用于递送胰岛素和胰高血糖素的治疗性混合微针贴片

用于递送胰岛素和胰高血糖素的治疗性混合微针贴片
1.相关申请的引证
2.本技术要求2020年7月7日提交的美国临时专利申请第63/048,913号的优先权，该申请通过引用并入本文。根据35 u.s.c.
§
119和任何其他适用的法规要求优先权。
技术领域
3.本技术领域一般涉及结合微针的治疗性混合微针贴片或贴片系统，用于将胰岛素和胰高血糖素递送至哺乳动物受试者。
4.关于联邦政府资助的研究与开发的声明
5.本发明是在政府支持下完成的，资助号为dk112939，由美国国立卫生研究院授予。政府对本发明享有某些权利。


背景技术：

6.胰岛通过β-细胞产生的胰岛素和α-细胞分泌的胰高血糖素的相互调节在血糖稳态中起关键作用。1型糖尿病(t1d)是一种自身免疫性疾病，其中胰腺β细胞遭到破坏，胰岛素分泌不足。另一方面，2型糖尿病(t2d)是由胰岛素抵抗和胰岛素分泌受损的β细胞功能障碍引起的代谢紊乱。目前针对t1d和晚期t2d的治疗方法都针对胰岛素缺乏症，包括皮下胰岛素注射或输注、内源性胰岛素刺激和新型葡萄糖响应性胰岛素给药等方式。尽管这些疗法可有效治疗高血糖症，但它们存在低血糖症的风险，因此需要患者监测并快速应对低血糖发作，以防止发展为癫痫发作、昏迷或死亡。
7.最近已经认识到，β细胞的破坏可能破坏其他胰岛细胞类型并导致胰高血糖素从α细胞分泌过多或分泌不足。α细胞功能障碍可进一步加剧糖尿病患者的高血糖，重要的是，由于胰岛素治疗期间的异常反调节响应，可能会增加严重低血糖的风险。因此，研究人员专注于探索重新编程和调节α细胞功能的方法。不幸的是，与解决β细胞破坏或功能障碍引起的胰岛素缺乏的葡萄糖响应性胰岛素递送系统的进展相比，开发治疗α细胞功能障碍和减轻急性低血糖相关风险的治疗系统仍然具有挑战性。


技术实现要素：

8.在一个实施方式中，提供了一种治疗性混合微针贴片，其可以葡萄糖依赖性方式将胰岛素和胰高血糖素递送至哺乳动物组织。治疗性混合微针贴片由含有胰岛素或胰高血糖素的微针的两个不同贴片区域构成，因此模仿胰岛细胞的功能以全面调节血糖水平。在一个实施方式中，两个不同的贴片区域由相同的3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸(apba)、甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐(amh)和1-乙烯基-2-吡咯烷酮(vp)单体共聚合而成，但含有不同比例的各单体。治疗性混合微针贴片的一些微针装有胰岛素，而其他微针则装有胰高血糖素。最终的治疗性混合型微针贴片中胰岛素或胰高血糖素的负载比例可以通过每种类型微针各自的数量进行调节。例如，在一个实施方式中，治疗性混合微针贴片中约四分之一的微针载有胰高血糖素，而其余微针(即约四分之三)载有胰岛素。进一步考虑超出该特定实施方
式的其他比率或分数。
9.为了制造治疗性混合微针贴片，使用掩模介导的顺序光聚合制备方法，该方法有助于将分别加载胰岛素和胰高血糖素的两个贴片区域整合到微针阵列贴片中，微针阵列贴片模拟胰岛细胞分泌胰岛素或胰高血糖素以响应血浆葡萄糖水平(pgl)。通过安排微针的加载模式，可以很容易地调节治疗性混合微针贴片的组成比。人胰岛由50-60％的β细胞和30-45％的α细胞组成。类似地，在一个实施方式中，该治疗性混合微针贴片中约四分之一的微针装有胰高血糖素，而其余微针则装有胰岛素。
10.在一个实施方式中，用于将胰岛素和胰高血糖素递送至活的哺乳动物组织的治疗性混合微针贴片包括具有多个微针的基底，微针从基底的表面延伸开，其中第一多个微针包含载有胰岛素的生物相容性聚合物，且第二多个微针包含载有胰高血糖素的生物相容性聚合物。在一个实施方式中，第一多个微针可位于治疗性混合微针贴片的第一区域，而第二多个微针可位于治疗性混合微针贴片的第二区域。在其他实施方式中，不同的微针类型(例如，含胰岛素或含胰高血糖素)可以相互穿插。
11.在另一个实施方式中，用于将胰岛素和胰高血糖素递送至哺乳动物活体组织的治疗性混合微针贴片系统包括第一贴片，该第一贴片包括具有多个微针的基底，微针从基底的表面延伸，其中第一贴片的微针包括载有胰岛素的生物相容性聚合物，第二贴片包括基底，其具有多个从基地表面延伸的微针，其中，第二贴片的微针包含载有胰高血糖素的生物相容性聚合物。第一和第二贴片施加于组织。在其他实施方式中，可能有另外的第一或第二贴片也被施加以调谐或调节胰岛素与胰高血糖素的比率(或反之亦然)。
12.在另一个实施方式中，使用治疗性混合微针贴片的方法包括将治疗性混合微针贴片放置在哺乳动物的活体组织上，使得多个微针刺入组织(例如，透皮施加中的皮肤组织)。治疗性混合微针贴片在组织上保留一段时间(例如，数小时、数天、许多天)。完成后，将治疗性混合微针贴片从组织中移除。
