具有双涂层的含铁纳米级颗粒及其在诊断和治疗中的应用，的制作方法

专利名称：：具有双涂层的含铁纳米级颗粒及其在诊断和治疗中的应用，的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有单元结构的含铁纳米级颗粒、它们的制备及其在诊断和治疗中的应用。一种物质，由于热能抵消了自发磁化Weiss’磁畴的永久排列(permanentalignment)，即使在低场强下也能显示最大磁化(高饱和磁化)，而且在外部磁场关闭后没有剩余磁感应，这种物质被称为超顺磁物质。这类物质包括研制成非肠道磁共振(MR)对比材料的含铁晶体。所述物质的特性是其对质子弛豫时间的强冲击以及在诊断步骤中用作对比介质的巨大效力。在医学诊断学中，检查超顺磁物质的重点放在了具有在磁铁矿或磁赤铁矿(尖晶石、反向尖晶石)发现的“磁铁矿类”晶体结构的氧化铁上。由于用作磁共振对比材料的超顺磁氧化铁强烈地影响着近距离的质子弛豫(高弛豫)，而且它们是具有“磁铁矿类”晶体结构的颗粒，所以它们具有类似的性能。已经公开了许多方法用于制备具有超顺磁性能的含铁晶体(氧化铁)，这些方法可根据各个方面进行分类，有两种制备超顺磁晶体的基本方法是可以区分的在高温下烧结，再机械粉碎；或者溶液中的湿法化学合成。迄今为止，只有由湿法合成制备的那些颗粒被研制为医用，而烧结方法被描述为制备用于技术(声音载体、颜料和有机调色剂)和生物技术应用如磁分离方法[SchostekS，BeerA；DE3,729,697A1；BorelliNF，LudererAA，PanzarinoJN；US4,323,056；OsamuI，TakeshiH，ToshihiroMetal.；JP60,260,463A2]的氧化铁。湿法化学合成可分成小类。有一种“两罐合成法”，该方法首先制备含铁核(氧化铁)，再加入稳定剂以保证其物理和盖伦试剂性质。利用离子交换剂制备铁核是“两罐合成法”的衍生。在“一罐合成法”中，氧化铁是在稳定剂存在系下制备的，所述稳定剂已在成核和氧化铁沉淀过程中涂在了核上，因此预防了毫微晶体的聚集和沉淀。在所述方法中，除了“两罐”和“一罐”的分类方法，还有一种基于所用溶剂类型的分类方法，被称为水法[HasegawaM，HokukokuS；US4,101,435；FujiRebioK.K.；JP59,195,161]和非水法[PorathJ，MatsL；EP179,039A2；ShigeoA，MikioK，ToshikatzuM；J.Mater.Chem.2(3)；277-280；1992；NorioH，SaturoO；JP05,026,879A2]。使用非水溶剂在“两罐”方法中制备的颗粒主要在工程上使用。由于医学和毒理学原因，用作人体诊断对比材料的磁性氧化铁需要水分散剂。对于在非水溶剂中制备且在制备后分散到水介质中时是稳定的那些颗粒，在这种分类中有特殊的位置。目前这类颗粒一般用在体外诊断如磁分离工程中[ChagnonMS，GromanEV，JosephsonL，etal.；US4,554,088]，但已有建议用于体内诊断中[PilgrimmH；US5,160,725]。由“两罐”法制备的颗粒主要用在早先直至二十世纪中叶的实验检查中，而当今涉及氧化铁的试验仅仅是为由“一罐合成法”制备的材料描述的。基于物理和化学性质以及药物/盖伦试剂稳定性，由于由“一罐”法制备的超顺磁含铁氧化物优于“两罐”法，所以“一罐”法已被普遍接受用于制备人体诊断应用的超顺磁含铁氧化物的制备。根据“一罐法”在水合介质中制备的颗粒的药物稳定悬浮液/溶液可再分为不同尺寸的氧化铁。