以根据多种因素而变化，诸如受试者的身体状况、年龄、体重；健康状况等；特定的应用，无论是诱导免疫应答还是提供保护性免疫；所施用的特定腺病毒载体；所施用的腺病毒载体编码的抗原；以及所施用的特定的分离的hiv抗原多肽。考虑到本披露，通过本领域普通技术人员可以容易地确定免疫原性有效量。
免疫原性有效量可以单步(诸如单次注射)或多步(例如多次注射)或以单一组合物或多种组合物施用。在所谓的初免-加强方案中，还有可能向受试者施用免疫原性有效量，并且随后向同一受试者施用另一剂量的免疫原性有效量。初免-加强方案的一般概念是疫苗领域的技术人员熟知的。如果需要，可以任选地向该方案中加入另外的加强施用。
“免疫原性组合物”或“疫苗组合物”特别地是包含免疫原性有效量的纯化或部分纯化的腺病毒载体和/或免疫原性有效量的分离的hiv包膜多肽的组合物。根据本发明的实施例，可以以相同的组合物(例如，免疫原性组合物或疫苗组合物)或以不同的组合物(例如，免疫原性或疫苗组合物)施用该腺病毒载体和分离的hiv包膜多肽，其中该一种或多种组合物不含佐剂。组合物和免疫原性或疫苗组合物可进一步包含其他hiv抗原，例如hivgag、pol和/或env抗原和/或表达此类抗原的腺病毒载体。
在一个实施例中，将免疫原性有效量的编码hivenv抗原的腺病毒载体以与免疫原性有效量的分离的hiv包膜多肽不同的组合物(例如，免疫原性组合物)施用。在此类实施例中，将这些不同的组合物共定位施用，即，施用于该受试者的相同或基本相同的部位，并且组合物不包含佐剂。
在另一个实施例中，将免疫原性有效量的编码hivenv抗原的腺病毒载体以与免疫原性有效量的分离的hiv包膜多肽相同的组合物(例如，免疫原性组合物)施用，其中该组合物不包含佐剂。在此类实施例中，可以在施用前将腺病毒载体和分离的hivenv多肽预混合以制备单一配制品，或者可以将该腺病毒载体和分离的hivenv多肽配制在相同的组合物中。
作为一般指导，当参考重组病毒载体使用时，免疫原性有效量可以在从约106个病毒颗粒至约1012个病毒颗粒，例如106、107、108、109、1010、1011或1012个病毒颗粒的范围内。免疫原性有效量可以以单一组合物或多种组合物，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种组合物(例如，片剂、胶囊或注射剂)施用，其中所述多个胶囊或注射剂的施用共同以免疫原性有效量提供给受试者。一般而言，当参考多肽(诸如分离的抗原性多肽)使用时，免疫原性有效量可以在从例如约0.3至约3000微克(μg)的范围内，例如1-1000μg，例如10-500μg，例如约1、5、10、15、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μg或在两者之间的任何量。当以多种组合物施用免疫原性有效量的疫苗组分时，优选每次施用时共定位施用该多种组合物。
组合物和免疫原性组合物的制备和使用是本领域技术人员所熟知的。液体药物组合物通常包含液体载剂，诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油，优选水或盐水。还可以包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液或二醇，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。这些组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。此类材料应该是无毒的，并且不应该干扰活性成分的功效。载剂或其他材料的确切性质可以取决于施用途径，例如肌内、皮下、皮内、口服、静脉内、皮肤、粘膜(例如，肠)、鼻内或腹膜内途径。
