用于预防和治疗纤维化和炎性病症的组合物和方法与流程

1.本发明整体涉及人类医学和兽医学领域。具体而言，本发明涉及通过将化合物施用于有需要的动物来预防和/或治疗纤维化或炎性病症。


背景技术：

2.纤维化是可能由对组织损伤的伤口愈合反应引起的病理结果。在一些情况下，纤维化是由未知机制引起的，并且在这种情况下通常被称为特发性纤维化。一个突出的实例是特发性肺纤维化(ipf)。当然，特发性纤维化仍有可能由未检测到的组织损伤和随后的伤口愈合反应引起。
3.已知伤口愈合包括损伤、炎症和修复的连续阶段。虽然伤口愈合对于维持身体的完整性和正常功能显然是必要的，但是纤维化疤痕组织的形成可导致严重的健康后果。就ipf而言，经常会看到肺功能急剧下降，这在很多情况下会导致患者死亡。
4.引发伤口愈合的伤害可以由身体创伤、自身免疫反应、感染(细菌、病毒或其他感染)和暴露于外来物质中的一者或多者引起。在受损组织包含内皮细胞的情况下，炎症介质被释放，继而调节凝血途径，导致形成纤维蛋白凝块以防止失血。在ipf中，注意到肺组织含有升高水平的血小板分化因子和x-box结合蛋白，这表明凝血途径不断被活化。
5.此外，在ipf患者和其他肺纤维化病症患者的肺中检测到凝血酶。凝血酶是导致纤维蛋白凝块形成的凝血途径的参与者，并且还引起成纤维细胞的增殖以及分化为肌成纤维细胞。
6.肺上皮细胞的损伤可以导致类似的纤维蛋白形成的引发，还会导致间质水肿、局部急性炎症以及上皮细胞与基底膜的分离。
7.基质金属蛋白酶(mmp)调节炎症细胞进出损伤区域的通道，mmp抑制剂调节该过程。mmp及其抑制剂之间的平衡调节炎症并且决定愈合反应期间沉积的胶原蛋白的净量。
8.炎症阶段开始于趋化因子吸引淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞。据认为，在炎症反应晚期募集的吞噬性巨噬细胞可以有助于清除成纤维细胞，从而促进正常愈合并且避免病理性纤维化。
9.在伤口愈合的修复阶段，形成富含纤维蛋白的支架，随后伤口发生收缩、闭合和再上皮化。所谓的肉芽组织是由纤维蛋白支架与纤连蛋白、平滑肌肌动蛋白和胶原蛋白的结合形成的。从ipf患者获得的成纤维细胞和肺泡巨噬细胞显示出平滑肌肌动蛋白和纤连蛋白水平升高，这表明成纤维细胞活化水平异常地高。
10.炎症细胞(尤其是肌成纤维细胞)的剔除对于阻止胶原蛋白沉积是重要的。在ipf患者中，成纤维细胞的剔除可以延迟，这可能是由于对细胞凋亡信号的抵抗。有人已经提出，对细胞凋亡的抵抗是纤维化疾病的潜在机制，然而，一些研究表明在ipf中分泌胶原蛋白的成纤维细胞和上皮细胞的凋亡率升高，这表明还涉及其他因素。
11.从广义上讲，纤维化是体内结缔组织过量的发展，是由正常或异常伤口愈合反应形成的。最终结果是形成疤痕组织，这可以是对健康有利的(例如伤口闭合)或有害的(诸如
在ipf或其他纤维化相关病症(包括囊性纤维化、心肌纤维化、佩罗尼氏(peyronie)病和硬皮病)中)。
12.现有技术提供了多种纤维化病症的治疗方法，然而，每种方法都存在一个或多个缺点。例如，肺移植是ipf患者的一个选项，然而供体器官的短缺和免疫抑制的需要对该治疗模式造成了重大限制。药物化合物诸如尼特丹尼(nintendanib)(ofev
tm
,boehringer ingelheim)可以通过改善呼吸参数来改善生活质量，但是不能改善存活期。又如，据发现，吡非尼酮(perfenidone)(esbriet
tm
,genetech)可以改善无进展存活期，然而，该药物会在皮肤、胃肠道、肝脏和神经系统中引起一系列副作用。
13.在此sars-cov-2大流行之际，寻找用于治疗肺纤维化的改善的或替代手段已变得尤为紧迫。如上文所述，感染可以引发损伤，进而导致受影响的组织或器官的纤维化发展。一项研究报道，17％的covid-19患者的胸部ct扫描显示出纤维条影，并且该研究提出，纤维病变是在肺部慢性炎症或增殖性疾病的痊愈过程中形成的，并且伴随着受感染的肺部组织的细胞组分被疤痕组织逐渐替代。因此，虽然可以开发出有效的治疗方法来清除肺部的sars-cov-2感染，但是肺纤维化形式的慢性健康问题可以仍然存在。
14.虽然炎症可以是纤维化的组成部分，但是它是本身可以导致一系列病症的过程，所述病症包括肺部炎症、皮肤炎症、胃肠道炎症、自身免疫性疾病、泌尿系统疾病、结节病、移植排斥、血管炎、动脉粥样硬化、盆腔炎性疾病、风湿热和耳炎。现有技术教导了各种药物物质(诸如皮质类固醇、地塞米松和生物制剂(诸如抗体疗法))的使用，然而，每种药物物质均存在不期望的副作用。
15.本发明的一个方面提供了对用于预防和治疗纤维化相关和炎症相关病症，尤其是累及肺组织的那些病症的组合物和方法的改善。本发明的另一个方面提供了用于预防和治疗纤维化相关和炎症相关病症，尤其是累及肺组织的那些病症的现有技术方法和组合物的有用的替代方案。
16.对包括在本说明书中的文档、法案、材料、装置、文章等等的讨论仅仅是出于为本发明提供背景的目的。并不表明或表示任何或全部这些事项构成现有技术基础的一部分，或是与本发明相关的领域中的普通常识，因为它在本专利申请的每项权利要求的优先权日之前存在。


技术实现要素：

17.在第一方面，但不一定是最广泛的方面，本发明提供了一种用于治疗和/或预防纤维化或炎性病症的方法，所述方法包括将有效量的类黄酮施用于有需要的动物。
18.在第一方面的一个实施方案中，所述纤维化病症至少部分由伤口愈合反应引起。
19.在第一方面的一个实施方案中，所述伤口愈合反应发生在包含上皮细胞和/或内皮细胞的组织中。
20.在第一方面的一个实施方案中，所述纤维化病症选自由以下各项组成的组：肺纤维化(包括特发性肺纤维化、感染诱发的肺纤维化、放射诱发的肺纤维化、进行性大块纤维化、囊性纤维化)、胰纤维化(包括囊性纤维化)、腹膜后纤维化、动脉纤维化(包括动脉僵硬)、肠纤维化(包括克罗恩(crohn)病)、关节纤维化(包括膝、肩和其他关节的关节纤维化、粘连性囊炎)、手/指纤维化(包括杜普伊特伦氏(dupuytren)挛缩)、真皮纤维化(包括瘢痕
瘤、肾源性系统性纤维化、硬皮病)、阴茎纤维化(包括佩罗尼氏病)、淋巴结纤维化(包括纵隔纤维化)和心肌纤维化(包括间质纤维化和替代性纤维化)。
21.在第一方面的一个实施方案中，所述纤维化病症是肺纤维化，并且所述炎性病症是肺部炎症。
22.在第一方面的一个实施方案中，所述类黄酮是黄烷酮。
23.在第一方面的一个实施方案中，所述黄烷酮具有根据式1的化学结构：
[0024][0025]
其中r2'、r3、r3'、r4'、r5、r6、r7各自独立地是：
[0026]
h、
[0027]
oh、
[0028]
o-、
[0029]
o-ch3、
[0030]
葡糖苷(包括鼠李糖苷基葡糖苷)或
[0031]
任何其他有机官能团。
[0032]
在第一方面的一个实施方案中，r2'、r3、r3'、r4'、r5、r6、r7如下所示：
[0033]
[0034][0035]
a；gl＝葡糖苷。
[0036]
b；rh-gl＝鼠李糖苷基葡糖苷。
[0037]
在第一方面的一个实施方案中，所述黄烷酮是二羟基黄烷酮和/或(2s)-黄烷-4-酮或其功能性衍生物。
[0038]
在第一方面的一个实施方案中，所述黄烷酮是(2s)-5,7-二羟基-2-苯基-2,3-二氢色烯-4-酮或其功能性衍生物。
[0039]
在第一方面的一个实施方案中，所述类黄酮是在植物细胞中天然合成的类型，但不一定是从植物细胞获得以用于所述方法。
[0040]
在第一方面的一个实施方案中，所述类黄酮在绵羊肺病模型中的使用引起肺功能、中性粒细胞和/或炎症细胞在肺灌洗液中的存在、组织学评估的炎症和/或纤维化中的任何一者或多者的改善。
[0041]
在第一方面的一个实施方案中，绵羊肺病模型依赖于博来霉素诱发的肺损伤。
[0042]
在第一方面的一个实施方案中，所述类黄酮被直接递送至具有纤维化、潜在地具有纤维化或者预测将来具有纤维化的组织。
[0043]
在第一方面的一个实施方案中，所述类黄酮被直接递送至所述肺。
[0044]
在第一方面的一个实施方案中，所述类黄酮被配制为可吸入粉末或可通过雾化器递送的溶液或者可通过支气管镜的活检端口递送的溶液。
[0045]
在第二个方面，本发明提供了类黄酮用于预防或治疗纤维化或炎性病症的用途。
[0046]
在第二方面的一个实施方案中，所述纤维化病症和/或所述炎性病症至少部分由伤口愈合反应或向包括过敏原的环境因素的暴露引起。
[0047]
在第二方面的一个实施方案中，所述伤口愈合反应或所述向环境因素的暴露发生在包含上皮细胞和/或内皮细胞的组织中。
[0048]
在第二方面的一个实施方案中，所述纤维化病症选自由以下各项组成的组：肺纤维化(包括特发性肺纤维化、感染诱发的肺纤维化、放射诱发的肺纤维化、进行性大块纤维化、囊性纤维化)、胰纤维化(包括囊性纤维化)、腹膜后纤维化、动脉纤维化(包括动脉僵硬)、肠纤维化(包括克罗恩病)、关节纤维化(包括膝、肩和其他关节的关节纤维化、粘连性囊炎)、手/指纤维化(包括杜普伊特伦氏挛缩)、真皮纤维化(包括瘢痕瘤、肾源性系统性纤
维化、硬皮病)、阴茎纤维化(包括佩罗尼氏病)、淋巴结纤维化(包括纵隔纤维化)和心肌纤维化(包括间质纤维化和替代性纤维化)，并且所述炎性病症选自由以下各项组成的组：肺部炎症(包括copd、哮喘、鼻炎、支气管炎)、真皮炎症(包括痤疮和硬皮病)、胃肠道炎症(包括乳糜泻、克罗恩病、结肠炎、憩室炎)、自身免疫性疾病(诸如sle)、泌尿系统疾病(包括肾小球肾炎、膀胱炎、前列腺炎)、结节病、移植排斥、血管炎、动脉粥样硬化、盆腔炎性疾病、风湿热和耳炎。
[0049]
在第二方面的一个实施方案中，所述纤维化病症是肺纤维化，并且所述炎性病症是肺部炎症。
[0050]
在第二方面的一个实施方案中，所述类黄酮是黄烷酮。
[0051]
在第二方面的一个实施方案中，所述黄烷酮具有根据式1的化学结构：
[0052][0053]
其中r2'、r3、r3'、r4'、r5、r6、r7各自独立地是：
[0054]
h、
[0055]
oh、
[0056]
o-、
[0057]
o-ch3、
[0058]
葡糖苷(包括鼠李糖苷基葡糖苷)或
[0059]
任何其他有机官能团。
[0060]
在第二方面的一个实施方案中，r2'、r3、r3'、r4'、r5、r6、r7如下所示：
[0061]
[0062][0063]
在第二方面的一个实施方案中，所述黄烷酮是二羟基黄烷酮和/或(2s)-黄烷-4-酮或其功能性衍生物。
[0064]
在第二方面的一个实施方案中，所述黄烷酮是(2s)-5,7-二羟基-2-苯基-2,3-二氢色烯-4-酮或其功能性衍生物。
[0065]
在第二方面的一个实施方案中，所述类黄酮是在植物细胞中天然合成的类型，但不一定是从植物细胞获得以用于所述方法。在一个实施方案中，所述类黄酮是外消旋形式，在这种情况下它可以从发酵过程中获得。
[0066]
在第二方面的一个实施方案中，所述类黄酮在绵羊肺病模型中的使用引起肺功能、中性粒细胞和/或炎症细胞在肺灌洗液中的存在、组织学评估的炎症和/或纤维化中的任何一者或多者的改善。
[0067]
在第二方面的一个实施方案中，所述绵羊肺病模型依赖于博来霉素诱发的肺损伤。
[0068]
在第二方面的一个实施方案中，所述类黄酮被直接递送至具有纤维化、潜在地具有纤维化或者预测将来具有纤维化的组织。
[0069]
在第二方面的一个实施方案中，所述类黄酮被直接递送至所述肺和/或气道。
[0070]
在第二方面的一个实施方案中，所述类黄酮被配制为可吸入粉末或可通过雾化器递送的溶液或者可通过支气管镜的活检端口递送的溶液。
[0071]
在第三方面，本发明提供了类黄酮用于制备用于治疗纤维化或炎性病症的药物的用途。
[0072]
在第三方面的一个实施方案中，所述纤维化病症至少部分由伤口愈合反应引起。
[0073]
在第三方面的一个实施方案中，所述伤口愈合反应发生在包含上皮细胞和/或内皮细胞的组织中。
[0074]
在第三方面的一个实施方案中，所述纤维化病症选自由以下各项组成的组：肺纤维化(包括特发性肺纤维化、感染诱发的肺纤维化、放射诱发的肺纤维化、进行性大块纤维化、囊性纤维化)、胰纤维化(包括囊性纤维化)、腹膜后纤维化、动脉纤维化(包括动脉僵硬)、肠纤维化(包括克罗恩病)、关节纤维化(包括膝、肩和其他关节的关节纤维化、粘连性囊炎)、手/指纤维化(包括杜普伊特伦氏挛缩)、真皮纤维化(包括瘢痕瘤、肾源性系统性纤维化、硬皮病)、阴茎纤维化(包括佩罗尼氏病)、淋巴结纤维化(包括纵隔纤维化)和心肌纤维化(包括间质纤维化和替代性纤维化)，并且所述炎性病症选自由以下各项组成的组：肺