毫米范围的颗粒可用于生物技术[SchroderU，MosbachK；WO83/01738或SchroderU；WO83/03426]，甚至要求保护其在体内诊断和治疗方面的应用[WidderKJ，SenyeiAE；US4,247,406或JacobsenT，KlavenessJ；WO85.043301]。然而，对于在医学诊断中的方法，纳米范围的颗粒是目前公开的主要颗粒。根据优选的用途，此范围也可再分为“大颗粒”(总体颗粒直径大约＞50nm)和“小颗粒”(总体颗粒直径大约＜50nm)。肝和脾的磁共振诊断是主要的应用领域，这是由于这种尺寸的颗粒可迅速并几乎完全被这些器官的大噬菌体溶解[KresseM，PfeffererD，LawaczeckR；EP516,252A2或GromanEV，JosephsonL；US4,770,183]。进一步地，已有建议将其用作临床高温治疗中的增强物质[HasegawaM，HiroseK，HokukokuS，etal.；WO92/22586A1和GordonRT；US4,731,239]。目前，几乎所有的医用颗粒都是氧化铁，这种氧化铁是在葡聚糖用作稳定物质[BacicG，NiesmannMR，MaginRLetal.；SMRM-Bookofabstracts328；1987；OhgushiM，NagayamaK，WadaAetal.；J.MagneticResonance29；599-601；1987；PouliquenD，LeJeuneJJ，PerdrisotRetal.；MagneticResonanceImaging9；275-283；1991或FerrucciJT，StarkDD；AJR155；311-325；1990]条件下制备的，但是，也公开了使用其它多糖，例如阿拉伯半乳聚糖[JosephsonL，GromanEV，MenzEetal.；MagneticResonanceImaging8；616-637；1990]、淀粉[FahlvikAK，HoltzE，SchroderUetal.；Invest.Radiol.25；793-797；1990]、葡糖氨基聚糖[PfeffererD，SchimpfkyC，LawaczeckR；SMRM-Bookofabstracts773；1993]或蛋白质[WidderDJ，GriefWL，WidderKJetal.；AJR148；399-404；1987]。合成的具体条件如所涉及的铁盐、温度、涂层聚合物(稳定剂)、滴定速率、碱的选择、纯化等影响着产品的化学和物理性能，因而影响其药物和盖伦试剂性质以及医用价值。在研制中，引起特定应用的有效使用的重要步骤是由Weissleder和Papisov完成的[WeisslederR；PapisovMI；ReviewsofMagneticResonanceinMedicine4；1-20；1992]，他们能揭示磁性氧化铁的“靶向能力”与颗粒大小成反比。这方面的问题就在于效力(磁共振效果)随着颗粒大小的减小而降低的事实。近来已经公开了在没有任何分级步骤的条件下制备尺寸特别小的磁性氧化铁[HasegawaM，ItoY，YamadaH，etal.；JP4,227,792]。对于尺寸特别小的颗粒，关于“功能性成像”的实验被称为MIONs。利用高碘酸盐氧化所述颗粒的葡聚糖涂层(磁性标签)，然后与特定的分子(抗肌浆球蛋白；多克隆抗体)偶合[WeisslederR，LeeAS；KhawBAetal.；Radiology182；381-385；1992，或WeisslederR，LeeAS，FishmanAetal.；Radiology181；245-249；1991]。Menz等人研制了一种特殊的方法[MenzET，RothenbergJM，GromanEV，etal.