可以使用本领域标准的多种测定在体外或体内评估在动物或人类有机体中施用时诱导或刺激抗hiv免疫应答的能力。有关可用于评估免疫应答的发生和激活的技术的一般说明，请参见例如coligan等人(1992和1994,currentprotocolsinimmunology[当代免疫学实验手册]；jwiley&sonsinc[约翰&威利父子公司]编辑,nationalinstituteofhealth[国家卫生研究所])。可通过测量活化效应细胞(包括衍生自cd4+和cd8+t细胞的那些)分泌的细胞因子谱(例如，通过对产生elispot对il-10或ifnγ的细胞的定量)，通过确定免疫效应细胞(例如，通过经典[3h]胸苷摄取进行的t细胞增殖测定)的活化状态，通过测定致敏受试者中抗原特异性t淋巴细胞(例如，在细胞毒性测定中的肽特异性裂解等)，来测量细胞免疫。
刺激体液应答的能力可以通过抗体结合和/或结合竞争来确定(参见例如harlow,1989,antibodies[抗体],coldspringharborpress[冷泉港出版社])。例如，可以通过酶联免疫吸附测定(elisa)来测量响应于提供免疫原的组合物的施用而产生的抗体的效价。该免疫应答也可以通过中和抗体测定来测量，其中病毒的中和定义为通过病毒与特异性抗体的反应/抑制/中和而导致的传染性丧失。可以通过抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)测定进一步测量该免疫应答。
诱导免疫应答的方法
如参考本文所述的方法所使用的，“诱导免疫应答”涵盖用于预防目的针对感染(诸如hiv感染)提供保护性免疫和/或接种受试者，以及用于治疗目的在对其有需要的受试者中引起针对感染(诸如hiv感染)的所希望的免疫应答或效应。如本文所用，术语“保护性免疫”或“保护性免疫应答”是指该接种疫苗的受试者能够控制对其进行了疫苗接种的致病因子的感染。通常，已经出现了“保护性免疫应答”的受试者仅出现轻度至中度临床症状或根本没有症状。
免疫原性有效量的分离的hivenv多肽和/或免疫原性有效量的腺病毒载体或其一种或多种组合物的施用典型地是肌内或皮下的。因此，典型地将包含此类疫苗组分的组合物或免疫原性组合物配制为用于肌内或皮下注射，并且出于本发明的目的，配制为不包含如上所示的佐剂，优选地不包含任何佐剂。然而，也可以设想其他施用方式，诸如静脉内、皮肤、皮内或鼻。对于静脉内、皮肤或皮下注射，该腺病毒载体将呈肠胃外可接受的水溶液的形式，它是无热原的并具有合适的ph、等渗性和稳定性。同样地，该分离的包膜多肽将处于肠胃外可接受的溶液形式，该溶液具有适当的ph、等渗性以及稳定性。本领域普通技术人员完全能够使用例如等渗媒介物，如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸盐林格氏注射液来制备适合的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
在一个特定的实施例中，通过肌内施用来施用免疫原性有效量的分离的hivenv多肽和/或免疫原性有效量的腺病毒载体或其一种或多种组合物。肌内施用可以通过使用针头注射腺病毒载体和/或包膜多肽的悬浮液来实现。一种替代方案是使用无针注射装置来施用组合物(使用例如，biojectortm)或含有疫苗的冷冻干燥粉末。
在一些实施例中，免疫原性有效量的分离的hivenv多肽和免疫原性有效量的腺病毒载体通过肌内施用以同一组合物共定位施用，其中该组合物不包含佐剂。根据本发明的共定位施用的实例是在受试者的一只手臂的三角肌中肌内注射该一种或多种组合物。
在一些实施例中，将免疫原性有效量的分离的hivenv多肽和免疫原性有效量的腺病毒载体通过肌内施用以不同的组合物共定位共施用，其中这些不同的组合物均不包含佐剂。在此类实施例中，这些不同的组合物的施用可以通过使用多室注射器注射，或通过使用两个独立的注射器注射到基本上相同的部位，例如，在彼此10cm之内注射到同一肌肉中。
在一些实施例中，将免疫原性有效量的分离的hivenv多肽和免疫原性有效量的编码hivenv抗原的腺病毒载体共定位施用给受试者进行初免免疫和加强免疫。
