吉西他滨联合抗产气肠杆菌药物在制备治疗胰腺癌药物中的应用的制作方法

本发明涉及吉西他滨联合抗产气肠杆菌药物在制备治疗胰腺癌药物中的应用，属于生物医药
技术领域：
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背景技术：
：胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90％为起源于腺管上皮的导管腺癌。其发病率和死亡率近年来明显上升。5年生存率<1％，是预后最差的恶性肿瘤之一。目前临床上胰腺癌的治疗方案仍以吉西他滨为主要治疗用药，但存在药物敏感性低、选择性差、毒副作用强、治疗剂量与毒性剂量间窗口窄等缺点。产气肠杆菌(enterobacteraeruginosa)菌体大小约为长1.2-3.0μm、宽0.6-1.0μm，为革兰氏阴性的兼性厌氧杆菌。为肠内细菌，不产胞子且具有小的荚膜，其有周鞭毛，可以活动。主要生存于人类和动物的肠道，为人体内的正常菌属，只有在人体虚弱的特殊情况下才偶尔引起疾病。本发明人研究发现，产气肠杆菌作为一种人类肠道的正常定植的细菌，在患有胰腺癌的病人的胰腺组织上存在高分布，进一步的研究发现产气肠杆菌可以影响胰腺癌的的浸润、远处转移、恶性程度等密切相关，并发现其与胰腺癌常用化疗药物吉西他滨的化疗敏感性密切相关。技术实现要素：本发明的目的在于解决现有技术中采用吉西他滨治疗胰腺癌存在的不足，提供一种吉西他滨联合抗产气肠杆菌药物在制备治疗胰腺癌药物中的应用，将吉西他滨与抗产气肠杆菌药物有机结合，进一步增强胰腺癌的化疗效果。技术方案吉西他滨联合抗产气肠杆菌药物在制备治疗胰腺癌药物中的应用。本发明人根据临床数据分析发现胰腺癌的患者的胰腺组织同正常人相比产气肠杆菌分度较高，经过研究表明产气肠杆菌可以激活胰腺癌细胞的pi3k/akt通路进而影响其生物学特性，进一步研究发现其与胰腺癌化疗药物吉西他滨的药物敏感性密切相关，在原有吉西他滨治疗胰腺癌的基础上，辅以针对产气肠杆菌的抗生素加以辅助治疗，可以增强吉西他滨的化疗效果，并抑制胰腺癌的迁移侵袭能力。进一步，所述抗产气肠杆菌药物为庆大霉素。吉西他滨和抗产气肠杆菌药物可以联合给药，或分开给药。一种治疗胰腺癌的药物组合物，以吉西他滨联合抗产气肠杆菌药物为主要活性成分。进一步，所述抗产气肠杆菌药物为庆大霉素。进一步，所述吉西他滨单次用量为100mg/kg体重，庆大霉素单次用量为2.4×105ui/kg体重。进一步，所述药物组合物还包含药学上可接受的药物载体。本发明的有益效果：本发明很好地改进了胰腺癌的化疗方案，通过使用常规的胰腺癌化疗药物并辅以抗产气肠杆菌的药物，能够有效抑制胰腺癌的生长速度，并减弱其迁移侵袭能力，减轻其炎症反应，这对于研究胰腺癌与菌群之间的联系起到了一个良好的启发作用。附图说明图1为胰腺癌细胞bxpc-3经不同方式处理后的迁移能力测试结果；图2为胰腺癌细胞panc-1经不同方式处理后的迁移能力测试结果；图3为胰腺癌细胞bxpc-3经不同方式处理后的侵袭能力测试结果；图4为胰腺癌细胞panc-1经不同方式处理后的侵袭能力测试结果；图5为胰腺癌细胞bxpc-3经不同方式处理后的增殖能力测试结果；图6为胰腺癌细胞panc-1经不同方式处理后的增殖能力测试结果；图7为不同处理组小鼠胰腺癌原位瘤瘤体照片；图8为不同处理组小鼠胰腺癌原位瘤瘤体体积。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。下述实施例中，吉西他滨购买自mce(hy-17026)，庆大霉素购买自翊圣生物有限公司，ly294002购买自cellsignailingtechology(#9901)，产期肠杆菌购买自北纳创联生物技术有限公司，菌种编号为bncc337113。