部炎症(包括copd、哮喘、鼻炎、支气管炎)、真皮炎症(包括痤疮和硬皮病)、胃肠道炎症(包括乳糜泻、克罗恩病、结肠炎、憩室炎)、自身免疫性疾病(诸如sle)、泌尿系统疾病(包括肾小球肾炎、膀胱炎、前列腺炎)、结节病、移植排斥、血管炎、动脉粥样硬化、盆腔炎性疾病、风湿热和耳炎。
[0075]
在第三方面的一个实施方案中，所述纤维化病症是肺纤维化，并且所述炎性病症是肺部炎症。
[0076]
在第三方面的一个实施方案中，所述类黄酮是黄烷酮。
[0077]
在第三方面的一个实施方案中，所述黄烷酮具有根据式1的化学结构：
[0078][0079]
其中r2'、r3、r3'、r4'、r5、r6、r7各自独立地是：
[0080]
h、
[0081]
oh、
[0082]
o-、
[0083]
o-ch3、
[0084]
葡糖苷(包括鼠李糖苷基葡糖苷)或
[0085]
任何其他有机官能团。
[0086]
在第三方面的一个实施方案中，r2'、r3、r3'、r4'、r5、r6、r7如下所示：
[0087]
[0088][0089]
在第三方面的一个实施方案中，所述黄烷酮是二羟基黄烷酮和/或(2s)-黄烷-4-酮或其功能性衍生物。
[0090]
在第三方面的一个实施方案中，所述黄烷酮是(2s)-5,7-二羟基-2-苯基-2,3-二氢色烯-4-酮或其功能性衍生物。
[0091]
在第三方面的一个实施方案中，所述类黄酮是在植物细胞中天然合成的类型，但不一定是从植物细胞获得以用于所述方法。
[0092]
在第三方面的一个实施方案中，所述类黄酮在绵羊肺病模型中的使用引起肺功能、中性粒细胞和/或炎症细胞在肺灌洗液中的存在、组织学评估的炎症和/或纤维化中的任何一者或多者的改善。
[0093]
在第三方面的一个实施方案中，所述绵羊肺病模型依赖于博来霉素诱发的肺损伤。
[0094]
在第三方面的一个实施方案中，所述类黄酮被直接递送至具有纤维化和/或炎症、潜在地具有纤维化和/或炎症或者预测将来具有纤维化和/或炎症的组织。
[0095]
在第三方面的一个实施方案中，所述类黄酮被直接递送至所述肺和/或气道。
[0096]
在第三方面的一个实施方案中，所述类黄酮被配制为可吸入粉末或可通过雾化器递送的溶液或者可通过支气管镜的活检端口递送的溶液。
[0097]
在第四方面，本发明提供了一种包含类黄酮的药物组合物，所述组合物被配制为适用于递送至动物的肺和/或气道。
[0098]
在第四方面的一个实施方案中，所述药物组合物被配制为适用于通过动物的气道直接递送至所述动物的肺和/或气道。
[0099]
在第四方面的一个实施方案中，所述药物组合物被配制为可吸入粉末或可通过雾化器递送的溶液或者可通过支气管镜的活检端口递送的溶液。
[0100]
在第四方面的一个实施方案中，所述类黄酮是黄烷酮。
[0101]
在第四方面的一个实施方案中，所述黄烷酮具有根据式1的化学结构：
[0102][0103]
其中r2'、r3、r3'、r4'、r5、r6、r7各自独立地是：
[0104]
h、
[0105]
oh、
[0106]
o-、
[0107]
o-ch3、
[0108]
葡糖苷(包括鼠李糖苷基葡糖苷)或
[0109]
任何其他有机官能团。
[0110]
在第四方面的一个实施方案中，r2'、r3、r3'、r4'、r5、r6、r7如下所示：
[0111][0112]
在第四方面的一个实施方案中，所述黄烷酮是二羟基黄烷酮和/或(2s)-黄烷-4-酮或其功能性衍生物。
[0113]
在第四方面的一个实施方案中，所述黄烷酮是(2s)-5,7-二羟基-2-苯基-2,3-二氢色烯-4-酮或其功能性衍生物。
[0114]
在第四方面的一个实施方案中，所述类黄酮是在植物细胞中天然合成的类型，但不一定是从植物细胞获得以用于所述方法。
[0115]
在第四方面的一个实施方案中，所述类黄酮在绵羊肺病模型中的使用引起肺功能、中性粒细胞和/或炎症细胞在肺灌洗液中的存在、组织学评估的炎症和/或纤维化中的任何一者或多者的改善。
[0116]
在第四方面的一个实施方案中，所述绵羊肺病模型依赖于博来霉素诱发的肺损伤。
附图说明
[0117]
图1以图表方式显示了在实施例1和2的绵羊研究中(i)博来霉素(引发损伤和纤维化)和(ii)生松素(生物活性测试化合物)施用的时间排程。还显示了组织采样的时间排程和肺功能测试的性能。
[0118]
图2是绵羊肺的照片，它显示了在实施例1和2详细描述的研究中所处理的器官的三个分段。右内侧段(在下图中称为“rm sal”)仅用盐水处理，代表健康的对照肺段。右尾段(在下图中称为“rc blm”)用博来霉素和媒介物处理，代表受损伤的肺段。左尾段(在下图中称为“lc blm+pin”)用博来霉素和生物活性测试化合物生松素处理，代表受损伤但经处理的肺段。
[0119]
图3是显示在实施例1中描述的研究的三只绵羊受试者的体重的图。
[0120]
图4a是显示在绵羊已经接受4个每周剂量的生松素后第11周每只绵羊的三个肺段中的每个的肺功能的图。
[0121]
图4b显示了与图4a相同的数据，但是对三只绵羊的肺功能结果取平均值并显示误差棒。
[0122]
图5是显示在实施例1中描述的研究中在绵羊已经接受4个每周剂量的生松素后第11周的肺功能的图，其中数据以三个肺段中的每个相对于基线的变化表示。图中显示了对数据进行的非配对和配对样品t检验的结果。
[0123]
图6a是显示在实施例1中描述的研究中在绵羊已经接受4个每周剂量的生松素后第12周的肺灌洗液中的中性粒细胞(炎症细胞)的图，其中数据以三个肺段中的每个的全部三只绵羊的平均值表示。图中显示了对数据进行的配对样品t检验的结果。
[0124]
图6b是显示在实施例1中描述的研究中在绵羊已经接受4个每周剂量的生松素后第12周的肺灌洗液中的炎症细胞的总和的图，其中数据以三个肺段中的每个的全部三只绵羊的平均值表示。图中显示了对数据进行的配对样品t检验的结果。
[0125]
图7a是显示与图6a相同的数据的图，只是分别显示了三只绵羊中的每只绵羊的数据。
[0126]
图7b是显示与图6b相同的数据的图，只是分别显示了三只绵羊中的每只绵羊的数据。
[0127]
图8a是显示在处死时(第12周)三个肺段中的每个的组织学测试中的炎症分数的图。图中提供了三只绵羊的分数的平均值和误差棒。
[0128]
图8b是显示在处死时(第12周)三个肺段中的每个的组织学测试中的纤维化分数的图。图中提供了三只绵羊的分数的平均值和误差棒。图中显示了对数据进行的配对样品t检验的结果。
[0129]
图8c是显示在处死时(第12周)三个肺段中的每个的根据图8a和图8b中提供的数据确定的总体病理分数的图。图中提供了三只绵羊的分数的平均值和误差棒。图中显示了对数据进行的配对样品t检验的结果。
[0130]
图9a是显示与图8a相同的数据的图，只是分别显示了三只绵羊中的每只绵羊的数据。
[0131]
图9b是显示与图8b相同的数据的图，只是分别显示了三只绵羊中的每只绵羊的数据。
[0132]
图9c是显示与图8c相同的数据的图，只是分别显示了三只绵羊中的每只绵羊的数据。
[0133]
图10a是显示在第11+12周评估的总体疾病分数、根据肺功能计算的分数、病理学分数和bal细胞的图。分数已经被归一化，以使得rc blm(博来霉素输注、媒介物处理)肺段的最大疾病分数＝100。分数显示为三只绵羊的平均值，并且显示了配对样品t检验的结果。
[0134]
图10b是显示与图10a相同的数据的图，只是分别显示了三只绵羊中的每只绵羊的数据。
[0135]
图11是显示在实施例2中详细描述的整个试验期间在指定时间测量的每只绵羊的体重的图。
[0136]
图12显示了如在实施例2中详细描述的研究的第11周评估的以不同方式处理的肺段的肺功能测量的一系列图。以不同方式处理的肺段为：右内侧(rm)肺段未经处理用作健康肺对照(对照)，右尾(rc)和左尾(lc)肺段输注博来霉素但不用药物治疗(blm)，或者输注博来霉素并接受4个每周剂量的ga172(blm+ga172)。ga172是本研究中所用的生松素的代码。a部分显示了cseg(n＝10)的平均值数据，这是衡量肺段膨胀难易程度的指标。b部分显示了单只绵羊的数据。c部分显示了第11周cseg相对于研究开始时第0周采集的基线值的百分比变化。显著性使用配对t检验来确定，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，n＝10只绵羊。
[0137]
图13显示了从第12周以不同方式处理的肺段的支气管肺泡灌洗(bal)液回收的中性粒细胞和炎症细胞参数测量的一系列图。以不同方式处理的肺段为：右内侧(rm)肺段未经处理用作健康肺对照(对照)，右尾(rc)和左尾(lc)肺段输注博来霉素但不用药物治疗(blm)，或者输注博来霉素并接受4个每周剂量的ga172(blm+ga172)。左图显示了中性粒细胞的数据，右图显示了炎症细胞的数据，这些数据包括中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的百分比的总和。上图显示了十只绵羊的平均值数据。下图显示了单只绵羊的数据。显著性使用配对t检验来确定，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，n＝10只绵羊。ga172是本研究中所用的生松素的代码。
[0138]
图14显示了汇总在第12周时从以不同方式处理的肺段采集的肺实质中的免疫染色的cd8+和cd4+ t细胞的数据的一系列图。以不同方式处理的肺段为：右内侧(rm)肺段未经处理用作健康肺对照(对照)，右尾(rc)和左尾(lc)肺段输注博来霉素但不用药物治疗(blm)，或者输注博来霉素并接受4个每周剂量的ga172(blm+ga172)。左图显示了肺段的平均值数据，右图显示了单只绵羊的数据。显著性使用配对t检验来确定，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，n＝10只绵羊。ga172是本研究中所用的生松素的代码。
[0139]
图15显示了如针对在死后从以不同方式处理的肺段采集的组织学h+e染色切片所评估的组织病理学评分数据。以不同方式处理的肺段为：右内侧(rm)肺段未经处理用作健康肺对照(对照)，右尾(rc)和左尾(lc)肺段输注博来霉素但不用药物治疗(blm)，或者输注博来霉素并接受4个每周剂量的ga172(blm+ga172)。上图显示了十只绵羊的平均值评分数据。下图显示了单只绵羊的数据。显著性使用配对t检验来确定，*p《0.05，**p《0.01，n＝10只绵羊。评分标准在材料和方法中有所描述。ga172是本研究中所用的生松素的代码。
[0140]
图16显示了在用ga172进行四次每周处理后测定胶原蛋白含量的羟脯氨酸测定法的数据。图a显示了参与实施例2的试验的10只绵羊的数据。图b显示了来自参与实施例1和实施例2的试验的13只绵羊的数据。对于每只绵羊，以不同方式处理的肺段为：右内侧(rm)
肺段未经处理用作健康肺对照(对照)，右尾(rc)和左尾(lc)肺段输注博来霉素但不用药物治疗(blm)，或者输注博来霉素并接受4个每周剂量的ga172(blm+ga172)。左图显示了十三只绵羊的平均值数据。右图显示了单只绵羊的数据。显著性使用配对t检验来确定，**p《0.01。ga172是本研究中所用的生松素的代码。
[0141]
图17显示了在用ga172进行四次每周处理后经马森(masson)三色染色的结缔组织的数据。马森三色染色将大多数结缔组织(包括胶原蛋白)染成蓝色。对于每只绵羊，以不同方式处理的肺段为：右内侧(rm)肺段未经处理用作健康肺对照(对照)，右尾(rc)和左尾(lc)肺段输注博来霉素但不用药物治疗(blm)，或者输注博来霉素并接受4个每周剂量的ga172(blm+ga172)。左图显示了十只绵羊的平均值评分数据。右图显示了单只绵羊的数据。染色和评分方法在材料和方法中有所描述。显著性使用配对t检验来确定，*p《0.05，***p《0.001，n＝10只绵羊。ga172是本研究中所用的生松素的代码。
