乳双歧杆菌BL-99提升肠道细菌感染抗性和肠道免疫力的应用的制作方法

本发明涉及微生物
技术领域：
，尤其是涉及一种乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)bl-99(保藏编号cgmccno.15650)在提升肠道细菌感染抗性和肠道免疫能力的新应用。
背景技术：
：肠道上皮细胞是机体抵抗病原菌的第一道屏障。病原菌在上皮细胞上的黏附或侵入，将会刺激肠道上皮细胞产生炎症因子或趋化因子。一些可溶性的介质可以调节肠道免疫系统或者诱发细胞的先天免疫反应。适当的免疫反应及良好的上皮细胞屏障功能将有助于保护宿主免受病原菌的感染。益生菌是指在摄入足量的数量时，可以对人体健康产生益处的一类活的微生物。益生菌作为肠道微生物组重要的组成成分，对人体健康发挥着不可忽视的重要作用，如营养供给，合成维生素，有助于消化、促进血管新生和肠神经功能。技术实现要素：本发明的一个目的在于提供一种乳双歧杆菌bl-99的新用途。本发明提供了一种乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)，本发明中命名为bl-99。该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心cgmcc(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)；保藏编号为cgmccno.15650。本发明提供的乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)，其具有耐胃酸和耐肠液性能，在ph2.5的胃酸液中处理30min时活菌存活率62％以上，处理2小时活菌存活率61％以上；在ph6.8的小肠液中处理2小时活菌存活率70％以上。在本发明中，以肠毒性大肠杆菌(enterotoxigenicescherichiacoli)etech10407和致肠病性大肠杆菌(enteropathogenicescherichiacoli)epeco119作为诱发体外肠道感染的病原菌菌株进行了乳双歧杆菌bl-99提升肠道免疫力的功能研究。两种类型的e.coli都是常见的致病菌，包含婴儿腹泻、旅行者腹泻、以及在发展中国家或者卫生较差的地区。etech10407是较为成熟、实验常用的模式菌株，也经常用于评价益生菌对于致病菌的黏附能力和炎症信号通路。本发明的研究发现，乳双歧杆菌bl-99(即保藏编号为cgmccno.15650的乳双歧杆菌)菌株具有抑制肠道病原菌的黏附的作用，能够显著etech1407和epeco119对caco-2细胞的黏附作用，提高肠道屏障完整性，并且具有抑制肠道炎症因子产生的作用，能够缓解由于etech10407引起的炎症反应。从而，本发明提供了乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)在制备用于提升肠道免疫力的组合物中的应用，所述乳双歧杆菌的保藏编号为cgmccno.15650。根据本发明的具体实施方案，本发明的应用中，所述乳双歧杆菌以活菌和/或死菌的固态或液态菌制剂的形式用于制备所述组合物。根据本发明的具体实施方案，本发明的应用中，所述提升肠道免疫力包括：提升肠道细菌感染抗性，在肠道系统中抵御致病菌侵入，维持肠道屏蔽功能，和/或预防致病菌引起的腹泻。根据本发明的具体实施方案，本发明的应用中，所述提升肠道免疫力包括：降低致病菌对肠道上皮细胞的黏附能力，和/或降低致病菌引起的肠道细胞释放炎症因子ip-10。根据本发明的具体实施方案，本发明的应用中，所述乳双歧杆菌的应用量为1.0×103cfu～1.0×1012cfu/天，或者以菌体的重量计为0.001μg～1000mg/天。优选地，所述乳双歧杆菌的应用量为107cfu～1011cfu/天，或者以菌体的重量计为10μg～100mg/天。