13.在另一个实施方式中，一种制造治疗性混合微针贴片的方法包括提供其中包含多个针状腔体的模具；在模具的一部分上形成掩模；在模具的非掩蔽部分上施加含有3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸(apba)、甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐(amh)、1-乙烯基-2-吡咯烷酮(vp)、胰高血糖素、交联剂和光引发剂的含胰高血糖素的溶液；移除掩模；用紫外光交联含胰高血糖素的溶液；在先前掩蔽的模具部分上施加含有3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸(apba)、甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐(amh)、1-乙烯基-2-吡咯烷酮(vp)、胰岛素、交联剂和光引发剂的含胰岛素的溶液；用紫外光交联含胰岛素的溶液；在模具上施加背衬材料并固化背衬材料；将治疗性混合微针贴片与模具分离。当然，可首先施加含胰岛素的溶液、交联，然后施加含胰高血糖素的溶液。此外，第一聚合物溶液可以在掩模仍然存在的情况下交联。不同的生物相容性聚合物可用于形成含有胰岛素和胰高血糖素的微针。
附图说明
14.图1a示出根据一个实施方式的用于递送胰岛素和胰高血糖素的治疗性混合微针贴片的平面图。治疗性混合微针贴片包括基底或基材以及从其表面延伸的多个微针。
15.图1b示出治疗性混合微针贴片的剖视图，示出基底或基材和从其表面延伸的多个微针。胰岛素和胰高血糖素被示出为设置在微针内。
16.图1c示出施加于哺乳动物(例如人类)组织的治疗性混合微针贴片。
17.图1d示出治疗性混合微针贴片的替代实施方式的平面图。
18.图1e示出治疗性混合微针贴片系统的替代实施方式，其包括具有加载有胰岛素的微针的第一贴片和具有加载有胰高血糖素的微针的第二贴片。
19.图2a是治疗性混合微针贴片的制造过程和葡萄糖响应血糖控制机制的示意图。高血糖和低血糖条件可分别促进胰岛素或胰高血糖素的释放。模具两个角处缺失的微针用于方向标记。
20.图2b是罗丹明b标记的胰高血糖素(青色)和cy5标记的胰岛素(品红色)混合微针贴片的平铺扫描荧光显微镜顶视图图像。比例尺，2毫米。
21.图2c是交叉处治疗性混合微针贴片的摄影图像(顶部)和扫描电子显微镜图像(底部)。比例尺，300μm。
22.图2d是分别显示胰高血糖素和胰岛素微针的机械性能的图。代表性的放大微针sem图像放置在每条曲线旁边。比例尺，100μm。
23.图3a示出葡萄糖调节的胰岛素/胰高血糖素释放的机制和体外评估。在高血糖条件下，葡萄糖-硼酸盐复合物的形成会增加周围的负电荷。(i)带正电的聚合物基质之间的排斥力被中和，诱导聚合物收缩并减慢胰高血糖素的扩散。(ii)带负电荷的胰岛素和带正电荷的聚合物基质之间的静电引力减弱，以促进胰岛素从微针中释放。(图3b-3c)。
24.图3b示出在37℃，ph7.4下，在不同葡萄糖浓度下，葡萄糖响应性聚合物基质的体外累积的胰岛素释放。数据点是平均值
±
标准差(n＝3)。
25.图3c示出在37℃、ph7.4下，在不同葡萄糖浓度下，葡萄糖响应性聚合物基质的体外累积的胰高血糖素释放。数据点是平均值
±
标准差(n＝3)。
26.图3d-3e通过在50mg/dl和400mg/dl之间交替葡萄糖浓度示出胰岛素(图3d)和胰高血糖素(图3e)的脉冲释放。每种溶液中胰高血糖素和胰岛素的孵育时间分别为15分钟和30分钟。数据点是平均值
±
标准差(n＝3)。
27.图3f-3g示出在指定的葡萄糖浓度下，胰岛素(图3f)和胰高血糖素(图3g)从治疗性混合微针贴片中的葡萄糖响应性释放。累积释放用elisa量化。数据点是平均值
±
标准差(n＝3)。统计显著性由双尾student’s t检验确定。**p《0.01、***p《0.001和****p《0.0001。
28.图4a-4f示出葡萄糖响应性胰岛素和胰高血糖素从微针释放的体内评价。(图4a)糖尿病小鼠(n＝5)在施加仅含胰岛素的贴片(胰岛素剂量：50mg/kg)后的pgl和血浆人胰岛素浓度。(图4b)在糖尿病小鼠(n＝5)中施加仅含胰岛素的贴片(胰岛素剂量：50mg/kg)后4小时，在时间＝0时由腹膜内葡萄糖激发触发的体内葡萄糖响应性胰岛素释放。葡萄糖剂量：3g/kg。(c-d)糖尿病小鼠(n＝5)分别在高血糖状态和低血糖状态下(由隔夜禁食和皮下注射2u/kg胰岛素诱导)用仅含胰高血糖素的贴片(胰高血糖素剂量：17mg/kg)治疗的pgl(图4c)和血浆胰高血糖素浓度(图4d)。统计显著性由双尾student’s t检验确定。(图4e-4f)用仅在胰高血糖素贴片给药后两小时由皮下注射70u/kg胰岛素(用箭头表示)激发的仅含胰高血糖素的贴片(胰高血糖素剂量：17mg/kg)治疗的糖尿病小鼠(n＝5)中的pgl(图4e)和血浆胰高血糖素浓度(图4f)。统计显著性由双尾student’s t检验确定。*p《0.05，**p《0.01。
29.图5a-5d示出治疗性混合微针贴片保护作用的体内评价。(图5a-5b)糖尿病小鼠(n
＝5)在用仅含胰岛素的贴片(胰岛素剂量：50mg/kg)或治疗性混合微针贴片(胰岛素剂量：50mg/kg，胰高血糖素剂量：17mg/kg)治疗后的pgl(图5a)和低血糖指数(图5b)。(图5c-d)糖尿病小鼠(n＝5)在用仅含胰岛素的贴片(胰岛素剂量：50mg/kg)或治疗性混合微针贴片(胰岛素剂量：50mg/kg，胰高血糖素剂量：17mg/kg)治疗后禁食六小时(突出显示区域)的pgl(图5c)和低血糖指数(图5d)。统计显著性由双尾student’s t检验确定，**p《0.01。低血糖指数定义为初始和最低pgl读数之差除以达到最低pgl所花费的时间。
30.图6示出用治疗性混合微针贴片经皮治疗后台盼蓝(trypan blue)染色的小鼠背部皮肤的图像。比例尺，600μm。
