一种穗花杉双黄酮在制备治疗胶质瘤药物中的应用的制作方法

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本发明属于医药技术领域，涉及一种提取物的新用途，穗花杉双黄酮在制备治疗胶质瘤药物中的应用。


背景技术：

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胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，胶质母细胞瘤是其中恶性程度最高的，呈浸润性生长，生长速度快，极难根治。胶质母细胞瘤又称多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，gbm)，是成人中枢神经系统中最常见、最致命的原发性恶性肿瘤，目前治疗效果较差。研究表明，异常激活的janus激酶2(janus kinase 2，jak2)-信号转导子和转录激活子3(signal transducers and activators of transcription 3，stat3)通路在gbm发病中起着重要作用，是其临床综合治疗的重要潜在靶点之一。穗花杉双黄酮又称阿曼托双黄酮(amentoflavone，af)，是一种来源于卷柏中的多酚类天热化合物，新近报道其可作为jak2的抑制剂对人类恶性黑色素瘤、结肠癌、肝癌等发挥抗癌作用。
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到目前为止，尽管手术、放化疗等取得很大进展，但胶质母细胞瘤的治疗远未达到理想效果，患者预后并无明显改善，平均生存期仅1年左右。因此，寻找新的治疗方法和药物始终是临床亟待解决的问题之一。近年来随着研究拓展，人们逐渐认识到，传统中医药及天然化合物等或可为未来胶质瘤治疗(辅助治疗)带来新的希望。


