一种磁热-免疫联合用药物及其应用

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种磁热-免疫联合用药物及其应用。

背景技术：

随着生物学和医学相关领域的科技进步，通过免疫方式治疗肿瘤(肿瘤免疫治疗)越来越受到人们的关注，已经成为一个十分有潜力的发展方向。肿瘤免疫疗法是继手术、放射、化学药物治疗三大疗法之后的新型疗法，具体而言，现代免疫疗法可通过调节免疫调节信号或激活针对特定肿瘤相关抗原的免疫系统，来促进t细胞介导的肿瘤消退。用于治疗肿瘤的免疫疗法主要包括car-t疗法、免疫检查点阻断疗法、细胞因子疗法、癌症疫苗疗法。尽管在开发阶段进行了广泛的研究，但在临床环境中，基于免疫的癌症治疗药物常常观察到治疗失败的现象。肿瘤异质性和获得性耐药是成功免疫治疗的主要限制。因此越来越多的研究者将重心转移到免疫治疗与其它治疗方式结合，从而实现协同治疗效果，弥补了免疫治疗的不足。最常见的有化疗、放疗或者光热治疗与免疫治疗结合，但是化疗与放疗通常会对机体产生很高的副作用，而光热治疗则因为光线的组织穿透差力而仅能够治疗在组织表面以下几毫米的肿瘤，这些因素都导致免疫组合疗法的发展受到限制。

技术实现要素：

本发明第一方面的目的，在于提供一种联合用药物。

本发明第二方面的目的，在于提供第一方面的联合用药物在制备抗肿瘤药品中的应用。

本发明第三方面的目的，在于提供一种包含第一方面的联合用药物的药品。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种联合用药物，包含磁热剂和免疫佐剂；所述磁热剂为铁磁性纳米晶体(fion)。

优选地，所述免疫佐剂为咪喹莫特(r837)、单磷酰脂质a(mpla)和瑞喹莫德(r848)中的至少一种；进一步为瑞喹莫德。

优选地，所述磁热剂为两亲性分子修饰的磁热剂。

优选地，所述两亲性分子为两亲性聚磷酸酯、两亲性聚乳酸、两亲性聚氨基酸中的至少一种；进一步为两亲性聚磷酸酯；更进一步为聚乙二醇-b-聚2-己氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷。

优选地，所述免疫佐剂为两亲性分子修饰的免疫佐剂。

优选地，所述两亲性分子为两亲性聚磷酸酯、两亲性聚乳酸、两亲性聚氨基酸中的至少一种；进一步为两亲性聚磷酸酯；更进一步为聚乙二醇-b-聚2-己氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷。

优选地，所述两亲性分子修饰的磁热剂通过超声自组装法制备，制备方法具体如下：将磁热剂、两亲性分子与有机溶剂混合，得到混合液；水浴超声状态下，将混合液加入水中，得到两亲性分子修饰的磁热剂。

优选地，所述磁热剂与两亲性分子的质量比为1：(5～20)；进一步为1：10。

优选地，所述有机溶剂与水的体积比为1：(3～30)；进一步为1：10。

优选地，所述有机溶剂为二甲基亚砜、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺中的至少一种。

优选地，所述超声的条件为：150～210w，20～100khz下处理20～60min。

优选地，所述制备方法还包括如下步骤：去除有机溶剂及未被两亲性分子修饰的磁热剂。

优选地，所述两亲性分子修饰的磁热剂的粒径为10～200nm。

优选地，所述两亲性分子修饰的免疫佐剂通过单乳化法制备，制备方法具体如下：将免疫佐剂、两亲性分子与有机溶剂混合，得到混合液；将混合液加入水中，乳化，得到两亲性分子修饰的免疫佐剂。