31.图7a和7b说明溶解度确定图像。图像(顶部)和550nm处的吸光度(底部)表明实验中使用的胰高血糖素(图7a)和胰岛素(图7b)的溶解度。将溶解在0.1mhcl中的50μl 20mg/ml胰岛素或胰高血糖素添加到具有指定ph值的1ml缓冲液中。数据点是平均值
±
标准差(n＝3)。
32.图8示出单体筛选的结果(amh/apba比率为1.1)。体外累积胰高血糖素从聚合物基质释放，amh/apba比率为1.1。释放曲线是在指定的葡萄糖浓度、37℃、ph7.4下绘制的。数据以平均值
±
标准差(n＝3)表示。
33.图9示出单体筛选的结果(amh/apba比率为1.4)。体外累积胰高血糖素从聚合物基质释放，amh/apba比率为1.4。释放曲线是在指定的葡萄糖浓度、37℃、ph7.4下绘制的。数据以平均值
±
标准差(n＝3)表示。
34.图10a-10d示出具有改变的amh和apba比例的葡萄糖响应性胰高血糖素性能。(图10a-10d)体外累积的胰高血糖素从聚合基质释放，amh/apba比率分别为0.5、0.8、1.1和1.4。释放曲线是在指定的葡萄糖浓度、37℃、ph7.4下绘制的。数据以平均值
±
标准差(n＝3)表示。
35.图11a-11c示出具有改变的amh和apba比率的葡萄糖响应性胰岛素性能。(图11a-11b)体外累积的胰岛素从聚合物基质释放，amh/apba比率分别为0.5(图11a)、1.3(图11b)和2.6(图11c)。释放曲线是在指定的葡萄糖浓度、37℃、ph7.4下绘制的。数据以平均值
±
标准差(n＝3)表示。
36.图12a-12d示出基质辅助激光解吸电离-飞行时间(maldi-tof)质谱。图12a-12d显示天然胰高血糖素(图12a)、从微针释放的胰高血糖素(图12b)、天然胰岛素(图12c)和从微针释放的胰岛素(图12d)的maldi-tof质谱。
37.图13a-13d示出仅含胰高血糖素的贴片的保护作用。(图13a)用仅含胰高血糖素的贴片(胰高血糖素剂量：17mg/kg)治疗的糖尿病小鼠与对照小鼠(未治疗)的pgl。(图13b)使用或不使用仅含胰高血糖素的贴片(胰高血糖激素剂量：17mg/kg)治疗的处于低血糖状态的糖尿病小鼠的pgl(通过隔夜禁食2u/kg胰岛素注射诱导)。(图13c)在注射70u/kg胰岛素后用仅含胰高血糖素的贴片(胰高血糖素剂量：17mg/kg)治疗和未治疗的糖尿病小鼠的pgl。(图13d)胰高血糖素贴片给药(胰高血糖素剂量：17mg/kg)后2小时注射70u/kg胰岛素后的pgl恢复。数据代表平均值
±
标准差(n＝5)。
38.图14示出苏木精和伊红(h&e)染色结果的图像。仅含胰高血糖素的贴片或仅含胰岛素的贴片分别施加于小鼠皮肤10小时或24小时。在微针移除后1、3和7天收获皮肤的治疗部分。给药一周后微针治疗部位的中性粒细胞浸润不明显。比例尺，200μm。
39.图15示出根据一个实施方式的治疗性混合微针贴片的制造所涉及的操作。
具体实施方式
40.图1a示出根据一个实施方式的用于将胰岛素和胰高血糖素递送至哺乳动物组织100(图1c)的治疗性混合微针贴片10的平面图。如本文所述，将胰岛素和胰高血糖素加载到在贴片10中形成的微针14a、14b中。治疗性混合微针贴片10由本文所述的生物相容性聚合物制成。在一些实施方式中，治疗性混合微针贴片10可以是部分或完全可生物降解的。在治疗性混合微针贴片10的上下文中，术语可生物降解是指基底或基材12和/或微针14a、14b由至少部分可生物降解的材料形成。在其他实施方式中，例如本文实验中描述的特定生物相容性聚合物系统，治疗性混合微针贴片10施加于组织100并在胰岛素和胰高血糖素释放时保持不变。然后在一段时间后将治疗性混合微针贴片10从组织中移除。这可能是在最初施加治疗性混合微针贴片10后数小时或数天/许多天。
41.在一个实施方式中，单个治疗性混合微针贴片10内的一些微针14a加载有胰岛素，而同一治疗性混合微针贴片10内的其他微针14b加载有胰高血糖素。可以通过改变加载有胰岛素和/或胰高血糖素的微针14a、14b的数量来调节或调谐治疗性混合微针贴片10内的胰岛素与胰高血糖素(或胰高血糖素与胰岛素)的比率。在一个实施方式中，治疗性混合微针贴片10含有比胰高血糖素更多的胰岛素。例如，治疗性混合微针贴片10中含有胰岛素的微针14a的数量可能占治疗性混合微针贴片10中微针14a、14b总数的大部分。因此，在该示例中，治疗性混合微针贴片10中超过50％的全部微针14a、14b装有胰岛素(即微针14a)。剩余的微针14b可以加载胰高血糖素。在另一个实施方式中，大约75％的微针14a加载有胰岛素，而大约25％的微针14b加载有胰高血糖素。应当理解，治疗性混合微针贴片10中胰岛素和胰高血糖素的相对量可以根据需要进行调节或调谐(例如，胰岛素：胰高血糖素比例为50.1:49.9、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20及它们之间的点)。虽然治疗性混合微针贴片10中胰岛素和胰高血糖素的相对量可通过治疗性混合微针贴片10中微针14a、14a的相应数量进行调节，但可以使用其他方法来控制每一种的相对量(例如，比率)。例如，可以使某些微针14a、14b的负载能力更大以适应更大负载的胰岛素和/或胰高血糖素。例如，某些微针14a、14b可以比其他微针14a、14b大以增加负载能力。在这样的实施方式中，可以调节胰岛素和/或胰高血糖素的相对量而不必改变微针14a、14b的数量。
