一种银花青蒿栀子方灌肠剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种银花青蒿栀子方灌肠剂(yqze)及其制备方法和应用。

背景技术：

手足口病(hand,footandmouthdisease,hfmd)又名发疹性水疱口腔炎，是以发热和手、足、口腔和臀部等部位出现疱疹为主要临床特征的一种急性传染病。引起hfmd的肠道病毒(enterovirus，ev)主要为柯萨奇病毒(coxsackievirus,cv)a组的2、4、5、6、7、9、10、16型和b组的1、2、3、4、5型；部分埃可病毒和ev-71。其中，ev71和cv-a16是主要病原体，国内外围绕这两种病毒进行了大量研究，2015年ev71疫苗通过国家食品药品监督管理总局生产注册审批。

2008年以来，cv-a6(柯萨奇病毒a组6型)开始在全世界范围内流行，从欧洲逐渐传播到了亚洲。国内cv-a6感染致hfmd发病率呈上升趋势，2013—2017年我国大陆地区hfmd疫情的监测数据表明，cv-a6已成为大部分地区的主要流行株，部分地区超越了ev71和cv-a16，成为引起hfmd的首位病原体，如2013年浙江省检测样本中cv-a6阳性率为51.3％。但是，cv-a6的相关研究目前较少，亟需抗cv-a6药物的研究。核苷类抗病毒药物的抗病毒谱广，但作用机制单一，长期大量使用易于产生耐药性，副作用大。清热解毒类中药制剂在治疗病毒性感染疾病的治疗上具有多靶点治疗、整体调节的特点，不仅能抗病毒、消炎、退热，还能提高人体免疫力，比单一抗病毒药物更具优势。

银花青蒿栀子方(yqz)源于名老中医经验方，组方为金银花、青蒿和栀子，具有清热解毒、疏风解表之功效。该方成功的开发成热毒宁注射液(rdn)等中药制剂，广泛应用于上呼吸道感染(外感风热证)的治疗，取得了良好的社会和经济效益。

专利cn101721515a公开了一种由青蒿、栀子、金银花组成的中药组合物在制备治疗hfmd药物中的应用。该专利中提及热毒宁注射液(其配比为青蒿6～25重量份、金银花3～15重量份、栀子3～12重量份)可抗ev71病毒，治疗ev71病毒感染引起的hfmd。但是，目前尚未有关于yqz抗cv-a6的研究报道。

cv-a6属于小核糖核酸病毒科的肠道病毒a组，2013年以来，cv-a6逐渐成为hfmd暴发流行的主要病原体之一。在引起hfmd的病毒中，cv-a16和ev71的p1区序列相似度极高，其靶受体、致病机制和抗病毒药物等某些方面存在相同或相似之处，但是，cv-a6靶点与cv-a16和ev71不同，因此，抗cv-a16和ev71病毒的药物无法用于cv-a6感染型hfmd的治疗。随着cv-a6感染引起的hfmd越来越多，寻找有效的抗cv-a6药物成为亟待解决的问题之一。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为此，本发明的一个目的在于提供一种银花青蒿栀子方灌肠剂。

本发明的一个另一目的在于提供银花青蒿栀子方灌肠剂的制备方法。

本发明的一个又一目的在于提供银花青蒿栀子方灌肠剂在制备治疗cv-a6引起的手足口病药物中的应用。

本发明的一个又一目的在于提供银花青蒿栀子方灌肠剂在制备抗cv-a6药物中的应用。

本发明是通过下述的技术方案来解决以上的技术问题的：

一种银花青蒿栀子方灌肠剂，由如下重量份的药物原料药制成：

金银花3-15份，青蒿6-25份，栀子1-2.99份。

优选的，上述的银花青蒿栀子方灌肠剂，由如下重量份的药物原料药制成：

金银花3份，青蒿15份，栀子2份。

或者，优选的，上述的银花青蒿栀子方灌肠剂，由如下重量份的药物原料药制成：

金银花2.77份，青蒿14.76份，栀子1.72份。

上述的银花青蒿栀子方灌肠剂的制备方法，包括如下步骤：

取金银花120g、青蒿600g和栀子80g，加入8倍量55％乙醇浸泡2h，28khz超声提取30min，提取2次；抽滤，合并滤液，40℃减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10；加入的吐温-80超声分散均匀，加入水溶性氮酮和山梨酸钾，加氢氧化钠溶液调节ph值为6.8，加纯化水至1000ml，即得。

