一种肠菌胶囊及其制备方法与流程

本发明属于粪菌移植技术领域，涉及一种肠菌胶囊及其制备方法。

背景技术：

粪菌移植目前被越来越多用于治疗严重的肠道疾病，目前中国至少有50家医院已经尝试用粪菌移植治疗多种疾病，已经注册粪菌移植临床试验超过20项，累计治疗病例约80000例。随着肠道菌群研究的深入，很多非肠道疾病也开始被证明与肠道菌群有关。但改变肠道菌群的方法很多，常规的益生菌效果具有局限性，肠菌移植是肠道微生态的整体移植，其比益生菌更为有利，因为“肠菌”是人类的终极益生菌。通过“粪菌移植”(fmt)新方法重建患者肠道微生态，疗效显著，也因为这个原因粪菌移植逐渐变得炙手可热起来。

目前肠菌移植已用于以下疾病的辅助治疗：艰难梭菌感染、小肠细菌过度生长、肠易激综合征、慢性便秘、炎症性肠病、慢性疲惫综合征、肠衰竭、代谢综合征(高血压、糖尿病、脂肪肝、肥胖等)、自闭症、焦虑、抑郁、双向情感障碍、帕金森等神经系统疾病、肿瘤化疗、免疫治疗患者(可有效提高化疗和免疫治疗药物的有效性、减少化疗、免疫治疗的毒副作用)、过敏相关疾病等。

但是目前“粪菌移植”的方式多数是通过胃镜、肠镜或者留置鼻空肠营养管、tet管等方式实施，存在实施困难，患者接受度差等缺点，而同时来自于不同捐献者的粪便中肠道微生物的种类、数量、丰度等都存在较大差异，难以选择出最适合的供者及菌群，对临床治疗效果的影响较大，因此，亟需研发一种更易于患者使用且副作用更低的移植方式，并且具有标准化的称之为“肠菌移植”的新干预方式。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供了一种肠菌胶囊及其制备方法，产品可常温存储或低温长期存储，移植方式为口服，方便且不良反应率更低。

为了实现上述技术目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

为了更好地保护粪菌中的益生菌，提高细菌低温下冻干存活率，本发明对冻干保护剂进行了优化。

本发明提供了一种肠菌胶囊，包含复合冻干保护剂，所述复合冻干保护剂由以下原材料组成：低聚果糖，低聚麦芽糖，海藻糖和水苏糖。

优选地，所述复合冻干保护剂各组分的质量体积浓度为：低聚果糖1.0％，低聚麦芽糖0.8％；海藻糖5.0％，水苏糖3.0％，质量体积浓度的单位为g/100ml。

更优选地，所述复合冻干保护剂的溶剂为无菌水。

上述复合冻干保护剂可在冻干和保存时维持粪便菌群的稳定性。低聚果糖和低聚麦芽糖属益生元类，可增加菌种活性，促进菌群在肠道内定植，改善人体肠道内环境；海藻糖能够使冻干菌在常温下长期保持活性，大幅度延长活菌制剂的保质期；水苏糖是一种天然纯在的四糖，可以显著促进双歧杆菌增殖，抑制产气产酸梭状芽孢杆菌等腐败菌的生产，另外产生大量生理活性物质，调节肠道ph值、灭杀致病菌，阻遏腐败产物生成，抑制内源致癌物的产生和吸收，并且分解衍生出多重免疫功能因子。本发明的特殊复合冻干保护剂使得肠菌中的6种主要菌群“双歧杆菌”、“乳酸菌”、“拟杆菌”、“肠球菌”、“肠杆菌”、“小梭菌”的冻干存活率均超过90.00％。