优选地，所述免疫佐剂与两亲性分子的质量比为1：(5～20)；进一步为1：10。

优选地，所述有机溶剂与水的体积比为1：(3～20)；进一步为1：5。

优选地，所述有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯中的至少一种。

优选地，所述乳化的条件为：冰浴下超声乳化2～10min。

优选地，所述超声的条件为：60～100w下超声2～20s，间隔1～10s。

优选地，所述制备方法还包括如下步骤：去除有机溶剂。

优选地，所述两亲性分子修饰的免疫佐剂的粒径为10～200nm。

优选地，所述联合用药物还包含免疫检查点阻断剂。

优选地，所述免疫检查点阻断剂为ctla4抗体、pd-1抗体中的至少一种。

优选地，所述联合用药物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的第二个方面，提供第一方面的联合用药物在制备抗肿瘤药品中的应用。

优选地，所述肿瘤为乳腺癌、胰腺癌、肺癌和结直肠癌肿瘤中的至少一种；进一步为结直肠癌肿瘤。

优选地，所述抗肿瘤药品中各组分的量，以小鼠给药剂量计算：磁热剂以铁离子浓度计算为3～10mg/kg；免疫佐剂为0.5～5mg/kg；免疫检查点阻断剂为0.5～5mg/kg。

优选地，所述抗肿瘤药品的给药方式为瘤内注射。

本发明的第三方面，提供一种包含第一方面的联合用药物的药品。

本发明的有益效果是：

本发明提供的联合用药物，通过在病灶部位直接注射后，通过施加特定场强的交变磁场，在杀死肿瘤细胞的同时，产生的肿瘤细胞碎片可作为肿瘤抗原，结合免疫佐剂的免疫放大效应，可产生类肿瘤相关“疫苗”作用，不仅可以消灭原位肿瘤，还能抑制远端肿瘤生长，提供高效的肿瘤治疗效果；本发明使用的磁热治疗相较于光热治疗具有更好的组织穿透性；采用的磁热剂(铁磁性纳米晶体)相较于传统的商业化fe3o4粒子，具有更好的热效应。

附图说明

图1是ppefion和pper848的粒径图。

图2是ppefion和pper848的zeta电势图。

图3是ppefion的紫外吸收谱图。

图4是pper848的紫外吸收谱图。

图5是ppefion和pper848的稳定性曲线图。

图6是pper848在不同ph下的药物释放曲线图。

图7是不同铁离子浓度的ppefion在同一场强处理下的温度时间曲线图。

图8是不同铁离子浓度的ppefion在同一场强处理下的热成像图。

图9是ppefion在不同场强处理下的温度时间曲线图。

图10是ppefe3o4及ppefion的磁热性能对比图。

图11是ppefion在交变磁场下对ct26细胞存活率的影响图：其中，***表示p<0.001。

图12是ppefion&pper848细胞水平促进dc细胞成熟的试验流程图。

图13是ppefion&pper848在体外的免疫刺激效果图：其中，a是ppefion&pper848对dc细胞成熟率影响的流式图；b是ppefion&pper848对dc细胞成熟率影响的统计结果图，其中，*表示p<0.05；**表示p<0.01。

图14是ppefion&pper848动物水平促进dc细胞成熟的试验流程图。

图15是ppefion&pper848在体内的免疫刺激效果图：其中，a是ppefion&pper848对dc细胞成熟率影响的流式图；b是ppefion&pper848对dc细胞成熟率影响的统计结果图，其中，*表示p<0.05；**表示p<0.01。

图16是ppefion&pper848联合ctla4抗体治疗小鼠双边肿瘤的疗效研究的试验流程图。

图17是ppefion&pper848联合ctla4抗体治疗小鼠双边肿瘤后的效果图：其中，a是ppefion&pper848联合ctla4抗体治疗小鼠双边肿瘤后的远端肿瘤的体积图；b是ppefion&pper848联合ctla4抗体治疗小鼠双边肿瘤后的远端肿瘤的直观图，其中，*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1一种磁热-免疫联合治疗药物