所述吐温-80的用量为3％，所述3％为质量体积比浓度，即吐温80与灌肠液的量体积比浓度为3g/100ml。

所述水溶性氮酮的用量为3％，所述3％为质量体积比浓度，即水溶性氮酮与灌肠液的量体积比浓度为3g/100ml。

所述山梨酸钾的用量为0.2％，所述0.2％为质量体积比浓度，即山梨酸钾与灌肠液的质量体积比浓度为0.2g/100ml。

上述的银花青蒿栀子方灌肠剂在制备治疗cv-a6感染引起的手足口病药物中的应用。

上述的银花青蒿栀子方灌肠剂在制备抗cv-a6药物中的应用。

上述的银花青蒿栀子方灌肠剂在制备治疗cv-a6感染引起的骨骼肌细胞凋亡药物中的应用。

上述的银花青蒿栀子方灌肠剂在制备治疗cv-a6感染引起的骨骼肌纤维损伤及细胞凋亡药物中的应用。

上述的银花青蒿栀子方灌肠剂在制备治疗cv-a6感染引起的脊髓前角和延髓中的神经元变性和坏死及其导致的急性弛缓性麻痹药物中的应用。

上述的银花青蒿栀子方灌肠剂在制备治疗cv-a6感染引起的脊髓前角神经元细胞线粒体损伤药物中的应用。

上述的银花青蒿栀子方灌肠剂在制备治疗cv-a6感染引起的心肌细胞损伤药物中的应用。

上述的银花青蒿栀子方灌肠剂在制备治疗cv-a6感染引起的肺纤维化药物中的应用。

本发明中，银花青蒿栀子方简称yqz；银花青蒿栀子方灌肠剂简称yqze。

本发明的有益效果：

(1)本发明考察了现有技术中记载银花青蒿栀子方(金银花3-15g、青蒿6-25g和栀子3-12g)是否具有抗cv-a6的作用并且进行了处方量的筛选。结果表明，金银花、青蒿和栀子不同比例配伍制备得到的醇提物抗cv-a6的活性差异较大。当组方配伍为：金银花3g、青蒿15g、栀子2g时，其醇提物对cv-a6的抑制率达到90.96％，显著高于对照利巴韦林(p<0.01)。

(2)本发明对银花青蒿栀子方灌肠剂的制备方法进行了筛选试验，确定了银花青蒿栀子方灌肠剂的制备方法。yqz超声法提取工艺优化的条件为：溶剂为55％乙醇、料液比1:8、超声时间30min、超声频率28khz。3％吐温-80为增溶剂时，木犀草苷和青蒿酸溶解度分别为112.38μg/ml和659.25μg/ml。以绿原酸和栀子苷、木犀草苷、青蒿酸的生物利用度为指标，促吸收剂的效果为：氮酮>泊洛沙姆>1,2-丙二醇。以3％吐温-80为增溶剂、3％氮酮为促吸收剂、0.2％山梨酸钾为防腐剂，制得浓度为0.80g(生药)/ml的yqze。

(3)体外抗病毒作用试验结果显示：与模型组相比，先加药后接毒、药物病毒混合后加入和先接毒后加药3种处理方式下，yqze均可显著降低细胞上清中的病毒载量(p<0.01)。其中，药物和病毒混合后加入的方式下yqze的抗病毒活性最好，表明其主要是通过抑制cv-a6对rd细胞的吸附/穿入过程发挥作用。与模型组比，yqze组的细胞凋亡率显著降低(p<0.01)。

(4)体内抗病毒作用试验结果显示：cv-a6感染icr乳鼠模型组和yqze组在14dpi的生存率分别为10％和70％。与模型组比，yqze组乳鼠急性弛缓性麻痹等症状减轻，运动能力趋于正常，临床评分低。he染色切片显示，yqze组乳鼠骨骼肌纤维和心肌纤维基本整齐，肺脏纤维化程度轻微，延髓和脊髓前角少量运动神经元变性坏死，病理组织损伤较模型组减轻。ihc染色切片显示，模型组乳鼠骨骼肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织中均有病毒抗原分布，yqze组乳鼠上述组织病毒抗原分布均减少。与模型组相比，yqze组乳鼠的骨骼肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织病毒载量显著降低(p<0.05或p<0.01)。模型组乳鼠脊髓组织的超微结构发生改变，如前角运动神经元细胞线粒体发生肿胀变形、形成空泡等，yqze组乳鼠的神经元细胞结构基本正常。与模型组相比，yqze组乳鼠的骨骼肌细胞凋亡减少，血清中il-5、il-6、il-12p70、tnf-α、ifn-γ和tgf-β水平显著降低(p<0.01)。

