专利名称：具有抗球虫和促生长作用的酸性聚环醚抗菌素的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的酸性聚环醚抗菌素，其结构为
其中Me为甲基，其绝对立体化学如上所示；还涉及该化合物的药用阳离子盐；含该抗菌素的家禽，牛或猪的营养饲料组合物及用于治疗或预防猪痢疾的家禽用抗球虫剂或用作牛或猪的助长剂；还涉及制备该抗菌素的发酵方法和在上述发酵方法中产生该抗菌素的微生物Actionmadura sp.。
化合物(I)是酸性聚环醚类抗菌素的一个新成员。这类抗菌素包括人们十分熟悉的化合物如莫能菌素(The Merck Index10th Ed.，Merk and Co.，Inc.，Rahway， N.J.1983，monograph no.6100)，尼日利亚菌素(Loc.cit.，monograph no.6390)，甲基盐霉素(Loc.cit.，mongraph no.6271)，拉沙里菌素(Loc.cit.，monograph no.5204)和盐霉素(Loc.cit.，monograph no.8193)。Westley对此课题已有综述“聚醚抗菌素”，Adv.Appl.Microbio.，vol.22，pp.177-223(1977)。在结构上与本发明的化合物密切相关的是利迪霉素，分别由Hamill等在美国专利4,528,822中和KusaKabe等在欧洲专利申请书158,179中公开，也可参见Tetrahedron Letters，vol.28，pp.3357-3360(1987)和J.Antibiotics，vol40，pp.237-237(1987)。利迪霉素的四氢呋喃β-环上有α-氢，而本发明化合物是α-甲基。这些化合物一般用作球虫抑制剂，饲料添加助长剂和(或)抗猪痢疾剂。
当Actinomadura sp.ATcc 53708在有氧环境的液体培养基中发酵时，产生一种新的酸性聚环醚抗菌素，其结构如式(I)所示。
本发明涉及上述式(I)的化合物，包括其药用阳离子盐，及其制备方法。该制备方法包括在含可吸收碳和氮源的液体营养培养基中，使上述的Actionmadura sp.ATCC 53708发酵，直到生成要求量的上述式(I)化合物，最好于有氧环境中进行发酵。在治疗或预防猪痢疾中，就用作抗球虫剂和/或助长剂而言，并不需要将化合物(I)从发酵液中分离出来制成基本纯净的化合物，而只需用粗产品即可，可用混有菌丝体(过滤发酵液所得)的沉淀物，也可用通过喷雾干燥或冰冻干燥整个发酵液而得到的固体。
所说的药用阳离子盐包括(但并不局限于)如下盐类钠盐，钾盐，钙盐，铵盐，N，N ′-二苄基乙二胺的盐，N-甲基葡酰胺(甲基葡铵)的盐和二乙醇胺的盐。最好的阳离子盐是钾和钠盐。
本发明也涉及营养饲料组合物，牛或猪的营养饲料组合物，该组合物包括有效量的式(I)化合物以促进生长和/或改善上述牛或猪饲料的利用率；涉及其它家禽的营养饲料组合物，其中含有效量的式(I)化合物，用以控制所述家禽的球虫感染。
本发明还涉及一种促进生长和/或增加猪或牛饲料利用率的方法，该法包括给予上述猪或牛能促进生长或促进饲料利用率的一定量的式(I)化合物，最好以营养饲料组合物的形式给予；一种预防或治疗猪痢疾的方法，该法包括给予猪有效量的式(I)化合物，预防或治疗上述猪痢疾；和一种控制家禽球虫感染的方法，该法包括给予所述家禽抗球虫有效量的式(1)化合物，特别是以营养饲料的形式给予。
最后，本发明涉及Actinomadura sp.ATCC 53708的生物学纯培养方法，所说的培养方法是在含可吸收碳和氮源的液体营养培养基中发酵时，能产生要求量的式(I)化合物的培养方法，包括上述冰冻干燥型培养方法。
