专利名称：用于神经和血管移植的胎膜管的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经和血管移植用的胎膜管。
胎膜、羊膜和绒毛膜作为首选材料，是基于以下几个原因。虽然动物胎膜也可采用，但最好使用人体胎膜。(1)作为本发明的一个方面，我们通过实验说明了人体羊膜和绒毛膜管在大鼠身上具有低免疫性，这是当采用点迹和ELISA技术测出膜中的各种抗原(主要是Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类胶原、纤维结合素和昆布氨酸)时而被证实的;(2)人体胎盘的获取无数量限制，且价格低廉;(3)90年来羊膜和绒毛膜一直被广泛用于医疗和外科适应症中;(4)它们可被用于新血管再造术中;(5)它们还可被植入人体皮下组织中，在七周内不会有急性排异反应。胎膜具有复杂的生化结构和不寻常的物理性质。它们可用下面描述的处理方法从物理上改造成为半硬的、有弹性的，具有不同长度、直径和厚度的管子。羊膜和绒毛膜的生化成分主要为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类胶原、昆布氨酸、纤维结合素及其它的糖蛋白。已经发现昆布氨酸通过与属于受体整合素成员的轴突糖蛋白反应可促使轴突伸张。我们所进行的免疫细胞化学研究使我们能改进我们的羊膜和绒毛膜处理方法，以将昆布氨酸保留作为膜管的主要成分，这将在下面叙述。
虽然最好是使用人体羊膜和绒毛膜，但本发明的另一方面还包括来自其它动物(例如牛)的羊膜和绒毛膜。
临床上认为神经自体移植是用来重新构造神经间隙的方法。神经自体移植的缺点表现在许多方面即需要进行附加的外科手术，在供体的伤口处可能会有麻木或感觉过敏的问题，而且经常会受到移植体尺寸的限制。虽然神经异体移植可以克服自体移植的许多缺点，但排异反应是一个主要问题，尽管可使用免疫控制剂，仍限制了它的临床应用。
在神经研究方面目前的课题和今后的方向，集中在研制临床用的理想的神经导管。研究者们已经采用了多种不同的材料，包括硅酮橡胶、聚四氟乙烯、聚原酸酯、polyglactin(一种可吸收外科缝线的材料)、间皮管、肌内基底层以及血管移植物作为神经管。上述每种材料均有缺点，都不能提供理想的再造神经材料。理想的神经导管，应是容易获得的、价廉、容易制造、具有不同尺寸的、非致免疫的、多孔的、不易折、可生物退化的，而且具有可提供对再造轴突有利环境的生化成分。如下所述，我们研制了一种采用人体羊膜的神经导管，它具有理想的神经管所具有的许多特性。
许多研究者最近试用胶原作为神经管。这种胶原在原体中必需为异体基因的或异体生殖的，从而可产生妨碍神经再造的免疫反应。对本发明的羊膜、绒毛膜神经管的免疫测试，显示出很小的免疫反应，从而避免了妨碍神经再造的因素。尽管羊膜、绒毛膜管显示出生物退化性及整体的结构重组，同时在电子显微镜下可观察到限于管壁周围的局部性轻微的炎症细胞浸润，但它还没有产生类似于长期神经压迫症的病变。而后者是采用硅酮橡胶管作神经再造时遇到的主要问题。
对采用羊膜、绒毛膜管作神经再造所进行的功能及形态学分析证实，它优于神经自体移植和硅酮管。
此外，当发生血栓而将血管切断并将血管段去除时，需要有将血管近体端和远体端连起来的血管。在旁路手术中，可避免为此目的而从腿中剥落静脉;同样，当病人没有足够的静脉来替代被去掉的发生血栓的动脉时而进行的随后的旁路手术中，也是如此。而且，移植静脉壁破损及其管腔闭塞而使供体处发病是主要问题，从而限制了它的应用。用于血管移植中的静脉血管，一般取自病人的腿或臂。供体病变以及作为冠状动脉旁路和周围血管插入旁路移植物的静脉移植物不可予料的开放，是众所周知的。已经试用了几种血管移植物，常用的包括保存的牛静脉移植物、涤纶修复移植物、特氟隆及脐动脉移植物。血栓的高发病率以及移植物的感染也是一个问题。作为理想的血管移植物来说，应当是无血栓基因的、易处理的、具有不同直径及长度、可伸长及有弹性的。