；WO90/01295]，他们利用具有生物因子细胞的聚合物(阿拉伯半乳聚糖)涂布大的纳颗粒，他们要求保护如Gordon[GordonRT；US4,735,796]的通过受体媒介的细胞摄粒作用的特殊吸附机理；Gordon利用高碘酸盐氧化葡聚糖稳定的颗粒，然后通过还原胺化，利用转铁蛋白偶合。用作肝脾磁共振诊断对比材料的“大颗粒”超顺磁氧化铁的制备是本领域的现状，所述材料的诊断利益已被证实。这些氧化铁中的部分已被研制成临床目的[AMI-25；AdvancedMagneticsInc.；Cambridge；Mass.；USA；PhaseIII/IVandSHU555A；ScheringAGBerlin；Germany；PhaseII]。用于特定(肝外的)方法如磁共振淋巴系造影术或磁共振血管造影术的氧化铁水压直径(hydrodynamicdiameter)的重要性是已知并且被检验过的。在血液中的半衰期随着颗粒直径的减小而增加，否则是相等的。制备小颗粒氧化铁的合成方法可从文献中得知。在研制基于超顺磁氧化铁的特殊对比材料中遇到的基本问题在于在没有可接受的物理和化学参数共同缺陷的条件下，还不可能改善靶向性能，即在靶向器官中的聚集和分布，这是因为最适用于制备靶向目的的含铁核的稳定剂非常有限。另外，尽管合成后的物质必须保留一些靶向性能(生物活性)，但是所有重要且非常特别的分子(蛋白质、肽、低核苷酸，还有多数低聚糖和多糖)不能用作制备相中的稳定剂，所以合成过程中的反应条件(酸碱pH、温度、涉及铁盐的氧化还原反应)降低了潜在稳定剂的选择。从至今使用的(化学)“钝感”聚合物，主要是葡聚糖，可以知道，合成条件中存在着各种非控制性反应，例如pH酸性范围内的解聚反应(例如在工业质量中由酸解生产低分子量葡聚糖)，以及在碱性范围(沉淀步骤)内可能破坏(糖-)聚合物的各种其它反应。考虑到糖化学和所需的反应条件，可以设想因为尽管葡聚据用于稳定，但在合成后却不留下任何葡聚糖，所以现有技术中的“葡聚糖磁铁矿”根本就不是葡聚糖磁铁矿。如果从药物和赞赏观点来观察，这就意味着基本成分-由于稳定剂形成涂层，因此稳定剂很大程度上确定了生物性能-是未知或未公开的。所导致的另一实际问题在于如果表面本身未知，那么在将来的研制中将不能优化表面性能。利用已深刻研究过的如磁共振淋巴系造影剂的应用可以表明，一方面由于使用葡聚糖作为稳定剂(至今还没有出版关于使用其它聚合物制备小颗粒氧化铁的资料)的现有技术中的颗粒大小优化使得颗粒聚集非常容易，所以这种大小优化确实推动了应用；但是另一方面，对于临床应用，其在淋巴结中的分布不够均匀[Taupitz，Metal.；SMRM-Bookofabstracts500；NewYork；USA；1993]。这种有力却是不均匀的聚集使得由重新优化水力直径的另一改性成为不大可能。靶向器官的小体积是研制特殊诊断物质的重要问题，例如，淋巴结的总重量还不到体重的1％。因此诊断物质必须主要集中在靶向组织中(特殊性)，而且在低浓度下具有强的对比-增强效果。由于超顺磁氧化铁当今代表了在磁共振中具有最强对比性的物质，所以这些颗粒特别适用于特殊应用。然而，由于颗粒大小对生物性能具有本质的影响，所以形成所述物质特征的氧化铁晶体核是一个问题。小颗粒大小能改善靶向能力，但是由于颗粒大小和磁矩的相互依赖，因此对比材料的效力降低了，从而必须寻求(物理)对比效果与(生物)靶向能力之间的折衷办法。根据一般规则，为了达到高的效力，含铁核应当尽可能地大，而总体直径应当维持很小。本发明所涉及的问题是提供一种含铁纳米级颗粒，该颗粒利用优化的特殊纳米级颗粒能够满足物理和生物要求。令人惊奇的是，本发明纳米级颗粒的靶向能力优越于现有技术中的氧化铁颗粒。对比材料和/或治疗物质/空前“靶向能力”的支持系统能够通过结合物理性能与纳米级颗粒的改性靶向能力而制得。纳米级颗粒是由单个模具(单元设计)制备的，这种方法保证了含铁核(物理效应；对比)与靶向成分(生物性能)结合时的最大灵活性。