能产生本发明式(I)的聚环醚抗菌素的培养方法选用微生物Actinodura sp.，该培养物作为典型培养物，收集于TheAmerican Type Culture Collection，Rock-ville，Maryland中，登记号为ATCC 53708。该培养物永久存放于The American Type cultureCollection，Rockville，Maryland，在授予专利权后的整个专利有效期内，公众可从那里得到该培养物。在申请尚未批准期间，可根据申请号37CFR1.14和35USC122获得该培养物。当专利批准后，对公众获得该保存培养物的限制将不可改变地被取消。
这个新的培养物是由在Tuzla，Istanbul，Turkey采集的土壤样品中衍生而得到的，并由Pfizer InC.的培养物保存中心鉴别为N777-1。由Dr.L.H.Huang对其进行了描述和分类。发现该培养物能产生小面积的放线属菌丝，一种产生短孢子链的需氧菌丝体和一种无碎片的基质菌丝体。全细胞分析的结果表明它属于Actinomadura类。
将上述微生物的倾面培养物接种于ATCC 172肉汤中，在摆床上于28℃生长4天。然后离心20分钟，用灭菌蒸馏水洗三次，接种在常用于鉴别放射线菌的培养基上。
该培养物于28℃培养，按一定时间观察培养结果，通常是14天观察记录一次。其颜色用通用专门术语加以描述，但准确的描述根据用The color Harmony Manual，fourthedition的色片加以比较而确定。全细胞氨基酸和糖的分析方法采用下列参考文献中描述的方法，参见Becker等Appl.Microbiol.，Vol.12，pp.421-423(1964)；Staneck等，Appl.Microbiol.，vol.28，pp.226-231(1974)和Lechevalier，J.Lab.Clin.Med.，vol.71，pp.934-944(1968)。
培养物鉴别如下酵母提取物-麦芽提取物琼脂培养基(ISP2#培养基，Difco)生长良好，具有黑灰色到黑色(接近灰色系列5ih，5ml)小点的膏体(2，ca)已发酵，表面有皱纹需氧菌丝体无至稀少，无色；膏体反面具有黑色(接近灰色系列5ml)小点，微黄色(2ca，2ea)；无可溶性色素。
燕麦片琼脂培养基(ISP3#培养基，Difco)生长一般，膏体(2ca)，稍有发酵，表面光滑需氧菌丝体无至稀少，无色；膏体反面(2ca)，可溶性色素膏体(2ca)。
无机盐-淀粉琼脂培养基(ISP4#培养基，Difco)生长不良，膏体(2ca)，薄，表面光滑；需氧菌丝体无至稀少，无色；膏体反面(2ca)；无可溶性色素。
甘油-天门冬氨酰胺琼脂培养基(ISP5#培养基，Difco)生长不良至一般，膏体(2ca)，薄，表面光滑，无需氧菌丝体；膏体反面(2ca)无可溶性色素。
蔡氏(Czapek)-蔗糖琼脂培养基(Waksman，“TheActinomycetes”，V.2，培养基1#，P.328，1961)生长一般至良好，膏体(2ca)，中度发酵，表面光滑，无需氧菌丝体；膏体反面(2ca)；无可溶性色素。
葡萄糖-天门冬氨酰胺琼脂培养基(同上，培养基2#)生长一般，膏体(2ca)，薄至中度发酵，表面光滑至有皱纹，无需氧菌丝体；膏体反面(2ca)；无可溶性色素。
Gordon和Smith′s酪氨酸琼脂培养基(Gordon和Smith，J.Bacteriol，69147-150，1955)生长一般至良好，膏体(2ca)，轻微至中度发酵，表面光滑至有皱纹，无需氧菌丝体；膏体反面(2ca)；可溶性色素淡黄色(2ea)。