本发明的羊膜、绒毛膜胶原管为非免疫基因的，且很容易制成各种长度和直径的管子。本发明的羊膜和绒毛膜管子非常适于用作神经移植物及用于冠状动脉旁路或血管旁路手术中的旁路血管。
本发明提供了用于移植以在神经及血管间隙搭桥的血管或导管。从胎盘的羊膜和绒毛膜中获得的膜状Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ类胶原的物理性质经改性并制成管子，从而可保持其开放性和弹性，以使血液经其管腔流过，且其管壁可耐受内部压力，其中膜的胎面或光滑面向内，则在神经移植情况下可促进轴突生长。
根据本发明的一方面，为了提供这种移植物，从新鲜胎盘而最好是人的胎盘中获取羊膜和绒毛膜，将羊膜和绒毛膜层从胎盘上分离并彼此分开，复盖在膜的胎面上的基层上的细胞单层材料被去掉，例如可通过浸在胰蛋白酶或胃蛋白酶中，将羊膜和绒毛膜在磷酸盐缓冲液或蒸馏水中反复冲洗至干净，再用伽马射线或化学交联剂如戊二醛使羊膜或绒毛膜交联，对组织进行消毒，提供抗病毒感染，增强其强度并使该材料从片状重新模制成导管状。然后将羊膜和绒毛膜片分层缠绕，以使光滑的胎面朝向光制管子的内表面。缠绕层数取决于管子的长度和直径。再将管子干燥，放入瓶中，密封并加标签，如需要可用250万拉德的伽马射线再次照射以进一步消毒，并使导管胶原进一步交联。如果需要，可将各层用适当的胶例如纤维蛋白胶粘在一起，以避免脱开，特别是用于血管移植的较大的导管。
随后在-20℃下将管子或导管储存备用。
对于神经移植来说，在植入羊膜和绒毛膜管时可在其中使用神经促进素，例如基底层颗粒、纤维结合素、胶原提取物、神经生长素或其它生长素。
因此，本发明的目的在于提供一种将切断的周围神经的近体和远体根相接或将血管的近体和远体端相接的管状移植物，它可避免上述已有技术中的缺点，并具有上述优点。
本发明的另一个目的是提供一种将切断的周围神经的近体和远体根相接或将血管的近体和远体端相接的移植物，它包括从人体胎盘获取的经消毒的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类胶原层构成的管壁，该胎盘上的细胞质基本上被去掉，其胎面向内，其胶原靠辐射或化学方法交联;该圆筒具有足够多的层数以保持其未闭或开放;圆筒的长度大于近体和远体根或端间的距离，其直径至少等于与远体根或端相连组织的直径。
本发明的另一个目的是提供这样一种移植物，其中的羊膜和/或绒毛膜的各层被粘在一起，以防止各层脱开。
本发明的另一个目的是提供这样一种圆筒形移植物，其管壁可使间质液流过其中，以为移植物提供早期营养，而在神经移植的情况下，可为许旺氏细胞的生长提供营养。
本发明的另一个目的是提供一种圆筒形移植物，它作为材料包涵体的研究模型，用于神经学领域中神经再造的药物研究。
本发明的另一个目的是提供一种神经移植物，它包括含有相关生长素的羊膜和/或绒毛膜管。
本发明另一个目的是提供一种神经移植物，它包括含有基底层颗粒的羊膜和/或绒毛膜管。
本发明的另一个目的是提供这样一种神经移植物，它可被制成较长长度，不扭结，可保持其形状，且其通道可保持未闭和开放。
从本说明书中可以看出本发明的其它目的、特性和优点。
下面介绍本发明的最佳实施例。