附图说明

图1rd细胞的形态(×200)；

图2优化配伍样品的病毒抑制率和病毒载量.n＝3,(注：与利巴韦林对照组比，**p<0.01)；

图3不同促吸收剂对青蒿酸、绿原酸和栀子苷吸收的影响.n＝6；

图4不同处理方式下的病毒抑制率(a)和病毒载量(b).n＝3,(注：与病毒对照组比，**p<0.01)；

图5对cv-a6致rd细胞凋亡的影响；

图6对cv-a6致rd细胞凋亡率的影响.n＝3,**p<0.01，***p<0.001；

图7对cv-a6感染icr乳鼠临床评分的影响；

图8对cv-a6感染icr乳鼠生存率的影响；

图9后肢骨骼肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织he染色切片(×200)；

图10各组乳鼠脊髓组织的超微结构(×10000)；

图11各组织脏器的ihc染色切片(×200)；

图12各组织脏器中的病毒载量.n＝4,

图13药物对cv-a6感染icr乳鼠骨骼肌细胞凋亡的影响(×200)；

图14对cv-a6感染icr乳鼠血清细胞因子水平的影响.n＝4,(a-il-5；b-il-6；c-il-12p70；d-tnf-α；e-ifn-γ；f-tgf-β注：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。

实施例1

一种银花青蒿栀子方灌肠剂，由如下重量份的药物原料药制成：

金银花3-15份，青蒿6-25份，栀子1-2.99份。

实施例2

一种银花青蒿栀子方灌肠剂，由如下重量份的药物原料药制成：

金银花3份，青蒿15份，栀子2份。

实施例3

一种银花青蒿栀子方灌肠剂，由如下重量份的药物原料药制成：

金银花2.77份，青蒿14.76份，栀子1.72份。

实施例4银花青蒿栀子方灌肠剂的制备方法，

取金银花110.8g、青蒿590.4g和栀子68.8g，加入8倍量55％乙醇浸泡2h，28khz超声提取30min，提取2次；抽滤，合并滤液，40℃减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10；加入的3％吐温-80超声分散均匀，加入3％水溶性氮酮和0.2％山梨酸钾，加氢氧化钠溶液调节ph值为6.8，加纯化水至1000ml，即得。

实施例5银花青蒿栀子方灌肠剂的制备方法，

取金银花120g、青蒿600g和栀子80g，加入8倍量55％乙醇浸泡2h，28khz超声提取30min，提取2次；抽滤，合并滤液，40℃减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10；加入的30g吐温-80超声分散均匀，加入30g水溶性氮酮和2g山梨酸钾，加氢氧化钠溶液调节ph值为6.8，加纯化水至1000ml，即得。

通过实验例进行了本发明银花青蒿栀子方药材配比的筛选试验、银花青蒿栀子灌肠剂制备方法的筛选和银花青蒿栀子灌肠剂药理学试验，详情如下：

试验例1本发明银花青蒿栀子方药材配比筛选试验

1材料

1.1药材

金银花药材为忍冬科忍冬属植物忍冬lonicerajaponicathunb.的干燥花蕾；青蒿药材为菊科蒿属植物黄花蒿artemisiaannual.的干燥地上部分；栀子药材为茜草科栀子属植物栀子gardeniajasminoideselis的干燥果实。以上药材购自泰安市金泰联药店。

1.2病毒、细胞和动物

cv-a6引自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所毒种室；人横纹肌瘤(rhabdomyoma，rd)细胞，引自中国预防医学研究所病毒研究室；icr孕鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证号：scxk(京)2012-0001)。

1.3溶液的配制

细胞培养液：mem培养基:胎牛血清:双抗＝89:10:1。

细胞维持液：mem培养基:胎牛血清:双抗＝97:2:1。

细胞实验中yqz溶液：精密称取醇提物粉末适量，加二甲亚砜1ml使溶解，得到浓度为20mg/ml储备液。取储备液适量，用维持液进行2倍倍比稀释，得到6.25-100μg/ml系列浓度溶液。

动物实验中yqz溶液：精密称取醇提物粉末适量，加入适量吐温-80，制成提取物浓度为50.0mg/ml(相当于生药0.256g/ml)的样品溶液。

无核糖核酸酶(ribonucleasefree，rnase-free)水：取200μldepc，加入199.8ml去离子水中，避光剧烈震荡过夜，121℃高压灭菌后冷却至常温，无菌分装于rnase-free离心管中，4℃保存备用。

75％depc乙醇：向经0.1％depc水浸泡并灭菌的玻璃瓶中加入75ml无水乙醇及25mlrnase-free水，常温保存备用。

2实验方法和结果

2.1细胞的复苏和培养

将rd细胞冻存管从液氮中取出，立即置于37℃水浴中快速振摇至完全解冻，室温1000r/min离心5min。弃上清，加入细胞培养液，缓慢吹打重悬，置于37℃、5％二氧化碳的细胞培养箱中，12h后更换新的培养液。