所述乳双歧杆菌的应用量为1.0×103cfu～1.0×1012cfu/天，或者以菌体的重量计为0.001μg～1000mg/天。根据本发明的具体实施方案，所述组合物可以包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。根据本发明的具体实施方案，所述组合物可使用于动物或是人类。所述组合物还可包括所属领域中的常规用料组分。例如，对于药物组合物，可包括适量的辅料，所述辅料可以为赋型剂、稀释剂、填充剂、吸收促进剂等。对于食品组合物，本发明的乳双歧杆菌可以按照现有技术中含乳双歧杆菌的食品进行生产，所述组合物可根据受施予者的需要，而采用不同形态。例如粉剂、锭剂、造粒、微胶囊、液体制剂等。在本发明的一具体实施方案中，所述组合物为食品组合物，所述食品可以为液体饮料、固体饮料、口服液、奶制品、片剂或胶囊，例如可以为发酵乳制品(例如发酵乳、风味发酵乳、发酵乳饮料等)、乳酪、含乳饮料、益生菌固体饮料或乳粉等。在本发明的另一具体实施方案中，所述组合物为饲料组合物。所述饲料组合物中的其他组分可以参照益生菌饲料领域的常规技术进行选择。在本发明的另一具体实施方案中，所述组合物为药物组合物。所述药物组合物中的其他组分可以参照益生菌药物领域的常规技术进行选择。综上所述，本发明提供了乳双歧杆菌bl-99的新用途，该菌具有显著降低致病菌对肠道上皮细胞的黏附能力、提高肠道屏障功能、激活肠道免疫能力的作用，可以用于制备具有抗感染、调节肠道健康和免疫能力的食品、药物及饲料等，具有广泛的应用前景。附图说明图1显示了乳双歧杆菌bl-99活菌数测定结果。图2显示了乳双歧杆菌bl-99抑制肠毒性大肠杆菌etech10407对caco-2的黏附效果(p<0.05)。图3显示了乳双歧杆菌bl-99抑制致病性大肠杆菌epeco119对caco-2的黏附效果(p<0.001)。图4显示了乳双歧杆菌bl-99降低肠毒性大肠杆菌etech10407诱发ip10产生的效果(p<0.001)。专利程序的微生物保存：本发明的乳双歧杆菌bl-99：保藏日期：2018年04月26日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所保藏编号：cgmccno.15650；分类命名：乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)。具体实施方式为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。乳双歧杆菌bl-99本发明的乳双歧杆菌bl-99是自婴儿肠道中分离得到的。该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心cgmcc(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)；保藏编号为cgmccno.15650。1.乳双歧杆菌bl-99的分类学特征理化实验结果见表1。表1实验项目结果实验项目结果革兰氏染色阳性碳水化合物产酸(续)细胞形状杆状，多形态核糖+形成芽孢-海藻糖-接触酶-木糖+氧化酶-麦芽糖+空气中生长-乳糖+厌氧生长+棉子糖+碳水化合物产酸山梨醇-甘露糖-蜜二糖+松三糖-半乳糖+果糖-甘露醇-水杨苷+l-阿拉伯糖-菊糖-葡萄糖酸钠-纤维二糖-蔗糖+淀粉+2.乳双歧杆菌bl-99的人工胃液、肠液耐受性双歧杆菌为通常不抗酸的菌属。本实施例中，测试了本发明的乳双歧杆菌bl-99的人工胃液、肠液耐受性，同时以目前领域中公认耐酸性能极好、可以通过胃肠道存活的乳双歧杆菌作为对比。测试方法：将乳双歧杆菌bl-99菌株于mrs液体培养基中37℃培养16小时后，于4℃、2500rpm下离心10min，收集菌体。将待测菌株分别在人工胃液、人工小肠液中培养，37℃处理0、30min、2h后进行活菌计数分析，以存活率评价菌株的耐酸及耐肠液性能。存活率＝(处理后的活菌数/0时刻活菌数)×100％。