(1)一种磁热-免疫联合治疗药物，包含两亲性聚磷酸酯修饰的铁磁性纳米晶体(ppefion)和两亲性聚磷酸酯修饰的免疫佐剂(pper848)。

(2)两亲性聚磷酸酯修饰的铁磁性纳米晶体(ppefion)的制备：采用超声自组装法制备两亲性聚磷酸酯修饰的铁磁性纳米晶体，具体如下：称取20mg聚乙二醇-b-聚2-己氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(peg-phep)(聚乙二醇-b-聚2-己氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷的合成方法参考文献：junxia,wang,yang,etal.nir-activatedsupersensitivedrugreleaseusingnanoparticleswithaflowcore[j].advancedfunctionalmaterials,2016,26(41):7516-7525)，与1ml铁磁性纳米晶体(fion)溶液(2mg/ml，溶剂为二甲基亚砜dmso；铁磁性纳米晶体的合成方法参考文献：kimd,leen,parkm,etal.synthesisofuniformferrimagneticmagnetitenanocubes[j].journaloftheamericanchemicalsociety,2009,131(2):454-455)混合，利用超声使peg-phep在dmso中充分溶解，得到混合液；随后，在水浴超声(功率180w，频率40khz)过程中，将混合液逐渐滴入到10ml超纯水中，继续超声30min后，用14000da透析袋透析24h除去dmso；透析结束后，过0.45μm滤膜除去未被包载的铁磁性纳米晶体(fion)，利用磁铁富集浓缩颗粒，加入500μl无菌水重悬，得到的纳米颗粒标记为ppefion。

取10μl颗粒溶液，加入1ml王水反应4h，加入超纯水定容至10ml，利用电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测得颗粒中包入的fion的含量。

(3)两亲性聚磷酸酯修饰的免疫佐剂(pper848)的制备：采用单乳化法制备两亲性聚磷酸酯修饰的免疫佐剂，具体如下：称取20mgpeg-phep(聚乙二醇-b-聚2-己氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷的合成方法参考文献：junxia,wang,yang,etal.nir-activatedsupersensitivedrugreleaseusingnanoparticleswithaflowcore[j].advancedfunctionalmaterials,2016,26(41):7516-7525)与2mg瑞喹莫德(r848)，溶解于1ml的三氯甲烷中，充分混匀溶解后得到混合液，将该混合液注入到5ml无菌水底部；在冰浴条件下，利用超声探头充分乳化4min(65w，开2s，关2s)，-20℃，-0.1mpa下旋蒸除去三氯甲烷并浓缩后，得到的纳米颗粒标记为pper848。

利用荧光分光光度计(shimadzurf-6000，japan)测试纳米颗粒溶液中为r848的浓度，取100ul纳米颗粒溶液用冷冻干燥机冻干得到粉末，之后用dmso溶解；配制1mg/ml的r848二甲亚砜溶液，稀释至10ug/ml，依次对半稀释至0.3125ug/ml，通过荧光分光光度计测定r848特征发射谱，荧光检测器设定激发波长为255nm，发射波长为300～450nm，将荧光强度与该物质的浓度关联，建立标准曲线，纳米颗粒包载r848的载药量(drugloadingcontent，dlc)及包封效率(encapsulationefficiency，ee)通过以下公式算得：

实施例2一种磁热-免疫联合治疗药物

(1)一种磁热-免疫联合治疗药物，包含两亲性聚磷酸酯修饰的铁磁性纳米晶体(ppefion)和两亲性聚磷酸酯修饰的免疫佐剂(pper848)。

(2)两亲性聚磷酸酯修饰的铁磁性纳米晶体(ppefion)的制备：采用超声自组装法制备两亲性聚磷酸酯修饰的铁磁性纳米晶体，具体如下：称取10mg聚乙二醇-b-聚2-己氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(peg-phep)(聚乙二醇-b-聚2-己氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷的合成方法参考文献：junxia,wang,yang,etal.nir-activatedsupersensitivedrugreleaseusingnanoparticleswithaflowcore[j].advancedfunctionalmaterials,2016,26(41):7516-7525)，与1ml铁磁性纳米晶体(fion)溶液(2mg/ml，溶剂为二甲基亚砜dmso；铁磁性纳米晶体的合成方法参考文献：kimd,leen,parkm,etal.synthesisofuniformferrimagneticmagnetitenanocubes[j].journaloftheamericanchemicalsociety,2009,131(2):454-455)混合，利用超声使peg-phep在dmso中充分溶解，得到混合液；随后，在水浴超声(功率180w，频率40khz)过程中，将混合液逐渐滴入到3ml超纯水中，继续超声30min后，用14000da透析袋透析24h除去dmso；透析结束后，过0.45μm滤膜除去未被包载的铁磁性纳米晶体(fion)，利用磁铁富集浓缩颗粒，加入500μl无菌水重悬，得到的纳米颗粒标记为ppefion。