细胞生长至细胞瓶底面积的90％以上时弃培养液，加0.01mpbs洗2次，加入1ml0.25％胰蛋白酶，置于37℃、5％二氧化碳的细胞培养箱中1min。弃胰蛋白酶，置于37℃、5％二氧化碳的细胞培养箱中，倒置显微镜下观察至细胞间隙明显加入培养液，吹打细胞至均匀分散，调整细胞密度至2×10⁴/ml，置于37℃、5％二氧化碳的细胞培养箱。

2.2病毒毒力测定

将cv-a6病毒液用维持液进行10倍比稀释，每个稀释度8个复孔，每孔100μl接种于单层rd细胞中，同时设正常细胞对照。置于37℃、5﹪co2的细胞培养箱孵育2h，弃液，加维持液继续培养，每隔24h换液一次。于72hpi观察细胞形态变化，记录特征性细胞病变(cpe)的孔数，按reed-muench法计算组织细胞半数感染量(tcid50)为10^-8.41/0.1ml。

2.3病毒载量测定

采用trizol法提取病毒rna，通过一步法荧光定量pcr进行定量。荧光定量pcr反应体系总体积为25μl，其中：2×mix12.5μl；polymerase1μl；rtase0.35μl；上游引物0.5μl；下游引物0.5μl；taqman探针0.5μl；dh2o2.65μl；待测rna模板7μl。引物和探针序列见表1。反应条件：50℃30min(×1)；92℃3min(×1)；92℃30s(×40)；55℃30s(×40)；68℃30s(×40)。

表1引物和探针序列

使用含有cv-a6vp1片段的质粒，按照试剂盒说明采用限制性内切酶使其线性化，然后进行体外转录。采用nanodrop2000c测定rna浓度，然后用rnase-free水稀释(稀释度10^-1～10^-7)，得到系列浓度的rna标准品溶液。取标准品溶液为模板，进行一步法荧光定量pcr测定ct值。将标准品的rna浓度转换为病毒拷贝数，将ct值和病毒拷贝数的对数进行回归，得到“ct值-病毒拷贝数”标准曲线方程为：ct＝-3.89lgc+54.08，r＝0.9991。

2.4体外抗病毒作用

以病毒抑制率(y1)和病毒载量(y2)为评价指标，采用bbd-rsm优化yqz体外抗cv-a6的组方配伍。基于yqz的组方范围，将金银花(x1)和栀子(x3)中间值均取6g，青蒿(x2)的中间值设置为12g，因素水平见表2，实验安排见表3。

2.4.1样品溶液的制备

按表2称取处方量药材粉末，加入8倍量75﹪乙醇，浸泡后室温超声20min，提取2次。过滤，合并滤液，减压浓缩得粗提液。将粗提液冷冻干燥，得17组yqz样品粉末。精密称取粉末适量，加二甲亚砜制备浓度为20mg·ml^-1储备液。取储备液适量，用维持液进行2倍比稀释，得6.25-100μg·ml^-1系列浓度溶液。

2.4.2细胞毒性测定

将17组样品溶液加到单层rd细胞中，每组4个复孔，每孔100μl，置于37℃含5﹪co2的细胞培养箱中培养48h，同时设置正常细胞对照组和利巴韦林对照组。采用cck8法测定波长450nm的od值，计算细胞存活率。17组样品浓度不高于25μg·ml^-1时，对细胞存活率均无影响，最大无毒浓度(tc0)确定为25μg·ml^-1，利巴韦林溶液tc0为100μg·ml^-1。

2.4.3抗病毒活性测定

将药液和病毒液1:1混合，加到单层rd细胞中，每孔100μl(moi＝1，药物浓度25μg·ml^-1)，同时设置正常细胞对照组、模型对照组和利巴韦林对照组。置于37℃含5﹪co2的细胞培养箱中培养1h。弃液，加维持液继续孵育至48hpi。显微镜下观察cpe，cck8法测定细胞存活率，计算病毒抑制率；收集细胞上清，按“2.3”项下方法测定病毒载量，结果见表3。

表2bbd试验设计因素水平表

表3bbd试验设计和结果

采用design-expert7.1软件对表2中的数据进行回归分析，得到各效应值对各因素的二次多元回归方程：y1＝181.75－21.12x1－0.039x2－19.24x3－0.38x1x2+0.63x1x3+0.15x2x3+1.77x1²－2.083×10^-4x2²+1.23x3²(1)；y2＝－0.22+1.71x1－0.079x2+1.52x3+0.026x1x2－0.089x1x3－0.01x2x3－0.12x1²+3.19×10^-3x2²－0.078x3²(2)。模型的方差分析结果见表4、5。

