具有粘液渗透性和细菌生物膜渗透性的抗菌剂在制备治疗肺损伤药物中的应用

本发明涉及新型抗菌剂设计领域。更具体地，涉及一种具有粘液渗透性和细菌生物膜渗透性的抗菌剂在制备治疗肺损伤药物中的应用。

背景技术：

1、囊性纤维化(cystic fibrosis,cf)是一种常染色体隐性遗传病，是由囊性纤维化跨膜传导调节因子cftr基因发生突变引发的疾病。由cftr基因编码的cftr蛋白负责驱动氯离子和碳酸氢根离子分泌，主要分布在气道、汗腺、胰腺导管、消化道、生殖系统等处。cftr基因突变后造成cftr蛋白功能异常，氯离子和碳酸氢根离子的跨膜转运受阻，影响上皮表面的渗透压及酸碱平衡。在肺部主要表现为气道表面脱水，粘液中粘蛋白含量相对增加，粘液的流变学特征改变。

2、cf患者的肺部粘液主要由带负电的粘蛋白、dna以及免疫细胞、肌动蛋白和细菌组成，与正常的肺部粘液相比浓度大概增加了3-4倍。粘液层类似于多孔的凝胶层，粘蛋白纤维之间通过静电作用及氢键等相互作用彼此交联，形成网格结构，网格尺寸大致为60-300nm。

3、cftr基因功能失调还会导致粘液纤毛清除系统受损，使患者出现慢性感染、炎症及呼吸道的实质性损伤等症状。慢性感染主要是由铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa,p.aeruginosa)的定植引起的。当细菌侵入呼吸道时，由于纤毛清除能力受损，非炎症防御机制无法发挥作用，由多形核白细胞(pmns)和抗体介导的炎症防御机制启动。pmns开始吞噬细菌时，会产生一个代谢爆发，从而导致高活性氧(ros)的释放，这些ros会杀死细菌或诱发细菌突变，并损害周围组织。p.aeruginosa一般通过突变成粘液型表型并形成生物膜来抵御炎症反应，从而不被吞噬或者清除出肺部。与浮游细菌相比，针对生物膜的清除及生物膜内细菌的消灭更加困难。生物膜内包裹细菌的厚厚的胞外聚合物(eps)是限制抗菌剂杀菌能力的关键屏障，eps主要成分为多糖、dna、蛋白质等，尽管在eps中存在物质运输的水通道，但由于尺寸限制或者静电吸附使得抗菌剂难以到达细菌表面。

4、目前临床上通常使用抗生素来治疗p.aeruginosa肺部感染，然而由于抗生素对肺部厚重的粘液层及细菌生物膜的渗透效果有限以及细菌对抗生素的耐药性，治疗效果往往很不理想。

5、抗菌肽(antimicrobial peptide,amp)是一种由正电荷氨基酸和疏水性氨基酸组成的新型短肽化合物，主要通过物理作用破坏细菌膜实现杀菌，因此不易使细菌产生耐药性，有望成为下一代抗生素。p.aeruginosa属于革兰氏阴性菌，外膜由带负电的脂多糖和磷脂组成，因此带正电荷和疏水域的amp可以通过静电作用及疏水相互作用杀死p.aeruginosa。cn111484568a通过把抗菌性多肽接枝到壳聚糖上来降低抗菌性多肽的溶血性，提高其生物相容性和壳聚糖的水溶性，使其更好地发挥抗菌功能，但是先前的研究仅涉及在相对简单的生物环境下进行穿透细菌生物膜并破坏细菌细胞膜来抗菌的功能，并未涉及在更为复杂的生物环境下(例如肺部粘液层)是否仍能进行有效抗菌的功能，目前对于囊性纤维化患者因铜绿假单胞菌引起的肺部感染至今还没有长期有效的治疗方法。

6、因此构建一种既可以渗透进肺部粘液层，又可以穿透细菌生物膜并杀死细菌的新型抗菌剂对于囊性纤维化患者肺部感染的治疗至关重要。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种具有粘液渗透性和细菌生物膜渗透性的抗菌剂在制备治疗肺损伤药物中的应用。经研究发现，本发明提供的抗菌剂可以快速穿透肺部粘液层和细菌生物膜，在遇到细菌后可快速解组装暴露抗菌多肽并破坏细菌细胞膜实现抗菌效果。

2、为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

3、本发明公开一种具有粘液渗透性和细菌生物膜渗透性的抗菌剂在制备治疗肺损伤药物中的应用，所述抗菌剂为利用聚乙二醇将抗菌多肽偶联至多糖载体的骨架上，并进一步自组装形成聚乙二醇部分包裹或完全包裹抗菌多肽和多糖载体的带正电或不带电的纳米颗粒；

4、所述抗菌多肽的氨基酸序列为lkllkkllkklkk。

5、进一步，所述应用具体是治疗囊性纤维化患者因铜绿假单胞菌引起的肺部感染。

6、进一步，所述多糖载体选自壳聚糖、壳寡糖、葡聚糖、透明质酸、海藻酸钠中的一种或多种，优选为壳聚糖、壳寡糖或葡聚糖。

7、进一步，所述聚乙二醇的分子量为500-5000da，示例性地，所述聚乙二醇的分子量可以为500da、1000da、1500da、2000da、2500da、3000da、3500da、4000da、4500da、5000da等，分别表示为peg500、peg1000、peg1500、peg2000、peg2500、peg3000、peg3500、peg4000、peg4500、peg5000等。