取10μl颗粒溶液，加入1ml王水反应4h，加入超纯水定容至10ml，利用电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测得颗粒中包入的fion的含量。

(3)两亲性聚磷酸酯修饰的免疫佐剂(pper848)的制备：采用单乳化法制备两亲性聚磷酸酯修饰的免疫佐剂，具体如下：称取10mgpeg-phep(聚乙二醇-b-聚2-己氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷的合成方法参考文献：junxia,wang,yang,etal.nir-activatedsupersensitivedrugreleaseusingnanoparticleswithaflowcore[j].advancedfunctionalmaterials,2016,26(41):7516-7525)与2mg瑞喹莫德(r848)，溶解于1ml的三氯甲烷中，充分混匀溶解后得到混合液，将该混合液注入到3ml无菌水底部；在冰浴条件下，利用超声探头充分乳化4min(65w，开2s，关2s)，-20℃，-0.1mpa下旋蒸除去三氯甲烷并浓缩后，得到的纳米颗粒标记为pper848。

利用荧光分光光度计(shimadzurf-6000，japan)测试纳米颗粒溶液中为r848的浓度，取100ul纳米颗粒溶液用冷冻干燥机冻干得到粉末，之后用dmso溶解；配制1mg/ml的r848二甲亚砜溶液，稀释至10ug/ml，依次对半稀释至0.3125ug/ml，通过荧光分光光度计测定r848特征发射谱，荧光检测器设定激发波长为255nm，发射波长为300～450nm，将荧光强度与该物质的浓度关联，建立标准曲线，纳米颗粒包载r848的载药量(drugloadingcontent，dlc)及包封效率(encapsulationefficiency，ee)通过以下公式算得：

实施例3一种磁热-免疫联合治疗药物

(1)一种磁热-免疫联合治疗药物，包含两亲性聚磷酸酯修饰的铁磁性纳米晶体(ppefion)和两亲性聚磷酸酯修饰的免疫佐剂(pper848)。

(2)两亲性聚磷酸酯修饰的铁磁性纳米晶体(ppefion)的制备：采用超声自组装法制备两亲性聚磷酸酯修饰的铁磁性纳米晶体，具体如下：称取30mg聚乙二醇-b-聚2-己氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(peg-phep)(聚乙二醇-b-聚2-己氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷的合成方法参考文献：junxia,wang,yang,etal.nir-activatedsupersensitivedrugreleaseusingnanoparticleswithaflowcore[j].advancedfunctionalmaterials,2016,26(41):7516-7525)，与1ml铁磁性纳米晶体(fion)溶液(2mg/ml，溶剂为二甲基亚砜dmso；铁磁性纳米晶体的合成方法参考文献：kimd,leen,parkm,etal.synthesisofuniformferrimagneticmagnetitenanocubes[j].journaloftheamericanchemicalsociety,2009,131(2):454-455)混合，利用超声使peg-phep在dmso中充分溶解，得到混合液；随后，在水浴超声(功率180w，频率40khz)过程中，将混合液逐渐滴入到20ml超纯水中，继续超声30min后，用14000da透析袋透析24h除去dmso；透析结束后，过0.45μm滤膜除去未被包载的铁磁性纳米晶体(fion)，利用磁铁富集浓缩颗粒，加入500μl无菌水重悬，得到的纳米颗粒标记为ppefion。

取10μl颗粒溶液，加入1ml王水反应4h，加入超纯水定容至10ml，利用电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测得颗粒中包入的fion的含量。

