S100A8\A9二聚体活性抑制剂在防治或诊断冠状病毒感染中的用途的制作方法

本发明涉及领域医药领域，具体涉及s100a8\a9二聚体活性抑制剂在防治或诊断冠状病毒感染中的用途。

背景技术：

冠状病毒是一种以蝙蝠和禽类为主要宿主的单链rna病毒。在近几十年中，几种冠状病毒突破了蝙蝠与人类的物种界限，严重危害了人们的生命安全，造成了很大的社会恐慌。2003年sars-cov导致的严重急性呼吸综合征最终导致8096例感染以及774例死亡；2012年mers-cov导致的中东呼吸综合征最终导致2494例感染以及858例死亡。2020年sars-cov2在世界各地均发现了大范围的疫情爆发，成为了进100年来最为严重的自然灾害。世界各国疫情持续爆发，疫情常态化对世界经济也造成极大冲击。因此，针对新型冠状病毒感染导致肺炎的防治问题成为了科研界的共同难关。

普遍而言，病毒疫苗是预防病毒传播的通用手段。然而不同于其他病毒，冠状病毒因其自身的特殊性导致人体对包括灭活和减毒活疫苗在内的几种疫苗产生的抗体具有ade(antibody-dependentenhancement)效应，难以保护机体抵抗病毒入侵。同样，病毒抗体也是治疗病毒感染的最后手段，而针对冠状病毒特异靶点的抗体因为ade效应的存在，无法清除病毒。因此，在难题得以解决以及有效的疫苗研制出来之前，新型冠状病毒肺炎的早期诊断以及对症治疗是控制疫情的重中之重。

关于新型冠状病毒肺炎的对症治疗，目前人们的关注点大部分在新型冠状病毒引起的特异性固有免疫表型以及炎症风暴方面。首先是炎症表型，人体在应对常见病毒感染的情况下，一般会出现淋巴细胞的上升，中性粒细胞不变或减少的血象。而冠状病毒肺炎反而会出现类似于细菌感染的血象变化，患者通常中性粒细胞上升，淋巴细胞不变或减少。而冠状病毒肺炎为何会出现细菌样的免疫表型是人们一直没有解释清楚的问题。然后再谈炎症风暴，炎性细胞因子分泌以及炎症细胞浸润是机体应对损伤进行修复的重要环节。然而在冠状病毒肺炎中，患者通常会最终发展为不受控制的高强度炎性细胞因子风暴，而这种失控的炎症不仅不会修复损伤的肺组织反而是冠状病毒肺炎后期致命性多器官衰竭的元凶。炎症风暴是从初步少量的炎性细胞因子分泌招募炎症细胞浸润活化，然后活化的炎症细胞进一步分泌炎症因子一步步信号放大导致的。因此，对早期的冠状病毒肺炎进行研究，发现炎症风暴的起始根源，才可以最有效地抑制炎症并进行对症治疗。然而冠状病毒肺炎患者有很长的潜伏期，像sars-cov2有7到14天左右的潜伏期。因此科研工作者们无法通过找到早期的冠状病毒肺炎患者，从而研究炎症的起始根源。目前已知的研究成果显示，不同于正常病毒感染，sars-cov、mers-cov以及sars-cov2感染早期并不会引起抗病毒细胞因子干扰素的正常表达。这可能是炎症居高不下的原因之一，却并不能揭示炎症风暴的发生且无法做到针对性治疗。

sars-cov2的长潜伏期是病毒感染无法早期诊断的根源。病毒感染的诊断通常为核酸检测，然而sars-cov2感染患者在潜伏期内无法检测到病毒核酸。与此同时潜伏期的患者同样具有传染能力，这为控制疫情传播创造了难题。