实施例1气肠杆菌通过激活pi3k/akt通路影响胰腺癌迁移、侵袭能力实验方法：为了分析产气肠杆菌对于胰腺癌迁移、侵袭的影响，使用胰腺癌研究常用细胞系bxpc-3及panc-1作为模型进行研究。1.transwell迁移实验方法：(1)胰腺癌细胞消化下来，离心后弃上清；(2)胰腺癌细胞用无血清培基dmem重悬，细胞计数，密度≈5×106/ml；(3)接种0.2ml于24孔板transwell小室的上室，下室加入0.6ml含2％血清的dmem培基；随后上室中加入相应药液(分为n、ea、ly、ea+ly四个处理组，n表示无处理空白对照组，ly表示使用akt通路抑制剂ly294002处理组，ea为使用产气肠杆菌上清处理组，ea+ly294002组为产气肠杆菌上清后加用ly294002处理组)，具体见表1：表1处理组的设置处理组nealyea+ly产气肠杆菌上清0200μl/ml0200μl/mlly2940020010μmol/ml10μmol/ml(4)37℃、5％co2、饱和湿度的恒温培养箱中培养24h；(5)取出小室，200μl枪头吸弃旧培基；(6)用1.5ml甲醇固定0.5-1h，200μl枪头吸弃甲醇；(7)0.1％结晶紫500μl染色30min，200μl枪头吸弃结晶紫，随后在大烧杯中用清水清洗(注意不能碰下壁)；(8)随后擦干上室的细胞和液体，晾干10min；(9)显微镜下观察并统计穿过上室的细胞数，分别选取10×和20×视野拍照备用，以穿透上室的细胞数表示细胞的迁移能力。2.transwell侵袭实验方法：(1)先将transwell小室铺基质胶(无血清dmed培养基1:5稀释，每孔加70μl，铺匀，37℃培养箱凝胶2h，美国bd公司)；(2)胰腺癌细胞消化下来，离心后弃上清；(3)胰腺癌细胞用无血清培基dmem重悬，细胞计数，密度≈5×106/ml；(4)接种0.5ml于24孔板transwell小室的上室，下室加入0.6ml含2％血清的dmem培基；随后上室中加入相应药液，具体见上面表1；(5)37℃、5％co2、饱和湿度的恒温培养箱中培养(6-12h)24h；(6)取出小室，200μl枪头吸弃旧培基；(7)用1.5ml甲醇固定0.5-1h，200μl枪头吸弃甲醇；(8)0.1％结晶紫500μl染色30min，200μl枪头吸弃结晶紫，随后在大烧杯中用清水清洗(注意不能碰下壁)；(9)随后擦干上室的细胞和液体，晾干10min。(10)显微镜下观察并统计穿过上室的细胞数，分别选取10×和20×视野拍照备用，以穿透上室的细胞数表示细胞的迁移能力。transwell迁移和侵袭实验中，每个实验进行3次，所有数据均采用t检验或方差分析进行统计学分析，差异有统计学意义(p<0.05)。实验结果见图1-4，其中，图1为胰腺癌细胞bxpc-3经不同方式处理后的迁移能力测试结果，图2为胰腺癌细胞panc-1经不同方式处理后的迁移能力测试结果，图3为胰腺癌细胞bxpc-3经不同方式处理后的侵袭能力测试结果，图4为胰腺癌细胞panc-1经不同方式处理后的侵袭能力测试结果，n表示无处理空白对照组，ly表示使用akt通路抑制剂ly294002处理组，ea为使用产气肠杆菌上清处理组，ea+ly组为产气肠杆菌上清后加用ly294002处理组。图中所染的为穿透的胰腺癌细胞，细胞穿透的多少分别代表其迁移、侵袭能力；p值表示有统计学意义的差异，分别设置为*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。由图1和2可以看出，产气肠杆菌上清处理后能够通过激活pi3k/akt通路从而增强胰腺癌细胞(bxpc-3和panc-1)的迁移能力，由图3和4可以看出，产气肠杆菌上清处理后能够通过激活pi3k/akt通路从而增强胰腺癌细胞(bxpc-3和panc-1)的侵袭能力。