(3)两亲性聚磷酸酯修饰的免疫佐剂(pper848)的制备：采用单乳化法制备两亲性聚磷酸酯修饰的免疫佐剂，具体如下：称取30mgpeg-phep(聚乙二醇-b-聚2-己氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷的合成方法参考文献：junxia,wang,yang,etal.nir-activatedsupersensitivedrugreleaseusingnanoparticleswithaflowcore[j].advancedfunctionalmaterials,2016,26(41):7516-7525)与2mg瑞喹莫德(r848)，溶解于1ml的三氯甲烷中，充分混匀溶解后得到混合液，将该混合液注入到10ml无菌水底部；在冰浴条件下，利用超声探头充分乳化4min(65w，开2s，关2s)，-20℃，-0.1mpa下旋蒸除去三氯甲烷并浓缩后，得到的纳米颗粒标记为pper848。

利用荧光分光光度计(shimadzurf-6000，japan)测试纳米颗粒溶液中为r848的浓度，取100ul纳米颗粒溶液用冷冻干燥机冻干得到粉末，之后用dmso溶解；配制1mg/ml的r848二甲亚砜溶液，稀释至10ug/ml，依次对半稀释至0.3125ug/ml，通过荧光分光光度计测定r848特征发射谱，荧光检测器设定激发波长为255nm，发射波长为300～450nm，将荧光强度与该物质的浓度关联，建立标准曲线，纳米颗粒包载r848的载药量(drugloadingcontent，dlc)及包封效率(encapsulationefficiency，ee)通过以下公式算得：

实施例4一种磁热-免疫联合治疗药物

(1)一种磁热-免疫联合治疗药物，包含两亲性聚磷酸酯修饰的铁磁性纳米晶体(ppefion)和两亲性聚磷酸酯修饰的免疫佐剂(pper848)。

(2)两亲性聚磷酸酯修饰的铁磁性纳米晶体(ppefion)的制备：采用超声自组装法制备两亲性聚磷酸酯修饰的铁磁性纳米晶体，具体如下：称取40mg聚乙二醇-b-聚2-己氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(peg-phep)(聚乙二醇-b-聚2-己氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷的合成方法参考文献：junxia,wang,yang,etal.nir-activatedsupersensitivedrugreleaseusingnanoparticleswithaflowcore[j].advancedfunctionalmaterials,2016,26(41):7516-7525)，与1ml铁磁性纳米晶体(fion)溶液(2mg/ml，溶剂为二甲基亚砜dmso；铁磁性纳米晶体的合成方法参考文献：kimd,leen,parkm,etal.synthesisofuniformferrimagneticmagnetitenanocubes[j].journaloftheamericanchemicalsociety,2009,131(2):454-455)混合，利用超声使peg-phep在dmso中充分溶解，得到混合液；随后，在水浴超声(功率180w，频率40khz)过程中，将混合液逐渐滴入到30ml超纯水中，继续超声30min后，用14000da透析袋透析24h除去dmso；透析结束后，过0.45μm滤膜除去未被包载的铁磁性纳米晶体(fion)，利用磁铁富集浓缩颗粒，加入500μl无菌水重悬，得到的纳米颗粒标记为ppefion。

取10μl颗粒溶液，加入1ml王水反应4h，加入超纯水定容至10ml，利用电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测得颗粒中包入的fion的含量。

(3)两亲性聚磷酸酯修饰的免疫佐剂(pper848)的制备：采用单乳化法制备两亲性聚磷酸酯修饰的免疫佐剂，具体如下：称取40mgpeg-phep(聚乙二醇-b-聚2-己氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷的合成方法参考文献：junxia,wang,yang,etal.nir-activatedsupersensitivedrugreleaseusingnanoparticleswithaflowcore[j].advancedfunctionalmaterials,2016,26(41):7516-7525)与2mg瑞喹莫德(r848)，溶解于1ml的三氯甲烷中，充分混匀溶解后得到混合液，将该混合液注入到20ml无菌水底部；在冰浴条件下，利用超声探头充分乳化4min(65w，开2s，关2s)，-20℃，-0.1mpa下旋蒸除去三氯甲烷并浓缩后，得到的纳米颗粒标记为pper848。