[0142]
图18显示了在说明书中称为“表1”的表。表1汇总了在实施例2中评估的单只绵羊的所有参数的数据。ga172是本研究中所用的生松素的代码。
具体实施方式
[0143]
在整个本说明书的描述和权利要求中，词语“包含”以及诸如“含有”和“包括”的词语的变体并不旨在排除其他添加剂、组分、整体或步骤。
[0144]
在整个本说明书中提到的“一个实施方案”或“实施方案”是指结合实施方案所描述的特定特征、结构或特性可被包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个本说明书中的各种位置出现短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定都是指同一个实施方案，但是可以指同一个实施方案。
[0145]
本发明至少部分基于以下发明人的发现：即原型植物类黄酮能够在预防和/或治疗病理性损伤诱发的纤维化或炎症方面提供有益效果。类黄酮可以作用于发生或不发生炎症的纤维化。类黄酮可以作用于导致或不导致纤维化的炎症。因此，类黄酮可以用作抗炎剂和/或抗纤维化剂。这些发现是建立在本文的实施例中的实验研究基础上的，所述实验研究表明，生松素(作为示例性黄烷酮)能够显著改善公认的特发性肺纤维化的动物模型的疾病参数。这种发现可以适用于其他纤维化病症，包括感染诱发的肺纤维化(包括来自冠状病毒诸如sars-cov-2的呼吸道感染)、放射诱发的肺纤维化、进行性大块纤维化、囊性纤维化、胰纤维化(包括囊性纤维化)、腹膜后纤维化、动脉纤维化(包括动脉僵硬)、肠纤维化(包括克罗恩病)、关节纤维化(包括膝、肩和其他关节的关节纤维化、粘连性囊炎)、手/指纤维化(包括杜普伊特伦氏挛缩)、真皮纤维化(包括瘢痕瘤、肾源性系统性纤维化、硬皮病)、阴茎纤维化(包括佩罗尼氏病)、淋巴结纤维化(包括纵隔纤维化)和心肌纤维化(包括间质纤维化和替代性纤维化)。
[0146]
在本发明的上下文中，术语“纤维化”是指由于局部的损伤或炎症或者局部的血液供应受到干扰而引起的器官或组织中的过多的纤维结缔组织的形成或发展。它可以是导致疤痕(异常反应过程)的正常愈合反应的结果，这些结果具有或不具有已知或理解的因果关系。
[0147]
对纤维化的研究的额外效果是发现类黄酮可用于治疗和/或预防炎症。申请人通过实验研究了由于博来霉素诱发的损伤引起的刺激而产生的炎症标志物，所述损伤对于发
明人使用的用于纤维化的动物模型而言是必需的。
[0148]
在本发明的上下文中，术语炎症包括在暴露于刺激(诸如感染、刺激物、过敏原)或细胞损伤后哺乳动物免疫反应的活化。与适应性免疫(它是对特定病原体的特异性反应)相比，炎症可以被视为先天免疫的类型。
[0149]
炎症可以被认为是急性的或慢性的，前者通常由粒细胞介导，后者由单个核细胞(包括单核细胞和淋巴细胞)介导。
[0150]
急性炎症可以作为身体通过维持组织完整性和影响组织修复来抵抗损伤或刺激的初始保护性反应而出现。或者，刺激可以是过敏刺激。
[0151]
急性炎症可以由细胞刺激，所述细胞包括驻留巨噬细胞、树突细胞、组织细胞、库普弗(kupffer)细胞、肥大细胞、血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。在刺激下，这些细胞被活化，释放炎症介导和致敏的分子，例如促炎性细胞因子、促炎性前列腺素、白三烯、组胺、血清素、中性蛋白酶、缓激肽和一氧化氮。这些分子调节依赖于局部脉管系统、免疫系统和受影响组织部位中的细胞和非细胞因子的生物学通路，从而传播和放大炎症反应。
[0152]
急性炎症反应，通常以血管舒张增加血液向组织的流动从而导致红斑(所述红斑可以延伸到该部位之外)，血管通透性增加从而导致水肿为特征。这种反应可以改变某些感觉神经元的兴奋性，从而导致超敏反应和疼痛。另外的影响可以包括释放炎症诱发分子，诸如神经肽，包括p物质、降钙素基因相关肽(cgrp)、前列腺素和氨基酸(如谷氨酸)。炎症的另一个组成部分可以是白细胞(主要是粒细胞)从血管至组织的迁移增加。当消除炎症刺激时，急性炎症反应通常会停止。
[0153]
延长的刺激可以导致慢性炎症反应，从而导致受影响组织中存在的细胞类型发生进行性转变。慢性炎症可以被认为是同时发生的组织破坏和愈合，最终结局是有害的(通常是组织损伤)。慢性炎症涉及一系列其他不相关的病症，包括心血管疾病、癌症、过敏、肥胖、糖尿病、消化系统疾病、退行性疾病、自身免疫性疾病和神经系统疾病。
[0154]
治疗或预防慢性炎症的尝试取得了有限的成功，这可能是由于慢性炎症的复杂病因和很多参与的炎症介导和致敏剂。nsaid类药物可以阻断内源性抗炎反应，这在一些情况下可以延长或加剧慢性炎症。
[0155]
在对从模式动物获得的组织进行的分析中，据发现生松素对动物肺组织中博来霉素诱发的损伤(特发性肺纤维化模型必需的)产生的炎症反应具有显著影响。因此，有人提出，类黄酮可以用于治疗或预防呼吸系统(包括肺以及气道)的一系列炎性病症。
[0156]
例如，哮喘和copd是全球流行率很高的疾病，具有导致显著发病和死亡的炎症组成部分。两种疾病都具有特征性症状和功能异常，其中气道阻塞是主要特征。哮喘的气道阻塞是可逆的，而对于copd，异常呼气流动在长时间内无显著变化。这些疾病中的炎症可以由环境过敏原、职业性致敏剂或病毒性呼吸道感染引发。在copd中，香烟烟雾中的任何一种物质都可以引发所见的炎症反应。
[0157]
在本发明的上下文中，术语“类黄酮”旨在包括黄烷醇、黄酮和黄烷酮。在组合物的一些实施方案中，类黄酮是黄烷酮，在一些实施方案中，手性黄烷酮作为光学异构体存在，在这种情况下黄烷酮可以是d-型或s-型。在组合物的一些实施方案中，s-异构体被用于本组合物中。
[0158]
在一些实施方案中，类黄酮是黄烷酮生松素。有利地，生松素是一种具有已知的安
全性谱的天然存在的化合物。此外，对该化合物的管控未达到必须由医生开具该化合物的处方的程度。
[0159]
很多保健消费者非常喜欢服用天然物质。在目前情况下，生松素可以自由地以预防性方式服用(例如，以预防将来可能发生的呼吸道感染而引起的肺纤维化)，而不必担心会产生显著的不良反应。因此，类黄酮化合物可以作为解决日后可能遇到的任何肺部问题的通用手段。
[0160]
除此之外或作为替代方式，类黄酮化合物可以在疾病过程开始之后施用，在这种情况下，考虑到很多植物源性化合物的一般安全性，该化合物可以自由地单独或与其他治疗方法(药物或其他治疗方法)组合服用。
[0161]
在本发明的方法中，类黄酮被施用于受试者。术语“受试者”和“患者”可互换使用，是指哺乳动物来源的动物物种的成员，包括但不限于小鼠、大鼠、猫、山羊、绵羊、马、仓鼠、貂、鸭嘴兽、猪、狗、豚鼠、兔和灵长类动物(例如猴、猿或人)。
[0162]
受试者是需要预防或治疗纤维化或炎症病症的受试者，它是指患有(或将来可能患有)疾病、障碍、病症或病理过程的受试者。
[0163]
术语“治疗”、“医治”、“预防”和“防止”包括消除、实质上抑制、减缓或逆转疾病、病症或障碍的进展，实质上改善病症的临床或症状，实质上预防疾病、病症或障碍的临床或美学症状的出现，以及保护免受有害或烦人症状的伤害。治疗还指实现以下一项或多项：(a)降低障碍的严重度；(b)限制正在治疗的一种或多种障碍的特征性症状的发展；(c)限制正在治疗的一种或多种障碍的特征性症状的恶化；(d)限制此前患有一种或多种障碍的患者的一种或多种障碍的复发；以及(e)限制此前无一种或多种障碍的症状的患者的症状复发。
[0164]
根据本方法，类黄酮以“有效量”施用于受试者。考虑到相关的纤维化或炎性病症以及受试者的特征，这被认为包括治疗有效量。根据一些实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.000001mg/kg体重至约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.00001mg/kg体重至约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.0001mg/kg体重至约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.001mg/kg体重至约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，类黄酮化合物的有效量为约0.01mg/kg体重至约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.1mg/kg(或100μg/kg)体重至约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约1mg/kg体重至约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约10mg/kg体重至约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约2mg/kg体重至约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约3mg/kg体重至约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约4mg/kg体重至约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约5mg/kg体重至约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约20、30、40、50或60mg/kg体重至约100mg/kg体重的量，包括端值在内。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约70mg/kg体重至约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约80mg/kg体重至约100mg/kg体重的
量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约90mg/kg体重至约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.000001mg/kg体重至约90mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.000001mg/kg体重至约80mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.000001mg/kg体重至约70mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.000001mg/kg体重至约60mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.000001mg/kg体重至约50mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.000001mg/kg体重至约40mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，类黄酮化合物的有效量为约0.000001mg/kg体重至约30mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.000001mg/kg体重至约20mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.000001mg/kg体重至约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.000001mg/kg体重至约1mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.000001mg/kg体重至约0.1mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.000001mg/kg体重至约0.1mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.000001mg/kg体重至约0.01mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.000001mg/kg体重至约0.001mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.000001mg/kg体重至约0.0001mg/kg体重的量。根据另一个实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的有效量为约0.000001mg/kg体重至约0.00001mg/kg体重的量。