苹果酸钙琼脂培养基(Waksman，Bacteriol，Rev.21，1-29，1957)生长不足，膏体(2ca)，薄，表面光滑；无需氧菌丝体，膏体反面(2ca)，无可溶性色素。
酪蛋白琼脂培养基(Gordon和Smith，同上)生长良好，膏体(2ca)，发酵，表面光滑至有皱纹，无需氧菌丝体；膏体反面淡黄色(2ea)；有微黄色(2ga)可溶性色素。
Bennett′s琼脂培养基(Waksman，Loc.Cit.，培养基30#，P.331)生长良好，膏体(2ca)，发酵，有皱纹，无需氧菌丝体；膏体反面淡黄色(2ca，2ea)；有淡黄色可溶性色素(2ea)。
Emerson′s琼脂培养基(同上，培养基28#，P.331)生长一般，淡黄色膏体(2ca，2ea)，发酵，有皱纹，无需氧菌丝体；膏体反面微黄色(2ic)；无可溶性色素。
营养琼脂培养基(同上，培养基14#，P.330)生长差至一般，膏体(2ca)，薄至微有发酵，有皱纹，无需氧菌丝体；膏体反面淡黄色(2ic)；无可溶性色素。
明胶琼脂培养基(Gordon和Mihm，J.Bacteriol.73，15-27，1957)生长良好，膏体(2ca)，发酵，有皱纹，无需氧菌丝体；膏体反面淡黄色(2ca，2ea)；可溶性色素淡黄色(2ea)。
淀粉琼脂培养基(同上)生长良好，膏体(2ca)，发酵，有皱纹，无需氧菌丝体；膏体反面淡黄色(2ca，2ea)；无可溶性色素。
土豆胡萝卜琼脂培养基(Lechevalier，Lab.Clin.Med.，71，934-944，1968，但只用30g土豆，2.5g胡萝卜和20g琼脂)生长差一般，灰白色(接近灰色系列2ba)，薄，表面光滑；需氧菌丝体无至稀少，无色；膏体反面(2a)无色；无可溶性色素。
自来水琼脂培养基(2％)生长差，膏体(2ca)，无色；膏体反面无色(2ca)；无可溶性色素。
Gauze′s矿物盐培养基1(Gauze等，Problemsin the classification of AntagonisticActinomycetes，English Ed.，P.13，1957)生长差至一般，膏体(2ca)，薄，表面光滑；需氧菌丝体无至稀少，无色；膏体反面(2ca)；无可溶性色素。
Gauze′s有机培养基2(同上)生长良好，膏体(2ca)，发酵，有皱纹，无需氧菌丝体膏体反面淡黄色(2ca，2ea)；无可溶性色素。
形态学性质在无机盐-淀粉琼脂培养基上培养3周后观察其形态学性质为需氧菌丝体无色，膏体白色；孢子链呈直线，弯曲或钩形，每条孢子链有2-9个孢子；孢子呈球形，卵形至椭圆形，直径0.8-1.4微米或1.1-1.8×0.8-1.2微米；表面光滑，如扫描电子显微镜所见。
生物化学性质无黑色素生成；无硫化氢生成；明胶被液化；无淀粉水解；硝酸盐未被还原成亚硝酸盐；在Jensen′s或Levine和Schoenlein纤维素肉汤中不生长，也不分解；不凝固也胨化牛奶；酪蛋白消化阳性；酪氨酸消化阴性；苹果酸钙消化阴性。碳水化物利用情况可利用葡萄糖，阿拉伯糖，果糖，甘露糖醇，鼠李糖，蔗糖，木糖，阿东糖醇，纤维二糖，甘油，麦芽糖，核糖，淀粉和海藻糖；不能利用肌醇，棉籽糖，己六糖，赤鲜糖，半乳糖，乳糖，甘露糖，松三糖，密二糖，α-甲基-D-葡葡糖甙，柳醇，山梨糖醇和山梨糖。
其它阳性试验包括乙酸盐和丙酮酸盐的利用；七叶灵水解；及黄嘌呤的分解。下面的试验是阴性结果苯甲酸盐，柠檬酸盐，糊精，乳酸盐，苹果酸盐，肉豆蔻酸盐，草酸盐，苯酚，丙酸盐和丁二酸盐的利用；腺嘌呤和酪氨酸的分解；马尿酸盐的水解。