优选地，所述胶囊采用肠溶胶囊。

更优选地，所述胶囊选用drcap耐酸型hpmc3号胶囊。所述drcap耐酸型hpmc胶囊能够很好地保护内容物到达肠道释放，3号胶囊较小，易于小孩及老年人服用。

本发明还提供了上述肠菌胶囊的制备方法，包括：

(1)将肠菌液加入复合冻干保护剂后，冷冻干燥，得肠菌冻干粉；

(2)将步骤(1)所得肠菌冻干粉装入胶囊中，得肠菌胶囊。

优选地，步骤(1)中，所述肠菌液采用以下方法制备：

1-1)选用多名健康供者标本进行混合，加入无菌水，于厌氧环境下进行初步均质处理，得到粪便浆体；

1-2)将步骤1-1)中所得粪便浆体进行逐级过滤去除食物残渣和其他小颗粒物质；

1-3)将步骤1-2)所得粪便浆体用无菌水多次重悬再离心，去上清，得到纯净的菌体。

优选地，步骤(1)还包括：将步骤1-3)所得菌体再悬浮于复合冻干保护剂中，分散重悬。重悬后，用50ml无菌管分装密封，成品肠菌液，于-80℃存储，解冻后可直接用于某些特殊病人经过上、中、下消化道进行移植。

为了进一步保护粪菌中的益生菌，本发明还对冻干方法进行了考察和优化。

优选地，步骤(1)中，所述冷冻干燥包括：

a.预冻：-80℃冰箱中预冻至少24h；

b.真空干燥：以真空度5pa，温度-65℃，真空干燥至少48h去除水分。

优选地，步骤1-1)中，取来自2～5名经筛查合格的健康供体1h～2h内新鲜粪便样本。作用是增加菌群多样性及丰度互补。

优选地，步骤1-1)中，100～200g粪便样本加入250～500ml无菌水进行初步均质处理。

优选地，步骤1-2)中，采用不锈钢滤网在氮气通风厨中逐级过滤，逐级过滤是指依次经过10目、18目、35目和100目的滤网，作用是去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质。

本品来源于经过严格筛查的健康供体的肠道菌群，相对于市场上单一的益生菌产品，本产品涵盖了一个健康人体肠道内应有的绝大部分菌群，产品可常温存储或低温长期存储，移植方式为口服，方便且不良反应率更低；添加成分是低聚果糖，低聚麦芽糖，海藻糖，水苏糖，属益生元类，都是纯天然无毒害的，利于菌群的冷冻保护和肠道定植，也不会对人体产生任何的副作用，且使用效果显著。

本发明的有益效果为：

1、菌群多样性及其丰度较为集中；

2、可常温短期存储或低温长久保存；

3、毒素及代谢产物等显著降低，副作用降低；

4、便于菌群移植的实施，不需要侵入性的实施方式：如胃镜、肠镜、鼻空肠营养管等；

5、增强菌群活性，利于肠道内定植。

附图说明

图1为本发明采用的健康供体调查表。

图2为本发明采用的供体筛查指标表格。

图3显示本发明方法1和方法2主要属水平上的分析结果。

图4显示本发明方法2和方法3宏基因组分析病毒数量及种类变化。

图5显示本发明代谢组学分析上清液中相关炎症因子(ltb4、cort、pgg2、5-hiaa)变化。

图6显示本发明方法3、方法4、方法5、方法6和方法7典型患者移植前后肠道菌群属水平上变化，control为供体。

图7显示本发明各量表记录结果。

图8显示本发明治疗期间phq-9评分结果变化。

图9显示本发明治疗期间hamd-24评分结果变化。

图10显示本发明治疗期间sds评分结果变化。

图11显示本发明典型患者移植前后肠道菌群属水平上变化。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例

以下方法均基于图1和图2提供的表格筛查合格的健康供体(必须满足相关要求才能提供样品)，获取来自健康供体1-2h内新鲜粪便样本。

方法1：将来自1个健康供体的约150g新鲜粪便样本置于搅拌器中，加入500ml无菌水溶液氮气通风厨中进行均质加工；将粪便浆体依次经过10目、18目、35目和100目的滤网逐级过滤，去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质。液体经3000r/min离心15min，弃上清，加入200ml无菌水，搅拌重悬再离心重复1次，得到菌体。并将菌体再悬浮于100ml无菌水中，分散重悬。-80℃预冷冻24h，以真空度5pa，温度-65℃，真空干燥48h。选用drcap耐酸型hpmc3号胶囊装填胶囊，约0.1g装于胶囊。

方法2：将来自5个健康供体的约150g(各取30g)新鲜粪便样本置于搅拌器中，加入500ml无菌水溶液氮气通风厨中进行均质加工；将粪便浆体依次经过10目、18目、35目和100目的滤网逐级过滤，去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质。液体经3000r/min离心15min，弃上清，加入200ml无菌水，搅拌重悬再离心重复3次，得到菌体。并将菌体再悬浮于100ml无菌水中，分散重悬。-80℃预冷冻24h，以真空度5pa，温度-65℃，真空干燥48h。选用drcap耐酸型hpmc3号胶囊装填胶囊，约0.1g装于胶囊。