[0165]
根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为1μg/kg/天至25μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为1μg/kg/天至2μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为2μg/kg/天至3μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为3μg/kg/天至4μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为4μg/kg/天至5μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为5μg/kg/天至6μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为6μg/kg/天至7μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为7μg/kg/天至8μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为8μg/kg/天至9μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为9μg/kg/天至10μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为1μg/kg/天至5μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为5μg/kg/天至10μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为10μg/kg/天至15μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为15μg/kg/天至20μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为25μg/kg/天至30μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为30μg/kg/天至35μg/kg/天。根据一
些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为35μg/kg/天至40μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为40μg/kg/天至45μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为45μg/kg/天至50μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为50μg/kg/天至55μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为55μg/kg/天至60μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为60μg/kg/天至65μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为65μg/kg/天至70μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为70μg/kg/天至75μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为80μg/kg/天至85μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为85μg/kg/天至90μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为90μg/kg/天至95μg/kg/天。根据一些其他实施方案，药物组合物的类黄酮化合物的治疗剂量的范围为95μg/kg/天至100μg/kg/天。
[0166]
所述发明的类黄酮的有效量包括但不限于这样的量，所述量足以：(1)除去至少一个纤维化部位或减小至少一个纤维化部位的大小，或者(2)降低胞外基质(包括胶原蛋白和纤连蛋白)沉积于肺纤维化患者肺部的间质中的速率，或者(3)炎症，包括炎症细胞(诸如中性粒细胞)内流至受影响的组织。该术语还涵盖足以抑制或减轻肺纤维化患者的至少一种症状的量，其中所述症状包括但不限于氧饱和度、呼吸困难(呼吸有困难)、干咳(急促、大声的呼气，它可以由刺激或炎症引起，并且无法清除呼吸道的痰)以及爆音(吸气时肺发出噼啪声，有时称为啰音或爆裂音)。术语“有效量”还可以涵盖足以预防或至少部分逆转哮喘和copd中所见的咳嗽、喘鸣或气道变窄的量。该术语还可以涵盖足以预防或至少部分逆转急性或慢性支气管炎中所见的咳嗽、喘鸣或粘液产生的量。
[0167]
可以根据所述发明采用的活性剂的有效量通常在约0.001mg/kg体重至约10g/kg体重的范围内。然而，剂量水平取决于多种因素，包括损伤的类型、年龄、体重、性别、患者的医学病症、病症的严重度、施用途径和频率以及所采用的特定活性剂。因此，剂量方案可以广泛变化，但是可以由医生使用标准方法常规确定，并且具有本说明书的有益效果。
[0168]
当类黄酮被递送至肺时，可以将吸入(通过呼吸吸入药物的行为)或吹入(在压力下将空气、气体或粉末递送至体腔或腔室的行为，例如，鼻腔吹入涉及在压力下通过鼻子递送空气、气体或粉末的行为)作为施用途径。
[0169]
类黄酮化合物可以在吸入装置的协助下递送，吸入装置可以是从液体或干粉气雾剂制剂产生小液滴或气雾剂的机器/设备或组件，并且被用于通过口腔施用以实现药物的肺部施用，例如以溶液剂、粉末剂等等形式施用。吸入递送装置的实例包括但不限于雾化器、计量吸入器和干粉吸入器(dpi)。
[0170]
如本文所用，术语“雾化器”是指用于以吸入肺的雾的形式施用液体药物的装置。
[0171]
如本文所用，术语“计量吸入器”、“mdi”或“喷药器”是指使用推进剂将特定量的药物(“计量剂量”)递送至患者的肺的加压手持式装置。如本文所用，术语“推进剂”是指用于通常利用气体压力通过收敛、发散的喷嘴排出物质的材料。压力可以来自压缩气体，或化学反应产生的气体。排出的材料可以是气体、液体、等离子体，或者在化学反应之前，排出的材
料是固体、液体或凝胶。加压计量吸入器中使用的推进剂是液化气体，传统上是氯氟烃(cfc)，后来逐渐使用氢氟烷烃(hfa)。合适的推进剂包括例如氯氟烃(cfc)(诸如三氯氟甲烷(也称为推进剂11)、二氯二氟甲烷(也称为推进剂12)和1,2-二氯-1,1,2,2-四氟乙烷(也称为推进剂114))、氢氯氟烃、氢氟烃(hfc)(诸如1,1,1,2-四氟乙烷(也称为推进剂134a、hfc-134a或hfa-134a)和1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(也称为推进剂227、hfc-227或hfa-227))、二氧化碳、二甲醚、丁烷、丙烷或它们的混合物。在其他实施方案中，推进剂包括氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或它们的混合物。在其他实施方案中，氢氟烃被用作推进剂。在其他实施方案中，hfc-227和/或hfc-134a被用作推进剂。
[0172]
如本文所用，术语“干粉吸入器”或“dpi”是指类似于计量吸入器的装置，但是其中药物是粉末形式。患者完全呼出一口气，将嘴唇放在接嘴周围，然后快速吸入粉末。干粉吸入器不需要mdi必需的时间排程和协调。
[0173]
如本文所用，术语“颗粒”是指是指极小的成分(例如，纳米颗粒、微粒，或者在一些情况下更大的成分)，在这些成分之内或之上含有如本文所述的组合物。
[0174]
有人提出，对于肺部施用，可以不必将类黄酮直接递送至肺组织，并且在一些情况下，化合物可以口服、肠胃外、直肠或通过一些其他施用途径施用。此外，对于非肺部施用适应症，类黄酮通常通过非肺部途径施用。
[0175]
就此而言，本方法可以需要施用包含本发明的类黄酮或其药学上可接受的盐、水合物或立体异构体的药物组合物或单一单位剂型，所述药物组合物或单一单位剂型也被本发明涵盖在内。本发明的单独剂型可以适用于口服、粘膜(包括舌下、含服、直肠、鼻腔或阴道)、肠胃外(包括皮下、肌肉内、推注、动脉内或静脉内)、透皮或局部施用。本发明的药物组合物和剂型通常还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。还考虑了无菌剂型。
[0176]
本实施方案涵盖的药物组合物包含本发明的类黄酮或其药学上可接受的盐、水合物或立体异构体，以及至少一种另外的用于治疗相关的纤维化或炎性病症的治疗剂，诸如现有技术组合物。剂型的组成、形状和类型通常根据它们的用途而变化。例如，用于疾病或相关疾病的急性治疗的剂型与用于同一疾病的慢性治疗的剂型相比，可以含有更多量的所含的一种或多种活性成分。类似地，肠胃外剂型与用于治疗同一疾病或障碍的口服剂型相比，可以含有更少量的所含的一种或多种活性成分。本发明涵盖的特定剂型彼此不同的这些和其他方式对于本领域的技术人员而言是显而易见的。剂型的实例包括但不限于：片剂；小胶囊剂；胶囊剂，诸如软弹性明胶胶囊剂；扁囊剂；糖锭剂；锭剂；分散剂；栓剂；软膏剂；泥罨剂(泥敷剂)；糊剂；粉末剂；敷料剂；霜剂；膏药剂；溶液剂；贴剂；气雾剂(例如，鼻腔喷雾剂或吸入剂)；凝胶剂；适用于口服或粘膜施用于患者的液体剂型，包括混悬剂(例如，水性或非水性液体混悬剂、水包油乳剂或油包水液体乳剂)、溶液剂和酏剂；适用于肠胃外施用于患者的液体剂型；以及无菌固体剂(例如，结晶或无定形固体)，它们可以被复原以提供适用于肠胃外施用于患者的液体剂型。
[0177]
典型的药物组合物和剂型包含一种或多种载剂、赋形剂或稀释剂。合适的赋形剂是制药领域的技术人员熟知的，并且本文提供了合适的赋形剂的非限制性实例。
[0178]
特定赋形剂是否适合掺入药物组合物或剂型取决于本领域熟知的多种因素，包括但不限于将剂型施用于患者的方式。例如，口服剂型诸如片剂可以含有不适用于肠胃外剂型的赋形剂。特定赋形剂的适用性还可以取决于剂型中的特定活性成分。
[0179]
本发明还涵盖包含活性成分的无水药物组合物和剂型的使用，因为水可以促进一些化合物的降解。例如，水(例如，5％)的添加作为模拟长期储存的手段，以确定制剂随时间推移的特征诸如保存期或稳定性，在制药领域是被广泛接受的。实际上，水和热会加速一些化合物的分解。
[0180]
因此，水对制剂的影响可以是重要的，因为水分和/或湿度在制剂的制造、处理、包装、储存、运输和使用期间通常都会遇到。
[0181]
本发明使用的无水药物组合物和剂型可以使用无水或含低水分成分以及低水分或低湿度条件来制备。
[0182]
可以制备无水药物组合物并且储存无水药物组合物以维持其无水性质。因此，无水组合物优选地使用已知可防止暴露于水的材料来包装，以使得它们可以被包含在合适的处方药盒中。合适的包装的实例包括但不限于密封箔、塑料、单位剂量容器(例如，小瓶)、泡罩包装和条形包装。
[0183]