温度关系21℃28℃37℃45℃生长良好生长良好生长良好生长良好分细胞分析全细胞水解物含有内消旋-二氨基庚二酸，葡萄糖，半乳糖，madurose，甘露糖和核糖。
N777-1培养物具有下列特征膏体基质菌丝体；短而无色的菌丝体，短孢子链，呈直线，曲线或钩形；孢子表面光滑。它利用葡萄糖，蔗糖，木糖，阿东糖醇，纤维二糖，甘油，麦芽糖，核糖，淀粉，海藻糖，乙酸盐和丙酮酸盐。分解黄嘌呤，次黄嘌呤和七叶灵。全细胞水解物含内消旋-二氨基庚二酸和madurose。因此，培养物N777-1属于Actinomadura类，如H.Lechevalier所认定。
已知的Actinomadura类培养物具有相同的膏体基质菌丝体和/或相同的生物化学性质，这些培养物包括A.Cremeasubsp，rifamycini，A.madurae subsp.simaoensis，和A.routienii。
培养物N777-1与A.cremea subsp.rifamy-cini的区别在于孢子表面光滑，不能还原硝酸盐，不能利用棉籽糖，能利用阿拉伯糖和鼠李糖。
培养物N777-1与A.madurae subsp.simaoe-nsis的区别在于膏体基质菌丝体是无色而不是桔棕色，需氧菌丝体是无色而不是无色至粉白色，不能还原硝酸盐，不能分解酪氨酸，能分解黄嘌呤。与A.routienii比较，其区别在于没有假孢子囊，不能水解淀粉，不能凝固牛奶，能利用甘露糖醇，果糖和甘油。
培养物N777-1在大多数生物化学试验中相似于A.albolutea，但与后者的区别是不能水解淀粉，不能凝固牛奶，膏体基质菌丝体不是棕至深棕色，孢子链是短的而不是长的。
根据上述数据，培养物N777-1被认为是Actinoma-dura类的一个成员，称之为Actinomadura Sp.，它已被收存于the American Type Culture Collection登记号为ATCC53708。
用本发明的Actinomadura Sp.很容易产生本发明的抗菌素化合物(I)。方法是使该微生物在约24°-36℃生长于搅拌和通气环境中，培养基包括碳水化合物如糖、淀粉、甘油；有机氮物质如大豆蛋白肉、酪氨酸、酵母提取物；生长物质如可溶谷物、鱼肉、棉籽肉；含微量元素的矿物盐如Fe、Co、Cu、Zn等；及作为缓冲剂的碳酸钙或磷酸盐。培养完成之后，通过下述方法很容易得到抗菌素在PH4.0-8.0，用有机溶剂如正丁醇、甲基异丁基酮或氯仿提取；滤出含沉淀抗菌素的菌丝体，滤液弃去；或更简单，喷雾干燥或冰冻干燥整个肉汤培养物。也可以用上述有机溶剂之一提取菌丝体或肉汤干燥物。如果需要纯化的抗菌素，可采用标准分离方法如浓缩、形成盐或游离酸、色层析、沉淀和/或结晶，将其从有机溶剂中分离出来，见下述实施例。
接通常的方法进行发酵将无性繁殖细胞从已接种Actino-madura Sp.ATCC 5508的斜面或Roux瓶中挖出，接种于合适的培养基上面制得接种物。产生的无性繁殖细胞依次用于接种含有合适生长培养基的摇瓶或接种罐。也可从摇瓶接种接种接种罐。生长一定时间(摇瓶通常120-144小时，接种罐168-196小时)后，将摇瓶或接种罐的无性繁殖细胞肉汤在无菌条件下接种于含合适于生长的培养基的发酵罐内。生长完成后(通常约120-196小时)，按上述的一般方法或按下述的特殊方法获得上述的抗菌素化合物的粗品或纯品。
