一种乳腺癌靶向分子探针及其制备方法和应用

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种乳腺癌靶向分子探针及其制备方法和应用。

背景技术：

乳腺癌居全球女性恶性肿瘤发病率及死亡率首位。保乳手术是早期乳腺癌的标准手术，不仅彻底切除肿瘤，同时保留乳房，有较好的美容外观。

体内荧光成像不仅可用于提高肿瘤分期的诊断，监测治疗反应，还能检测复发或残留疾病，目前已应用到恶性肿瘤手术导航领域。伴随着近红外一区(thefirstnearinfraredwindow,nir-ⅰ,700-900nm)、近红外二区(thesecondnearinfraredwindow,nir-ⅱ,1000-1700nm)荧光探针的开发，荧光成像技术由可见光成像发展到近红外荧光成像，降低了组织吸收与自发荧光的干扰，极大地提高了信噪比，使得肿瘤与周围正常组织的界限更加清晰。尤其是基于近红外二区荧光探针的荧光成像技术具有“组织透明窗口”的独特性，荧光光源在组织中具有更低的散射和吸收，进一步提高了成像的空间分辨率和组织穿透深度，为术中诊疗精准度的提高提供了更有力的工具。该成像技术为肿瘤边界精准界定提供了安全、无创的前景。

但现有的荧光探针在对肿瘤的靶向性方面大多数研究使用rgd，靶向的是肿瘤组织血管内皮细胞上的αvβ3受体整合素。使用叶酸配体，靶向肿瘤细胞上的叶酸受体，以上都缺少特定的靶向性。

技术实现要素：

本发明针一种乳腺癌靶向分子探针及其制备方法和应用，该探针具备较高的生物安全性，且cpp30能靶向乳腺癌细胞，具有较强穿膜能力，能将icg带入肿瘤细胞，实现肿瘤细胞定位，更好的指导术中肿瘤的可视化。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种乳腺癌靶向分子探针，所述探针为lipo-icg-cpp30，其包括脂质体lipo，所述脂质体为球状，其内部包裹有吲哚菁绿icg，外部修饰有多肽cpp30。

优选地，所述脂质体包括磷脂、胆固醇及二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。

一种乳腺癌靶向分子探针的制备方法，该方法包括以下步骤：

s1、称取10mgcpp30溶解于1.5mlph值为7的磷酸缓冲盐溶液中后加入15mg磷脂-聚乙二醇-马来酰亚胺反应得到a溶液；

s2、将a溶液装入截留分子量3500的透析袋，置于装有去离子水的烧杯中透析，除去未反应的磷脂-聚乙二醇-马来酰亚胺和cpp30，得到磷脂-聚乙二醇-cpp30溶液；

s3、分别称取6.25mg氢化大豆磷脂、0.7mg胆固醇、0.7mg磷脂-聚乙二醇、0.7mg吲哚菁绿溶于3ml三氯甲烷中得到b溶液；

s4、将b溶液转移至茄形烧瓶中旋转蒸发至瓶底成膜；

s5、加入0.5ml磷脂-聚乙二醇-cpp30溶液和2ml去离子水得到c溶液；

s6、将c溶液收集至ep管中进行水浴超声后，过滤得到d溶液；

s7、将d溶液装入截留分子量为14000的透析袋，置于装有去离子水的烧杯中透析，除去未负载的磷脂-聚乙二醇-cpp30和吲哚菁绿，补充去离子水定容至2.5ml，得到lipo-icg-cpp30溶液。

优选地，步骤s1中混合溶液反应条件为室温，时间为12h。

优选地，步骤s4中b溶液旋转蒸发温度为37℃，时间为10min，转速为150rpm/min。

优选地，步骤s6中水浴超声条件为40khz、100w，时间为10min。

优选地，步骤s6中c溶液过滤方法具体为：通过脂质体挤出器移取溶液至200nm滤膜过滤，如此反复挤出过滤20次再通过100nm滤膜，反复挤出过滤20次，最后收集液体得到d溶液。