本发明还涵盖包含一种或多种降低活性成分分解速率的化合物的药物组合物和剂型。此类化合物在本文中称为“稳定剂”，包括但不限于抗氧化剂，诸如抗坏血酸、ph缓冲剂或盐缓冲剂。
[0184]
正如赋形剂的量和类型那样，剂型中的活性成分的量和具体类型可以因多种因素而异，所述因素诸如但不限于将剂型施用于患者的途径。然而，本发明的典型剂型包含本发明的类黄酮或其药学上可接受的盐、水合物或立体异构体，每单位包含0.1mg至1500mg，以提供约0.01至200mg/kg/天的剂量。
[0185]
适用于口服施用的本发明的药物组合物可以以离散剂型提供，所述离散剂型诸如但不限于片剂(例如，咀嚼片)、小胶囊剂、胶囊剂和液体剂(例如，调味糖浆剂)。此类剂型含有预定量的活性成分，并且可以通过本领域的技术人员熟知的制药方法来制备。
[0186]
本发明的典型口服剂型根据常规药物配混技术通过将一种或多种活性成分与至少一种赋形剂充分掺合来制备。赋形剂可以采用多种形式，取决于施用所需的制备剂形式。例如，适用于口服液体或气雾剂剂型的赋形剂包括但不限于水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂和着色剂。适用于固体口服剂型(例如，粉末剂、片剂、胶囊剂和小胶囊剂)的赋形剂的实例包括但不限于淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。
[0187]
由于易于施用，片剂和胶囊剂代表了最有利的口服剂量单位形式，在这种情况下采用固体赋形剂。如果需要，可以通过标准水性或非水性技术来对片剂进行包衣。此类剂型可以通过任何一种制药方法来制备。通常，药物组合物和剂型通过以下步骤来制备：将活性成分与液体载剂、细分的固体载剂或它们二者均匀充分掺合，然后根据需要将产物成型为所期望的外观。
[0188]
例如，片剂可以通过压缩或模塑来制备。压缩片剂可以通过以下步骤来制备：在合适的机器中压缩自由流动形式的活性成分，诸如粉末或颗粒，任选地与赋形剂混合。模塑片剂可以通过以下步骤来制备：在合适的机器中模塑用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物。
[0189]
可以用于本发明的口服剂型的赋形剂的实例包括但不限于粘合剂、填充剂、崩解剂和润滑剂。适用于药物组合物和剂型的粘合剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉或其他淀粉、明胶、天然和合成树胶诸如阿拉伯胶、藻酸钠、藻酸、其他藻酸盐、粉末状黄蓍胶、瓜
尔胶、纤维素及其衍生物(例如，乙基纤维素、乙酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯基吡咯烷酮、甲基纤维素、预糊化淀粉、羟丙基甲基纤维素(例如，2208、2906、2910号)、微晶纤维素以及它们的混合物。
[0190]
适用于本文公开的药物组合物和剂型的填充剂的实例包括但不限于滑石、碳酸钙(例如，颗粒或粉末)、微晶纤维素、粉末状纤维素、葡萄糖结合剂、高岭土、甘露糖醇、硅酸、山梨糖醇、淀粉、预糊化淀粉以及它们的混合物。本发明的药物组合物中的粘合剂或填充剂通常以药物组合物或剂型的约50至约99重量％存在。
[0191]
微晶纤维素的合适形式包括但不限于以avlcel-ph-101、avtcel-ph-103、avicel rc-581、avicel-ph-105销售的材料(可从fmc corporation,american viscose division,avicel sales,marcus hook,pa获得)以及它们的混合物。一种特定粘合剂是以avicel rc-581销售的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠的混合物。合适的无水或低水分赋形剂或添加剂包括avicel-ph-103
tm
和淀粉1500lm。
[0192]
崩解剂被用于本发明的组合物中，以提供当暴露于水性环境时崩解的片剂。含有太多崩解剂的片剂可以在储存期间崩解，而含有太少崩解剂的片剂可以无法以所期望的速率或在所期望的条件下崩解。因此，应使用足够量的崩解剂来形成本发明的固体口服剂型，所述崩解剂既不应过多也应不过少，以致于不利地改变活性成分的释放。所用的崩解剂的量根据制剂的类型而变化，并且对于本领域的普通技术人员而言是容易辨别的。典型的药物组合物包含约0.5至约15重量％的崩解剂，具体而言约1至约5重量％的崩解剂。
[0193]
可以用于本发明的药物组合物和剂型的崩解剂包括但不限于琼脂、藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、波拉克林钾、淀粉羟乙酸钠、马铃薯或木薯淀粉、预糊化淀粉、其他淀粉、粘土、其他藻胶、其他纤维素、树胶以及它们的混合物。
[0194]
可以用于本发明的药物组合物和剂型的润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇、其他二醇、硬脂酸、十二烷基硫酸钠、滑石、氢化植物油(例如，花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、椰子油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂以及它们的混合物。另外的润滑剂包括例如syloid硅胶(aerosil 200，由w.r.grace co.,baltimore,md制造)、合成二氧化硅的凝结气溶胶(由degussaco.,piano,tx销售)、cab-o-sil(热解二氧化硅产品，由cabot co.,boston,ma销售)以及它们的混合物。如果完全使用，润滑剂的用量通常小于它们所掺入的药物组合物或剂型的约1重量％。
[0195]
本发明的方法中使用的类黄酮可以通过控释手段或通过本领域的普通技术人员熟知的递送装置来施用。实例包括但不限于以下美国专利中所述的那些：3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123以及4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556和5,733,566。以不同的比例使用例如羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、可渗透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体、微球或它们的组合以提供所期望的释放曲线，可以将此类剂型用于提供一种或多种活性成分的缓释或控释。可以容易地选择本领域的普通技术人员已知的合适的控释制剂(包括本文所述的那些)以用于本发明的活性成分。因此，本发明涵盖适用于口服施用的单一单位剂型，诸如但不限于适用于控释的片剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂和小胶囊剂。
[0196]
所有控释药物产品都有一个共同的目标，即相比其非控释对应物所实现的而言改
进药物治疗。理想情况下，在医学治疗中使用最佳设计的控释制剂的特征在于在最短的时间内使用最少量的药物来治愈或控制病状。控释制剂的优点包括药物活性延长、给药频率降低和患者顺应性增加。另外，控释制剂可用于影响作用起效时间或其他特性，诸如血药水平，并因此可影响副作用(例如不良作用)的发生。
[0197]
大多数控释制剂被设计为最初释放一定量的药物(活性成分)，其立即产生期望的治疗效果，并且逐渐且持续释放其他量的药物以在延长的时间段内维持这种水平的治疗或预防效果。为了在体内维持这种恒定的药物水平，药物必须从剂型中释放出来，其速率将取代从身体代谢和排泄的药物量。可以通过各种条件刺激活性成分的控制释放，这些条件包括但不限于ph、温度、酶、水或其他生理条件或化合物。
[0198]
肠胃外剂型可以通过各种途径施用于患者，所述途径包括但不限于皮下、静脉内(包括推注)、肌肉内和动脉内途径。因为它们的施用通常绕过患者对污染物的天然防御，所以肠胃外剂型优选地是无菌的或能够在施用于患者之前进行灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于注射用溶液、准备好溶解或悬浮于药学上可接受的注射用媒介物中的干燥和/或冻干产品(可复原粉末)、注射用混悬剂和乳剂。
[0199]
可以用于提供本发明的肠胃外剂型的合适的媒介物是本领域的技术人员熟知的。实例包括但不限于：注射用水usp；水性媒介物，诸如但不限于氯化钠注射液、林格氏(ringer)注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液以及乳酸林格氏注射液；水可混溶性媒介物，诸如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；以及非水性媒介物，诸如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
[0200]
增加本文公开的活性成分中的一种或多种的溶解度的化合物也可以被掺入本发明的肠胃外剂型中。
[0201]
可以使用透皮剂型。此类形式包括“储库型”或“基质型”贴剂，所述贴剂可以被施用于皮肤并佩戴特定时间期以允许所期望的量的活性成分渗透。
[0202]
可以用于提供本发明所涵盖的透皮和局部剂型的合适的赋形剂(例如，载剂和稀释剂)和其他材料是制药领域的技术人员熟知的，并且取决于给定药物组合物或剂型将被施用的特定组织。考虑到这一点，典型的赋形剂包括但不限于水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油以及它们的混合物。
[0203]
根据待治疗的特定组织，可以在用本发明的活性成分治疗之前、联合本发明的活性成分或在用本发明的活性成分治疗之后使用另外的组分。例如，渗透促进剂可以用于协助将活性成分递送至组织。合适的渗透促进剂包括但不限于：丙酮；各种醇，诸如乙醇、油醇和四氢呋喃醇；烷基亚砜，诸如二甲基亚砜；二甲基乙酰胺；二甲基甲酰胺；聚乙二醇；吡咯烷酮，诸如聚乙烯吡咯烷酮；ollidon级(聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮)；尿素；以及各种水溶性或不溶性糖酯，诸如tween 80(聚山梨醇酯80)和span 60(单硬脂酸脱水山梨糖醇酯)。
[0204]
还可以调节药物组合物或剂型或者药物组合物或剂型所施用的组织的ph，以改善一种或多种活性成分的递送。类似地，可以调节溶剂载剂的极性、它们的离子强度或张力，以改善递送。化合物诸如硬脂酸盐也可以被添加至药物组合物或剂型中，以有利地改变一种或多种活性成分的亲水性或亲脂性，从而改善递送。在这方面，硬脂酸盐可以被用作制剂的脂质媒介物、乳化剂或表面活性剂以及递送增强剂或渗透增强剂。活性成分的不同盐、水合物或溶剂化物可以用于进一步调节所得的组合物的性质。
[0205]
当纤维化或炎性病症累及真皮或皮下时，可以使用局部剂型。此类形式包括但不限于霜剂、洗剂、软膏剂、凝胶剂、溶液剂、乳剂、混悬剂或本领域的技术人员已知的其他形式。
[0206]
可以用于提供本发明所涵盖的透皮和局部剂型的合适的赋形剂(例如，载剂和稀释剂)和其他材料是制药领域的技术人员熟知的，并且取决于给定药物组合物或剂型将被施用的特定组织。考虑到这一点，典型的赋形剂包括但不限于水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油以及它们的混合物。
[0207]
根据待治疗的特定组织，可以在用本发明的活性成分治疗之前、联合本发明的活性成分或在用本发明的活性成分治疗之后使用另外的组分。例如，渗透促进剂可以用于协助将活性成分递送至组织。合适的渗透促进剂包括但不限于：丙酮；各种醇，诸如乙醇、油醇和四呋喃醇；烷基亚砜，诸如二甲基亚砜；二甲基甲酰胺；聚乙二醇；吡咯烷酮，诸如聚乙烯吡咯烷酮；kollidon级(聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮)；尿素；以及各种水溶性或不溶性糖酯，诸如tween 80(聚山梨醇酯80)和span 60(单硬脂酸脱水山梨糖醇酯)。