方法3：将来自5个健康供体的约150g新鲜粪便样本置于搅拌器中，加入500ml无菌水溶液氮气通风厨中进行均质加工；将粪便浆体依次经过10目、18目、35目和100目的滤网逐级过滤，去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质。液体经3000r/min离心15min，弃上清，加入200ml无菌水，搅拌重悬再离心重复3次，得到菌体。并将菌体再悬浮于100ml无菌水中，分散重悬。-80℃预冷冻24h，以真空度5pa，温度-65℃，真空干燥48h。选用drcap耐酸型hpmc3号胶囊装填胶囊，约0.1g装于胶囊。

方法4：将来自5个健康供体的约150g新鲜粪便样本置于搅拌器中，加入500ml无菌水溶液氮气通风厨中进行均质加工；将粪便浆体依次经过10目、18目、35目和100目的滤网逐级过滤，去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质。液体经3000r/min离心15min，弃上清，加入200ml无菌水，搅拌重悬再离心重复3次，得到菌体。并将菌体再悬浮于100ml含10％甘油的无菌水中，分散重悬。-80℃预冷冻24h，以真空度5pa，温度-65℃，真空干燥48h。选用drcap耐酸型hpmc3号胶囊装填胶囊，约0.1g装于胶囊。

方法5：将来自5个健康供体的约150g新鲜粪便样本置于搅拌器中，加入500ml无菌水溶液氮气通风厨中进行均质加工；将粪便浆体依次经过10目、18目、35目和100目的滤网逐级过滤，去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质。液体经3000r/min离心15min，弃上清，加入200ml无菌水，搅拌重悬再离心重复3次，得到菌体。并将菌体再悬浮于100ml含复合冻干剂(低聚果糖0.8％，低聚麦芽糖1.2％；海藻糖4％，水苏糖2.0％)无菌水中，分散重悬。-80℃预冷冻24h，以真空度5pa，温度-65℃，真空干燥48h。选用drcap耐酸型hpmc3号胶囊装填胶囊，约0.1g装于胶囊。

方法6：将来自5个健康供体的约150g新鲜粪便样本置于搅拌器中，加入500ml无菌水溶液氮气通风厨中进行均质加工；将粪便浆体依次经过10目、18目、35目和100目的滤网逐级过滤，去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质。液体经3000r/min离心15min，弃上清，加入200ml无菌水，搅拌重悬再离心重复3次，得到菌体。并将菌体再悬浮于100ml含复合冻干剂(低聚果糖1.0％，低聚麦芽糖1.0％；海藻糖6％，水苏糖2.5％)无菌水中，分散重悬。-80℃预冷冻24h，以真空度5pa，温度-65℃，真空干燥48h。选用drcap耐酸型hpmc3号胶囊装填胶囊，约0.1g装于胶囊。

方法7：将来自5个健康供体的约150g新鲜粪便样本置于搅拌器中，加入500ml无菌水溶液氮气通风厨中进行均质加工；将粪便浆体依次经过10目、18目、35目和100目的滤网逐级过滤，去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质。液体经3000r/min离心15min，弃上清，加入200ml无菌水，搅拌重悬再离心重复3次，得到菌体。并将菌体再悬浮于100ml含复合冻干剂(低聚果糖1％，低聚麦芽糖0.8％；海藻糖5％，水苏糖3％)无菌水中，分散重悬。-80℃预冷冻24h，以真空度5pa，温度-65℃，真空干燥48h。选用drcap耐酸型hpmc3号胶囊装填胶囊，约0.1g装于胶囊。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

测试例

一、多样性及丰度测定：

方法1和方法2对比，向冻干粉中加入无菌水，补足至原体积，采用16srdna技术分析，主要属水平上的分析结果如图3所示，可以看出，方法2中5个供体所得样品菌群丰度明显好于方法1中1个供体所得样品菌群丰度。