菌株在人工胃酸(ph2.5)中的存活率检测结果如表2所示，bb-12在人工胃酸(ph2.5)中处理30min时活菌存活率7.04％，处理2小时活菌存活率仅1.64％；而本发明的乳双歧杆菌bl-99在人工胃酸(ph2.5)中处理30min时活菌存活率62.60％，处理2小时活菌存活率61.83％。表明本发明的乳双歧杆菌bl-99具有优异的耐胃酸能力，能较为顺利地通过胃到达肠道发挥益生作用。表2菌株在人工胃酸(ph2.5)中的存活率菌株在人工小肠液(ph6.8)中的存活率检测结果参见表3。数据显示，bb-12在人工小肠液(ph6.8)中处理2小时活菌存活率仅28.95％；而本发明的乳双歧杆菌bl-99在人工胃酸(ph2.5)中处理2小时活菌存活率70.23％。表明本发明的乳双歧杆菌bl-99具有优异的耐肠液能力，可以在肠道内存活并定殖。表3菌株在人工小肠液(ph6.8)中的存活率3.乳双歧杆菌bl-99的的毒力实验及安全性检测将本发明的乳双歧杆菌bl-99接种于bbl液体培养基中，36±1℃厌氧培养48±2小时，计数培养液中乳双歧杆菌bl-99活菌数为3.7×108cfu/ml，将培养物的原液和5倍浓缩液，经口以20.0ml/kgbw给受试小鼠连续灌胃3天，观察7天。实验设培养基原液和5倍浓缩液对照组。实验结果表明：乳双歧杆菌bl-99的bbl培养物原液和5倍浓缩液组与各自对照组相比，对小鼠体重增长的影响无统计学意义(p＞0.05)，同时未观察到受试小鼠有毒性反应或死亡。采用sn/t1944-2007《动物及其制品中细菌耐药性的测定》方法，评估乳双歧杆菌bl-99的抗生素敏感性能。评价结果显示，乳双歧杆菌bl-99对氨苄西林ampicillin、青霉素gpenicilling、红霉素erythromycin、氯霉素chloramphenicol、克林霉素clindamycin、万古霉素vancomycin和四环素tetracycline等敏感。符合欧洲食品安全委员会(europeanfoodsafetyauthority)对食用细菌耐药性评价规范中的要求。乳双歧杆菌bl-99不含外源抗生素耐药基因，食用安全。4.实施例中所用乳双歧杆菌bl-99的活菌数测定乳双歧杆菌bl-99(保藏编号：cgmccno.15650)，平板涂布法挑出单菌落，16s鉴定后于甘油管-80℃冷冻保藏。实验前菌株于mrs培养基，37℃培养。生长至对数期离心培养基富集菌体。使用荧光细胞分选法(flourescenceactivatedcellsorting，facs)测定活菌数和菌活性，测定结果见图1。本发明各实施例用菌株活菌数分为1×108cfu/ml和1×106cfu/ml。5.实施例中数据分析实验中的所有数据至少重复3次，实验结果表示为平均值±标准差；采用spss17.0软件进行数据分析(spss，chicago，il，usa)，显著性分析采用lsd的方法进行单因素方差分析，p-value<0.05被认为有统计学上的显著差异，显著性差异按照：*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001区分。图的绘制采用graphpadprism5.0。实施例1.抗黏附能力测定采用共培养的方法探究双歧杆菌bl-99对etech10407、epeco119是否具有caco-2黏附抗性。caco-2细胞接种于24孔板中培养。caco-2细胞使用pbs缓冲液清洗，菌株和caco-2细胞共同培养1h。etech10407和epeco119以感染复数(multiplicityofinfection,moi)50：1添加至caco-2细胞中共同培养1h(37℃)，最终活菌数为1×107cfu/ml。以无双歧杆菌bl-99添加的caco-2组作为阴性对照。使用1mm氧化锌(zincoxide，zno)替代双歧杆菌bl-99作为阳性对照组。孵育后，清洗并裂解caco-2细胞，然后致病菌被接种在琼脂上。在37℃琼脂平板上培养过夜后，数细菌的cfu菌落数以衡量致病菌吸附。