技术实现要素：

鉴于现有技术中存在的技术问题，发明人应用恒河猴和人源ace2转基因小鼠，建立sars-cov2肺部感染动物模型。探究在sars-cov2感染早期机体发生的固有免疫特征，发现s100a8蛋白是启动炎症风暴的根源，并成为sars-cov2感染患者早期诊断的免疫指标。随后，通过药物帕喹莫德(paquinimod)抑制s100a8/s100a9蛋白的功能最终抑制组织中病毒滴度，炎症水平下降，有效地遏制了动物模型中sars-cov2肺炎的发生发展。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供s100a8/s100a9二聚体活性抑制剂在制备用于防治冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。

根据本发明所述的用途，优选地，所述s100a8/s100a9二聚体活性抑制剂为小分子物质，其为具有下式(i)或(ii)所示结构的化合物：

式(i)，其中，r1至r3各自独立地表示c1-c5烷基；

式(ii)，其中，r1至r3各自独立地c1-c5烷基，r4至r6各自独立地表示卤素原子，r7表示羟基或氢原子。

根据本发明所述的用途，优选地，所述s100a8/s100a9二聚体活性抑制剂为帕喹莫德和/或他喹莫德。

根据本发明所述的用途，优选地，所述s100a8/s100a9二聚体活性抑制剂为靶向s100a8基因或s100a9基因的shrna。

根据本发明所述的用途，优选地，所述s100a8/s100a9二聚体活性抑制剂为抗s100a8或其片段的抗体和/或抗s100a9或其片段的抗体。

本发明的第二方面，提供检测s100a8基因表达水平的试剂在制备用于诊断冠状病毒感染的诊断剂或试剂盒中的用途。

根据本发明所述的用途，优选地，所述检测s100a8基因表达水平的试剂包括引物和/或探针。

本发明的第三方面，提供显示s100a8的量、或s100a9的量或者s100a8/s100a9二聚体的量的试剂在制备用于诊断冠状病毒感染的诊断剂或试剂盒中的用途。

根据本发明所述的用途，优选地，显示s100a8的量的试剂为抗s100a8或其片段的抗体，显示s100a9的量的试剂为抗s100a9或其片段的抗体。

本发明的第四方面，提供一种用于筛选对防治或减缓冠状病毒感染有用的化合物的方法，其包括测量样本中s100a8基因和/或s100a9基因表达水平，或者s100a8和/或s100a9的量的步骤。

根据本发明的方法，优选地，所述方法包括：

a.测量感染冠状病毒的非人受试者采集的生物样本中s100a8基因和/或s100a9基因的表达水平，或者s100a8和/或s100a9的量得到第一测量值的步骤；

b.将待测化合物施用至该非人受试者的步骤；

c.测量从施用待测化合物后的该非人受试者采集的生物样本中s100a8基因和/或s100a9基因表达水平，或者s100a8和/或s100a9的量得到第二测量值的步骤；

d.比较第一测量值和第二测量值的步骤；

e.当第二测量值小于第一测量值时，将待测化合物筛选为对防治或减缓冠状病毒感染有用的化合物，当第二测量值大于或等于第一测量值时，将待测化合物筛选为对防治或减缓冠状病毒感染无用的化合物。

根据本发明的方法，所述方法包括：

a.测量过表达s100a8和/或s100a9的细胞中s100a8和/或s100a9的表达水平得到第一测量值的步骤；

b.将待测化合物施用至所述细胞的步骤；

c.测量从施用待测化合物后的细胞中s100a8基因和/或s100a9基因的表达水平得到第二测量值的步骤；

d.比较第一测量值和第二测量值的步骤；

e.当第二测量值小于第一测量值时，将待测化合物筛选为对治疗或减缓冠状病毒感染有用的化合物，当第二测量值大于或等于第一测量值时，将待测化合物筛选为对治疗或减缓冠状病毒感染无用的化合物。