用标准方法试验式(I)化合物的体外抗菌活性，这些标准方法可测定化合物抗一种或几种微生物的最小抑菌浓度(MIC)(单位mcg/ml)。其中方法之一是由《抗菌素敏感性试验的国际合作研究》(Ericcson and Sherris，Acta.Pathologica et Microbiologia ScandinavSupp.217，Section B64-68〔1971〕)推荐的方法，该法利用脑心浸渍(BHI)琼脂和接种物重复装置。将过夜生长试管稀释100售后用作标准接种物(将含20,000-100,000细胞的约0.002ml菌液放于琼脂表面；20ml BHI琼脂/盘)。试验药物的最初浓度为200mcg/ml，每次稀释2倍，其制备12个稀释液。在37℃18小时后观察培养皿时单菌落消失。受试微生物的敏感性(MIC)被确定为用肉眼判断，对微生物的生长能够产生完全抑制时，化合物的最低浓度。如其它骤环醚抗菌素一样，本发明的式(I)化合物对革兰氏阳性菌和Treponema hyodysenteriae(猪痢疾的致病菌)均有抗菌作用，见表(I)。
表I式(I)化合物的体外抗菌活性微生物 菌株NaMIC，mcg/mlClostridiumperfringens10A0060.3910A0090.20Actinomycespyogenes14D0020.3914D0080.3914D0110.39Treponemahyodysenteriae94A0010.2094A0020.2094A0070.20通过下述方法可得到式(I)化合物抗鸡球虫感染的有效数据。用充分混合的含有化合物(I)或其钠盐和/或钾盐的谷糠饲料喂30-50天的来克亨健康小公鸡，24小时后，每只小公鸡口服接种试验的Eimeria类卵囊，对照组(30-50天的小鸡)喂不含化合物(I)或其盐的谷糠饲料，24小时后同样接种，作为感染对照组。还有一组30-50天的小鸡喂以同样的不含抗菌素的谷糠饲料，但不用球虫感染，作为正常对照组。对于E.acervulina感染组，五天后评价治疗效果，六天后评价所有其它指标。
测量抗球虫活性所用的标准按J.E Lynch的方法分为0-4损伤等级，参见“抗球虫活性的初步评价新方法”，Am.J.Vet.Res.，22，324-326，1961；和依据J.Johnson和W.H.Reid提出的改良评分法对其它类分0-3级，参见“Anticoccidial Drugs.Lesion Sco-ring Techniques in Battery and FloorPen Experiments in Chicks”，Exp.Parasit.28，30-36，1970.用治疗组的损伤分数除以感染对照组的损伤分数便得到抗菌活性。实验表明，当小鸡谷糠饲料中含1.0-25ppm的化合物(I)和其阳离子盐时，对Eime-ria tenella，E.acervulina，E.maxima，E.brunetti和E.necatrix感染具有优良的抗菌活性。例如，对于敏感的E.tenella，式(I)化合物在5ppm时便显示出100％的损伤控制。
本发明的式(I)化合物也可与其它已知的抗球虫剂合用，这些抗球虫剂包括上面引证的美国专利4,582,822中Hamill等限定的抗球虫剂，如硝卡巴嗪，4，4′-二硝基碳酰苯胺或萘酰胺。