数生长中的大肠杆菌菌落数并记录为cfu/ml。与抗粘附测试平行的，将大肠杆菌(终浓度为)107cfu/ml添加到1ml受试物(bl-99菌液)中，并在37℃共培养1小时以测量活性。培养后，从每个样品离心收集大肠杆菌，再悬浮于pbs中，并在琼脂平板上接种。在37℃琼脂平板上培养过夜后，数细菌的cfu菌落数以衡量致病菌吸附。数生长中的大肠杆菌菌落数并记录为cfu/ml。实验通过上述以人体肠道细胞caco-2为模型，本发明证实了双歧杆菌bl-99对肠毒性大肠杆菌etech10407和肠致病性大肠杆菌epeco119具有抑制作用。在本发明的一些批次的实验中，108cfu/ml浓度的双歧杆菌bl-99对etech10407抑制能力的实验结果如图2所示。在没有双歧杆菌bl-99的干预条件下，肠毒性大肠杆菌etech10407对caco-2细胞的黏附数高达3.75×106cfu/ml(6.57logcfu/ml)。而当大肠杆菌etech10407和双歧杆菌bl-99共同作用时，黏附的etech10407数目为7.67×105cfu/ml(5.88logcfu/ml)，抑制率为10.8％。在本发明的一些批次的实验中，108cfu/ml浓度的双歧杆菌bl-99对epeco119抑制能力的实验结果如图3.所示。在没有双歧杆菌bl-99的干预条件下，肠毒性大肠杆菌etech10407对caco-2细胞的黏附数高达2.34×106cfu/ml(6.37logcfu/ml)。而当大肠杆菌etech10407和双歧杆菌bl-99共同作用时，黏附的etech10407数目为4.5×105cfu/ml(5.65logcfu/ml)，抑制率为11.29％。在本发明的另一些批次的实验中，进行了106cfu/ml和108cfu/ml两种不同浓度的双歧杆菌bl-99对于抑制大肠杆菌epeco119粘附到caco-2细胞的实验。其中，108cfu/ml浓度进行了两组别的实验测定。实验结果数据(均值±标准误差，重复三次测量)如表4所示。用dunnett’sposthoc测试对阴性对照与受试组进行比较后，发现在实验组1中，106浓度下的bl-99比阴性对照显著更低(p<0.05)；108浓度下的益生菌bl-99有降低epec粘附的趋势。在实验组2中，108浓度下的bl-99显著降低了致病菌粘附(p<0.01)。表4上述实验结果表明，乳双歧杆菌bl-99对肠毒性大肠杆菌etech10407和肠致病性大肠杆菌epeco119均具有抑制作用。实施例2.肠道屏障完整性测试理想的小肠上皮屏障功能是保护宿主免受致病菌侵入和/或致病菌来源毒素的先决条件。在此研究中，体外的屏障完整性通过测定肠道细胞层的跨表皮的电阻(teer)体现。为了研究益生菌对于感染的作用，测定了teer在大肠杆菌感染前和感染后随时间变化的情况。caco-2细胞被接种到transwell聚碳酸酯细胞培养插入物中，平均孔径为0.4um，面积为0.33cm2直至完全分化(±1000ω)。用世界精准仪器购入的evom2表皮伏特测量器测量跨上皮细胞电阻(teer)以衡量屏障完整性。在测试当天，细胞被冲洗，并在37℃下用不含抗生素和血清、但含有受试物质的培养基中培养1小时。紧接着加入大肠杆菌到受试物质之上(感染倍数moi为200:1)，并培养6小时。在实验开始前(t＝-1)，受试物质暴露1小时后及添加致病菌前(t＝0)，并在致病菌接触后1小时、2小时、3小时、4小时和6小时分别测定teer。在与致病菌接触后单独条件下的teer值与其各自在t＝0时的teer值相关，且被表述成δteer(ω.cm2)。阴性对照(只加入大肠杆菌)与未接触致病菌或受试物质的阳性对照也在实验组别中。所有条件重复测定三次，一些对照组被重复测定6次。表5记录了106cfu/ml浓度的益生菌bl-99在暴露于大肠杆菌etech10407的情况下，对于跨膜电阻teer的影响。表6记录了108cfu/ml浓度的益生菌bl-99在暴露于大肠杆菌etech10407的情况下，对于跨膜电阻teer的影响。