利用荧光分光光度计(shimadzurf-6000，japan)测试纳米颗粒溶液中为r848的浓度，取100ul纳米颗粒溶液用冷冻干燥机冻干得到粉末，之后用dmso溶解；配制1mg/ml的r848二甲亚砜溶液，稀释至10ug/ml，依次对半稀释至0.3125ug/ml，通过荧光分光光度计测定r848特征发射谱，荧光检测器设定激发波长为255nm，发射波长为300～450nm，将荧光强度与该物质的浓度关联，建立标准曲线，纳米颗粒包载r848的载药量(drugloadingcontent，dlc)及包封效率(encapsulationefficiency，ee)通过以下公式算得：

实施例5ppefion和pper848纳米颗粒的表征

(1)粒径与电位

取实施例1制备得到的ppefion和pper848，采用动态光散射仪(dynamiclightscattering,dls)检测纳米颗粒粒径与电位，粒径结果如图1所示：ppefion粒径约为60nm，pper848粒径约为30nm；电位结果如图2所示：ppefion电位约为-18mv，pper848电位约为-17mv。

(2)颗粒的紫外吸收谱

采用紫外分光光度计(shimadzuuv-2600，japan)测量r848、fion、peg-phep(ppe)实施例1制备得到的ppefion和pper848的紫外吸收谱，结果如图3、4所示：图3可见：fion在235～600范围内有宽谱吸收，ppefion在上述范围内有fion的特征吸收峰，表明ppefion的成功合成；图4可见：r848在248nm与321nm处均有较强吸收峰，pper848在上述范围内有r848的特征吸收峰，表明pper848的成功合成。

(3)颗粒的稳定性

分别将实施例1制备的ppefion和pper848置于1xpbs溶液中共培养，分别于1、2、4、8、12、24、48、72h检测ppefion和pper848的粒径，结果如图5所示：ppefion和pper848在1xpbs溶液中共培养72h后，两种纳米颗粒粒径均无明显变化，具有较好的稳定性。

(4)pper848的药物释放性能

r848从pper848中的释放是在含有0.02mol.l^-1的磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，pbs，ph＝7.4、6.5或5.5)中进行：分别进行三组平行实验，取1ml实施例制备得到的pper848(pper848中r848的浓度为450μg/ml)重悬于1ml0.02mpbs(ph＝7.4、6.5或5.5)中，将纳米颗粒置于透析袋中(spectra/por，float-a-lyzer，mwco＝14000)，再将透析袋分别置于三组装有20ml的pbs缓冲液(ph＝7.4、6.5或5.5)50ml离心管中，释放于37℃摇床(80rpm)下进行；分别在0.5、1、2、4、8、12、24、36、48h将释放外液全取出，并补充等量的新鲜缓冲液；将取出的释放外液冻干，dmso溶解，荧光分光光度计(shimadzurf-6000，japan)分析释放外液中r848的浓度。结果如图6所示：pper848颗粒随着ph值降低，药物释放速度和释放量增加。

(5)ppefion的磁热性能表征

将实施例1制备得到的ppefion纳米颗粒(铁离子浓度为2mg/ml)分别稀释至铁离子浓度为400、300、200、100μg/ml，各取1ml的ppefion纳米颗粒溶液置于铜质线圈内，另取1ml的超纯水作为对照(upw)，使用近红外相机(ici7320,infraredcamerainc.,texas,usa)实时监测施加同一场强的交变磁场下(h＝36ka/m，f＝320khz)，不同浓度颗粒溶液10min内的温度变化，结果如图7、8所示：在相同场强下，ppefion经磁场处理后，热效应随浓度的增加而增加。

取铁离子浓度为400μg/ml的ppefion纳米颗粒溶液1ml，置于铜质线圈内，另取1ml的超纯水作为对照(upw)，使用近红外相机(ici7320,infraredcamerainc.,texas,usa)时监测施加不同场强的交变磁场下(h＝36、32、28、24、20ka/m,f＝320khz)，颗粒溶液10min内的温度变化，结果如图9所示：相同浓度的ppefion，经过不同场强的磁场处理后，热效应随场强的增加而增加，而upw只有略微的上升。