A.羊膜的获取和制备根据本发明这一方面，从新鲜的人体胎盘获得羊膜。胎盘来自医院中的分娩，并在分娩后24小时内拿到。只能使用经过艾滋病和肝炎病毒检测且不属于滥用静脉注射(IV)药品等高危人群的母亲产出的胎盘。应当小心，避免皮肤与血液及组织接触，以将这些材料工作区的污染减至最低程度。
可用手指将羊膜层从胎盘上剥离。从所获得的羊膜中选取最大的厚度均匀的羊膜片。最好用磷酸盐缓冲溶液或蒸馏水将选出的膜片彻底清洗，以除掉血污及碎块。再将膜片进一步冲洗至洁白透明。
可通过将该膜浸在胰蛋白酶中来除去其胎面上基底层上的细胞单层。在室温下将该膜浸在蒸馏水与胰蛋白酶的1∶1溶液中两小时。所用的胰蛋白酶最好取自procine胰腺，浓度为25%，没有钙和镁。经胰蛋白酶处理后，最好用磷酸盐缓冲溶液或蒸馏水对羊膜反复冲洗，直到获得没有粉色胰蛋白酶痕迹的洁白的膜。
冲洗完的羊膜片置于蒸馏水瓶中，并且用500，000拉德的伽马射线照射。照射羊膜会使胶原交联，对组织进行消毒，提供抗病毒传播的动物保护，随后将该材料由片状重新模制成导管或管状。然后将瓶子储存在-80℃的冰柜中。如果需要，例如可用戊二醛使羊膜进行化学交联。
B导管的制作将羊膜从冰柜中取出，在室温下解冻三至四个小时。在手术显微镜下对羊膜片进行检查，以检查其缺陷并确定膜的胎面或光滑面。通过使用碾压机，仔细地将宽度足够制成所需导管长度和直径的羊膜片收集起来。羊膜片的取向，应使其光滑的胎面朝向最后得到的管子的内表面。
虽然可用任何适当方式缠绕羊膜片，但最好使用具有适当直径的高度抛光的不锈钢移植片固定模将羊膜片绕成层。
为保持羊膜筒形状、避免扭结且保持未闭或开放所需的羊膜片缠绕层数，取决于管子或圆筒的长度及直径。例如1.6～1.8英寸直径的导管约需10层羊膜片，而直径为2.5英寸的管约需15层。此导管可具有任何长度。缠在移植片固定模上的管子，然后再在40～60℃的烘箱中干燥约30分钟。干燥可使管子易于从移植片固定模上取下。如果需要，为防止脱开，可使用适当的粘合剂或胶(例如纤维蛋白胶)将羊膜片层粘在一起。然后将管子放在瓶中，密封，加标签，用二百万拉德的伽马射线照射以进一步消毒及使胶原交联。随后，导管在-20℃下储存备用。
实例1在本实例中，人体羊膜的基底膜整体性及薄层成分，在其制成导管之前及以后均靠免疫细胞化学方法进行测定。本发明的人体羊膜导管具有低免疫性，它是在用点迹或ELISA方法测出羊膜中的各种抗原(主要是Ⅰ类胶原、纤维结合素及昆布氨酸)时而被证实的。近九十年来羊膜被广泛用于各种医疗和外科适应症，并且表明能用于新血管再造术。它也可被植入人体皮下组织中，在长达7周时间内不会有急性排异症。
胎膜具有复杂的生化结构和不寻常的物理性质。本发明中它们被用上述处理方法从物理角度改造成为半硬的、有弹性的、具有不同长度、直径和厚度的导管。羊膜的生化成分主要为Ⅰ、Ⅲ类胶原、昆布氨酸、纤维结合素(纤粘连蛋白)及其它糖原蛋白质。已经发现昆布氨酸通过与属于受体整合素族成员的轴突糖原蛋白质反应，可促使轴突伸张。本发明对羊膜的处理方法是将昆布氨酸保留为这些组分的主要成分。本发明中使用伽马射线有几个好处。在20万拉德剂量的辐射下，所有的细菌、真菌及病毒(包括艾滋病病毒)都会被破坏。最好采用250万拉德的剂量，以保证成品材料的彻底消毒。这种剂量还能增强羊膜胶原的交联，从而使其强度增加，以保证将此羊膜导管制成半硬状同时保持弹性，以便在植入后保持未闭性。但如前所述，采用已知方法(例如浸在戊二醛中)进行化学交联也是可取的。