在一些实施例中，在向受试者施用免疫原性有效量的编码hivenv抗原的腺病毒载体后，将免疫原性有效量的分离的hivenv多肽和免疫原性有效量的编码hivenv抗原的腺病毒载体共定位施用给受试者进行加强免疫。换句话说，可以施用免疫原性有效量的编码hivenv多肽的腺病毒载体进行初免免疫，随后将免疫原性有效量的分离的hivenv多肽与免疫原性有效量的编码hivenv抗原的腺病毒载体共定位施用进行加强免疫。优选地，此类初免和加强免疫通过肌内施用来施用。上文详细描述了可用于此类初免-加强方案的腺病毒载体和分离的hivenv多肽。在特定的实施例中，使用相同的腺病毒载体，优选rad26载体，用于初免免疫和加强免疫。
在某些实施例中，该初免免疫和/或该加强施用，优选该初免和该加强施用两者，进一步包括施用一种或多种编码一种或多种另外的hiv抗原(例如gag和/或pol)的腺病毒载体。在不存在佐剂的情况下由腺病毒编码的hivenv抗原和分离的hivenv多肽的共定位施用基本上不会降低针对此类另外的hiv抗原的细胞免疫应答。
施用初免和加强免疫的时间没有特别限制。例如，可以施用疫苗组合物进行初免免疫，并在施用疫苗组合物进行加强免疫之前重新施用。还考虑了进一步施用疫苗组合物以进一步加强免疫。在某些实施例中，在最初施用初免疫苗后约1-12周，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周，首次施用加强疫苗。在其他实施例中，在最初施用初免疫苗后约12-52周，例如，约12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50或52周，首次施用加强疫苗。基于本文的教导和本领域的常识，本领域普通技术人员将能够改变初免和加强疫苗的确切时机、其施用频率、其剂量等。
在一个特定的实施例中，在受试者中诱导针对hiv的免疫应答的方法包括向该受试者以单一组合物或不同的组合物共定位施用免疫原性有效量的分离的hivenv多肽和免疫原性有效量的编码seqidno:1的hivenv抗原的腺病毒载体(优选rad26载体)，其中该一种或多种组合物不包含佐剂。可以重新施用该免疫原性有效量的分离的hivenv多肽和该免疫原性有效量的腺病毒载体，优选共定位施用，以增强免疫应答。另外地或可替代地，在向该受试者施用免疫原性有效量的编码hivenv抗原(例如seqidno:1的hivenv抗原)的腺病毒载体后，可以一次或多次共定位施用免疫原性有效量的分离的hivenv多肽和免疫原性有效量的腺病毒载体进行加强免疫。在某些实施例中，该分离的hivenv多肽包含seqidno:6或seqidno:7，或包含两种分离的hivenv多肽，其分别包含seqidno:6和7。
在另一个特定的实施例中，在受试者中诱导针对hiv的免疫应答的方法包括向该受试者以单一组合物或不同的组合物共定位施用免疫原性有效量的分离的hivenv多肽和免疫原性有效量的编码seqidno:3的hivenv抗原的腺病毒载体(优选rad26载体)，其中该一种或多种组合物不包含佐剂。可以重新施用该免疫原性有效量的分离的hivenv多肽和该免疫原性有效量的腺病毒载体，优选共定位施用，以增强免疫应答。另外地或可替代地，在向该受试者施用免疫原性有效量的编码hivenv抗原(例如seqidno:3的hivenv抗原)的腺病毒载体后，可以一次或多次共定位施用免疫原性有效量的分离的hivenv多肽和免疫原性有效量的腺病毒载体进行加强免疫。在某些实施例中，该分离的hivenv多肽包含seqidno:6或seqidno:7，或包含两种分离的hivenv多肽，其分别包含seqidno:6和7。
在其他实施例中，将编码hivenv抗原的腺病毒载体与一种或多种编码一种或多种其他hiv抗原的其他腺病毒载体一起施用。这些腺病毒载体可以与分离的hivenv多肽以相同的组合物或以不同的组合物共定位施用，其中该一种或多种组合物不包含佐剂。可以施用这些腺病毒载体进行初免免疫，然后与分离的hivenv多肽以相同的组合物或以不同的组合物共定位重新施用，其中该一种或多种组合物不包含佐剂。优选地，该腺病毒载体和该一种或多种其他腺病毒载体是rad26载体。