以商品化fe3o4磁性纳米颗粒(购自南京东纳生物科技有限公司，货号为mag3000)为原料制备两亲性聚磷酸酯修饰的fe4o3磁性纳米颗粒(ppefe3o4，制备方法同实施例1)，分别取铁离子浓度为400μg/ml的ppefe3o4及ppefion，测试其在交变磁场下10min内的温度变化(场强为36ka/m)，结果如图10所示：ppefion的升温速率明显高于ppefe3o4，磁热性能更好。

实施例6ppefion细胞水平杀伤肿瘤细胞

将鼠结直肠癌细胞系(ct26)与不同铁离子浓度(100、50、10μg/ml)的ppefion(对照组加入等量pbs)在37℃共同培养4h(每孔10万个细胞)，随后消化孔板中的细胞(用原本孔中的培养基终止细胞消化)到ep管中，非磁热组直接种入新的24孔板中，磁热组将装有细胞的ep管放入线圈磁热后(32ka/m，10min)再重新种入孔板中；12h后，弃掉旧培养液，加入含mtt的培养基(vdmem:vmtt＝5:1，cmtt＝5mg/ml)，反应4h，小心吸掉上清，每孔加入400μldmso，摇晃10min，充分溶解，每个复孔取300μl转移到96孔板中，用酶标仪测每孔在490nm处的od值。结果如图11所示：在没有交变磁场的条件下(amf-)，ppefion的细胞毒性很低；相比之下，ppefion随着fe浓度增加，经交变磁场处理后(amf+)，对ct26细胞的杀伤效果逐渐增加。

实施例7ppefion&pper848细胞水平促进dc细胞成熟

ppefion&pper848细胞水平促进dc细胞成熟的试验流程图如图12所示，具体如下：断颈处死小鼠(购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司)，取其大腿骨，收集骨干中的骨髓细胞，接种于24孔板中，，每孔50万个细胞，使用dmem完全培养基进行培养(含10％灭活的fbs，1％双抗)每两天换一次液(培养基中加入20ng/ml的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和10ng/ml的il-4)，小鼠骨髓来源树突状细胞培养至第6天时可开始使用。用不同条件处理的ct26细胞(每孔10万个)，分别为(1)pbs(ct26细胞)，(2)ppefion(-)(ppefion+ct26细胞)，(3)ppefion(+)(ppefion+ct26细胞，磁热10min)，(4)ppefion(-)&pper848(ppefion+pper848+ct26细胞)，(5)ppefion(+)&pper848(ppefion+pper848+ct26细胞，磁热10min)，所用磁场强度均为28ka/m，ppefion的剂量(终浓度)是100μg/ml(铁离子浓度)，pper848的剂量(终浓度)是5μg/ml(r848浓度)，利用脂多糖lps(1μg/ml)作为阳性对照，各处理加入的物质的体积相同(200μl)。将这些处理后的肿瘤细胞放入transwell系统的上层，下层为dc细胞(每孔50万个细胞)，孵育24h。24h后，将骨髓树突状细胞(bmdcs，dc细胞)分别用流式抗体染色。染色结束后，利用12色流式细胞仪(bdfacscelesta)测试dc的成熟率。结果如图13所示：与非磁热组相比(ppefion(-))，ct26细胞经过磁热处理后(ppefion(+))，产生的肿瘤细胞残渣能够更有效的刺激dc成熟。此外，磁热处理肿瘤细胞再联合r848后(ppefion(+)&pper848)，所产生的dc刺激效果比单纯磁热处理肿瘤细胞的组(ppefion(+))更高，也比没有磁热处理肿瘤细胞但使用了r848的组(ppefion(-)&pper848)高，甚至与lps的dc刺激效果接近，这表明磁热处理肿瘤细胞后产生的细胞残渣与r848联合，可以产生强烈的dc刺激效果。与pbs组相比，单纯的磁性颗粒(ppefion(-))也轻微的提高了dc的成熟率，可能是因为ppefion作为一种外来物质，同样可能刺激到dc细胞。