通过免疫试验证实，羊膜神经导管具有很小的不显著的免疫反应。这样就避免了一些影响再造神经的不利因素。尽管羊膜显示了生物退化的迹象和整体的结构重组，且在电子显微镜下观察到限于导管壁周围区域的局部炎症细胞浸润，但它没有产生长期神经压迫症的病变。而后者是近来临床使用的硅酮橡胶管作神经再造时遇到的主要问题。
对羊膜导管的长期观察，可看到以许旺氏细胞透过导管层的浸润及胶原重组为特征的主要结构变化，表明生物退化性及重组现象，这是羊膜导管的一个特性。
如前所述，本发明的羊膜管可以作为许多促进神经生长的材料[如基底层、纤维结合素(纤粘连蛋白)、胶原提取物、神经生长素及其它生长素]的载体。如美国专利5，002，071所述，胶原提取物可为从人体胎膜中提取的胶原。例如在植入时，可将基底层以冻干沉淀物、被极化或被保存在任一种保存液中的形式应用在羊膜管中。
实例2在本实例中，在实验动物体上用本发明的导管进行的神经再造，将从形态学方面及功能上与自体移植及其它类型的神经管进行比较。
将十一只猫分成五组对4厘米间隙的胫神经再造进行评价。
第一组(3只动物)羊膜管;
第二组(3只动物)羊膜管，用肌肉中提取的基底层作为神经生长素;
第三组(3只动物)神经自体移植;
第四组(1只动物)用假手术控制;
第五组(1只动物)未修复。
这些动物生存六个月后被杀掉，然后对神经段进行形态学和组织学研究。
采用Demerol及苯巴比妥肌肉注射和卤化乙烷及NO2混和物吸入而使猫麻醉。露出胫神经，4厘米长的神经段修复状况如下在第一组(羊膜)，羊膜管被缝合在间隙4厘米的近体和远体根上。两根缝线位于180°的两侧，且穿过仅包含神经根的神经外膜的管子的整个厚度。
在第二组(羊膜-基底层)，与上相同，将4厘米的神经段切开，由填充基底层的羊膜管对此间隙搭桥。
在第三组(神经自体移殖)，4厘米的神经段被切开，再用神经外膜技术重新附着。
在第四组(假手术)，胫神经被切开但未变动。
在第五组(未修复)，4厘米的胫神经被切开，未见修复而将神经断头缝在下部肌肉上。
动物存活六个月，除假手术一组外在各实验组都没有观察到功能改进。
六个月后将猫杀死，并进行形态学和组织学研究。结果显示羊膜基底层对神经再生是极有利的物质，而且在羊膜胶原管中添加肌肉的基底层，可促进神经再生。
在轴突直径的矩形图中，羊膜基底层组显示了与假手术组相似的分布，甚至更大的轴突，且相当比例的(9%)轴突在1.5～2.25微米的范围内。对于神经自体移值，其矩形图可与假手术组相比，但大量的(37%)轴突在0.5～0.75微米之间。在羊膜管组中，轴突直径在0.1～1微米之间，而多数(58%)轴突在0.25～0.5微米范围内。轴突直径的矩形图表明，基底层有助于获得较大的轴突，且与正常状态最为接近。
本实例的结论是人体羊膜导管是用于神经移植的很好的替代物，而肌肉的基底层在被加到羊膜胶原管中时是很好的神经营养材料;填有基底层的羊膜导管优于神经自体移殖;人体羊膜胶原管对于神经再生是良好的导管，并可以容纳任何神经营养材料。
实例3在本例中，用人体绒毛膜代替人体羊膜。将绒毛膜与羊膜分开，再按上述A段中同样的方法进行处理，按B段中叙述的同样方法制成的导管，具有与实例1及2相似的性质，并适用于神经生长及作为血管。如将绒毛膜与羊膜分开，则可省去上述采用胰蛋白酶或胃蛋白酶的步骤。
实例4在本实例中，用从牛的羊膜和绒毛膜中得到的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类胶原及其组合代替人体膜，并如上述制成导管或管子，它可获得与人体膜相同的用于神经生长及作为血管的满意结果。