42.在一个实施方式中，治疗性混合微针贴片10可以施加于活的哺乳动物组织100，以治疗哺乳动物受试者的高血糖和低血糖病症。在一个具体实施方式中，治疗性混合微针贴片10用于治疗糖尿病。哺乳动物组织100可包括任何组织，但皮肤组织100被认为是最合适的。治疗性混合微针贴片10因此是透皮治疗。
43.治疗性混合微针贴片10包括基底或基材12，其包括从基材12延伸或突出的多个微针14a、14b。多个微针14a、14b通常从基底或基材12的表面沿垂直方向延伸或突出(见图1b)。多个微针14a、14b可以布置成如图1a所示的规则重复阵列，或者，它们可以随机排列。在一个实施方式中，形成在基底或基材12上的多个微针14a、14b可具有基本相似的形状和尺寸。然而，在其他实施方式中，多个微针14a、14b可具有不同的形状和/或尺寸。例如，从基底或基材12延伸的微针14a、14b的阵列或场的周边区域可以比治疗性混合微针贴片10的中心区域更长或具有不同的尺寸和/或形状，以更好地将治疗性混合微针贴片10固定到施加
部位。同样，在其他实施方式中，包含胰岛素的微针14a可具有与包含胰高血糖素的微针14b不同的尺寸和/或形状(或大小)。
44.在一个特定的实施方式中，微针14a、14b，正如其名称所暗示的，具有针状形状。例如，微针14a、14b可包括有助于刺入组织100(见图1c)的尖锐尖端16(见图1b)。微针14的长度(l)可以变化，但通常微针14a、14b从基底或基材12延伸小于约2.0mm(图1b)。微针14的典型长度约为500-1,500μm，但大小可能超出该范围。微针14a、14b的基底18比尖端16宽。通常，微针14a、14b的基底18的直径或宽度(w)可小于约600μm(例如，300μm基底宽度和大约700μm的高度)(图1b)。微针14a、14b可以通过几百μm(例如，200μm)的间距或间隔彼此分开。微针14a、14b的特定数量、密度、大小和形状由用于形成治疗性混合微针贴片10的模具的特定构造控制，这将在下面更详细地描述。如本文所述，微针14a、14b是金字塔形的(例如金字塔形)，但也可以考虑其他形状(例如圆锥形)。治疗性混合微针贴片10的基底12可包括水合或溶胀时的柔性材料。微针14a、14b的数量和配置可以根据受试者而变化。例如，较大的哺乳动物可能需要具有较多微针14a、14b的较大治疗性混合微针贴片10。在测试的治疗性混合微针贴片10中，使用了30x30阵列的微针14a、14b。
45.仍然参照图1a和1b，固定微针14a、14b的基底或基材12可以任选地结合或以其他方式粘附到背衬材料20(例如，通过使用粘合剂、化学连接等)。背衬材料20可以由机织织物、诸如聚氯乙烯、聚乙烯或聚氨酯的塑料材料或乳胶制成。背衬材料20可以是柔性的，使得治疗性混合微针贴片10在施加时可以保形地覆盖组织100(见图1c)。可选地，背衬材料20可以包括覆盖背衬材料20的全部或部分面向组织的表面的粘合剂材料22。例如，粘合剂可以形成在围绕基底或基材12或背衬材料20的周边的背衬材料20上，使得基底或基材12可以固定在组织100的表面上。粘合材料22有助于将治疗性混合微针贴片10固定到组织100。粘合材料22可包括树脂(例如乙烯基树脂)、丙烯酸酯如甲基丙烯酸酯环氧二丙烯酸酯。在其他实施方式中，可以完全省略背衬材料20。或者，治疗性混合微针贴片10可以通过微针14在组织100中的接合固定到组织100。在其他替代方案中，治疗性混合微针贴片10可以使用基底或基材12上的粘合剂或胶水固定到组织100。单独的绷带或包裹物也可用于将治疗性混合微针贴片10固定到组织100。
46.在图1d所示的一个替代实施方式中，可以将多个子贴片24整合到背衬材料20中以制成最终的治疗性混合微针贴片10。这对于大覆盖区域或可能对基底或基材12造成破损风险的弯曲表面可能是有用的。各种子贴片24虽然具有一定的刚性，但由于柔性背衬材料20能够使整个治疗性混合微针贴片10弯曲，因此仍然能够贴合组织100的表面(例如，图1c)。因为单个子贴片24的尺寸较小，它们不会受到显著的弯曲应力，否则会导致更大的刚性结构响应弯曲和/或操作而断裂。在子贴片24所在的位置之间(例如，在子贴片24的行和列之间)可以在背衬材料20内发生弯曲或挠曲。在该实施方式中，某些子贴片24可以包括加载有胰岛素的微针14a，而其他子贴片24可以包括加载有胰高血糖素的微针14b(图1d中所示)。
47.作为又一替代并且参照图1e，使用了多个治疗性混合微针贴片10。在该实施方式中，提供了第一治疗性混合微针贴片10a，其具有其中含有胰岛素的微针14a。提供第二治疗性混合微针贴片10b，其具有其中含有胰高血糖素的微针14b。治疗性混合微针贴片10a、10b均施加于组织100，以实现与具有加载有胰岛素和胰高血糖素的微针14a、14b的单个贴片10相同或相似的结果。胰岛素和胰高血糖素的特定比例或相对组成(例如本文在单个治疗性