由于单元结构允许由存放的(含铁核)成分和可能是高感度的靶向分子“正好及时地”装配完整的纳米级颗粒，所以这种结合具有优势。这种与临床放射药物学中的感冒药盒(coldkits)的相似性促进了例如使用患者的血清成分作为靶向分子(如自身抗体)。由于本发明颗粒的强烈着色，因此也可通过眼睛检测所述颗粒。上述着色是必要的，例如当这种颗粒用作手术中的可见标记物质时。进一步地，这里描述的纳米级颗粒还可治疗用途，例如用于在与活性物质磁性连接释放的结合靶体积之上利用外部磁铁的磁性靶向探测中。纳米级颗粒可聚集在如肿瘤中，因此该颗粒可在局部高温中用作特殊的增强剂。本发明的纳米级颗粒含有含铁核、形成优化大小纳米级颗粒的第一涂层(合成聚合物)和第二涂层(靶向聚合物)，以及任意的药物助剂、药物和/或吸附介质/增强剂。含铁核可以是颗粒、胶体或晶体形式。纳米级颗粒包含由核制备的合成聚合物，该聚合物作为第一涂层涂布在核上，所述聚合物在控制物理和/或药物/盖伦试剂性能的制备中是需要的。然后通过解吸方法将合成聚合物与铁的比例调节至所需的数值。对于在代表纳米级颗粒表面且包围核和第一涂层基本结构单元的特殊诊断中，需要吸附靶向聚合物。为改善吸附，可在第一涂层与第二涂层之间存在吸附介质/增强剂。纳米级颗粒的其它成分可以是药物助剂或药物。图1为本发明纳米级颗粒的结构剖面图。所述基本结构单元(含铁核加上第一涂层)在溶液中的水力直径小于100nm，且不大于5倍含铁核直径，优选小于50nm。本发明纳米级颗粒的进一步特征在于其可以优选的稳定胶体溶胶形式得到，但是该颗粒也可以制成冻干粉，所述冻干粉能利用药物中的普通溶剂(电解液、血浆膨胀剂、葡萄糖液、生理盐水等等)溶成溶液；或在于基本结构单元以及靶向成分和任意的助剂是分开的溶液或冻干剂，它们可在任何所需地点及时地混合而得到给药的溶液。含铁核的磁矩比铁(II)或铁(III)离子大。由于含铁核的磁性，所以当物质用作磁共振X线体层照相术的对比材料时，含铁核能促进对比-增强效果；达到优化对比效果必须是超顺磁的或者至少含有超顺磁部分。这就意味着所述核必须是晶体或多原子配合物(“颗粒”)，因为这种类型的磁力现象只发生在固体物质中。本发明的含铁核可以由磁铁矿或赤铁矿组成或含有磁铁矿或赤铁矿。所述核中至多有25％重量的铁可由其它金属离子替代。所述非铁离子是顺磁、抗磁或其二者混合。本发明纳米级颗粒的进一步特征在于含铁核的由电子显微镜测量的直径小于30nm，优选小于15nm，该核含有至少50种金属原子，其中至少90％含铁核的颗粒直径分布在平均0.7×至平均1.3×的范围内。纳米级颗粒中合成聚合物的含量为存在的金属离子总重量的0.01至1倍。优选含量为总重量的0.25至0.75倍。单体或聚合物质、或者这些物质的混合物或衍生物、或者含官能团的衍生物、或者另外取代且分子量小于100,000Da的衍生物均可以用作合成聚合物。优选的物质具有分子量小于10,000或5000Da。对于用作合成聚合物，葡聚糖或葡聚糖混合物和/或葡聚糖衍生物特别优选。合成聚合物可在其分子中含有一个或几个酸基或几个官能团，其中优选含有N、S、P或O原子。用作靶向聚合物和合成聚合物的物质或物质的混合物可以相同或不同；由于靶向聚合物不曝露在合成及合成中的合成聚合物副反应中，因此靶向聚合物保留其生物状态。含铁核和第一涂层的母体物质确定了纳米级颗粒的物理性质，而靶向聚合物确定了纳米级颗粒的生物性质。纳米级颗粒中所含的靶向聚合物重量为存在的金属离子重量的0.5至50倍，优选1至25倍。本发明的纳米级颗粒可含有吸附介质/增强剂，其量小于或等于所含金属离子的总重量。这些吸附介质/增强剂增强或使靶向聚合物吸附在含有含铁核/(剩余)合成聚合物的基本结构单元上。