技术实现要素：

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本发明的目的在于提供sutherlandin-5-p-hydroxybenzoate在制备治疗胶质瘤药物中的应用，穗花杉双黄酮在制备治疗胶质瘤药物中的应用，以胶质母细胞瘤细胞系u87mg为对象，研究穗花杉双黄酮对其增殖、凋亡的影响，为gbm的临床治疗提供新的实验数据和应用研究基础。
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其具体技术方案为：
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一种穗花杉双黄酮在制备治疗胶质瘤药物过程中的应用。
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与现有技术相比，本发明的有益效果为：
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穗花杉双黄酮能够有效抑制胶质母细胞瘤的增殖，这些结果与yen th等研究相符。深究其机制，穗花杉双黄酮可显著抑制胶质瘤细胞jak2-stat3信号通路的活化应是重要的原因之一。而jak2-stat3通路受阻，可使其下游bcl-2表达显著下调，从而明显增加肿瘤细胞凋亡。因此，应用穗花杉双黄酮阻断jak2-stat3信号通路，促进肿瘤细胞凋亡、抑制其增殖，为胶质母细胞瘤治疗或辅助治疗的新方法。
附图说明
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图1是cck-8检测不同浓度穗花杉双黄酮在不同时间对u87mg细胞活性的影响*p<0.05vs 0μm组，**p＜0.01vs 0μm组；
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图2是cck-8检测不同浓度穗花杉双黄酮对u87mg细胞凋亡的影响，其中，a.流式细
胞术检测结果；b.多次独立实验检测数据统计结果，*p＜0.05vs 0μm组，**p＜0.01vs 0μm组；
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图3是western blotting检测不同浓度穗花杉双黄酮对jak2、stat3、p-jak2、p-stat3、bcl-2蛋白表达的影响。
具体实施方式
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下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
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1材料和方法
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1.1细胞培养gbm细胞系u87mg购自中科院上海细胞资源中心，为人类多形性胶质母细胞瘤单克隆成系，who分级标准为iv级。置于含10％胎牛血清的dmem培养基中培养(dmem培养液、胰蛋白酶购自美国gibco公司、胎牛血清购自美国hyclone公司)。
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1.2主要试剂(盒)穗花杉双黄酮购自美国sigma公司，jak2、p-jak2、stat3、p-stat3、bcl-2、β-actin单克隆抗体购自美国cell signal technology公司，western blotting相关试剂(盒)购自南京凯基生物科技发展有限公司，发光液购自美国advansta公司，cck-8试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，annexin v/pi试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。
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1.3 cck-8检测细胞增殖收集生长状态良好的u87mg细胞，接种于24孔板，每孔接种2.0
×
105个，置于5％co2、37℃的恒温箱中孵育24小时。依次加入浓度为0μm、50μm、100μm、150μm、200μm的穗花杉双黄酮，分别干预24、48、72h。然后每孔加入100μl的cck-8液，继续在培养箱中孵育1h，用酶标仪测定450nm波长的吸光度(d
450
)。
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1.4 annexin v/pi双染检测细胞凋亡收集生长状态良好的u87mg细胞，接种于6孔板，每孔接种1.0
×
106个，置于5％co2、37℃的恒温箱中孵育24h。依次加入浓度为0μm、50μm、100μm、150μm、200μm的穗花杉双黄酮施行干预24h。用不含edta的胰酶消化收集细胞，用pbs洗涤细胞两次，2000rpm常温下离心2min，弃上清，加入500μl binding buffer悬浮细胞，加入5μl annexin v混匀后，再加入5μl的pi混匀，室温避光孵育15min，上机检测。
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1.5 western blotting检测蛋白表达收集生长状态良好的u87mg细胞，接种于6孔板，每孔接种1.0
×
106个，置于5％co2、37℃的恒温箱中孵育24小时。依次加入浓度为0μm、50μm、100μm、150μm、200μm的穗花杉双黄酮施行干预24h。然后每孔加入细胞裂解液500μl，冰浴裂解15min，14000rpm、4℃离心15min，取上清液。按蛋白测定试剂盒(bca法)说明书测定蛋白浓度，经sds-page电泳分离后电转移至pvdf膜，用封闭液温室封闭2h，常规一抗和二抗孵育后，dab显影检测蛋白表达。
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1.5统计学处理采用spss 19.0统计软件进行数据处理。数据以均数
±
标准差表示，采用方差分析比较组间的差异，p＜0.05为差异有统计学意义。
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2结果
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2.1穗花杉双黄酮抑制gbm细胞增殖
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为研究穗花杉双黄酮能否有效抑制胶质母细胞瘤增殖，课题组用不同浓度的穗花杉双黄酮干预24、48、72h后用cck-8法检测了u87mg的细胞活性。结果显示(图1)，100μm穗花杉双黄酮干预24h后，u87mg的细胞活性显著下降(p＜0.05)，其后随着穗花杉双黄酮浓度增大、干预时间延长而出现更显著的抑制(p＜0.01)。由此表明，穗花杉双黄酮能够显著抑制
gbm细胞增殖，且呈现出明显的浓度和时间依赖性。
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2.2穗花杉双黄酮促进gbm细胞凋亡
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为研究穗花杉双黄酮能否促进胶质母细胞瘤凋亡，课题组用不同浓度的穗花杉双黄酮干预24h后用annexin v/pi双染法检测了u87mg的细胞凋亡率。结果显示(图2)，50μm穗花杉双黄酮干预24h后，u87mg的细胞凋亡率显著增加(p＜0.05)，其后随着穗花杉双黄酮浓度增大出现更为显著的增加(p＜0.01)。由此表明，穗花杉双黄酮能够显著促进gbm细胞凋亡，且呈现出明显的浓度依赖性。
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2.3穗花杉双黄酮抑制gbm细胞jak2-stat3通路活化调控
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为研究穗花杉双黄酮对胶质母细胞瘤jak2-stat3通路的影响，课题组用不同浓度的穗花杉双黄酮干预24h后用western blotting检测了u87mg细胞中jak2、stat3、其磷酸化活化蛋白(p-jak2、p-stat3)，以及受其调控的下游凋亡相关蛋白bcl-2的表达水平。结果显示(图3)，不同浓度穗花杉双黄酮干预后，u87mg细胞中jak2、stat3蛋白的表达水平并无明显变化，而50μm穗花杉双黄酮干预24h后即出现u87mg细胞中p-jak2、p-stat3及bcl-2蛋白表达明显受到抑制，其后随着穗花杉双黄酮浓度增大更为显著。由此表明，穗花杉双黄酮能够抑制jak2-stat3通路的激活，下调其下游bcl-2蛋白的表达。
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穗花杉双黄酮(af)是从卷柏科植物中提纯出来的一类天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化等多种药理活性。新近研究发现af能够抑制多种肿瘤增殖并诱导其凋亡，但具体机制仍有待进一步阐明。jak2-stat3通路是肿瘤发病中发挥关键调控作用的一条重要细胞因子信号转导通路。在胶质瘤细胞组织中，通过jak2磷酸化活化，募集并激活stat3，使其形成二聚体并转位到核内，结合到基因启动子区域的特异dna反应元件上，启动下游b淋巴细胞瘤-2(b cell lymphoma-2，bcl-2)等目的基因转录，从而抑制肿瘤细胞凋亡、促进增殖，导致胶质瘤细胞发生发展。
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本研究表明，穗花杉双黄酮能够有效抑制胶质母细胞瘤的增殖。深究其机制，穗花杉双黄酮可显著抑制胶质瘤细胞jak2-stat3信号通路的活化应是重要的原因之一。而jak2-stat3通路受阻，可使其下游bcl-2表达显著下调，从而明显增加肿瘤细胞凋亡。因此，应用穗花杉双黄酮阻断jak2-stat3信号通路，促进肿瘤细胞凋亡、抑制其增殖，有望成为胶质母细胞瘤治疗或辅助治疗的新方法。
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以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到技术方案的简单变化或等效替换均属于本发明的保护范围内。