8、进一步，所述抗菌剂的尺寸小于肺部粘液层粘蛋白交联形成的筛状网络的尺寸；所述抗菌剂的尺寸小于铜绿假单胞菌生物膜的水合通道尺寸；优选地，所述抗菌剂的尺寸为100-300nm。

9、进一步，所述多糖载体为壳聚糖时，所述抗菌剂为球形纳米颗粒，粒径在100nm左右，表示为cs-peg-lk13。

10、进一步，所述多糖载体为壳聚糖，所述聚乙二醇的分子量为500da时，所述抗菌剂表示为cs-peg500-lk13，所述抗菌剂中聚乙二醇部分包裹抗菌多肽和壳聚糖，由于部分抗菌多肽暴露在纳米颗粒外表面，其外表面呈电正性。

11、进一步，所述多糖载体为壳寡糖时，所述抗菌剂为不规则的短棒状和/或纤维状纳米颗粒，表示为cos-peg-lk13。

12、进一步，所述多糖载体为壳寡糖，所述聚乙二醇的分子量为1000da时，所述抗菌剂表示为cos-peg1000-lk13，所述抗菌剂中聚乙二醇完全包裹抗菌多肽和壳寡糖，其外表面呈电中性。

13、进一步，所述多糖载体为葡聚糖，所述抗菌剂为球形纳米颗粒，粒径在300nm左右，表示为dex-peg-lk13。

14、进一步，所述多糖载体为葡聚糖，所述聚乙二醇的分子量为1000da时，所述抗菌剂表示为dex-peg1000-lk13，所述抗菌剂中聚乙二醇完全包裹抗菌多肽和葡聚糖，其外表面呈电中性。

15、进一步，所述抗菌剂按照如下步骤制备得到：

16、1)将多糖载体溶解于2-吗啉乙磺酸缓冲液(mes)中，得到溶液a；

17、2)将聚乙二醇溶解于2-吗啉乙磺酸缓冲液中，再加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)活化20-30分钟，得到溶液b；

18、3)将溶液b和溶液a混合，反应6-72小时，反应结束后透析、冻干，得到多糖载体-聚乙二醇偶联物；

19、4)将多糖载体-聚乙二醇偶联物和抗菌多肽溶解于2-吗啉乙磺酸缓冲液中，得到溶液c；

20、5)取硫酸铜水溶液与抗坏血酸钠水溶液混合，在0-4℃下搅拌至形成黄色沉淀，再加入氨基胍水溶液搅拌至形成浅紫色悬浊液；

21、6)将悬浊液加入到溶液c中，在0-4℃下搅拌反应0.5-48小时，反应结束后透析、冻干，即得。

22、进一步，步骤4中，所述硫酸铜水溶液的浓度为0.5m，所述抗坏血酸钠水溶液的浓度为1m，所述氨基胍水溶液的浓度为1m。

23、本发明的有益效果如下：

24、本发明提供了一种易于制备、粘液渗透性较好且抗菌效果好的新型抗菌剂材料在制备治疗肺损伤药物中的潜在应用，尤其针对于治疗囊性纤维化患者因铜绿假单胞菌引起的肺部感染。

25、根据使用的多糖载体及聚乙二醇连接链分子量的不同，抗菌剂可自组装形成不同尺寸的球形、短棒状或纤维状纳米颗粒，这些纳米颗粒的尺寸均小于肺部粘液层粘蛋白网络的尺寸和细菌生物膜孔隙的尺寸，具备粘液渗透和细菌生物膜渗透的前提。

26、由多糖载体-聚乙二醇-抗菌多肽三组分组成的抗菌剂，根据自组装情况的不同，外表面可呈电正性或电中性。cos-peg1000-lk13和dex-peg1000-lk13两组材料自组装后peg处于纳米颗粒外表面，用于包裹多糖载体及抗菌多肽，材料外表面呈现电中性，当材料进入粘液层后不会受到带负电的粘液成分静电相互作用的束缚，同时由于peg的亲水性，纳米颗粒可以在粘液层中快速渗透。cs-peg500-lk13材料与传统电中性及电负性的粘液渗透型材料相比，外表面具有强正电性，按以往观点来看，正电性材料属于粘液黏附型材料，但cs-peg500-lk13在静电相互作用下可以快速拉近于黏液层距离，黏附后在材料中peg的加入使得该材料在快速黏附进入粘液层的基础上，仍具有很好的粘液渗透效果，同时该材料可自组装为尺寸在100nm左右的均匀的球形纳米颗粒，具有很大应用潜力。

27、基于同样原理，本发明设计的抗菌剂材料可以通过细菌生物膜上的水合通道快速穿透带负电的细菌生物膜，在细菌生物膜内遇到细菌时，可解组装暴露出抗菌肽，通过静电相互作用、疏水相互作用等方式清除生物膜内细菌，同时该材料具有较好的生物安全性，在囊性纤维化患者肺部感染的治疗方面具有较好的应用前景。