混合微针贴片10的上下文中描述的示例)可以通过例如调节两个治疗性混合微针贴片10a、10b中的微针14a、14b的数量、大小和形状来调节。治疗性混合微针贴片10a、10b可以共同位于组织100的相同区域，或者它们可以放置在组织100上的不同位置。虽然这个替代实施方式使用两个治疗性混合微针贴片10，应当理解，可以使用额外数量的治疗性混合微针贴片10。例如，可以存在在微针14a中包含胰高血糖素的单个治疗性混合微针贴片10a和在微针14b中包含胰岛素的两个(或更多)治疗性混合微针贴片10a。可以给正在施加治疗性混合微针贴片10a、10b的患者或受试者开具处方或说明，以例如将一种类型的治疗性混合微针贴片10a与一种或多种其他类型的治疗性混合微针贴片10b组合施加。当然，将两种类型的微针14a、14b并入单个治疗性混合微针贴片10可防止患者或护理人员意外偏离胰岛素与胰高血糖素的所需比例，因为仅施加了单个治疗性混合微针贴片10。
48.治疗性混合微针贴片10的微针14a、14b由3-(丙烯酰胺基)苯硼酸(apba)、甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐(amh)和1-乙烯基-2-吡咯烷酮(vp)单体共聚而成但含有胰岛素或胰高血糖素。如本文所述的掩模介导的顺序光聚合制备方法有助于将分别加载有胰岛素和胰高血糖素的两种类型的微针14a、14b整合到治疗性混合微针贴片10中，其模拟胰岛细胞分泌胰岛素或胰高血糖素以响应血浆葡萄糖水平(pgl)。治疗性混合微针贴片10中胰岛素和胰高血糖素的组成比可以通过微针14a、14b的加载模式的排列而容易地调节。
49.为了形成用于将胰岛素和胰高血糖素递送至活组织的治疗性混合微针贴片10，使用模塑工艺。图15说明根据一个实施方式制造治疗性混合微针贴片10的操作。在操作200中，提供模具(例如，由硅制成)，其包含多个针状腔体。模具可由多种材料制成，包括硅、金属、玻璃等。接下来，如在操作210中所见，将掩模放置在模具的一部分上。模具被掩模覆盖的区域被阻挡以防止液体预聚物溶液进入针状腔体。掩模可以被配置成使治疗性混合微针贴片10的专用区域包含含胰岛素的微针14a和含胰高血糖素的微针14b，或者它们可能相互穿插。
50.接下来，如在操作220中所见，将预聚物溶液施加到模具。在一个实施方式中，该预聚物溶液包括含胰高血糖素的溶液，该溶液含有3-(丙烯酰胺基)苯硼酸(apba)、甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐(amh)、1-乙烯基-2-吡咯烷酮(vp)、胰高血糖素、交联剂和光引发剂。这适用于流体进入模具非掩蔽部分中的针状腔体的模具。在操作230中，移除掩模，并且在操作240中，填充第一多个针状腔体的含胰高血糖素的溶液然后经受紫外光以引发交联。请注意，可以在交联操作之后或之前去除掩模。在该第一交联操作之后，将第二预聚物溶液施加到模具以填充剩余的第二多个针状腔体。这在图15的操作250中示出。在一个实施方式中，该预聚物溶液包括含胰岛素的溶液，该溶液含有3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸(apba)、甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐(amh)、1-乙烯基-2-吡咯烷酮(vp)、胰岛素、交联剂和光引发剂，该溶液覆盖在之前掩蔽的模具部分上。在操作260中，含胰岛素的溶液然后经受紫外光以引发第二预聚物溶液的交联。接下来，在操作270中，将背衬材料施加到模具上并固化。固化后，如操作280所示，现在形成的治疗性混合微针贴片10然后与模具分离。治疗性混合微针贴片10可以保持在这种“干燥”状态直到使用。
51.虽然在模具中形成的特定治疗性混合微针贴片10使用紫外光交联，但应该理解，其他聚合物材料可以使用其他光波长来引发聚合物材料的交联。此外，一些替代实施方式可以完全省略光并使用交联剂引发交联，该交联剂在放置到模具上之前添加到聚合物前体
材料(例如，预聚物溶液)中。在其他实施方式中，可以使用诸如热的外部刺激来引发交联过程。
52.为了使用治疗性混合微针贴片10，将治疗性混合微针贴片10施加到组织100。在一个示例中，治疗性混合微针贴片10被用力手动压入组织100(例如，皮肤)中。使得微针14a、14b刺入组织。诸如冲压工具、辊等的施加器也可用于施加治疗性混合微针贴片10。治疗性混合微针贴片10可通过机械粘附、通过使用粘合剂或通过绷带、包裹物等可将治疗性混合微针贴片10固定至组织的方式粘附至组织。治疗性混合微针贴片10在可能包括数小时或数天/许多天的时间段内保持在适当位置。在流逝的时间之后或在治疗性混合微针贴片10不再如所期望的那样发挥作用之后，治疗性混合微针贴片10从组织100移除。用户或医疗保健提供者可以物理地从组织移除治疗性混合微针贴片10。在使用多个治疗性混合微针贴片10a、10b的实施方式中，多个治疗性混合微针贴片10a、10b以相同方式施加和移除。
53.实验
54.本发明公开了一种治疗性混合微针贴片10，其可以葡萄糖依赖性方式递送胰岛素和胰高血糖素。治疗性混合微针贴片10由加载胰岛素的微针14a或加载胰高血糖素的微针14b的区域构成，从而模拟胰岛细胞的功能以全面调节血糖水平。微针14a、14b由3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸(apba)、甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐(amh)、1-乙烯基-2-吡咯烷酮(vp)等相同单体共聚而成，但各单体的比例不同(图2a)。如上所述的掩模介导的顺序光聚合制备策略有助于将分别加载胰岛素和胰高血糖素的两种类型的微针14a、14b整合到治疗性混合微针贴片10中，其模拟胰岛细胞分泌胰岛素或胰高血糖素以响应血浆葡萄糖水平(pgl)。通过安排微针14a、14b的加载模式(或在其他实施方式中通过使用多个治疗性混合微针贴片10a、10b)可以容易地调节治疗性混合微针贴片10的组成比。人胰岛由50-60％的β细胞和30-45％的α细胞组成。类似地，在一个特定的实现方法或实施方式中，治疗性混合微针贴片10中四分之一的微针14b加载有胰高血糖素，而其余四分之三的微针14a加载有胰岛素。