乳腺癌靶向分子探针可应用于乳腺癌保乳手术中的荧光导航探针。

采用上述技术方案后，本发明与背景技术相比，具有如下优点：

本发明提供一种乳腺癌靶向分子探针及其制备方法和应用，利用生物相容性好、低毒性、表面可被修饰的脂质体包裹荧光染料吲哚菁绿icg，再以多肽cpp30作为靶向肽修饰脂质体，制备出乳腺癌靶向分子探针lipo-icg-cpp30，较高的生物安全性；脂质体外部修饰的多肽cpp30能靶向乳腺癌细胞，具有较强穿膜能力，能将icg带入肿瘤细胞，实现肿瘤细胞定位，icg在近红外一区和二区均能发出荧光，利用其荧光特性作为分子探针用于乳腺癌手术导航，通过荧光成像可视化乳腺癌保乳手术切缘残留病灶，更好的指导乳腺癌保乳手术术中可视化，实现实时、精准的切缘的评估。

附图说明

图1为本发明探针lipo-icg-cpp30结构示意图；

图2为本发明实施例中实验1探针lipo-icg-cpp30的粒径折线图、吸收光谱折线图、荧光强度折现图及电镜图；

图3为本发明实施例中实验2探针lipo-icg-cpp30的穿膜能力直方图和定位情况图；

图4为本发明实施例中实验2探针lipo-icg-cpp30的细胞毒性直方图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在本发明中需要说明的是，术语“上”“下”“左”“右”“竖直”“水平”“内”“外”等均为基于附图所示的方位或位置关系，仅仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示本发明的装置或元件必须具有特定的方位，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例

如图1所示，本发明公开了一种乳腺癌靶向分子探针，探针为lipo-icg-cpp30，其包括脂质体lipo，脂质体为球状，其内部包裹有吲哚菁绿icg，外部修饰有多肽cpp30。

脂质体包括磷脂、胆固醇及二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)。

乳腺癌靶向分子探针lipo-icg-cpp30的制备方法，该方法包括以下步骤：

s1、称取10mgcpp30溶解于1.5ml磷酸缓冲盐溶液(pbs)中后加入15mg磷脂-聚乙二醇-马来酰亚胺(dspe-peg-mal)，至于室温下反应12h得到a溶液，其中pbs的ph为7.4；

s2、将a溶液装入截留分子量3500的透析袋，置于装有去离子水的烧杯中透析，除去未反应的磷脂-聚乙二醇-马来酰亚胺和cpp30，得到磷脂-聚乙二醇-cpp30(dspe-peg-cpp30)溶液；

s3、分别称取6.25mg氢化大豆磷脂、0.7mg胆固醇、0.7mg磷脂-聚乙二醇、0.7mg吲哚菁绿溶于3ml三氯甲烷中得到b溶液；

s4、将b溶液转移至茄形烧瓶中旋转蒸发至瓶底成膜，旋转蒸发温度为37℃，时间为10min，转速为150rpm/min；

s5、加入0.5ml磷脂-聚乙二醇-cpp30溶液和2ml去离子水得到c溶液；

s6、将c溶液收集至ep管中使用40khz、100w水浴超声10min后，通过脂质体挤出器移取溶液至200nm滤膜过滤，如此反复挤出过滤20次再通过100nm滤膜，反复挤出过滤20次，最后收集液体得到d溶液；

s7、将d溶液装入截留分子量为14000的透析袋，置于装有去离子水的烧杯中透析，除去未负载的磷脂-聚乙二醇-cpp30和吲哚菁绿，补充去离子水定容至2.5ml，得到lipo-icg-cpp30溶液。

乳腺癌靶向分子探针lipo-icg-cpp30可应用于乳腺癌保乳手术中的荧光导航探针。

通过对制取的lipo-icg-cpp30探针进行表征和细胞实验，该探针粒径较为均一，且稳定性好，吸收光谱及其荧光强度也具有良好的稳定性，探针中icg在近红外一区和二区均能发出荧光，且icg在近红外二区存在拖尾现象，将其用于二区荧光成像的信噪比明显要高于一区，利用其荧光特性作为分子探针用于乳腺癌手术导航，通过荧光成像可视化乳腺癌保乳手术切缘残留病灶，更好的指导乳腺癌保乳手术术中可视化。

将lipo-icg-cpp30探针用于孵育乳腺癌细胞mda-mb-231细胞，收集细胞后使用流式细胞仪及正置荧光显微镜检测，发现探针中的多肽cpp30对乳腺癌细胞有较好的穿膜能力，且荧光强度呈时间和浓度依赖性，相反的在其他肿瘤组织和作为非肿瘤组织的人真皮成纤维细胞中表现出了较差的穿膜能力，据此推测cpp30对乳腺癌细胞有一定的靶向性，更好实现肿瘤细胞定位；