实验数据重复三次测量。表5表6106cfu/ml浓度的双歧杆菌bl-99，相较于阴性对照，在t＝1、t＝2的时间点，有提升teer值的趋势。108cfu/ml浓度的双歧杆菌bl-99，相较于阴性对照，在多个时间点均有提升teer值的趋势。实施例3.免疫调节能力测定乳双歧杆菌bl-99的免疫调节能力是基于是否能降低etcth10407caco-2细胞诱发的ip-10(10kdainterferon-gamma-inducedprotein,ip10)的产生。将caco-2细胞在96孔板养到适合的丰度。在实验最初，用不含抗生素的培养基冲洗细胞一次。将单层细胞与受试物质在37℃下用不含抗生素的培养基中共培养1小时，重复三次。加入大肠杆菌刺激细胞(moi200:1)。在1小时培养后，单层细胞与致病菌共培养，并用含有受试物质和50μg/ml庆大霉素的培养液冲洗和培养过夜。作为空白对照(blank)，只用了培养液而没用大肠杆菌刺激。用大肠杆菌刺激但没用受试物质的培养液被用作大肠杆菌应答的对照。此外，作为caco-2细胞应答的对照，用含有rectnfα(10ng/ml)以及recifnγ(5ng/ml)(均从英国阿宾顿的r&dsystems购入)的混合物培养液刺激细胞。刺激24小时候收集上清液并储存于-20℃。按照生产商的使用指导，用bio-plex试剂盒(美国加州biorad公司)测试ip-10。实验结果表示为平均值±标准差；采用spss17.0软件进行数据分析(spss，chicago，il，usa)，显著性分析采用lsd的方法进行单因素方差分析，p-value<0.05被认为有统计学上的显著差异，显著性差异按照：*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001区分。文章中的图的绘制采用graphpadprism5.0。108cfu/ml浓度的乳双歧杆菌bl-99降低ip10产生的结果如图4.所示。caco-2细胞模型中加入etech10407引起了ip10显著上调，细胞培养液中的ip10含量达到656.52±57.11pg/ml,空白组caco-2细胞未经任何处理，细胞培养上清液中ip10含量为162.29±21.28pg/ml。加入双歧杆菌bl-99作用1h后，细胞培养液上清液中的ip10含量较低，为146±7.74pg/ml。表明双歧杆菌bl-99具有抑制炎症因子ip10产生，并且显著抑制etech10407引起的炎症反应(p<0.001),进一步说明bl-99具有一定程度降低etec10407引起炎症反应的潜力。干扰素γ诱导蛋白10(ip10)在uc的发生发展过程中发挥着重要作用。ip10属于elr阴性的cxc亚家族的内生趋化因子，在ifn-γ诱导下由多种细胞如成纤维细胞、内皮细胞、单核细胞、t淋巴细胞等分泌，也可以在脂多糖、前炎症因子如ifn-α/β及tnf-α等刺激下分泌。cxcr3是ip10唯一的受体，ip10与cxcr3特异性结合后，能够促进cxcr3+细胞的趋化活性，从而触发多步骤的信号转导通路，使cxcr3阳性靶细胞t细胞、b细胞、单核/巨噬细胞、树突细胞、nk细胞等向局部炎症病灶趋化。其中，被募集的t细胞在活化后主要分泌il-2、tnf-β、ifn-γ；巨噬细胞主要分泌tnf-α、il-1β、il-6、il-18、il-12、il-23、ifn-γ等炎性因子；而局部分泌增加的tnf-α、ifn-γ等炎症因子一方面刺激产生更多ip10，进一步募集更多的免疫细胞，形成恶性循环；另一方面可直接或间接损伤肠黏膜屏障，从而损伤肠黏膜，促进溃疡性结肠炎的发生发展。以上研究结果证实：乳双歧杆菌bl-99能够显著etech1407和epeco119对caco-2细胞的黏附作用，缓解由于etech10407引起的炎症反应。表明乳双歧杆菌bl-99对于预防婴儿腹泻、旅行者腹泻、肠道炎症等具有良好的潜力。当前第1页12