55.治疗性混合微针贴片10的微针14a、14b包含加载胰岛素和胰高血糖素的聚合物基质。为了将胰高血糖素制剂分配到四分之一的微针14b中，使用聚乙烯吡咯烷酮(pvp)微针“掩模”来防止液体渗入微针模具的胰岛素微针14a中。然后将vp、amh、apba、光引发剂和交联剂的胰高血糖素预载(7wt.％)单体混合物添加到模具中，然后在冰上进行真空和光聚合。在载有胰高血糖素的微针14b凝固后，剥离掩模，将含有相同单体成分但比例不同的胰岛素预载(7wt.％)混合物添加到模具中，并进行相同的真空和光聚合处理。所形成的金字塔形微针14a、14b在底部宽度为300μm，高度为700μm，排列成30
×
30阵列。为了使治疗性混合微针贴片10具有透明的柔性基底或基材12，在微针14a、14b的顶部使用了商用紫外线固化材料norland optical adhesive 86，用于脱模。治疗性混合微针贴片10的荧光图像表明，罗丹明b标记的胰高血糖素针和cy5标记的胰岛素针成功分离成预先设计的图案(图2b)。放大的照片和sem图像(图2c)进一步证实了两种类型的微针14a、14b的成功结合，表面形态的差异可以忽略不计。此外，测量了胰岛素和胰高血糖素微针14a、14b的断裂力，发现分别为每根微针0.26n和0.28n(图2d)，两者都足以穿透皮肤(图6)。
56.胰岛素和胰高血糖素递送的葡萄糖响应机制可归因于amh/apba聚合物网络在不同葡萄糖浓度下的协同净电荷转移，胰岛素和胰高血糖素在生理ph值下的等电点(pi)差异，以及随之而来的周围聚合物凝胶基质的收缩或膨胀(图3a)。胰岛素具有约ph 5.4的等
电点，因此在生理ph下呈现负电荷和高溶解度。相比之下，胰高血糖素在6至8的ph范围内具有低溶解度，因为它的等电点约为7.1(参见图7a和7b)。apba单体可以与葡萄糖可逆地结合生成带负电荷的环状硼酸酯。同时，带正电荷的amh单体用于调节聚合物基质的电荷；该单体以1.1和1.4的比例(图8和9)优于与apba搭配使用的其他九种带正电荷的单体。胰岛素或胰高血糖素的葡萄糖响应性释放通过操纵主要单体成分的比例来确定(图10a-10d和11a-11c)，胰高血糖素针14b的amh与apba的比例为1.4，胰岛素针14a的amh与apba的比例为2.6。当条件从正常血糖变为高血糖时，会形成带更多负电荷的葡萄糖-硼酸盐复合物。净正电荷的减少削弱了胰岛素和带正电荷的基质之间的静电引力，促进了胰岛素分子从胰岛素微针14a中的释放。对于胰高血糖素基质，增加的负电荷中和最初带正电的基质，其收缩聚合物网络并阻止胰高血糖素分子从胰高血糖素微针14b扩散。在400mg/dl的高葡萄糖水平下，观察到促进的胰岛素释放和有限的胰高血糖素释放(图3b和3c)。当周围条件低血糖时，胰岛素基质恢复初始净电荷，减缓胰岛素释放，而增加的正净电荷在基质中产生排斥相互作用，使胰高血糖素分子从聚合物网络中释放出来。通过记录嵌入amh与apba摩尔比为0.5、0.8和1.1的聚合物基质的释放曲线，验证了这种胰高血糖素释放机制，其中逆转amh和apba的量导致葡萄糖响应行为的相反模式(图10a-10d)。
57.分别表征胰岛素和胰高血糖素制剂的脉冲释放曲线，并通过聚合物基质在低血糖(50mg/dl)和高血糖溶液(400mg/dl)中的交替温育来证明几个葡萄糖响应性激素释放循环)(图3d和3e)。为了评估整合的胰岛素和胰高血糖素制剂的葡萄糖响应行为，通过酶联免疫吸附测定(elisa)量化了不同葡萄糖浓度下的激素水平。如图3f-3g所示，葡萄糖依赖性释放性能与个体释放曲线相似。胰岛素或胰高血糖素从它们相应的微针14a、14b的释放速率以葡萄糖依赖但反调节的方式被调节。此外，天然胰岛素/胰高血糖素和从微针14a、14b释放的胰岛素/胰高血糖素的基质辅助激光解吸电离飞行时间(maldi-tof)质谱分析证实，蛋白质分子在整个聚合过程中保持完整(图12a-12d)。
58.接下来，在链脲佐菌素(stz)诱导的胰岛素缺乏型糖尿病小鼠模型中评估了相应的仅含胰岛素的贴片和仅含胰高血糖素的贴片的体内血糖调节能力。用胰岛素贴片(剂量：50mg/kg)治疗的小鼠的pgl在一小时内达到正常血糖水平(《200mg/dl)，并在此范围内停留长达六小时。血浆胰岛素水平在一小时达到峰值并在三小时后稳定(图4a)。体内葡萄糖响应性通过腹膜内葡萄糖耐量试验(ipgtt)进行评估，该试验在治疗后4小时以3.0g/kg的剂量进行。观察到pgl的峰值，随后在接下来的观察期内pgl呈下降趋势(图4b)。响应于pgl的初始增加，在pgl峰值后一小时内记录到血浆胰岛素的显著峰值(图4b)。