优选的吸附介质/增强剂为具有下述结构或其部分结构的肽RRTVKHHVN、RRSRHH或RSKRGR[氨基酸的单字母编码]。包括所有纳米级颗粒成分的水力直径不大于10倍含铁核直径且不大于1.2倍基本结构单元直径。本发明的纳米级颗粒包括单个单元如能随时组合的基本结构单元、靶向聚合物、药物和吸附介质。纳米级颗粒制剂是纳米范围的稳定含铁核颗粒的低粘性水合胶体溶液或悬浮液。纳米级颗粒溶液不含有任何更大的聚集体并可通过静脉内给药，该制剂能够满足国际药典中的非肠道给药要求。一般地，基本结构单元可通过加热处理进行无菌化。最终纳米级颗粒的“无菌化”方法取决于第二涂层的敏感度，但是无论在何种情况下，消毒和无菌制备都是有保证的。由于颗粒的尺寸很小，所以过滤无菌化总是可行的。另一种保证实际上无菌的给药溶液的方法是将敏感的靶向聚合物与无菌基本结构单元在使用前很短的时间内结合。当用作如磁共振对比介质时，纳米级颗粒是非常有耐药力的，而且在诊断与致命剂量之间具有非常满意的安全界限。依赖于特殊应用的诊断剂量为每千克体重5μmol至200μmol(铁)，而致命剂量大约为每千克体重(小鼠)20mmol至50mmol。物质是完全生物降解的。溶解含铁核，然后将铁引入生理铁池。用作合成和靶向的聚合物能通常降解代谢分解成基本单元(糖、氨基酸)。纳米级颗粒溶液非常稳定，在制成制剂后测不出物理参数(颗粒大小、磁性性能)的变化。当在无菌条件下制成制剂时，溶液可保存很长一段时间；例如，在12个月时间内观察不到不稳定现象如聚集或沉淀。由于含铁晶体具有很强的颜色，使用所述溶液或悬浮液具有微红褐至黑的颜色。这种特征颜色可用于可见监测，从而所述物质可用于外科药物中的标记。当用作磁共振X线体层照相术中的对比介质时，纳米级颗粒为超顺磁或含有超顺磁部分。即使在低磁场强度下，该颗粒也能显示出高的饱和磁化，而且在外磁关闭后没有剩余磁感应。纳米级颗粒可制成溶液(悬浮液)，能在不进行进一步制备下应用。由于纳米级颗粒与常用医用溶剂如生理盐水、电解质溶液或葡萄糖溶液相容，所以该颗粒可根据需要稀释，并可为特殊应用而注射或灌输。从存放的观点出发，冻干粉是制成溶液的另一种制剂。将基本结构单元冻干，然后再悬浮在溶解的靶向聚合物中，或者在吸附之后，将基本结构单元和纳米级颗粒冻干，然后在使用之前将其再溶解在生理盐水或注射用无菌水中。另一种储存所述物质的方法是将基本结构单元和靶向聚合物分别存放在溶液中，在使用之前混合。特殊或胶体含铁核是通过变换，由单分子溶解的铁前体制得的，接着一罐合成，调节pH值，使其在稳定剂物质(合成聚合物)存在下沉淀。在制备中，合成聚合物分离了晶体核，故可用于控制颗粒大小。合成聚合物不但决定了晶体核的物理和药物/盖伦试剂性能，而且决定了整个纳米级颗粒的物理和药物/盖伦试剂性能。因为所述核分离到了不存在聚集的程度(无菌稳定)，所以合成聚合物促进了溶液的稳定(悬浮液)。当获得含铁核颗粒时，通过吸附调节合成聚合物，从而给出合成聚合物与铁的比例。铁核和作为第一涂层包围和稳定含铁核的合成聚合物残留物的溶液(悬浮液)代表了单元系统的基本结构单元。基本结构单元的特征在于其高的物理和盖伦试剂性能。第二重要的成分是合成后被基本结构单元吸附且作为第二涂层包围核和第一涂层的靶向聚合物。第二涂层是纳米级颗粒的表面，该涂层决定了体内性能。基本结构单元和靶向聚合物可在任何时间混合，也可进行“正好及时”的制备。合成聚合物残留物和靶向聚合物之间的吸附方法可通过中间步骤得到改性或提高加入吸附介质/增强剂。吸附介质/增强剂也可加入到含靶向聚合物的混合物中。药物助剂或药物可按类似的方法在任何时间加入。本发明的特殊优点是明显的，本发明的方法第一次使得以最优的方式满足特殊纳米级颗粒的物理和生物两者的要求成为可能。