对于家禽球虫病的预防或控制，用合适的载体将本发明的化合物以口服的形式给予家禽，方便的给药方法是将其含于饮水中或家禽饲料中，以便随着饮水或食物摄取治疗量的抗菌素。最好以浓缩液的形式直接计量将抗菌剂加入饮水中，或以预混合物或浓缩物的形式直接加入饲料中。为了将药物掺入饲料中，常用置于载体中的治疗剂预混合物或浓缩物。治疗剂可以是基本纯的(如，游离酸或其药用盐)，也可是分析过的粗产品如湿的或干的菌丝体，或全肉汤培养干燥物。象描述的那样，合适的载体是液体或固体，如水，各种粉；例如大豆饼粉，亚麻籽饼粉，玉米棒子芯粉和矿物盐混合物常常被用于家禽饲料。特别有效的载体是家禽饲料本身，即少量的家禽饲料。载体使活性物质容易均匀地分散于与之混合的饲料中。因为需要本发明的活性成份的量很小，所以这是十分重要的。重要的是将活性物充分混入预混合物中，然后再将预混合于饲料中。因此，可将活性成份分散或溶解于适当的油载体中，如大豆油，玉米油，棉籽油等，或挥发性有机溶剂中，然后再与载体混合。浓缩物中活性物质的比例可任意改变，因为通过将适当比例的预混合物与饲料混合，可调节最终饲料中活性物质的量，以得到一个理想的治疗剂含量。
饲料生产者将高效浓缩物与上述的蛋白质源载体如大豆饼粉和其它粉混合，得到适合于直接喂家禽的浓缩补充物。在这种情况下，可允许家禽吃普通饲料。也可将上述浓缩补充物直接加入家禽饲料中，获得一种含治疗有效量的一种或数种本发明化合物的营养平衡饲料。用标准方法如双壳混合机充分混合该混合物，以保证均一性。
就用于家禽而言，本文描述的化合物的使用浓度随情况不同而变化生长期，使用连续的低浓度，即在鸡生长期的前5-12周，连续低浓度起到有效的预防作用。就治疗已发生的感染而言，需要较高浓度以克服感染，饲料中化合物(I)的浓度一般为约1.0-25ppm，最好是约2.5-12.5ppm。当药物混入饮水中给药时，根据每天食物的平均消耗量和饮水消耗量的重量比确定给药浓度，使日服药剂量相等。
用含有不同浓度的式(I)化合物或其盐的饲料喂试验组动物，可直接测得式(I)化合物或其盐促进猪或牛生长和/或增加食物利用率的活性。因此，英国专利说明书1,197,826详述了一种评价饲料中抗菌素活性的体外瘤胃方法。
就用于预防或治疗猪痢疾，或就促进牛或猪生长和/或增加饲料利用率而言，式(I)化合物或其盐最好作为饲料添加剂给药。按照十分相似于上面所描述的制备家禽饲料的方法制备的饲料，值得注意的是在制备的饲料中治疗剂是均匀分散态。此合物(I)在牛或猪饲料中使用的浓度一般为约0.25-25ppm，对于反刍动物，式(I)化合物可做成大丸药口服给药，该大丸药停留在瘤胃网状囊中，在一个较长的时期(如4-8周)内以基本恒定的速率释放治疗剂，每天可提供相当于上述饲料添加所提供的剂量，即平均每天剂量(mg)＝〔0.25至25(ppm)〕×平均每天饲料消耗量(kg)这种控制释放大丸药的例子参见Cardinal的美国专利4,601,893。
下面的实施例是对本发明的解释，而不是加以限制。实施例1Actinomadura Sp.ATCC53708的发酵及化合物(I)钠盐的分离
Actinomadura Sp.的最初培养是用ATCC53708培养物接种在斜面或Roux瓶的固体培养基上，制备的ATCC培养基№172含如上成份克/升葡萄糖 10可溶淀粉 20酵母提取物 5酪蛋白酶水解物 1碳酸钙 1蒸馏水加至1000ml，并用KOH调PH至7.0，加入琼脂 20选用下述任何一个培养基制备摇瓶培养基C ′ 克/升西瑞糖 10大豆粉 10玉米发酵固体 5玉米淀粉 10NaCl 5CoCl20.002CaCO31
JDYTT 克/升西瑞糖 10玉米淀粉5玉米浸渍液 5酪蛋白酶水解物 5CoCl20.002CaCO33将100ml培养基加入300ml摇瓶中，在120℃和15P.S.i.消毒30分钟，冷却后，用上述Actinoma-dura SP.斜面培养物的无性繁殖细胞混悬液接种，接种瓶放于移动距离为1.5-2.5英寸，摇动频率为150-200次(CPM)的摇床上，于28℃振摇5-7天。