59.对两组糖尿病小鼠上仅含胰高血糖素的贴片的释放曲线进行了表征：一组具有高血糖pgl(未治疗)和一组具有低血糖pgl(通过隔夜禁食和皮下注射2u/kg胰岛素治疗)。对pgl和血浆胰高血糖素水平的同时研究表明，在给药后三小时出现低血糖的组中，血浆胰高血糖素水平明显更高。随后也实现了pgl增加到正常范围(图4c和4d)。腹膜内胰岛素耐量试验(ipitt)通过在仅含胰高血糖素的贴片施加后两小时皮下注射70u/kg胰岛素来进行，之后，胰岛素激发组的pgl下降并在两小时内达到低血糖(图4e)。响应于pgl的下降，观察到血浆胰高血糖素水平逐渐增加。相反，未注射胰岛素的对照糖尿病小鼠组显示胰高血糖素释放速率没有波动，因此没有引起pgl的进一步升高(图4f和图13a)。总之，仅含胰岛素的贴片和仅含胰高血糖素的贴片都显示出葡萄糖调节释放以维持血糖正常。
60.为了证实胰高血糖素微针14b减轻低血糖症的能力，用仅含胰高血糖素的贴片治疗处于低血糖症(通过隔夜禁食和皮下注射2u/kg胰岛素诱导)的糖尿病小鼠并在治疗期间保持禁食状态。贴片治疗的小鼠在两小时后恢复了正常血糖状态，而未贴片治疗组仍处于低血糖范围内(图13b)。为了进一步表征胰高血糖素贴片的保护能力，糖尿病小鼠在整个实验过程中被禁食并接受胰岛素注射(70u/kg)。仅含胰高血糖素的贴片减缓了胰岛素注射后pgl的降低，并最终阻止了pgl降至50mg/dl以下(图13c)。相反，对照组的pgl迅速下降到低血糖范围，并保持了两个小时。当正常食物摄入条件下的糖尿病小鼠接受胰岛素注射(70u/kg)激发时，与对照组相比，贴片治疗组的pgl恢复速度仍然更快(图13d)。
61.然后施加治疗性混合微针贴片10，并将葡萄糖响应性治疗性能与单独的仅含胰岛素的贴片的性能进行比较。正如预期的那样，胰高血糖素微针14b与胰岛素微针14a的整合延迟了pgl的降低，并且在治疗性混合微针贴片治疗组中观察到pgl在正常血糖范围内的波动模式。与仅含胰岛素的贴片的平坦曲线(图5a)相比，该结果证实了胰岛素和胰高血糖素微针14a、14b之间的交替调节作用。此外，治疗性混合微针贴片10显示出显著降低的低血糖指数(定义为初始和最低pgl读数之差除以达到最低pgl所花费的时间)平均为0.99，而胰岛素加载贴片为1.42(图5b)。通过使糖尿病小鼠禁食6小时来表征模拟延迟食物摄入对仅胰岛素和治疗性混合微针贴片10性能的影响。治疗性混合微针贴片10将pgl调节在正常血糖范围内，而仅含胰岛素的贴片会导致低血糖(图5c)。这种对进食延迟的显著保护作用也反映在治疗性混合微针贴片10的维持低血糖指数平均值为0.91和仅含胰岛素的贴片的低血糖指数平均值增加为2.25(图5d)。
62.关于生物相容性，基质交联且可去除的治疗性混合微针贴片10可以消除与可溶解基质或可植入装置相关的治疗后安全问题。分别评估用每个贴片治疗10小时或24小时的小鼠皮肤的苏木精和伊红染色(h&e)，并且对于长达24小时的施加，在给药一周后显示给药部位不明显的嗜中性粒细胞浸润(图14)。
63.总之，已经描述了双重葡萄糖响应性胰岛素和胰高血糖素递送装置或治疗性混合微针贴片10，其在一系列葡萄糖范围内充当外部“胰岛”。使用这种混合配方进行治疗可能对生活方式改变、作息不规律和错过进餐或胰岛素剂量不准确的糖尿病患者特别有益。治疗性混合微针贴片10或贴片系统(来自多个此类治疗性混合微针贴片10a、10b)仍有机会通过优化配方和微针设计寻求增强的释放动力学和延长的血糖控制。为了促进治疗性混合微针贴片10未来向广泛用户的转化，胰岛素和胰高血糖素微针14a、14b的比例可以在制造过程中定制以满足不同个体的不同需求。此外，3d打印技术可以使设计过程自动化，并为治疗性混合微针贴片10配备邮票状施加器，以标准化皮肤渗透过程。最后，用于制造治疗性混合微针贴片10的掩蔽和顺序光聚合方法可以扩展到其他药物递送应用，用于共同递送具有增强功效和安全性的多种疗法。
64.材料和方法
65.材料
66.除非另有说明，否则所有化学品均购自sigma-aldrich，并按原样使用。norland optical adhesive 86购自norland products inc。3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸购自boron molecular(目录号bm1195)。人重组胰岛素购自thermo fisher scientific(目录号a11382ij)。胰高血糖素和甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐购自fisher scientific(目录号
50-751-6116、50-145-4119)。
67.治疗性混合微针贴片的合成