探针的合成成分脂质体、多肽cpp30、吲哚菁绿icg皆安全无毒，合成的探针也具备较高的生物安全性，使用该探针孵育的mda-mb-231细胞存活率高，活性好，故探针的细胞毒性较低。

实验1：对探针lipo-icg-cpp30进行表征，测其粒径、吸光度和荧光强度，并拍摄电镜图。

1.粒径：取200ul探针原液用pbs稀释10倍至2ml，分别于0、12、24、48、96h加入到四面光的比色皿中使用动态光散射粒径仪测探针粒径大小。

2.吸光度和荧光强度：取5ul探针原液用pbs稀释20倍至100ul加到96孔板中，分别于0、12、24、48、96h使用酶标仪测探针吸收光谱，根据测得吸收光谱选取探针最佳激发波长与发射波长，分别于0、12、24、48、96h使用酶标仪测在最佳波长下测其对应荧光强度。

实验1测试数据图表如图2所示，根据图2可知探针lipo-icg-cpp30粒径较为均一，且稳定性好，吸收光谱及其荧光强度也具有良好的稳定性。

实验2：在细胞中验证探针lipo-icg-cpp30的穿膜效率和毒性。

1.流式细胞仪检测探针的穿膜效率：

a.铺板：胰酶消化10cm皿里的mda-mb-231-luc细胞，离心后用1ml培养基重悬细胞，取10μl进行细胞计数，根据所测细胞浓度及所需浓度，用培养基稀释细胞，按每孔5*10⁴个细胞进行铺板；

b.加探针：细胞37℃培养24h后，待其长至对数生长期，按icg3ug/ml浓度加探针及其对照组(lipo-icg-cpp30/lipo-icg/nc)，每种探针三个副孔，孵育6小时。

c.收集细胞：吸走原有培养基，用pbs清洗后，使用胰蛋白酶消化细胞，加入dmem终止消化后离心收集细胞，用pbs重悬细胞团，重复两次，以确保完全去除带有探针的培养基，最后用pbs重悬细胞，用滤网过滤细胞后收集在ep管中，包上锡纸避光。

d.流式细胞仪检测：通过流式细胞仪进行荧光强度检测，并使用flowjo分析各组别的荧光强度。

2.正置荧光显微镜观察探针在肿瘤细胞中的定位

a.铺板：事先将爬片紫外照射半小时，在12孔板底部加少量培养基后放入爬片，使其尽可能贴合，将计数后的mda-mb-231-luc细胞按5×10⁴/ml种入培养板内；

b.加探针：37℃培养培养24h，按icg3ug/ml浓度加探针加入探针及其对照组(lipo-icg-cpp30/lipo-icg/nc)；

c.制片：37℃孵育6h后吸走原有培养基，加入pbs置于摇床清洗，每次5min，重复三遍，4％多聚甲醛室温固定15min，加pbs摇床清洗三遍后，取出爬片晾干，加dapi染细胞核，倒扣在载玻片上后滴加中性树脂封片；

d.拍照：正置荧光显微镜观察并拍照

3.酶标仪检测探针对细胞的活性影响

a.铺板：将mda-mb-231-luc细胞铺96孔板，1000个细胞/孔，每个浓度设置3个副孔；

b.探针孵育：于5％co2、37℃培养24h至对数生长期后，将探针加入培养基中稀释成不同浓度(0、0.1、1、10、100ug/ml)，给细胞换液，包上锡纸，置于培养箱中避光孵育72h后

呈色：每孔加入10μlcck-8溶液后避光培养箱中孵育2h，用全波长多功能酶标仪(varioskanflash)测定样品在450nm处吸光度(od值)；

c.计算细胞存活率：计算公式：细胞存活率％＝[(odx-odn)/(od0-odn)]×100％[odx:实验孔吸光度(含探针)；od0:对照孔吸光度(不含探针)；odn:空白孔吸光度(不含细胞、探针)]。

实验2测试数据图表如图3和图4所示，由图3可知通过探针lipo-icg-cpp30用于孵育乳腺癌细胞mda-mb-231细胞，收集细胞后使用流式细胞仪和正置荧光显微镜检测，发现探针具有良好的穿膜能力，且荧光强度呈时间和浓度依赖性；由图4可知mda-mb-231细胞在不同浓度的探针孵育后，通过cck8实验分析细胞活性，证明探针的细胞毒性较低。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。