附图说明

图1为sars-cov2感染早期的肺部转录活性聚类分析结果。

图2为中性粒细胞数量上升以及炎症风暴趋化聚类分析结果。

图3为基于s100a8基因的警戒素蛋白分析结果。

图4为sars-cov2肺炎患者的肺组织转录本分析结果。

图5为人源ace2转基因小鼠感染sars-cov2的肺组织转录本分析结果。

图6为ifnar基因敲除小鼠感染mhv后s100a8基因表达结果。

图7为ifnar敲除小鼠以及人源ace2小鼠感染呼吸道病毒iav后s100a8基因表达结果。

图8为基于s100a8蛋白的kegg和go通路分析结果。

图9为帕喹莫德药物对冠状病毒感染抵抗力的特异性实验结果。

图10为对ifnar敲除小鼠感染mhv的肺组织后药物抑制结果。

图11利用针对s100a8和s100a9的shrna降低肺部s100a8/s100a9的表达水平结果图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“%”或“量”均为基于重量的百分数。

实施例1

一、s100a8/s100a9是治疗新型冠状病毒相关肺炎的有效靶点

应用恒河猴和人源ace2转基因小鼠，建立sars-cov2肺部感染动物模型。探究在sars-cov2感染早期机体发生的固有免疫特征，发现s100a8蛋白是启动炎症风暴的根源，并成为sars-cov2感染患者早期诊断的免疫指标。随后通过药物帕喹莫德(paquinimod)抑制s100a8/s100a9蛋白的功能最终抑制组织中病毒滴度，炎症水平下降，有效地遏制了动物模型中sars-cov2肺炎的发生发展。

首先对恒河猴滴鼻感染sars-cov2，取第0、3、5天的肺组织进行rna-seq测序，分析sars-cov2感染早期的肺部转录活性改变。如图1结果所示，通过go分析发现，上调的基因主要都聚类在免疫、炎症以及中性粒细胞趋化方向上。揭示了在sars-cov2感染早期，恒河猴肺部已经出现了炎症风暴倾向以及中性粒细胞的浸润和活化，证明sars-cov2感染恒河猴动物模型建立成功，也提示sars-cov2感染患者的临床症状中中心粒细胞的增多是一个早期病理学事件。

通过比对中性粒细胞趋化聚类中的基因，阐释sars-cov2肺炎不同于常见病毒引起中性粒细胞数量上升以及炎症风暴的原因。比对结果如图2所示，在所有上调基因中，最为明显的是s100a8基因，且其在中性粒细胞趋化中发挥重要功能。

s100a8蛋白是经典的警戒素蛋白。机体细胞受外来压力刺激(如damp信号通路活化)或组织发生损伤会导致警戒素转录并分泌，从而招募炎症细胞浸润介导炎症反应发生。通过对已知警戒素进行分析，分析结果如图3所示，可以发现在sars-cov2感染早期，恒河猴肺部组织并没有广泛上调警戒素表达，s100a8基因表达的上调在sars-cov2感染早期是极为特异的。提示s100a8蛋白是sars-cov2肺炎致病过程中导致炎症风暴的重要一环。

为了进一步确认s100a8基因表达上调是sars-cov2肺炎的重要标志，我们同时对sars-cov2肺炎患者的肺组织以及人源ace2转基因小鼠感染sars-cov2的肺组织进行了转录本分析。sars-cov2肺炎患者的肺组织转录本分析结果如图4所示，人源ace2转基因小鼠感染sars-cov2的肺组织转录本分析结果如图5所示。结果显示sars-cov2肺炎患者和人源ace2转基因小鼠感染sars-cov2的肺组织均出现了s100a8基因表达上调。

患者肺组织样本s100a8基因表达上调不是很强，可能是因为样本是感染后期的缘故。而小鼠样本显示在加毒感染第一天s100a8基因就已经上调表达，在第五天到达峰值。证明了s100a8基因表达上调启动于感染的早期阶段，在炎症风暴的放大过程中处于靠近起始的位置。且s100a8基因表达的上调趋势揭示了s100a8蛋白在sars-cov2肺炎中介导中性粒细胞浸润活化的作用。上述结果显示，s100a8蛋白的上调发生在sars-cov2肺炎早期，其特异性基因表达上调是sars-cov2感染招募中性粒细胞的关键原因之一。