二、毒素及代谢产物的测定：

方法2和方法3对比，向冻干粉中加入无菌水，补足至原体积，离心取上清液，代谢组学分析(lc-ms/ms)上清液中相关炎症因子(ltb4、cort、pgg2、5-hiaa)变化，结果如图5所示，可见经过方法3所得的样品的代谢产物明显低于方法2，可明显减少副作用；宏基因组分析病毒数量及种类变化(top7)，结果如图4所示，可见经过方法3所得的样品的部分病毒含量明显低于方法2，可明显减少副作用。

三、菌群存活率检测：

方法3、方法4、方法5、方法6、方法7对比，样品处理前活菌数检测：将待测样品梯度稀释，采用倾注平板计数法检测活菌数。样品处理后活菌数检测：向冻干粉中加入无菌水，补足至原体积，活菌检测方法同上。

检测处理前后的活菌数，按下列公式计算存活率：

存活率＝冻干后无菌水溶液补足至前体积的活菌数/处理前活菌数。

表1.方法3-7的菌群存活率检测结果

结果如表1所示，可见不同方法得到的菌群存活率对比，方法7各种主要菌种存活率最高。

四、多样性及丰度对比：

方法3、方法4、方法5、方法6、方法7对比，处理前采集少许原始样本，其余样本再分别按方法3、方法4、方法5、方法6和方法7获得冻干粉后，向冻干粉中加入无菌水补足至原体积后再次取样，作处理前后对比，采用16srdna技术分析。结果如图6所示，可见经过方法7样品治疗的患者菌群结构及丰度明显更趋向于供体。

由此可见，采用方法7制备的肠菌胶囊能够更好地保护粪菌中的各种有益菌。

本发明采用drcap耐酸型hpmc胶囊来封装肠菌冻干粉，该胶囊具有耐酸特性。采用所述胶囊能够防止其在胃内崩解，有助于安全地将肠菌冻干粉运送至肠部位。该胶囊在不同时间，在胃肠内崩解的情况为：在0min时，胶囊刚刚进入胃内；在胃内逗留50分钟后，开始准备释放内容物；在105分钟时，胶囊离开胃里面进入到小肠部位，开始释放内容物。本发明实施例中采用的是3号小胶囊，易于小孩及老人吞服，其真正崩解的位置大概是在回肠末端，有效地避免了胃酸对肠菌冻干粉中各种有益菌群的破坏。

综上所述，本发明的肠菌胶囊具有较为完整的肠道菌群，在肠道菌群相关性疾病上具有很好的应用前景。

临床应用例

选择12名抑郁症患者开展肠菌胶囊治疗，年龄为20-60岁。分别于每天早餐30min后服用方法7制备的肠菌胶囊，连续于第1、2、3、4周给予治疗，每周一次性给予16粒。收集患者各个随访点的血液及大便样本，血液用于神经递质的检测，大便用于菌群分析。于各随访点记录填写健康问卷抑郁量表phq-9、汉密尔顿抑郁量表hamd-24、抑郁自评量表(sds)，如图7所示，涉及本发明治疗期间标本采集及各量表采集记录时间点安排。

1、每日大便情况及布里斯托尔大便量表评价结果如表2所示，可见，经过治疗后，大便情况改善。

表2.布里斯托尔大便量表评价结果

2、健康问卷抑郁量表phq-9评分结果，见图8，显示肠菌胶囊治疗后患者评分结果显著下降，治疗效果明显。

3、汉密尔顿抑郁量表hamd-24评分结果，见图9，显示在肠菌胶囊治疗后第二周开始患者评分结果显著下降，治疗效果明显。

4、抑郁自评量表(sds)评分结果，见图10，同样显示在经过肠菌胶囊治疗后患者评分结果显著下降，治疗效果明显。

5、移植前后患者血清神经递质检测结果(pg/ml，)如表3所示，可见，血清中3种神经递质治疗后比治疗前显著增加，有助于改善抑郁症患者的临床症状。

表3.移植前后患者血清神经递质检测结果

注：与治疗前比较，^αp＜0.05

6、典型患者移植前后肠道菌群属水平上变化，如图11所示，显示本发明治疗期间各时间点菌群检测结果显示随时间增进患者菌群多样性逐渐增加并趋向于供者。

由以上测试结果可知，实施例组患者各项指标改善，说明在本发明制备的肠菌胶囊在对抑郁症治疗上，可有效的改善症状，增加肠道菌群丰度，具有较好的效果。