在一个特定的实施例中，将编码hivenv抗原的腺病毒载体与编码其他hivenv抗原的其他腺病毒载体一起施用。例如，可以将编码seqidno:1的hivenv抗原的腺病毒载体(优选rad26载体)与编码seqidno:3的hivenv抗原的其他腺病毒载体(优选rad26载体)组合施用。可以将此类腺病毒载体与分离的hivenv多肽共定位施用，以在受试者中诱导针对hiv的免疫应答。也可以施用此类腺病毒载体进行初免免疫，并与分离的hivenv多肽共定位重新施用进行加强免疫。根据本发明的实施例，当一起共定位施用时，该腺病毒载体和分离的hivenv多肽以相同的组合物或不同的组合物施用，其中该一种或多种组合物不包含佐剂。在某些实施例中，该分离的hivenv多肽包含seqidno:6或seqidno:7，或包含两种分离的hivenv多肽，其分别包含seqidno:6和7。
在另一个特定的实施例中，将编码hivenv抗原的腺病毒载体与一种或多种编码一种或多种其他hiv抗原(例如，hiv、env、gag、和/或pol抗原)的其他腺病毒载体(例如，1、2、3、4或多种其他腺病毒载体)一起施用。每个腺病毒载体可以编码不同的hiv抗原或多种hiv抗原的组合。例如，可以将编码seqidno:1的hivenv抗原的腺病毒载体(优选rad26载体)与编码seqidno:3的hivenv抗原的第二腺病毒载体(优选rad26载体)、编码seqidno:4的hivgag-pol抗原的第三腺病毒载体(优选rad26载体)、和编码seqidno:5的hivgag-pol抗原的第四腺病毒载体(优选rad26载体)组合施用。可以将此类腺病毒载体与分离的hivenv多肽共定位施用，以在受试者中诱导针对hiv的免疫应答。也可以施用此类腺病毒载体进行初免免疫，并与分离的hivenv多肽共定位重新施用进行加强免疫。当一起定位施用时，该腺病毒载体和分离的hivenv多肽以相同的组合物或不同的组合物施用，其中该一种或多种组合物不包含佐剂。在某些实施例中，该分离的hivenv多肽包含seqidno:6或seqidno:7，或包含两种分离的hivenv多肽，其分别包含seqidno:6和7。
根据本发明的实施例，当施用一种或多种腺病毒载体进行初免免疫，随后在不存在佐剂的情况下与分离的hivenv多肽共定位施用进行加强免疫时，为进行初免免疫和加强免疫施用的一种或多种腺病毒载体可以相同也可以不同。在某些实施例中，它们是相同的。
在一些实施例中，免疫应答包含针对hiv的体液免疫应答，优选针对hiv-1的多个进化枝，诸如至少进化枝a、b和/或c。
在一些实施例中，免疫应答包含针对hiv的细胞免疫应答，优选针对hiv-1的多个进化枝，诸如至少进化枝a、b和/或c。
在一些实施例中，免疫应答包含t辅助1(th1)偏向性免疫应答。表达cd4的t淋巴细胞也称为辅助t细胞，其产生细胞因子。辅助t细胞可进一步细分为t辅助1(th1)和t辅助2(th2)，并且由此类细胞产生的细胞因子分别称为th1型细胞因子和th2型细胞因子。th1型细胞因子倾向于产生促炎应答，从而杀死细胞内的寄生虫并持续自身免疫应答。干扰素-γ是主要的th1细胞因子。过度的促炎应答可导致不受控制的组织损伤，因此需要一种机制来抵消这种作用。特别地，th2型细胞因子包括白细胞介素(il)4、5和13，它们与特应性过敏体质中ige和嗜酸性粒细胞应答的促进有关，还包括白细胞介素10，其被认为是可以同时阻止病原体清除并改善免疫病理学的原型抗炎细胞因子。参见，例如，来自：bingley等人.bmj[英国医学杂志].2000年8月12日；321(7258):424。