[0208]
可以使用粘膜剂型，所述粘膜剂型包括但不限于眼用溶液剂、喷雾剂和气雾剂，或本领域的技术人员已知的其他形式。适用于治疗口腔粘膜组织的剂型可以被配制成漱口水或口腔凝胶剂。在一个实施方案中，气雾剂包含载剂。在另一个实施方案中，气雾剂是无载剂的。
[0209]
本发明的类黄酮也可以通过吸入来直接施用于肺。对于吸入施用，类黄酮可以通过许多不同的装置方便地递送至肺。
[0210]
类黄酮也可以被配制成长效制备剂。此类长效制剂可以通过移植(例如，皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射来施用。因此，例如，所述化合物可以用合适的聚合物或疏水性材料(例如配制成可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂来配制，或配制成微溶衍生物，例如配制成微溶盐。
[0211]
或者，可以采用其他药物递送系统。脂质体和乳剂是熟知的可以用于递送类黄酮的递送媒介物的实例。还可以采用某些有机溶剂诸如二甲基亚砜，虽然这通常以更大的毒性为代价。类黄酮也可以在控释系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料。在又一个实施方案中，可以将控释系统放置于本发明的化合物的靶标例如肺附近，因此仅需要全身剂量的一部分。
[0212]
可以用于提供本发明所涵盖的粘膜剂型的合适的赋形剂(例如，载剂和稀释剂)和其他材料是制药领域的技术人员熟知的，并且取决于给定药物组合物或剂型将被施用的特定部位或方法。考虑到这一点，典型的赋形剂包括但不限于水、乙醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油以及它们的混合物，这些赋形剂是无毒且药学上可接受的。
[0213]
还可以调节药物组合物或剂型或者药物组合物或剂型所施用的组织的ph，以改善一种或多种活性成分的递送。类似地，可以调节溶剂载剂的极性、它们的离子强度或张力，以改善递送。化合物诸如硬脂酸盐也可以被添加至药物组合物或剂型中，以有利地改变一种或多种活性成分的亲水性或亲脂性，从而改善递送。在这方面，硬脂酸盐可以被用作制剂的脂质媒介物、乳化剂或表面活性剂以及递送增强剂或渗透增强剂。活性成分的不同盐、水合物或溶剂化物可以用于进一步调节所得的组合物的性质。
[0214]
在本发明的一些实施方案中，类黄酮与氨基酸组合配制或者施用。有人提出，类黄酮和氨基酸协同作用以治疗和预防炎性病症，尤其是气道的炎性病症，诸如哮喘和急性呼吸窘迫综合征(诸如，冠状病毒covid-19感染中存在的那些)。特别有效的氨基酸包括l-甘氨酸和l-酪氨酸。肠道细菌代谢物诸如对甲酚硫酸盐可以与类黄酮组合，并且可以与第三活性剂诸如氨基酸组合。
[0215]
类黄酮可以被掺入营养产品中，所述营养产品包括但不限于食品组合物、非处方药和膳食补充剂。类黄酮可以被添加至各种食品中以便同时消耗。作为食品添加剂，本发明的类黄酮可以以与常规食品添加剂相同的方式使用，因此只需要与其他组分混合以增强味道。
[0216]
人们将认识到，膳食补充剂可以不使用与药物组合物相同的制剂组分或者具有与药物组合物相同的无菌和其他药物监管机构要求。膳食补充剂可以是液体形式，例如溶液、糖浆或悬浮液，或者可以是在使用前用水或任何其他合适的液体复原的产品形式。此类液体制备剂可以通过常规手段来制备，所述液体制备剂诸如茶、健康饮料、膳食手摇饮料、液体浓缩物或液体可溶性片剂、胶囊剂、丸剂或粉末剂，从而可以通过将液体可溶性片剂、胶囊剂、丸剂或粉末剂溶解于液体中来制备饮料，并且消耗所得的饮料。或者，膳食补充剂可以采取通过常规手段制备的片剂或胶囊剂的形式，并且任选地包括其他膳食补充剂，这些其他膳食补充剂包括维生素、矿物质、其他草药补充剂、结合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂，如上文所讨论，片剂可以通过本领域熟知的方法来包衣。在一个优选的实施方案中，膳食补充剂可以采取胶囊剂或粉末剂的形式，所述胶囊剂或粉末剂被溶解于液体中以便口服消耗。
[0217]
饮料中或掺入食品中的类黄酮的量将取决于饮料、食品的类型和所期望的效果。通常，单份包含约0.1％至约50％，优选地约0.5％至约20％的食品组合物的量。更优选地，食品包含占食品组合物的约1重量％至约10重量％的量的类黄酮。食品的实例包括但不限于糕点诸如甜食(糖果、果冻、果酱等)、口香糖、豆沙、烘焙糕点或模制糕点(曲奇饼、饼干等)、蒸制糕点、可可或可可产品(巧克力和可可)、冷冻糕点(冰淇淋、冰等)、饮料(果汁、软饮料、碳酸饮料)、健康饮料、健康棒和茶(绿茶、红茶等)。
[0218]
根据本发明，生松素是优选的类黄酮。生松素的产生方法主要有三种。生松素的提取可以使用例如植物材料、蜂蜜或蜂胶以及真菌作为起始物料。
[0219]
出于成本、效率或消费者接受度的原因，化合物可以优选地从天然来源提取。所述化合物存在于多种植物中，但是在一些科的植物中更为普遍。它不会均匀地出现在植物的特定部分，但是每个科都倾向于使它集中在同一区域。它被认为在病原体攻击的情况下对植物起到保护作用。大多数植物似乎都含有(s)-生松素，但是一些植物含有(r)-对映异构体或外消旋物质。
[0220]
很多桉属(eucalyptus)物种都含有生松素，一些物种的含量非常高。例如毛叶桉(eucalyptus torelliana)可以使所述化合物在果实树脂中的表达水平达到3.7％。在叶材料中的存在水平较低，虽然仍然足以提供实用和经济的提取。
[0221]
生松素产量最高的一些物种来自良姜属(alpinia)物种，事实上草豆蔻(alpinia katsumadai)似乎是主要的商业来源。该物种报道的来自种子的产量范围为613mg/kg至2490mg/kg。从高良姜(alpinia officinarium)的根茎分离的产量为32000mg/kg。
[0222]
据报道，光果甘草(glycyrrhiza glabra)(甘草)的叶含有特别高水平的生松素，高达24100mg/kg。
[0223]
已经在澳洲茶(leptospermum polygalifolium)和麦卢卡树(leptospermum scoparium)的单花蜂蜜中检测到生松素。这表明，这些植物的花蜜中含有生松素，并且水平为60至260mg/kg。
[0224]
已经从蒲桃(syzygium jambos)的花以及莲雾(s.samarangense)的叶和果实中分离出生松素。果实中的含量不是特别高，为2.2mg/kg，但是可以使用。
[0225]
优选地，不使用色谱法从植物来源中分离生松素。如果必须使用色谱法，则应在过程中尽可能后期的步骤进行，以最大可能地减少提取物的复杂性和所需的溶剂体积。
[0226]
通过以下步骤从银顶白蜡桉(eucalyptus sieberi)中分离出仅3种类黄酮的粗混合物。在室温下用甲醇提取，然后部分浓缩，然后倒入水中并滤出沉淀物。将沉淀物重复再溶解于甲醇中，并用水再沉淀，直到沉淀物中无类黄酮残留。浓缩合并的甲醇水溶液，并且用石油精提取叶绿素和蜡。用石油精部分浓缩，并且用醚进行液-液提取若干天。部分浓缩和冷却沉淀，然后通过色谱法分离。
[0227]
浓缩大量甲醇水溶液的另一种方法是使其通过大孔树脂诸如xad，进行梯度洗脱并且收集和浓缩目标馏分。然而，仍然需要色谱法。
[0228]
已经通过以下步骤从干燥的叶中获得含有类黄酮的粗提物：在室温下提取，以及使用正己烷60或甲醇进行索氏(soxhlet)提取。索氏提取使用的溶剂比冷提取更少，这表明生松素可以在高达68℃下长时间存活。甲醇的提取通过以下提取法来进行研究：索氏提取(64.7℃，32h)、超声辅助提取(超声，40℃，30分钟三次)以及60℃(100巴，20分钟，两个循环)、80℃(100巴，20分钟，两个循环)、100℃(100巴，20分钟，两个循环)加速溶剂提取，它们分别得到3.2g、2.6g、3.3g、3.6g和3.5g提取物。
[0229]
用于本组合物的生松素可以通过发酵方法在大肠杆菌(escherichia coli)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和委内瑞拉链霉菌(streptomyces venezuelae)中获得。前两者似乎产生(s)-生松素，但是委内瑞拉链霉菌产生外消旋物。
[0230]
有人提出，将细胞培养作为产生植物源性代谢物(包括生松素)的手段，因为它积聚的数量可能比完整的植株更高。姜科(zingiberaceae)的成员产生大量生松素。据报道，该科的成员凹唇姜(boesenbergia rotunda)的产量高达9.2g/kg。使用萘乙酸和2,4-二氯苯氧基乙酸的培养基利用分生组织衍生的愈伤组织来建立细胞悬浮培养物。以1.0ml的沉降细胞体积进行接种产生8.6mg/kg干重的最大生松素积聚。
[0231]
文献中报道了生松素的多种化学合成方法。例如，生松素可以从l-苯丙氨酸生物合成。该转化需要四个催化步骤。首先，l-苯丙氨酸通过苯丙氨酸氨裂合酶(pal)转化为肉桂酸。然后，肉桂酸通过4-香豆酸:coa连接酶(4cl)转化为相应的辅酶a(coa)酯。然后，在查耳酮合酶(chs)的催化下，三分子丙二酰coa与一分子肉桂酰coa酯逐步缩合得到(2s)-生松素查耳酮。最后，查耳酮异构酶(chi)将查耳酮转化为(2s)-生松素。
[0232]
在组合物的一些实施方案中，黄烷酮是生松素并且优选地是如下所示的(s)-生松素。
[0233][0234]
可以使用其他二羟基黄烷酮来代替生松素，例如，可以使用4',7-二羟基黄烷酮(甘草素)来代替生松素。
[0235]
在一些实施方案中，单羟基黄烷酮，诸如乔松酮，它是在5位被羟基羟基取代并且在7位被甲氧基基团取代的(2s)-黄烷酮。
[0236]
其他潜在有用的化合物包括黄烷酮白杨素、高良姜素和短叶松素。
[0237]
实施例1：5,7-二羟基-2-苯基-2,3-二氢-4h-色烯-4-酮(生松素)在绵羊肺模型的炎症和纤维化治疗方面的功效证明
[0238]
在动物模型中，博来霉素是最广泛使用的表征肺纤维化的药剂。在绵羊模型中，使用气管内施用两个剂量的博来霉素来诱发肺实质纤维化。总体研究方案如图1所示。
[0239]
实验动物
[0240]
在本实施例中，采用三只年龄在9个月和1岁之间的雌性美利奴绵羊。动物被饲养在室内并接受针对任何现有寄生虫病的驱虫药治疗。根据实验开始前的临床检查以及尸体解剖时的大体病理学检查来判断绵羊没有显著的肺部疾病。墨尔本大学动物实验伦理委员会遵循澳大利亚关于科学目的实验动物护理和使用行为准则批准以下概述的所有实验程序。
[0241]
博来霉素施用和治疗方案
[0242]
如图2所示，使用药物级硫酸博来霉素(hospira,melbourne,australia)在所有动物肺的左尾叶内诱发活绵羊的纤维化。将硫酸博来霉素配制成0.6u博来霉素/毫升盐水的浓度，并以每肺段3u的速率施用于左右尾叶，以产生组织损伤并引发纤维化。对于左尾叶，施用7mg生松素的10％ dmso溶液以测试生松素在治疗或预防博来霉素诱发的纤维化中的功效。对于右尾叶，损伤是由博莱霉素诱发的，单独施用dmso，以使得左右尾叶之间的任何差异效应都可以归因于生松素。
[0243]
作为假治疗，将盐水溶液施用于右内侧叶。
[0244]
将博来霉素、博来霉素/生松素和盐水组合物中的每者以5ml大丸剂通过光学纤维支气管镜的活检端口施用于适当的肺段。
[0245]
各种组合物施用的时间排程汇总于图1中，在第12周对全部三只绵羊实施安乐死。
[0246]
尸检和组织采样
[0247]
如图1所概述，在第12周，通过静脉内注射过量巴比妥酸盐(lethabarb,veterinary clinic,university of melbourne,werribee,australiaia)对绵羊实施安乐死，以进行组织收集和分析。
[0248]
在安乐死后，移除肺，找到目标肺段并将目标肺段小心地从周围组织解剖下来。然后将1:1的oct和无菌pbs溶液的混合物充入单个肺段。这种充入程序维持肺段组织的膨胀状态，然后在福尔马林中固定或冷冻以进行冷冻切片。
[0249]