实施例2气肠杆菌通过激活pi3k/akt通路影响胰腺癌细胞的增殖能力实验方法：为了分析产气肠杆菌对于胰腺癌增殖能力的影响，使用胰腺癌研究常用细胞系bxpc-3及panc-1作为模型进行研究，并通过平板克隆实验进行验证。平板克隆实验步骤：(1)胰腺癌细胞消化下来，离心后弃上清；(2)胰腺癌细胞用10％胎牛血清的dmem培养液重悬，细胞计数；(3)将细胞悬液加入六孔板中，每孔加入胰腺癌细胞500个；随后各孔中加入相应药液(分为n、ea、ly、ea+ly四个处理组，n表示无处理空白对照组，ly表示使用akt通路抑制剂ly294002处理组，ea为使用产气肠杆菌上清处理组，ea+ly294002组为产气肠杆菌上清后加用ly294002处理组)，具体见表2：表2处理组的设置处理组nealyea+ly产气肠杆菌上清0200μl/ml0200μl/mlly2940020010μmol/ml10μmol/ml(4)于加入细胞后的第7天、第5天和第3天，弃去上清并重新加入10％胎牛血清的dmem培养液，并与各孔中加入相应药液(每次均与之前相同)：(5)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用pbs小心浸洗3次。加4％多聚甲醛固定细胞2ml固定2小时：(6)固定两小时后弃去4％多聚甲醛，并使用结晶紫染液染色15min，后吸去染液，并使用pbs小心浸洗3次。(7)将六孔板置于白纸上，拍照，并计数克隆。实验3次，所有数据均采用t检验或方差分析进行统计学分析，差异有统计学意义(p<0.05)，实验结果见图5-6，图5为胰腺癌细胞bxpc-3经不同方式处理后的增殖能力测试结果，图6为胰腺癌细胞panc-1经不同方式处理后的增殖能力测试结果，图中所染的为胰腺癌细胞克隆细胞团，细胞团的多少代表增殖能力的大小，p值表示有统计学意义的差异，分别设置为*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。由图5和6可以看出，产气肠杆菌上清处理后能够通过激活pi3k/akt通路从而增强胰腺癌细胞(bxpc-3和panc-1)的增殖能力。实施例3吉西他滨联合抗产气肠杆菌药物治疗胰腺癌的效果测试在原有吉西他滨治疗胰腺癌的基础上，辅以庆大霉素加以治疗，以增强吉西他滨的化疗效果，并抑制胰腺癌的迁移侵袭能力。在spf级饲养条件下，24只雄性裸鼠共分为3组(gm组、anti组、ea组)，每组8只：gm组为空白对照组，饮用水中无任何处理。anti组为无菌处理组，小鼠的饮用水中加入头孢西丁(500mg/l)处理48小时构建无菌动物模型，并通过粪便菌群检测加以验证，然后通过口服灌胃的方式使产气肠杆菌(1×108colonyformingunits)入小鼠肠腔。ea组为产气肠杆菌处理组，小鼠的饮用水中加入头孢西丁(500mg/l)处理48小时构建无菌动物模型，并通过粪便菌群检测加以验证，然后通过口服灌胃的方式使产气肠杆菌(1×108colonyformingunits)入小鼠肠腔。各组小鼠同期进行胰腺癌原位瘤块注射的方式构建胰腺癌模型，两周后小鼠肿瘤模型构建成功。小鼠肿瘤模型构建成功后，3组小鼠均使用吉西他滨腹腔注射进行治疗(100mg/kg体重)，anti组同时辅以庆大霉素(2.4×105ui/kg体重)口服灌胃加以治疗，吉西他滨每天注射一次，anti组庆大霉素(2.4×105ui/kg体重)口服灌胃每天一次，吉西他滨是采用0.9％的氯化钠注射液溶解盐酸吉西他滨冻干粉后注射使用，庆大霉素是采用0.9％的氯化钠注射液溶解后使用。14天后将小鼠在符合伦理的条件下处死，称重，收取组织标本并拍照。图7为不同处理组小鼠胰腺癌原位瘤瘤体照片，图8为不同处理组小鼠胰腺癌原位瘤瘤体体积。由图7和图8可以看出，与gm组、ea组相比，anti组小鼠的肿瘤体积小很多，这说明ea菌(产气肠杆菌)可以有效影响吉西他滨的化疗效果，庆大霉素联合吉西他滨化疗效果优于原有的化疗方案。当前第1页12