因此，在一些实施例中，“t辅助1偏向性免疫应答”或“th1偏向性免疫应答”是指其中与由t辅助2(th2)细胞产生的细胞因子的量(例如，浓度)相比，t辅助1(th1)细胞产生更大量(例如，浓度)细胞因子的免疫应答。可以通过测量一种或多种th1细胞因子(例如，ifn-γ)和一种或多种th2细胞因子(例如il-4、il-5、il-13等)的浓度并将一种或多种th1细胞因子的浓度与一种或多种th2细胞因子的浓度进行比较来确定免疫应答是否可以被表征为“th1偏向性”。在一个特定的实施例中，通过确定来自受试者的样品中th1细胞因子(例如，ifn-γ)的浓度与th2细胞因子(例如，il-5)的浓度的比率来鉴定th1偏向性免疫应答。例如，ifn-γ的浓度与il-5的浓度的比率为1至100，诸如1、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100，或者之间的任何值，更优选大于1，甚至更优选大于10，指示th1偏向性免疫应答。
本发明还涉及免疫原性有效量的分离的hiv包膜(env)多肽和免疫原性有效量的编码hivenv抗原的腺病毒载体在用于通过将该分离的env多肽和腺病毒载体共定位施用给受试者在该受试者中诱导针对hiv的免疫应答的药物的制备中的用途，其中该免疫原性有效量的分离的hivenv多肽和该免疫原性有效量的腺病毒载体处于单一组合物或不同的组合物中，且其中该一种或多种组合物不包含佐剂。关于诱导针对人类免疫缺陷病毒(hiv)的免疫应答的方法的如本文所述的本发明的所有方面和实施例可以应用于本发明的该方面。
本发明进一步涉及免疫原性有效量的分离的hiv包膜(env)多肽和免疫原性有效量的编码hivenv抗原的腺病毒载体，用于通过将该分离的hivenv多肽和该腺病毒载体共定位施用给受试者在该受试者中诱导针对hiv的免疫应答，其中该免疫原性有效量的分离的hivenv多肽和该免疫原性有效量的腺病毒载体处于单一组合物或不同的组合物中，且其中该一种或多种组合物不包含佐剂。关于诱导针对人类免疫缺陷病毒(hiv)的免疫应答的方法的如本文所述的本发明的所有方面和实施例可以应用于本发明的该方面。
实施例
本发明还涉及以下非限制性实施例。
实施例1是一种在受试者中诱导针对人类免疫缺陷病毒(hiv)的免疫应答的方法，该方法包括向该受试者共定位施用：
a.免疫原性有效量的分离的hiv包膜(env)多肽；以及
b.免疫原性有效量的编码hivenv抗原的腺病毒载体，
其中该免疫原性有效量的该分离的hivenv多肽和该免疫原性有效量的该腺病毒载体以单一组合物或不同的组合物共定位施用，并且其中该一种或多种组合物不包含佐剂。
实施例2是一种在受试者中诱导针对人类免疫缺陷病毒(hiv)的免疫应答的方法，该方法包括向该受试者共定位施用：
a.免疫原性有效量的分离的hiv包膜(env)多肽；以及
b.免疫原性有效量的编码hivenv抗原的腺病毒载体，
其中该免疫原性有效量的该分离的hivenv多肽和该免疫原性有效量的该腺病毒载体以单一组合物或不同的组合物共定位施用，并且其中该一种或多种组合物不包含佐剂，其中该佐剂为或包含磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝、氧化铝、磷酸钙、脂质体、水包油乳剂(例如mf59)、油包水乳剂、石蜡油、类毒素、皂角苷或其级分(例如quila、qs21、matrix-m、iscomatrix和iscom)、il-1、il-2、il-12、mogm-csf、脂质a或者其类似物或衍生物(例如单磷酰脂质a(mpl)、3-脱氧酰化的mpl(3d-mpl)、gla、sla、phad、rc529等)、cpg、咪唑并喹啉(例如咪喹莫特、r848)或其任何组合。