68.治疗性混合微针贴片10是通过掩蔽辅助的顺序聚合在紫外线照射下制备的。首先，胰高血糖素(7wt.％)预装在含有n,n'-亚甲基双丙烯酰胺(mba)(1.5wt.％)作为交联剂和2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(irgacure 2959)(1.5wt.％)作为光引发剂的vp单体液体中，amh和apba以1.4的摩尔比溶解在混合物中。类似地，通过将amh和apba以2.6的比例溶解在含有mba(0.6wt.％)和2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(1.5wt.％)的vp单体液体中，制备胰岛素(7wt.％)制剂。然后，通过vp的光聚合成型微针掩模，并调节为覆盖贴片10(胰岛素加载)区域的四分之三。胰高血糖素制剂通过移液管沉积到模具表面(硅模具)的未掩蔽部分，然后置于真空下以渗透模具内的针状凹陷。在冰浴中用紫外线灯(100w；365nm；blak-ray)光聚合5分钟之前，从模具表面去除多余的溶液和掩模。然后，将载有胰岛素的混合物添加到剩余的微针模具(之前被掩模覆盖)中，用刀片刮掉多余的溶液，然后在紫外线灯下在冰上光聚合8分钟。然后，将用于基底或基材12的紫外线固化材料(norland optical adhesive 86)逐滴添加到模具上并通过覆盖0.01英寸厚的透明聚碳酸酯薄膜(mcmaster-carr)而均匀铺展。在紫外线下固化15分钟后，将所得治疗性混合微针贴片10小心地与模具和薄膜分离，将其在室温下保持干燥以供进一步研究或使用。
69.微针表征
70.治疗性混合微针贴片10中微针的荧光图像通过共焦激光扫描显微镜(clsm、ls880、zessi)平铺扫描。zeiss supra 40vp场发射扫描电子显微镜用于表征治疗性混合微针贴片10。治疗性混合微针贴片10在成像前用金/钯靶溅射30秒。微针14a、14b的机械强度通过instron 8516拉伸压缩机评估。初始量规设置为微针尖端16和不锈钢板之间2mm，负载传感器容量为10n。顶部不锈钢板朝向微针14a、14b移动的速度为0.25mm/min。当针开始弯曲时记录微针14a、14b的失效力。
71.体外释放研究
72.为了评估胰岛素或胰高血糖素制剂的葡萄糖响应性，将样品37℃下在具有各种葡萄糖浓度(50、100、200和400mg/dl)的1ml pbs溶液(ph 7.4)中轻轻摇晃(150rpm)孵育。在预定时间点，收集30μl上清液，并在96孔板中使用coomassie(bradford)蛋白测定法(thermo fisher scientific)对释放的胰岛素或胰高血糖素进行定量。在infinite 200pro多模式酶标仪(tecan group)上在595nm处检测吸光度，并用胰岛素(15μg/ml-1mg/ml)或胰高血糖素(8-500μg/ml)标准曲线计算浓度。负载比为3比1的整合胰岛素和胰高血糖素制剂的共同释放以相同的方式进行，但使用elisa进行测量。
73.动物实验
74.所有动物实验均按照由加利福尼亚大学洛杉矶分校的机构动物护理和使用委员会批准的动物研究方案进行。贴片的体内性能在链脲佐菌素诱导的成年糖尿病小鼠(雄性c57b6，8周龄；杰克逊实验室)上进行了评估。对于微针插入，治疗性混合微针贴片10被用力按压10秒，并通过使用医用胶带固定在小鼠皮肤上。为避免移动，在施加治疗性混合微针贴片10期间用异氟烷麻醉小鼠。插入后，用accu-chek aviva(roche diabetes care,inc.)血糖仪记录pgl。
75.血浆胰岛素或胰高血糖素水平测量
76.通过收集20μl血浆来测量血浆胰岛素或胰高血糖素水平，将其储存在-20℃，直到按照制造商的说明使用人胰岛素(目录号kaq1251)/胰高血糖素(目录号ehgcg)酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒(thermo fisher scientific)进行测量。
77.腹膜内葡萄糖耐量试验(ipggt)
78.对于ipgtt触发的胰岛素释放试验，糖尿病小鼠用剂量为50mg/kg的胰岛素微针贴片治疗。在治疗后4小时以3g/kg的剂量给予腹膜内葡萄糖(pbs中的0.3g/ml)，以达到增加的血糖水平峰值，并使用accu-chek aviva血糖仪(roche diabetes care,inc.)通过尾静脉血液(～3μl)测量pgl。对于血浆胰岛素定量，以预定的时间间隔收集血液(～50μl)，离心以分离血浆，并储存在-20℃直至使用elisa试剂盒进行测量。
79.腹膜内胰岛素耐量试验(ipitt)
80.对于ipitt触发的胰高血糖素释放，在插入胰高血糖素微针贴片(17mg/kg)后两小时给予胰岛素(70u/kg)以实现血糖降低。pgl用血糖仪测量。在选定的时间点收集血液(～50μl)，分离血浆以使用elisa试剂盒进行胰高血糖素分析。
81.h&e染色实验
82.将胰高血糖素和胰岛素治疗性混合微针贴片10施加于小鼠的剃光背部10小时或24小时。在去除微针后第1、3或7天，对小鼠实施安乐死，从治疗部位采集皮肤碎片，并在4％甲醛中固定24小时，然后由加州大学洛杉矶分校病理与检验医学转化病理学核心实验室进行h&e染色。在eclipse ti2荧光显微镜(nikon)上获取组织病理学图像。
83.统计分析
84.所有结果均表示为平均值
±
标准差。使用双尾student’s t检验进行两组比较的统计分析。所有统计分析均使用prism软件包(prism 7.0d；graph pad software，美国，2017)进行。实验组和对照组之间的差异在p《0.05时被认为具有统计学意义。显著性在图中表示为*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001和****p《0.0001。
85.虽然已经示出和描述了本发明的实施方式，但是在不脱离本发明的范围的情况下可以进行各种修改。因此，除了权利要求及其等同物之外，本发明不应受到限制。