本发明的方法包括用管子将切断的神经的近体和远体根或血管的近体和远体端连接起来，该管子包括至少一层不含细胞或上皮材料的、由Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类胶原或其混合物、昆布氨酸、纤维结合素和其它糖原蛋白组成的消毒的交联膜，其胎面朝内。该膜用辐照或化学方法进行消毒及交联，并且具有足够的层数以保持其未闭性。此管长度至少等于近体和远体根或近体和远体端间的距离，而其直径至少等于、最好稍大于近体和远体根或近体和远体端的连接组织。对于神经移植，管中可含有神经生长素，例如基底层、纤维结合素或胶原提取物、或其结合，如上所述。此管被缝合或用其它方法固定在与神经根或血管端相邻的连接组织上。
此移植物可长期储存，以提供随时待用的移植材料来源。该移植物可被制成任意长度和直径，而且可将移植物的各层粘在一起，以防止使用时各层脱开。
因此，将切断的神经或血管的近体和远体端间的间隙连接起来的移植物为圆筒形，其管壁至少包括一层从胎盘中的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类胶原及其组合物中提取的消毒的交联膜，此移植物非常令人满意。
因此，本发明很好地实现了发明目的，而且具有上面指出的优点和性能以及其它特征。
虽然出于介绍的目的给出了本发明的最佳实施例，但在由权利要求所限定的本发明的范围内可以作出一些变化和改进。
权利要求
1.一种在切断的神经的近体和远体根之间和血管的近体和远体端之间间隙搭桥用的移植物，包括一个圆筒，其长度至少等于切断神经或血管的近体和远体端间的距离，其直径至少等于切断神经或血管的近体和远体端的直径；该圆筒的管壁至少由一层消毒的交联膜构成，该膜包括选自由Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类及其混合物构成的一组胶原；上述胶原从胎盘的羊膜、绒毛膜或其组合物组中获得。
2.如权利要求1的移植物，其特征在于所述管壁至少包括粘在一起的两层片状膜，以防止使用时各层脱开。
3.如权利要求1的移植物，其特征在于，该移植物可使间质液流过其圆筒的管壁。
4.如权利要求1、2或3的移植物，其特征在于该移植物为神经移植物，而且至少包含一种神经生长素。
5.如权利要求1、2或3的移植物，其特征在于该移植物为神经移植物，并且包含基底层、纤维结合素、羊膜胶原提取物或其组合。
6.一种恢复被切断神经功能的方法，包括用权利要求1、2或3所述的移植物将切断神经的近体和远体端连接起来。
7.一种恢复被切断神经功能的方法，包括用权利要求1、2或3所述的移植物将切断神经的近体和远体端连接起来;该神经移植物至少包含一种神经生长素。
8.一种恢复被切断神经功能的方法，包括用权利要求1、2或3所述并包含基底层的移植物将切断神经的近体和远体端连接起来。
9.一种替换血管的方法，包括用权利要求1、2或3所述的移植物将血管的近体和远体端连接起来。
10.如权利要求1、2、3、4或5的移植物，其中羊膜或绒毛膜取自人体胎盘。
全文摘要
本发明公开了一种用于神经和血管移植的圆筒、它的制作方法和应用。该圆筒的管壁由至少一层从胎盘获取的消毒的交联I、II及III类胶原或其组合构成。该神经移植物可促进轴突的再生。该神经及血管移植物为非免疫性的，可被制成各种长度和直径的管子，并易于处理，且在使用中保持关闭或开放。
文档编号A61F2/04GK1079912SQ9211481
公开日1993年12月29日 申请日期1992年11月26日 优先权日1991年11月26日
发明者S·M·肖纳克, 凯瑟·J·格莱 申请人:研究发展基金会