实验通过对不同病毒感染的小鼠动物模型进行研究，探究s100a8的上调是sars-cov2特异的还是具有普适性。首先是对另一种以小鼠为宿主的冠状病毒mhv进行研究，实验结果如图6所示，ifnar基因敲除小鼠感染mhv导致s100a8基因表达上调。对另一种以小鼠为宿主的呼吸道病毒iav实验结果如图6和图7所示，对ifnar敲除小鼠以及人源ace2小鼠感染呼吸道病毒iav则并不会引起s100a8上调。从而证明了s100a8基因表达的上调是冠状病毒特异的，揭示s100a8成为冠状病毒感染早期诊断的免疫学指标的可能性。

细胞在正常生理状态下，s100a8蛋白本底表达量不高，s100a9蛋白正常表达并定位于细胞质。在收到信号刺激的情况下，s100a8蛋白大量表达，与s100a9蛋白在细胞质中形成二聚体并被分泌到胞外，招募中性粒细胞并结合其膜受体tlr4，激活下游炎症信号启动炎症反应。tlr4是著名的模式识别受体(prr)，大量研究证明其主要功能是识别革兰氏阴性菌病原相关分子模式(pamp)脂多糖(lps)，进而激活下游信号通路启动固有免疫以及炎症反应。s100a8蛋白在冠状病毒感染中的特异性上调进而激活tlr4受体，如图8所示，这样就解释了为何冠状病毒肺炎不同于常见病毒感染出现的淋巴细胞的上升、中性粒细胞下降，反而会出现类似于细菌感染的中性粒细胞上升、淋巴细胞减少的血象。

二、sras-cov2的潜在药物分析

1.s100a8/s100a9二聚体小分子抑制剂

实验采用药物帕喹莫德(paquinimod)进行研究，帕喹莫德是一种小分子抑制剂，可以有效抑制s100a8/s100a9二聚体与tlr4的结合，进而抑制下游炎症信号激活。结果如图9所示，结果显示相较于对照组，帕喹莫德滴鼻组人源ace2小鼠明显对sras-cov2的抵抗性增强；帕喹莫德滴鼻组ifnar敲除小鼠感染mhv的生存率上升；而帕喹莫德滴鼻组小鼠感染iav的生存率并没有显著性差别。提示帕喹莫德可以特异性提高对冠状病毒感染的抵抗力。

后续对ifnar敲除小鼠感染mhv的肺组织进行分析，实验结果如图10所示，结果发现药物抑制s100a8/s100a9二聚体对tlr4的活化后无法有效招募炎症细胞聚集以及随后的肺部s100a8基因表达上调，减轻了炎症以及炎症导致的肺部损伤，抑制了sars-cov-2和mhv复制。上述结果证明了帕喹莫德可以通过抑制s100a8蛋白的功能进而抑制冠状病毒感染导致的中性粒细胞活化，将失控的炎症风暴扼杀于摇篮中。因此，帕喹莫德成为潜在的sars-cov2肺炎对症治疗药物。

2.针对s100a8和s100a9的shrna

为了进一步确证s100a8/s100a9在新型冠状病毒感染中的免疫调节功能，发明人构建了s100a8和s100a9的shrna(其序列如表1所示)，并包装成慢病毒。通过鼻饲小鼠，来降低肺部s100a8/s100a9的表达水平(如图11所示)。而且shrna敲低了s100a8/s100a9之后，sars-cov-2感染引起的小鼠体重的降低，明显被挽救。在分子机制方面，s100a8/s100a9shrna显著下调了ly6g的表达水平，说明基因沉默技术来靶向s100a8/s100a9，也能够降低sars-cov-2的引起的免疫细胞浸润和炎症反应。

表1

序列表

<110>北京大学

<120>s100a8\a9二聚体活性抑制剂在防治或诊断冠状病毒感染中的用途

<130>bh2000237-1

<141>2020-08-27

<150>202010725774.6

<151>2020-07-24

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