表4病毒抑制率(y1)二次回归模型的方差分析

表5病毒载量(y2)二次回归模型的方差分析

由表4、5的显著性检验分析可见，模型(1)和(2)均具有高度显著性(p<0.0001)，说明建立的模型有意义；模型的校正决定系数分别为0.9720和0.9868，失拟项不显著(p>0.05)，说明模型的拟合度均良好，可以用此模型对yqz体外抗cv-a6的组方配伍进行优化。模型系数显著性检验结果表明，x1和x3对y1、y2的影响极其显著，影响大小顺序均为x3>x1>x2，且x1和x2、x1和x3之间有相互影响。

应用design-expert7.1软件分析得到优化条件为：金银花2.77g，青蒿14.76g，栀子1.72g，此条件下制备的样品预测的病毒抑制率和病毒载量拷贝数的对数分别为91.93﹪和5.89。结合实际操作方便和方差分析结果，确定最佳组方配伍为：金银花3g，青蒿15g，栀子2g。

2.4.4验证试验

按照上述最佳组方配伍制备3批样品进行验证实验，48hpi的cpe结果如图1所示，yqz降低了cv-a6感染rd细胞导致的cpe。

病毒抑制率和病毒载量测定结果见图2，与预测值相比无显著性差异(p>0.05)，说明应用box-behnken试验设计优化得到的组方配伍有良好的准确度。yqz的病毒抑制率和病毒载量与对照利巴韦林之间均存在显著性差异(p<0.01)，具有良好的抗cv-a6作用。

试验例2本发明的银花青蒿栀子方灌肠剂的提取工艺的优化试验

1动物：健康wistar大鼠，雌雄各半，体重180～220g，由山东鲁抗医药有限公司提供，合格证号：scxk(鲁)20130001。

2方法和结果

2.1提取工艺的优化

2.1.1正交试验优化提取工艺

按照实验例1优化组方(金银花3g、青蒿15g和栀子2g)称取9份，加入乙醇浸泡2h，按照l9(34)正交试验设计进行试验，超声提取2次，将提取液合并。以提取液中青蒿酸提取量(w1)、青蒿素提取量(w2)、木犀草苷提取量(w3)、栀子苷提取量(w4)和绿原酸提取量(w5)为评价指标进行加权综合评价，考察乙醇体积分数(a)、溶剂用量(b)、提取时间(c)及超声频率(d)4个因素，每个因素3个水平进行试验设计，因素水平见表6，试验设计和结果见表7。综合评分＝0.2(w1/w1max+w2/w2max+w3/w3max+w4/w4max+w5/w5max)。

表6因素水平表

表7正交试验设计方案和结果

通过表7直观分析可知，青蒿酸、青蒿素、栀子苷和绿原酸提取量主要是受到因素a和b变化的影响，木犀草苷提取量影响主要是受到因素b和c变化的影响，各因素对加权综合评分的影响大小顺序为b＞c＞a＞d，即溶剂用量影响最大，其次是超声时间。

表8综合评分的方差分析结果

表8方差分析结果表明，各因素的影响均无显著性差异(p>0.05)。最工艺为a1b3c3d2，由于b2和b3、c2和c3组综合评分平均值接近，考虑到节约成本和时间，优化工艺调整为a1b2c2d2即溶剂为55％乙醇、料液比1:8、超声时间30min、频率28khz。

2.1.2验证试验

按照处方比例称取金银花、青蒿和栀子3份，采用优化工艺即55％乙醇、料液比1:8、超声时间为30min、频率28khz，进行验证试验，青蒿酸、青蒿素、木犀草苷、栀子苷和绿原酸提取量测定结果见表9。

表9验证试验结果(n＝3)

由表9可见，按照综合加权评分法所得优化工艺进行提取，综合评分高，提取液中5种成分的提取量rsd值小于3％，说明该工艺稳定可靠。

2.2增溶剂吐温-80用量的筛选

按照优化处方称取药材粉末共20g，按照优化工艺进行提取，提取液过滤，合并滤液，40℃减压回收乙醇并浓缩。加入增溶剂吐温-80，超声分散，加水调整体积至25ml。混匀后10000r/min离心10min，取上清加甲醇稀释，分别测定木犀草苷和青蒿酸的浓度，考察吐温-80用量对二者浓度的影响。加入不同用量的吐温-80，溶液中木犀草苷和青蒿酸的浓度测定结果见表10。