切成2mm厚横切片，将每个处理的肺段在10％中性缓冲的福尔马林中固定，并在石蜡中处理以进行组织病理学评估。将其余的肺切片包埋在oct中，并在漂浮在液氮上的铝船上的低温模具中冷冻。这些切片保持在-80℃下以进行冷冻切片和免疫组织学。
[0250]
肺段功能分析
[0251]
使如图2所示，在清醒状态下，使用楔形支气管镜技术对绵羊进行有意识的呼吸，使用对不同肺段中的流动的压力响应来评估肺段顺应性(cseg)。简而言之，使用定制的肺段气道监测(slam)系统来监测肺段流量和压力。在首先确定支气管镜对设定流量的阻力后，将支气管镜楔入所关注的肺段的气道中，并使空气中5％ co2的恒定流量(6ml/s)通过支气管镜的工作通道。
[0252]
计算肺段顺应性。简而言之，在将支气管镜楔入肺的特定区域后，使压力达到稳定状态。在稳定状态下大约5秒后，中断气流，关闭气流供应。然后根据从该程序生成的压力-流量衰减曲线计算肺段顺应性。每个肺段重复该过程3次，并表示为cseg的平均值。压力通过pm-1000变换放大器(cwe inc.,admore,usa)记录，流量使用质量流量计(824-s,sierra instruments,monterey,usa)记录。使用数据采集卡(pci-6233；national instruments corp.,austin,usa)来采集数据，并使用slam系统(latitude e6520,dell computer corporation,texas usa和labview,national instruments corp.,austin,usa)对数据进行分析。所有阻力测量值都针对通过支气管镜的工作通道的流量阻力进行校正。
[0253]
组织学
[0254]
石蜡包埋的组织切片(5μm)用苏木精和伊红y(h&e)进行染色，以进行一般组织学和病理变化评估，并且使用马森三色染色来鉴定肺实质内的胶原蛋白含量变化。通过半定量和定量参数对纤维化肺损伤进行形态学评估，如下文所述：
[0255]
(i)半定量形态指数(smi)
[0256]
肺实质的组织病理学使用半定量评分系统由对治疗组设盲的有经验的病理学者进行评估。简而言之，所用的标准分别给出炎症和纤维化病理学的分数指数，这些分数指数相加得到“总体病理学分数”。
[0257]
(ii)定量图像分析(qia)
[0258]
a)纤维化分数：对纤维化程度或胶原蛋白含量进行定量，以指示实质组织内的总体胶原蛋白含量的变化。简而言之，使用mirax载玻片扫描仪(carl zeiss micro-imaging,jena,germany)将马森三色染色载玻片扫描成数字格式。选择十个连续、不重叠的视野进行分析，这些视野缺乏明显的气道和/或血管。使用image pro plus(6.3版，适用于windows，media cybernetics,bethesda,maryland,usa)来分析每个视野，使用“颜色选择器”工具来测量每个视野内的染成蓝色的组织(胶原蛋白)的面积。对于每个载玻片，对十个视野中的每个的染成蓝色的胶原蛋白区域的分数取平均值。纤维化分数的面积以总视野面积的百分比表示。
[0259]
b)形态测量：对石蜡包埋的肺组织切片进行h&e染色，以进行形态测量评估。将来自对照和博来霉素处理的肺段的肺实质的数字图像导入image pro plus软件以进行分析。通过将使用image pro生成的定制设计的测试网格叠加在肺实质上来进行测量。通过点计数法来确定实质组织内的组织和空隙分数。在200倍的最终放大率下，对总共15个视野进行分析。
[0260]
免疫组织化学
[0261]
对冷冻组织切片进行免疫组织化学。切片用100％冷乙醇固定10分钟，同时用含3％ h2o2内源性过氧化物酶(univar,knoxville,vic,australia)封闭。然后使用封闭液(1％牛血清白蛋白、5％正常绵羊血清的pbs溶液)对切片进行预封闭30分钟。在封闭后，将切片与cd4和cd8阳性炎症细胞的一抗(每个都是从abd serotech,raleigh,usa获得的小鼠抗体)一起温育。
[0262]
在洗涤后，将切片与适当的二抗(兔抗小鼠ig/hrp；abd serotech,raleigh,usa)一起温育1小时。然后洗涤切片并使用基于过氧化物酶的检测系统进行可视化。通过删减针对二抗对照和生物学上不相关的同种型对照的一抗来确定特异性。
[0263]
肺实质细胞计数
[0264]
对用cd4、cd8(参见上文)之一进行免疫组织化学染色的单个组织切片进行肺实质区的阳性细胞数量评估。使用具有计数线附件的显微镜在400倍放大率下观察完整的肺实质区。对计数线边界内的所有阳性细胞进行计数，根据需要将视野重新定位到新区域，以获得至少100个阳性细胞的计数，记录视野数和每只绵羊的总细胞数。在400倍放大率下，计数线的面积被确定为0.078mm2，这个数据被用于计算细胞密度(细胞/面积；数据以个细胞/mm2表示)。
[0265]
支气管肺泡灌洗液的收集
[0266]
从所有绵羊的各个肺段收集支气管肺泡(bal)液进行分析。为了收集bal细胞/液体，将柔性光学纤维支气管镜推进到选定的肺段，并通过滴注和抽取大约10ml等分的pbs溶液来收集灌洗液。将样品立即放置于冰上。通过以下方式使细胞与上清液分离，以1000rpm离心灌洗液7分钟以除去细胞。将上清液储存于-80℃，直至使用。
[0267]
在考虑该描述后，本领域的技术人员将了解如何在各种替代性实施方案和替代性应用中实施本发明。然而，虽然本文将描述本发明的各种实施方案，但是应当理解这些实施方案仅以举例的方式，而非限制性方式提供。因此，这种各种替代性实施方案的描述不应被解释为限制本发明的范围或广度。此外，优点或其他方面的陈述适用于特定的示例性实施方案，但是不一定适用于所有实施方案，或者实际上权利要求涵盖的任何实施方案。
[0268]
考虑到目前的数据，显而易见的是，与假处理的右内侧段相比，在全部三只绵羊中博来霉素的施用对肺功能有负面影响，增加了炎症并诱发了纤维化。左右尾段的比较数据表明，肺功能的改善以及炎症和纤维化的减少可归因于生松素的施用。生松素的有益效果在全部三只绵羊中均具有统计学显著性并且被记录下来。
[0269]
实施例2：通过输注到单个肺尾段中进行5,7-二羟基-2-苯基-2,3-二氢-4h-色烯-4-酮(生松素)在绵羊肺模型的炎症和纤维化治疗方面的功效证明
[0270]
材料、方法和分析
[0271]
绵羊肺段纤维化的诱发
[0272]
在这项研究中，使用总共10只绵羊。以与本文的实施例1类似的方式在每只绵羊的两个肺段中进行纤维化。使用该程序(如下文进一步详细描述)，纤维化被限制在较小、单独的肺区域中，其余90％-95％的健康、未受影响的肺承担正常的呼吸功能。
[0273]
研究中的所有绵羊(n＝10)的每个肺段接受2个单剂量的博来霉素(3个单位)挑战，间隔两周，将动物饲养到最后一个博来霉素剂量后5周略多一点。博来霉素是熟知的诱
发肺纤维化的药剂。施用程序涉及将支气管镜插入右肺和左肺的肺段，然后将博来霉素通过支气管镜活检端口缓慢输注到两个肺段，如图2所示。
[0274]
在本文的实施例1详细描述的研究中，生松素的剂量率为每只绵羊每周7mg生松素。注意，这种相对较低的剂量允许以下事实：即只治疗一个肺段中的相对较小的区域，而不是整个肺或整个身体，否则每只绵羊需要显著更多的药物。正如实施例1的研究显示每只绵羊7mg那样，决定在该实施例中使用相同的剂量率(即，将7mg生松素输注到每只绵羊的单个尾肺段中)。将生松素溶解于10％dmso中，并给予四次，间隔一周，如图1所示。
[0275]
施用程序涉及将溶于媒介物中的生物活性分子输注到肺段，如图1所示。出于对照目的，将对侧肺的肺段用作博来霉素阳性、无药物对照，如图1所示。将溶于媒介物中的生物活性分子以5ml输注液通过支气管镜的活检端口递送。注意，为了消除左肺和右肺之间的任何微小差异(例如生理学或解剖学等)，使生松素的输注液在左尾肺段和右尾肺段之间随机分配。一半动物(5只绵羊)的右尾肺段接受生松素，而另外5只绵羊的左尾肺段接受生松素。右内侧肺段保持未经处理，并用作在尸体解剖时进行采样的健康肺对照组织(图2)。
[0276]
支气管肺泡灌洗采样程序
[0277]
对于在图1中列出的时间点进行的每次支气管肺泡(bal)采样，将内窥镜操纵到特定肺段进行采样，通常通过约3-4个气道分支。对于bal采样，将10ml无菌盐水通过内窥镜的活检端口输注到特定肺段，然后通过同一端口回收到注射器中。该程序回收3至5ml bal液。采样方法从支气管镜导航到的特定肺段的小气道和肺泡腔收集细胞以进行分析。将来自每个肺段的bal细胞离心到载玻片上，并用hem-quik进行染色，以对炎症细胞进行差异细胞计数。
[0278]
肺功能测试和分析
[0279]
在图1所示的时间点测量所述肺段的肺功能。评估所有测试肺段(每只绵羊的左右尾叶和内侧叶)的肺功能。使用本文的实施例1中概述的程序通过内窥镜来测量肺段的功能容量。本研究中评估的肺功能参数称为肺段顺应性(缩写为cseg)。一般而言，顺应性是衡量肺部膨胀难易程度的指标。顺应性差的肺称为僵硬肺，通常更难膨胀。
[0280]
血液采集
[0281]
在图1所示的时间提供以下方式对绵羊进行采血：从颈静脉采集10ml血液置于含有肝素的试管中。对血液进行处理以进行血细胞计数分析。
[0282]
绵羊的安乐死和用于分析的肺组织采样
[0283]
在最后一个博来霉素剂量(第12周初)后5周略多一点对绵羊实施安乐死，如图1所示。在安乐死后，移除肺，找到目标肺段并将目标肺段小心地从周围组织解剖下来。然后在大约20cm/h2o的压力下，将1:1的最佳切割温度化合物(oct,proscitech ltd pty)和无菌pbs溶液的混合物充入单个肺段。将膨胀肺段的若干连续横切片固定于10％中性缓冲的福尔马林中，并在石蜡中处理以进行组织病理学评估。将其余的肺切片包埋在oct中，并在漂浮在液氮上的铝船上的低温模具中冷冻以进行免疫化学分析。
[0284]
石蜡包埋的组织切片(5μm)用苏木精和伊红y(h&e)进行染色，以进行一般组织学评估，并且使用马森三色染色来鉴定肺实质内的胶原蛋白含量变化。
[0285]
组织病理学评分
[0286]
使用如本文的实施例1中概述的半定量评分系统来评估肺实质的组织病理学。简
而言之，对所有组织学载玻片进行设盲，以使评估员不了解治疗组。对于每个h&e染色切片，根据本文的实施例1中概述的纤维化、炎症和总体病理分数的评分标准，对20倍放大率的10个连续、不重叠视野进行分级。选择远离大气道和大血管的区域。然后对全部十个视野的分数取平均值得到在切片肺段中评估的参数的代表性分数。
[0287]
使用羟脯氨酸测定法进行的胶原蛋白含量分析
[0288]
将羟脯氨酸测定法用于推导每个片段的胶原蛋白含量和浓度。简而言之，将来自每个肺段的冷冻肺组织冻干至干重，在6m hcl中水解，并通过使用beckman du-64分光光度计(beckman coulter inc,brea,ca)测量复原样品(溶于0.1m hcl)在558nm下的吸光度来评估羟脯氨酸含量。从反式-l-羟基-l-脯氨酸(sigma-aldrich)的标准曲线确定羟脯氨酸含量。通过将羟脯氨酸测量值乘以6.94(基于羟脯氨酸占大多数组织中胶原蛋白的氨基酸组成的14.4％)来推导胶原蛋白含量，然后将胶原蛋白含量表示为干重组织的比例，以得到胶原蛋白浓度(以百分比表示)。
[0289]
结缔组织含量分析：马森三色测定法
[0290]
使用技术人员已知的方法通过评估实质组织内的总体结缔组织含量变化来对纤维化程度进行定量。为了进行该分析，使用将结缔组织染成蓝色的马森三色染色剂对绵羊肺组织的石蜡切片进行染色。简而言之，使用与显微镜和计算机连接的数码相机拍摄马森三色染色肺切片的图像。在400倍放大率下随机拍摄十个视野，不包括大血管和支气管。然后使用plus(6.3版，适用于windows，media cybernetics,bethesda,maryland,usa)来分析图像，使用“颜色选择器”工具来测量每个视野内的染成蓝色的组织(胶原蛋白和其他结缔组织)的面积。然后对每个载玻片的十个图像中的每个的值取平均值。染成蓝色的组织的面积分数以总视野面积的百分比(染成蓝色的组织面积占总视野面积的百分比)表示。在编码载玻片中以盲法进行图像捕获和分析。
[0291]
肺实质中的cd4+和cd8+ t细胞的分析
[0292]