实施例8ppefion&pper848动物水平促进dc细胞成熟

ppefion&pper848动物水平促进dc细胞成熟的试验流程图如图14所示，具体如下：在balb/c小鼠(6周龄，20±2g，均购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司)背部左端种植结直肠癌肿瘤，具体构建过程如下：使用胰岛素注射器在在每只小鼠右侧背部皮下注射100万个细胞，完成小鼠植瘤。每天监控肿瘤生长情况，使用游标卡尺测量并计算出肿瘤的大小，具体公式为：v＝0.5xaxb²，其中，v为肿瘤的体积，a和b分别为游标卡尺测量肿瘤的最大长度和最小宽度，待肿瘤生长至50mm³左右将小鼠随机分为四组，每组五只，对肿瘤进行治疗，分别为(1)pbs组(瘤内注射pbs)；(2)ppefion组(瘤内注射ppefion，ppefion的剂量(终浓度)是5mg/kg(铁离子浓度))；(3)ppefion(+)组(瘤内注射ppefion，ppefion的剂量(终浓度)是5mg/kg(铁离子浓度)，磁热10min)；(4)ppefion(+)&pper848组(瘤内注射磁热ppefion和pper848，磁热10min，ppefion的剂量(终浓度)是5mg/kg(铁离子浓度)，pper848的剂量(终浓度)是2mg/kg(r848浓度))，磁热仪器的参数设置为h＝28ka/m，f＝320khz；各处理注射的物质的体积相同(50μl)。三天后小鼠摘眼球取血，并摘取腹股沟淋巴结。腹股沟淋巴结细胞经过anti-cd45-bv510，anti-cd11c-pe，anti-cd80-pe/cf594，anti-cd86-apc(均购自biolegend公司)流式抗体染色，利用12色流式细胞仪(bdfacscelesta)测试淋巴结中dc的成熟率。结果如图15所示：相对于ppefion(+)组的磁热治疗，ppefion(+)&pper848组磁热联合免疫佐剂的处理，可以更加强烈的刺激腹股沟dc细胞的成熟。此外，相对于pbs组与未磁热的ppefion(-)组，ppefion(+)&pper848组的dc成熟率是前两者的两倍多；表明交变磁场触发下的ppefion&pper848能够有效的引起体内的免疫响应。

实施例9ppefion&pper848在小鼠双边肿瘤模型上的疗效研究

在小鼠(balb/c雌性小鼠(6周龄，20±2g)，购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司)背部左右两端分别种植小鼠结直肠癌肿瘤(左边视为原位肿瘤，右边视为远端肿瘤)，具体的构建方法如下：使用胰岛素注射器在在每只小鼠右侧及左侧背部皮下注射120万个细胞，完成小鼠植瘤。每天监控肿瘤生长情况，使用游标卡尺测量并计算出肿瘤的大小，具体公式为：v＝0.5xaxb²，其中。v为肿瘤的体积，a和b分别为游标卡尺测量肿瘤的最大长度和最小宽度；七天后将荷瘤小鼠随机分为五组，每组十二只，对左边原位肿瘤进行治疗，治疗过程示意图如图16所示，分别为(1)pbs组；(2)ppefion(+)&pper848(瘤内注射ppefion和pper848，磁热10min)；(3)ppefion(+)+actla4组(瘤内注射ppefion，磁热10min，腹腔注射actla4)；(4)ppefion(-)&pper848+actla4组(瘤内注射ppefion和pper848，腹腔注射actla4)；(5)ppefion(+)&pper848+actla4组(瘤内注射ppefion和pper848，腹腔注射actla4，磁热10min)。均在左侧瘤内注射，fion的剂量是按铁离子计5.0mg/kg，r848的剂量是2.0mg/kg；anti-ctla4的腹腔给药剂量为50μg/只，给药频率为第1、4、8天。将小鼠置于线圈中，磁热仪器的参数设置为磁场强度28ka/m，交变磁场频率320khz，磁热时间为10min。小鼠经过不同的治疗后，每隔两天用游标卡尺测量其左右两端肿瘤的长和宽，肿瘤的体积为(长乘以(宽的平方))除以2。实验结果如图17所示：ppefion(+)&pper848+actla4组表现出最强的抑制远端肿瘤生长的效果，可能源于磁热联合免疫佐剂激活细胞毒性t细胞后，免疫检查点阻断剂actla的使用进一步解除抑制t细胞活化的信号并维持t细胞。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。