表10吐温-80用量对木犀草苷和青蒿酸溶解度的影响(n＝3)

由表10可见，吐温-80用量为3％和5％时，溶液中木犀草苷和青蒿酸的溶解度显著高于用量为1％的溶液(p<0.01)。但是，吐温-80用量为3％和5％对二者溶解度的影响无统计学差异(p>0.05)。因此，确定吐温-80用量为3％。

2.3促吸收剂的筛选

固定促吸收剂用量为3％，分别制备促吸收剂为氮酮、泊洛沙姆188和1,2-丙二醇的灌肠剂。取健康wistar大鼠24只，随机分为4组：无促吸收剂对照组、氮酮组、泊洛沙姆188组、1,2-丙二醇组，每组6只。比较不同促吸收剂对绿原酸、栀子苷、木犀草苷和青蒿酸吸收的影响。

根据测定的血药浓度数据，采用das软件进行数据处理，求得药动学参数血药浓度-时间曲线(auc)，比较不同促吸收剂对青蒿酸、绿原酸和栀子苷吸收的影响，结果见图3。

加入促吸收剂后，绿原酸、栀子苷、木犀草苷和青蒿酸的吸收均有所增加。由于无促吸收剂组、泊洛沙姆188组和1,2-丙二醇组木犀草苷血药浓度较低，数据点少，无法进行药动学参数计算。其中，3％的氮酮可显著增加绿原酸、栀子苷和青蒿酸吸收(p<0.01)，泊洛沙姆188显著增加了青蒿酸和栀子苷的吸收(p<0.05)。因此，氮酮作为促吸收剂的效果最好，确定氮酮为促吸收剂。

2.4yqze的制备

按照优化的处方工艺制备3批yqze样品。将金银花、青蒿、栀子分别粉碎，过60目筛。称取金银花120g、青蒿600g和栀子80g共10份，加入8倍量55﹪乙醇浸泡2h，28khz超声提取30min，提取2次。抽滤，合并滤液，40℃减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10。加入3﹪的吐温-80超声分散均匀，加入3﹪水溶性氮酮和0.2﹪山梨酸钾，加氢氧化钠溶液调节ph值为6.8，加纯化水至1000ml，得每毫升相当于生药0.8克的褐色澄清灌肠剂。

实验例3银花青蒿栀子方灌肠剂体内外抗cv-a6的作用

1病毒、细胞和动物同实验例1

溶液的配制

取实施例5制备的yqze1ml(浓度相当于生药0.8g/ml)，加维持液逐级稀释至浓度相当于生药102.0μg/ml和51.0μg/ml。

2实验方法和结果

2.1体外抗cv-a6作用

2.1.1对病毒复制增殖过程的影响

收集对数期rd细胞，用生长液调整细胞密度为5×104个/ml，接到96孔板，每孔100μl。置于37℃含5％二氧化碳的细胞培养箱中培养24h：

(1)先加药后接毒：取yqze稀释液(浓度相当于生药51.0μg/ml)加入到96孔板中，每孔100μl，置于37℃、5％二氧化碳的细胞培养箱孵育3h。弃液，加入cv-a6液，每孔100μl(moi＝1)，置于37℃、5％二氧化碳的细胞培养箱孵育1h。弃液，加入维持液，每孔100μl，置于37℃、5％二氧化碳的细胞培养箱孵育至48hpi。

(2)药物和病毒混合加入：将yqze稀释液(浓度相当于生药102.0μg/ml)和病毒液1:1混合，加入到96孔板中，每孔100μl(moi＝1)。置于37℃、5％二氧化碳的细胞培养箱中培养1h。弃液，加入维持液，每孔100μl，置于37℃、5％二氧化碳的细胞培养箱孵育至48hpi。

(3)先接毒后加药：96孔板中加入cv-a6液，每孔100μl(moi＝1)，置于37℃、5％二氧化碳的细胞培养箱孵育1h。弃液，加入yqze稀释液(浓度相当于生药51.0μg/ml)，置于37℃、5％二氧化碳的细胞培养箱孵育5h。弃液，加入维持液，每孔100μl，置于37℃、5％二氧化碳的细胞培养箱孵育至48hpi。