同时预备5升的发酵瓶，其中含3升上述C′或JDYTT培养基或下述培养基UK1-2 克/升西瑞糖 45大豆粉 10玉米浸渍液 10CoCl20.002MgSO40.10CaCO33MnSO40.10FeSO40.10加入抗泡沫剂(聚丙二醇P2000，含10％(重量)环氧乙烷1ml)，密闭发酵瓶，在120℃和15p.s.i.灭菌45分钟，然后用摇瓶培养物(约3％接种物)接种，在30℃发酵120-168小时，同时搅拌并通入空气，搅拌速度为每分钟1700转(RPM)，每分钟通入的空气量与液体的体积之比为1∶1。
当发酵完成(根据对B.subtilis ATCC6633的抗菌培养检测)后，停止发酵，在天然PH下用硅藻土过滤，使沉淀结块在甲醇中浆化，减压浓缩，用2-3倍体积的水稀释，然后用1/3或1/2体积的甲基异丁基酮或正丁醇提取2次，通过虹吸或离心分出有机层，减压浓缩，得式(I)抗菌素粗品，为粘稠油状物。
用Bacillus subtilis ATCC 6633或金黄色葡萄球菌ATCC6538的敏感菌 株检查肉汤培养基和提取后的液体的生物活性。肉汤培养基和提取后 液体的成份可用Anal-tech硅胶GF板检查，以乙酸乙酯作为洗脱剂。层析后的层析板用香草醛试剂(3g香草醛溶于75ml乙醇中，加上25ml85％磷酸)喷洒，并加热至80℃，式(I)的抗菌素产品显紫色圆点。也可将层析板涂一层含有金黄色葡萄球菌或B.subti-lis菌，并加有2，3，5-三苯基-2H-四氮唑氯化物-水合物的琼脂，然后于37℃保温16小时，可检出抗菌素(粉色背景上呈白点)。
预备含0.7升C′或JDYTT培养基的摇瓶可进行大规模的发酵。摇瓶接种物在28℃发酵5-7天，然后用于接种分别含100或4000升UK1-2培养基的200或6000升发酵罐。每罐约需1升接种物，发酵7-10天后，收集发酵物。
用50升甲基异丁基酮在天然PH值提取小批量发酵(100升)的全部发酵液，用旋风釜和旋转蒸发器减压浓缩有机提取液至油状，该油状物混于正己烷中，于500g的硅胶柱上层析两次。第一次用乙酸乙酯洗脱，第二次用CHCl3∶丙酮(1∶1)洗脱。收集的各洗脱部分，用上述薄板层析法鉴别。第二次硅胶柱层析的活性洗脱液再于florisil上层析，用CHCl3∶CH3OH(19∶1)作洗脱剂。合并各部分洗脱液，用稀H3PO4振摇，然后用磷酸氢二钠缓冲液振摇，使其形成钠盐，用Na2SO4干燥，蒸馏，残留物于乙醚中结晶，分离出式(I)化合物的钠盐915mg，m.p.245-249℃，〔α〕D25＝-19.0°(C＝1，CH3OH)。
元素分析C45H77O14Na计算值C，62.47；H，8.97实测值C，62.89；H，9.22C-13nmr〔溶剂CDCl3化学位移(ppm)；括号里的数字表示氢的数目〕182.8(0)，110.0(0)，106.0(0)，99.1(1)，87.2(1)，86.9(0)，86.2(1)，86.2(0)，84.8(1)，83.4(0)，82.6(1)，80.2(1)，78.5(1)，75.2(1)，74.8(1)，74.6(1)，66.4(1)，60.3(3)，57.9(3)，56.9(3)，44.5(1)，39.0(1)，36.9(1)，36.8(2)，35.9(2)，35.4(2)，35.2(2)，35.1(1)，35.0(1)，31.3(2)，30.9(2)，30.5(1)，28.2(3)，27.1(2)，26.1(2)，25.0(3)，21.0(3)，18.3(3)，16.7(3)，15.3(3)，13.4(3)，13.1(3)，11.2(3)，10.7(3)，and 10.6(3).