对于该分析，从全部10只绵羊的左右尾叶和右内侧叶切下冷冻组织切片，并将切片放置于载玻片上。
[0293]
使用间接免疫过氧化物酶技术对这些冷冻组织切片进行免疫组织化学。将针对绵羊细胞表面分子的特异性单克隆抗体用于鉴定cd8和cd4 t淋巴细胞亚群。对于细胞计数，使用区域校准网格在最多20个显微镜视野(400倍放大率)中对200个免疫过氧化物酶阳性细胞进行计数，或者对频率较低的最少20个显微镜视野进行计数。
[0294]
结果
[0295]
动物健康和生松素施用的安全性
[0296]
在整个治疗期间和整个试验过程中定期进行健康检查，直到安乐死。这是为了确定生松素治疗不会对接受试验的绵羊造成不良的健康问题或副作用。在整个生松素治疗期间(第8周至第12周，图2)，所有动物均保持健康。在此期间，动物的体重继续增加，在这些绵羊的预期正常范围内(图11)，并且无其他不良健康事件。
[0297]
据发现，在整个生松素治疗期间，在这些饲养条件下，绵羊的心脏和呼吸率都在预期的正常范围内。体核温度读数也在正常范围内。在两个采样时间点，血液白细胞的分类计数都在正常范围内。
[0298]
总之，根据所用的临床评估标准，发现生松素治疗对接受试验的全部十只绵羊均
未造成不良健康影响。
[0299]
生松素对肺功能的影响
[0300]
图12显示了在用生松素进行四次每周治疗后不同肺段的肺功能。所测量的肺功能参数是局部肺段的顺应性，称为cseg。一般而言，较低的顺应性水平意味着肺段的功能较差(即更难膨胀并且肺更僵硬)。正如预期的那样，仅接受损伤剂博来霉素而不接受生松素的肺段，与未经处理的健康对照肺段相比，具有显著更低的平均肺段顺应性(图12a)。接受损伤剂博来霉素和生松素的肺段具有更高的平均段顺应性，这与未经处理的健康对照肺段无显著差异(图12a)。单只绵羊的cseg数据显示，试验中的十只绵羊有八只在用博来霉素造成损伤并且用四次每周生松素输注进行治疗的肺段中具有功能改善(图12b，图18所示的表1)。所用的另一个肺功能评估是相对于基线的顺应性百分比变化(图12c)。它衡量了从研究开始(在博来霉素和生松素治疗之前)到最后生松素治疗完成后顺应性的变化。评估表明，在生松素的四次每周施用后，生松素处理的肺段的顺应性显著改善(图12c)。
[0301]
总之，生松素治疗显著改善了博来霉素损伤肺段的肺功能。
[0302]
生松素对支气管肺泡灌洗细胞的影响
[0303]
图13显示了用生松素进行四次每周输注治疗后的bal细胞数据。bal细胞是在试验的第12周即处死绵羊前两天从肺段采集的。在bal液中评估的细胞计数仅为中性粒细胞，以及主要炎症细胞的总和，所述炎症细胞包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞。正如正常健康肺所预期的那样，未经处理的健康对照肺段在bal液中具有相对较少的炎症细胞数量(图13)。
[0304]
相比之下，博来霉素损伤的肺段(不使用生松素)，与健康对照肺段相比，在bal液中具有显著更多的中性粒细胞和其他炎症细胞数量(图13)。接受损伤剂博来霉素并接受生松素处理的肺段，与从仅接受博来霉素而不接受生松素的肺段采集的细胞数量相比，显示出中性粒细胞和炎症细胞数量显著减少(图13)。单只绵羊的bal细胞数据显示，参与试验的十只绵羊有九只，与从用博来霉素损伤但不接受生松素输注的肺段采集的bal液中的炎症细胞数量相比，从用博来霉素损伤并且用生松素处理的肺段采集的炎症细胞数量较低(图13，图18所示的表1)。
[0305]
总之，生松素治疗显著减少了响应于博来霉素的破坏性暴露而浸润bal液的炎症细胞的数量。十分之九的绵羊在这些肺段的bal液中具有的浸润性炎症细胞的百分比有所降低。
[0306]
生松素对肺实质t细胞的影响
[0307]
图14显示了用生松素进行四次每周输注处理后的t细胞数据。在死后(第12周)采集的以不同方式处理的肺段的实质中评估t细胞。正如正常健康肺所预期的那样，未经处理的健康对照肺段在肺实质中具有相对较少的cd8+和cd4+ t细胞数量(图14)。
[0308]
相比之下，博来霉素损伤的肺段(不使用生松素)，与健康对照肺段相比，在肺实质中具有显著更多的cd8+和cd4+ t细胞数量(图14)。接受损伤剂博来霉素并接受生松素处理的肺段，与从仅接受博来霉素而不接受生松素的肺段采集的细胞数量相比，显示出肺实质中的cd8+和cd4+ t细胞数量显著减少(图14)。单只绵羊的细胞数据显示，参与试验的所有绵羊在生松素处理后cd8+和cd4+ t细胞较少(图14)。
[0309]
总之，生松素处理与驻留在肺实质中的免疫染色的cd8+和cd4+ t细胞数量的显著
减少相关。所评估的所有绵羊在生松素处理的肺段中t细胞数量有所减少。
[0310]
生松素对组织病理学的影响
[0311]
图15显示了用生松素进行四次每周处理后的组织病理学评分数据。所评分的组织病理学参数是炎症、纤维化和总体病理学。正如正常健康肺所预期的那样，未经处理的健康对照肺段，对于所评估的每个病理学参数具有低分(图15)。相比之下，博来霉素损伤的肺段(不使用生松素)，对于所测试的每个参数具有显著较高的平均分数(图15)。重要的是，接受伤害剂博来霉素并接受生松素处理的肺段，对于所评估的每个参数具有较低的平均分数(图15)。此外，与仅接受博来霉素输注的肺段相比，接受博来霉素和生松素二者的肺段具有显著较低的炎症和总体病理学分数(图15)。虽然与仅接受博来霉素输注的肺段相比，接受博来霉素和生松素输注的肺段具有较低的纤维化分数，但是差异无统计学显著性(图15)。单只绵羊的组织病理学数据表明，生松素治疗与参与试验的十只绵羊中的九只的总体病理学分数改善、十只绵羊中的九只的炎症分数改善以及十只绵羊中的八只的纤维化分数改善相关(图15，下图，图18所示的表1)。应当注意的是，对于所评估的全部三个参数，与生松素治疗相关的显著改善的病理学分数仍然均显著高于未经处理的对照肺段的相应病理学分数(图15)。
[0312]
总之，生松素治疗显著改善了博来霉素损伤的肺段的炎症组织病理学和总体病理学分数。十分之九的绵羊的这些肺段的总体病理学分数有所改善。
[0313]
生松素对胶原蛋白浓度的影响
[0314]
图16显示了在用生松素进行四次每周处理后胶原蛋白含量的羟脯氨酸测定法的数据。图16a的数据从大型试验中的全部10只动物收集，这些数据显示，与未接受博来霉素或生松素的健康肺对照肺段的胶原蛋白数据相比，仅输注博来霉素(不使用生松素)显著增加了胶原蛋白含量。生松素的施用未减少博来霉素诱发的胶原蛋白含量增加(图16a)。为了证实这些数据，将来自实施例1的试验研究中使用的三只绵羊的另外的胶原蛋白含量数据(参见图16b)包括在内。实施例1的试验使用与本实施例2试验中所用的相同的方案进行。因此，将来自全部13只绵羊的羟脯氨酸数据包括在该测定法中被认为在科学上是可接受的。图16b所示的来自全部13只绵羊的数据，强化了上文对图16a给出的解释，即生松素的施用不会减少博来霉素诱发的胶原蛋白含量增加。
[0315]
总之，如通过羟脯氨酸测定法所评估，生松素治疗与博来霉素损伤的肺段中的胶原蛋白含量的显著降低无关。
[0316]
生松素对马森三色染色的结缔组织的影响
[0317]
图17显示了在用生松素进行四次每周处理后经马森三色染色的结缔组织的数据。马森三色染色将大多数结缔组织染成蓝色。染色结缔组织包括胶原蛋白和其他与纤维化相关的胞外基质蛋白。因此，马森三色切片上的蓝色百分比值是用于评估暴露于博来霉素的肺段中的纤维化重塑的程度的读数。图17的数据显示，与未接受生松素处理的博来霉素输注的肺相比，生松素处理显著降低了暴露于博来霉素的肺段中染成蓝色的百分比。
[0318]
总体而言，数据显示，与博来霉素损伤但不使用生松素处理相关的蓝色分数百分比相比，参与试验的十只绵羊中有九只在博来霉素损伤并接受四次每周生松素输注治疗的肺段中具有蓝色百分比值降低(图1，图18所示的表1)。
[0319]
总之，生松素治疗与结缔组织含量的显著降低相关，如博来霉素损伤的肺段的蓝
色百分比值所示。
[0320]
讨论
[0321]
本研究利用生理学和药理学相关的肺纤维化的绵羊模型来确定由gretalsaustralia pty ltd从特殊生物来源提取的生物活性分子生松素的安全性和功效迹象。
[0322]
生松素处理后试验所用的绵羊的健康状况
[0323]
就生松素治疗的安全性而言，根据所用的临床评估标准，发现生松素治疗对接受试验的全部十只绵羊均未造成不良健康影响。事实上，在动物饲养环境中，在整个生松素治疗期间，心脏和呼吸率、体核温度和体重增加读数均在绵羊的预期正常范围内。
[0324]
据发现，暴露于生松素的小肺段相对正常，唯一显著的病理学可归因于与博来霉素输注相关的损伤的预期残余效应。在生松素暴露的肺段中，无可归因于生松素的其他病理学或肺损伤的明显迹象。
[0325]
生松素在实验性肺病的绵羊模型中改善若干疾病参数的功效。
[0326]
本研究的目的是为本文的实施例1详细描述的研究的有前景的发现提供统计功效。在该实施例中，使用10只绵羊来在统计学上证实生松素在肺纤维化的绵羊模型中的功效。主要发现是，生松素的施用能够改善肺功能，减轻肺部炎症，并降低博来霉素损伤诱发的总体病理学分数。重要的是，数据的统计学分析表明，与未经处理的肺段对照的对应数据相比，这些疾病读数在生松素处理的肺段中得到显著改善。
[0327]
就肺功能而言，如通过顺应性(肺段僵硬度的度量)所评估，据发现，生松素治疗显著改善了博来霉素损伤的肺段的功能顺应性。这表明，生松素治疗在受损伤的肺段中的作用导致这些肺段的功能发挥水平高于其他肺段。
[0328]
相似地，从正在研究的肺段回收的肺灌洗炎症细胞的鉴定表明，生松素治疗显著减少了占据肺泡和小气道腔隙的炎症细胞数量。事实上，在生松素治疗后，十分之九的绵羊的从受损伤的肺段回收的炎症细胞数量有所减少。在肺灌洗液中减少的主要炎症细胞类型是中性粒细胞，它从无药物治疗的博莱霉素肺段的7.4％的总bal细胞下降到生松素处理的博来霉素损伤的肺段的3.7％。肺实质中的生松素相关的cd4+和cd8+ t细胞减少与从生松素和博来霉素暴露的肺段的肺灌洗液回收的炎症细胞减少在整体上一致。cd4+和cd8+ t细胞是很多免疫反应的细胞实验组中的重要组成部分。总体而言，这些数据支持了生松素具有很强的抗炎性质的观点。
[0329]
就组织病理学分数而言，在生松素治疗后受损伤的肺段的平均炎症和总体病理学分数得以改善。重要的是，与未使用生松素治疗的实验性损伤的肺相比，生松素治疗的受损伤的肺的这些读数在统计学上较低。此外，与未使用生松素治疗的实验性损伤的肺相比，生松素治疗的受损伤的肺的平均纤维化病理学分数较低。
[0330]
对来自以不同方式处理的肺段的组织样品进行羟脯氨酸测定法。羟脯氨酸测定法测量蛋白质样品中的胶原蛋白的水平，并且在本领域中被认为是组织中的纤维化水平的金标准读数指标。该测定法表明，生松素未解决与博来霉素损伤相关的胶原蛋白含量增加问题。马森三色测定法(另一种经常用于评估纤维化程度的读数指标)表明，与未接受药物治疗的博来霉素暴露的肺切片相比，染成蓝色的百分比(即结缔组织含量的度量，在本测定法中所有胞外蛋白质都被染成蓝色)在博来霉素暴露和生松素处理的肺切片中显著较低。总
之，来自羟脯氨酸和马森三色测定法的数据表明，生松素具有使一些胞外基质蛋白质减少的能力(如马森三色数据所示)，但是不一定使胶原蛋白减少(通过羟脯氨酸数据证实)。总体而言，来自纤维化分数、马森三色和羟脯氨酸测定法的数据表明，生松素具有适度的抗纤维化作用，以及一些抗重塑性质。
[0331]
在最后一次博来霉素输注后第7天开始生松素施用，这意味着该药物在急性炎症后施用，主要在肺纤维化的纤维化阶段施用。生松素在纤维化阶段施用并且显示出适度的抗重塑作用，但是具有很强的抗炎作用，这一事实使人们相信生松素应能够很好地转化为治疗一系列人类炎性疾病。
[0332]
本领域的技术人员将理解，除具体描述的那些之外，本文所述的本发明很容易进行进一步变化和修改。应当理解，本发明包括落入本发明的精神和范围内的所有这些变化和修改。
[0333]
虽然已经结合详细显示和描述的优选的实施方案公开了本发明，但是对本发明进行的各种修改和改进对于本领域的技术人员而言将是显而易见的。
[0334]
因此，本发明的精神和范围不受前述实施例的限制，而是在法律允许的最广泛的意义上被理解。