分别按照实验例1记载的方法测定病毒载量和病毒抑制率，结果见图4。由图4可见，先加药后接毒的处理方式下，yqze表现出一定的抗病毒活性，表明药物具有预防cv-a6感染rd细胞的作用。药物和病毒混合孵育后加入细胞的方式病毒抑制率最高、病毒载量最低，和先接毒后加药的处理方式之间存在显著性差异(p<0.01)，表明yqze可有效抑制cv-a6对rd细胞的吸附/穿入。先接毒后加药的处理方式下，yqze的病毒抑制率最低、病毒载量最高，表明了yqze对cv-a6的复制环节具有抑制作用，但是作用强度比药物对病毒的吸附/穿入细胞的抑制作用要小。

2.1.2对病毒诱导rd细胞凋亡的影响

收集对数期rd细胞，用生长液调整细胞密度为5×10⁴/ml，接到6孔板，每孔2ml，置于37℃、5％二氧化碳的细胞培养箱过夜。弃液，加药物和病毒处理24h。把细胞培养液吸出至离心管内，pbs洗涤一次，加入适量胰酶，室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶。加入收集的细胞培养液，轻轻吹打细胞，1000g离心5min。弃上清，收集细胞，用pbs重悬细胞并计数。取5-10万重悬细胞，1000g离心5min，弃上清，加入195μlannexinv-fitc结合液轻轻重悬细胞。加入5μlannexinv-fitc，轻轻混匀。加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温避光孵育10-20min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况,结果见图5-6。

如图5-6所示，yqze和对照利巴韦林对rd细胞的凋亡基本无影响，cv-a6感染rd细胞后显著促进其凋亡(p<0.001)，yqze对病毒导致的凋亡具有显著的抑制作用(p<0.001)，并和利巴韦林对照组存在显著性差异(p<0.01)。

2.2体内抗cv-a6作用

2.2.1分组和给药

取10日龄icr乳鼠随机分为4组：正常对照组、模型对照组、yqze组(生药2.6g·kg^-1)及利巴韦林对照组(10mg·kg^-1)，每组14只。除正常对照组以外，其余组ip感染cv-a6，剂量为10^8.0tcid50。接毒后1h内灌肠给药，每日2次，连续给药14d，模型对照组和正常对照组为同体积ns；利巴韦林对照组im给药。第4天每组随机取4只乳鼠，乙醚吸入麻醉后内眦取血，分离血清-80℃保存，用于细胞因子测定。然后，取心脏、肺脏、脊髓、延髓、脊柱肌和后肢肌等组织-80℃保存，用于病毒载量测定。余下10只用于观察症状和统计生存率，末次给药3h后处死剩余动物，采集后肢骨骼肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织，加10﹪中性福尔马林固定用于组织病理检查和免疫组织化学检查；取脊髓颈膨大段加2.5﹪戊二醛固定，用于超微结构观察。

2.2.2生存率和临床评分统计

每天观察、记录乳鼠的症状变化，统计生存率，参考文献zhangz,dongz,weiq,etal.aneonatalmurinemodelofcoxsackievirusa6infectionforevaluationofantiviralandvaccineefficacy[j].jvirol,2017,91(9):2450-2456.对临床症状进行评分。临床评分结果见图7，生存率变化见图8。

模型对照组icr乳鼠ip感染108.0tcid50cv-a6病毒液后5d后开始出现后肢急性弛缓性麻痹的典型症状，14dpi的生存率为10％。yqze组(生药2.6g/kg)乳鼠出现afr症状的少，运动能力较为正常，临床评分低，14dpi的生存率为70％。yqze有效改善了cv-a6感染icr乳鼠的症状，提高了生存率，药效优于对照利巴韦林。

2.2.3组织病理检查

将组织用中性福尔马林溶液固定、石蜡包埋，制备厚度为5μm的切片，he染色后光学显微镜下观察。取脊髓颈膨大段，置于2.5﹪戊二醛、1﹪四氧化锇中固定。梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，制备厚度为50-60nm超薄切片，醋酸铀-枸橼酸铅双染色后透射电子显微镜下观察。

后肢骨骼肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织he染色石蜡切片见图9。

由图9可见，与正常组相比，模型组乳鼠后肢肌出现严重的肌纤维溶解、断裂，肌束稀疏，yqze组乳鼠的后肢骨骼肌基本无肌束断裂，肌纤维排列较为整齐。模型组乳鼠脊髓前角和延髓中的神经元出现变性、坏死，yqze组的神经元坏死程度有一定的改善。正常组乳鼠心肌细胞排列致密有序，形态规整。模型组乳鼠的心肌有泡沫化，心肌纤维有轻度的溶解、断裂，yqze组心肌无出血现象，心肌纤维排列较为整齐。模型组乳鼠肺组织出现严重的纤维化，yqze组肺纤维化程度与模型组相比明显减轻，肺泡形态接近正常。