大罐全部发酵液通过下法处理用1800升甲基异丁基酮提取约4000升的发酵液，用Podbielnack提取器分离出有机溶剂，减压浓缩有机溶剂至稀浆状，用等体积甲醇研磨两次，除去不溶的油，减压浓缩甲醇研磨液至浆状，用正己烷提取2次，合并正己烷，用乙腈提取，乙腈待回收。环己烷减压浓缩后用硅胶色层析，吸附有产品的硅胶放于过滤漏斗上依次用正己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯和丙酮解吸附。将含有活性成份的CH2Cl2和乙酸乙酯浓缩，溶解于正己烷中，用酸水洗，然后用1％N-甲基葡胺水溶液提取。水相用NaCl盐析，并用同体积的乙酸乙酯提取2次，合并有机层，用活性炭处理，过滤，用PH9.0的磷酸钠缓冲液洗涤，Na2SO4干燥，减压浓缩，乙醚中结晶，得50.8g的钠盐(与小规模发酵的产品相同)。实施例2化合物(I)的游离酸形式用一分液漏斗将上述钠盐的氯仿液与等体积的盐酸(PH2)充分振摇可得式(I)抗菌素的游离酸。分出氯仿层，水洗，减压蒸去溶剂得游离酸.m.p.87-90℃；〔α〕D25＝-6.9°(C＝1，甲醇)。
元素分析C14H78O14·1/2H2O计算值C，63.43；H，9.34实测值C，63.35；H，9.53实施例3化合物(I)的钠盐将上述实施例制得的游离酸(45mg)溶于100ml氯仿中，加入碳酸钠(0.5g)水(100ml)溶液。将上述混合物置于分液漏斗中，猛烈振摇几分钟，分出氯仿层，用新鲜氯仿洗水层，合并氯仿提取液，用Na2SO4干燥，过滤，蒸发溶剂得41mg钠盐，mp230-235℃。
按C45H77O14Na计算值C，62.47；H，8.96实测值C，62.20；H，9.14实施例4化合物(I)的铷盐为了制备式(I)化合物的铷盐，将游离酸(30mg)溶于50ml氯仿中，加入碳酸铷(35mg)的水(25ml)溶液，搅拌2小时，分出有机层，水层用同体积氯仿提取，合并氯仿提取液，蒸发溶剂得白色固体，通过慢慢蒸发乙醚，重结晶出铷盐，得到的结晶由Dr.J.Bordner用X衍射测定结构。实施例5化合物(I)的钾盐为了制备式(I)化合物抗菌素的钾盐，将130mg游离酸溶于100ml氯仿中，加入K2CO3(100mg)的水(100ml)溶液，搅拌几分钟，倒入分液漏斗中，猛烈振摇几分钟，分出有机相，减压蒸发得化合物(I)，白色粉状固体，mp，255-260℃，〔α〕D25＝-19.6°(C＝1，CHCl3)。
按C45H77O14K计算值C，61.34；H，8.81实测值C，60.91；H，8.8权利要求
1.一种制备下式化合物或其药用盐的方法，
其中Me＝CH3；该方法包括在浸入的需氧环境中，于含有可吸收碳和氮源的液体培养基中发酵Actinomadura sp.ATCC53708，直至产生一定量的上述化合物。
2.按权利要求1的方法，其中该化合物以其钠盐或钾盐的形式分离出来。
3.按权利要求1的方法，其中上述化合物从发酵培养基中分离出来。
4.按权利要求1的方法，其中通过过滤发酵液，得到含上述化合物的沉淀，它是含有菌丝体的混合物。
5.按权利要求1的方法，通过喷雾干燥或冰冻干燥整个发酵液，得到含上述化合物的粗品。
全文摘要
通过一种新微生物，ActinomaduraSp.ATCC53708的发酵，产生一种酸性聚环醚抗菌素，并用X衍射确定了它的结构。这种新的抗菌素被用作鸡的抗球虫剂，猪痢疾的预防或治疗剂及牛和猪的生长促进剂。
文档编号A61K35/74GK1035132SQ8910071
公开日1989年8月30日 申请日期1989年2月4日 优先权日1988年2月8日
发明者约翰·菲利普·德兰姆, 沃尔特·帕特里克·卡伦 申请人:美国辉瑞有限公司