实施例2a是实施例2的方法，其中该佐剂为或包含磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝、氧化铝、磷酸钙、脂质体、水包油乳剂(例如mf59)、油包水乳剂、石蜡油、类毒素、皂角苷或其级分(例如quila、qs21、matrix-m、iscomatrix、iscom)、il-1、il-2、il-12、mogm-csf、脂质a或者其类似物或衍生物(例如单磷酰脂质a(mpl)、3-脱氧酰化的mpl(3d-mpl)、gla、sla、phad、rc529等)、cpg、或咪唑并喹啉(例如咪喹莫特、r848)、toll样受体激动剂(例如，tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr7、tlr8、tlr9等激动剂)；as01；as02；as03；as04；as15；as25；聚合物佐剂(例如，crl-1005、卡波姆、adjuplex)、gerbu、teramide、psc97b、adjumer、pg-026、gsk-i、gcmaf、b-阿迪宁、mpc-026)、adjuvax、betafectin、alf、alfa或alfq、或其任何组合。
实施例3是如实施例2或2a所述的方法，其中该一种或多种组合物不包含任何佐剂。
实施例4是如实施例1-3中任一项所述的方法，其中在向该受试者施用免疫原性有效量的编码hivenv抗原的腺病毒载体后，共定位施用该免疫原性有效量的该分离的hivenv多肽和该免疫原性有效量的该腺病毒载体进行加强免疫。
实施例5是如实施例1-4中任一项所述的方法，其中该腺病毒载体是腺病毒26(rad26)载体。
实施例6是如实施例1-5中任一项所述的方法，其进一步包括将免疫原性有效量的编码第二hivenv抗原的第二腺病毒载体与免疫原性有效量的该腺病毒载体一起施用。
实施例7是如实施例6所述的方法，其中该第二腺病毒载体是腺病毒26(rad26)载体。
实施例8是如实施例1-7中任一项所述的方法，其进一步包括施用免疫原性有效量的一种或多种编码另外的hiv抗原的腺病毒载体。
实施例9是如实施例8所述的方法，其中这些另外的hiv抗原包括gag和/或pol。
实施例10是如实施例8或9中任一项所述的方法，其中该一种或多种编码另外的hiv抗原的腺病毒载体是rad26载体。
实施例11是如实施例1-10中任一项所述的方法，其中该共定位施用是肌内注射至单块肌肉。
实施例12是如实施例1至11中任一项所述的方法，其中该免疫应答包括体液免疫应答。
实施例13是如实施例1至11中任一项所述的方法，其中该免疫应答包括细胞免疫应答。
实施例14是如实施例1至13中任一项所述的方法，其中该免疫应答包括t辅助1(th1)偏向性免疫应答。
实施例15是如实施例8至10中任一项所述的方法，其中与在该受试者的对侧部位施用含磷酸铝佐剂的该hivenv多肽和这些腺病毒载体相比，针对这些另外的hiv抗原的免疫应答没有显著降低。
本发明的以下实例是为了进一步说明本发明的性质。应当理解，以下实例不限制本发明，且本发明的范围由所附权利要求确定。
实例
实例1：在兔中进行的免疫原性研究
在初免-加强方案中以6周的间隔对新西兰白(nzw)兔进行免疫原性评估。在第0天和第42天将hiv-1进化枝cgp140重组蛋白(10μg)与425μg磷酸铝佐剂(
加强后两周，通过酶联免疫吸附测定(elisa)以疫苗自体进化枝cgp140作为包被抗原来测量血清抗体。结果示于图1中。特别地，结果显示在研究的第56天，在不同的腿中共施用载体和含佐剂的蛋白(“铝+相同部位-”)的组和在没有佐剂的情况下共定位施用(即，相同部位注射)载体和蛋白(“铝-相同部位+”)的组之间的进化枝cgp140elisa效价不能区分。
因此，该研究证明，当将所施用的疫苗组分(即，处于腺病毒载体和分离的多肽的形式的hivenv抗原)注射到相同部位，即，共定位施用时，铝佐剂是非必要的。
实例2：小鼠的免疫原性研究
在初免-加强方案中以6周的间隔对小鼠进行免疫原性评估。在第0天和第42天，对cb6/f1小鼠按2种不同剂量将hiv-1进化枝cgp140重组蛋白与ad26.mos4.hiv疫苗共定位注射(即，相同部位注射)或者在两条不同的后腿分别施用来免疫，特别是12.5μg和1.25μg的进化枝cgp140重组蛋白。在进行共定位注射的情况下，将ad26.mos4.hiv和gp140临时预混合(‘笼侧混合’)。在不同的后腿中施用重组蛋白和ad26.mos4.hiv疫苗(参见说明书的实例1)的组中的进化枝cgp140重组蛋白分别含21.25μg和2.125μg的相应剂量水平的磷酸铝佐剂。当与12.5μg进化枝cgp140重组蛋白一起施用时，ad26.mos4.hiv疫苗的总剂量为2.5x109个病毒颗粒(vp)，而与1.25μg进化枝cgp140重组蛋白一起施用时，其总剂量为2.5x108vp。通过肌内施用对动物进行免疫。