透射电子显微镜下观察脊髓组织的超微结构，结果见图10。

由图10可见，正常组脊髓前角神经元细胞器丰富，在核周分布均匀，有丰富的粗面内质网平行排列，核糖体颗粒丰富，形成发育良好的尼氏体区域(图a)，核内染色质均匀，核仁大而圆，位于胞体中央，核膜清晰，线粒体呈椭圆形，嵴清晰(图c)；髓鞘板层结构排列整齐(图b)。模型组脊髓前角神经元细胞器数量明显减少，粗面内质网扩张并有脱颗粒，核糖体颗粒分散，未形成尼氏体；核膜凹凸不平，核仁变小，异染色质边缘聚；胞浆广泛水肿，线粒体肿胀变形，基质稀疏，大部分嵴膜不清甚至消失，外膜膨胀隆起，形成空泡，有的甚至发生崩解(图d)；髓鞘板层结构紊乱、扭曲，出现囊性间隙，中间有纤维填充，进一步分离破裂(图e)；小胶质细胞包围吞噬脊髓前角神经元，呈现嗜神经现象(图f)。yqze药物组脊髓前角神经元细胞接近正常，粗面内质网基本为平行状排列，水肿减轻，游离核糖体减少，表明细胞合成功能旺盛，有利于神经轴突的修复(图i)；线粒体形态较改善，水肿减轻，数量增加(图g)；髓鞘板层结构散乱、扭曲和分离程度减轻(图h)。利巴韦林对照组脊髓前角神经元细胞器粗面内质网逐渐恢复正常的平行状排列，水肿减轻，游离核糖体减少(图j)，线粒体形态较改善，水肿减轻，数量增加；异染色质边缘聚(图l)；髓鞘板层结构散乱，中间有纤维填充(图k)。

2.2.4免疫组织化学检查

对6-8周龄icr雄性乳鼠多次皮下注射灭活的cv-a6，制备多克隆抗体。以自制多克隆抗体为一抗，hrp标记羊抗鼠igg为二抗，进行免疫组织化学染色，光学显微镜下观察。

后肢骨骼肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织ihc检查结果见图11。

由图11可见，病毒抗原在模型组乳鼠后肢骨骼肌中病毒表达最为严重，脊髓和延髓的神经元和胶质细胞有病毒抗原分布，在心脏中的分布相对较少，在肺组织中分布广泛。与模型组相比，yqze组后肢骨骼肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织的ihc染色切片阳性信号均明显减少，表明病毒抗原分布降低。

2.2.5组织病毒载量测定

取冻存组织加入液氮研磨，测定方法同实验例1“2.3”项下。后肢骨骼肌、肺脏、心脏和脊髓中的病毒载量测定结果见图12。

由图12可见，yqze显著降低了cv-a6感染icr乳鼠后肢肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织中的病毒载量(p<0.01或p<0.05)。

2.2.6tunnel染色

取“2.2.3”项下骨骼肌石蜡切片，脱水后用组化笔画圈，加10﹪山羊血清室温封闭30min。吸除血清，加tunnel反应混合液37℃孵育1h。tbs洗涤3次，每次5min。滴加dapi染色，避光室温孵育10min。tbs洗涤，抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下观察，结果见图13。

如图13所示，icr乳鼠感染cv-a6后骨骼肌出现较多的凋亡细胞，yqze和利巴韦林对照组凋亡细胞少，说明yqze对病毒导致的骨骼肌细胞凋亡具有抑制作用。

2.2.7细胞因子测定

采用elisa试剂盒测定血清中tgf-β水平。采用procartaplex多因子检测试剂盒测定il-4、il-5、il-6、il-12p70、tnf-α和ifn-γ的水平。96孔板每孔加入300μl包被特异性抗体的混合微球，加入25μl血清，采用magpix测定样品的荧光值，根据标准曲线计算细胞因子浓度。

细胞因子的测定结果表明，血清中il-4的水平均较低，且组间无差异，相关数据不进行罗列。yqze对cv-a6感染icr乳鼠血清中il-5、il-6、il-12p70、tnf-α、ifn-γ和tgf-β的影响结果见图14。

由图14可见，cv-a6感染造成细胞因子风暴，与正常对照组相比，模型组乳鼠在4dpi时血清中il-5、il-6、il-12p70、tnf-α、ifn-γ和tgf-β均显著升高(p<0.001)。与模型对照组相比，yqze组乳鼠血清中il-5、il-6、il-12p70、tnf-α、ifn-γ和tgf-β均显著降低(p<0.01或p<0.001)，其中tnf-α、ifn-γ和tgf-β的水平和利巴韦林对照组之间存在显著性。