加强后两周(即，在第56天)，通过elisa测量血清抗体，其中疫苗自体进化枝cgp140作为包被抗原。结果示于图2中。特别地，结果显示与在不同的腿中共同施用载体和含佐剂的蛋白(“铝+相同部位注射-”)的组相比，在没有佐剂的情况下共定位施用(即，同一部位注射)载体和没有佐剂的蛋白(“铝-相同部位注射+”)的组在第56天时血清中的进化枝cgp140elisa效价具有增加的进化枝cgp140elisa效价。
另外，用进化枝cgp140重组蛋白在体外重新刺激小鼠的脾细胞，并在重新刺激后48小时分析上清液中的细胞因子。确定ifnγ与il-5的比率，并且高ifnγ/il-5比率指示相对的t辅助1(th1)偏向性免疫应答。结果示于图3中。结果证明，与在不同位置共施用载体和含佐剂的蛋白相比，共定位施用(即，相同部位注射)载体和没有佐剂的蛋白诱导th1偏向性免疫应答。
另外，在研究的第56天，通过ifnγelispot评估了hiv-1特异性细胞免疫应答。使用分别具有gag、pol和env的全球潜在t细胞表位(pte)肽库离体刺激小鼠的脾细胞。结果示于图4中。该结果显示，与远端共施用相比，当共定位施用腺病毒载体和蛋白时，env抗原的细胞免疫应答显著更高(p<0.0001，以剂量和施用方式作为解释因素的双因素方差分析)。这些结果证明，共定位施用(即，相同部位注射)腺病毒载体和没有佐剂的蛋白不会降低(甚至增加)对共施用的抗原的免疫应答。
因此，该研究证明，当在相同部位注射(即，共定位施用)疫苗组分时，铝佐剂是非必要的；而共定位施用处于腺病毒载体和分离的多肽的形式的hivenv抗原会产生增强的平均体液应答。该研究还证明，在没有佐剂的情况下，共定位施用处于腺病毒载体和分离的多肽的形式的hivenv抗原诱导th1偏向性免疫谱。
参考文献
1.us2012/0076812
2.wo2003/104467
3.wo2007/104792
4.wo2008/107370
5.wo2010/042942
6.wo2011/106705
7.wo2014/107744
8.wo2015/189425
9.wo2016/049287
10.abbinketal.,(2007)virol81(9):4654-63
11.barouchetal.thelancet,volume392,issue10143,p232-243,july21,2018；
12.barouchetal.,natmed2010,16:319-323；
13.barouchetal.,cell155:1-9,2013
14.bingleyetal.bmj.2000aug12；321(7258):424
15.coliganetal.(1992and1994,currentprotocolsinimmunology；edjwiley&sonsinc,nationalinstituteofhealth).
16.havenga,etal.,2006,jgenvirol87:2135-43；
17.jonesetal.j.biol.chem.,280,13406-13414(2005)
18.kovacsetal,pnas2012,109(30):12111-6,
19.nkololaetal2010,j.virology84(7):3270-3279
序列表
序列表
<110>扬森疫苗与预防公司
<120>共定位施用疫苗组分诱导针对人类免疫缺陷病毒的免疫应答的方法
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<160>12
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