基于颗粒的单元结构，即分别制备基本结构单元(含铁核+第一涂层)和靶向聚合物(第二涂层)，本发明具有最适合物理性能的合成聚合物是选自没有任何纳米级颗粒所需生物靶向能力限制的合成物；因此是第一次不需要折衷纳米级颗粒的物理和药物性能与其所需的生物效果。靶向聚合物不要暴露在有害的合成条件中。可以使用许多起作第一涂层作用的靶向物质。类似地，不需要合成后的反应，所述合成后的反应可能需要恰当的反应条件并降低配体的完整性；例如，不需要如在高碘酸盐氧化，然后再还原胺化中涉及含二硫化物桥的蛋白质的氧化还原反应，仍维持生物活性。由于不需要分离的反应溶液如高碘酸盐，所以另一基本优点在于无需进行基本结构单元/靶向聚合物的纯化。本方法允许当场制备，包括在使用之前立即“正好及时地”制备纳米级颗粒；这种方法可能是需要或必要的，例如对于“个体”对比介质(如自身抗体)或者如果靶向聚合物在溶液中只保留很短时间的稳定。由于纳米级颗粒的“表面”可分别改性/优化，而且可利用先进的分析方法如核磁共振或红外光谱进行分析，所以本发明方法具有进一步优化的优点。如果存在特殊核，这些方法均不能应用。由于表面是由特定的方法制备并可进行充分的分析，因此使表面性能的系统优化成为可能；而作为颗粒以整体进行处理的现有技术中的制备方法，表面是未知的且只能用试凑法进行优化。由此，纳米级颗粒是由几个步骤制备的。一般地，含铁核是由“一罐”法合成的，也就是在稳定剂(合成聚合物)存在下。稳定剂(合成聚合物)溶解在水中，与单分子铁化合物混合。通过增加pH值将铁盐转变成优选的氧化物。在另一种方法中，将稳定剂溶液碱化，然后与铁盐混合。混合物回流加热并中和，或者反过来也一样。纯化粗物质，通过解吸方法调节剩余物或未固定吸附/粘合的合成聚合物至精确的铁与稳定剂重量比。包含氧化铁核和(残余)合成聚合物的纯化和解吸碱性物质代表(单元结构)纳米级颗粒的基本结构单元。作为选择，接着可进行加热无菌化。在需要或在维持“存放”时，通过基本结构单元吸附选择的靶向聚合物，结构单元选择性带有中间吸附或者助吸附的媒介剂/增强剂。其它成分如药物助剂或药物可任意地加入。图2给出了一般制备方法的概况。注意根据下文描述的含铁核的“一罐”法，合成总是在稳定剂存在下进行的。混合作为前体的化学计量量的铁(II)盐和铁(III)盐，制备含铁核。使用的盐将影响着所得晶体的质量；根据文献介绍，主要使用盐酸盐，即氯化亚铁和氯化铁。但是一般地，所有强酸盐包括硫酸盐和硝酸盐均可使用。由于铁(II)盐非常容易氧化，所以当使用这些盐时，不容易保证精确的化学计量。这里优选使用更加复杂的盐如Mohr’盐，这种盐对氧化较不敏感。令人惊奇地，由于无机离子可用作稳定剂或辅助稳定剂，因此使用有机盐优于使用无机盐。已证实葡糖酸铁(II)或柠檬酸铁(III)特别适合；但是也可使用其它有机离子物如富马酸盐、酒石酸盐、乳酸盐或水杨酸盐。不必要滞留高度氧化敏感的铁(II)盐且减少“外来离子”数量、仅仅依赖铁(III)盐的合成方法使得制备变得容易。合成方法仅从铁(III)盐开始，而铁(II)盐是在通过计算还原剂量的反应中就地产生。一般地，尽管可以使用所有能化学计量精度地还原铁(III)的还原剂，但是由于反应的羟胺能定量地转变成一氧化二氮并能容易地完全从反应混合物中分离，因此优选羟胺。如果更详细地研究铁盐的化学，先前描述的方法的缺点将会变得明显。这就是将化学计量组成中的铁(II)和铁(III)转变成具有指定结构晶体的沉淀步骤的目的。增加pH值，将形成所需的氧化物。然而，如果考虑到在pH大约为2时，铁(III)离子[pKLFe(OH)3大约371]1(1pKL值取决于浓度，数据是指10-2mol/l的溶液)会形成微溶的氢氧化物，而当pH为8时，铁(II)离子才开始以氢氧化物沉淀[pKLFe(OH)2大约13.5]，由此可见直接生成所需的晶体几乎是不可能的，反应路径必须包括氢氧化物的后续反应步骤。可使用适当的配位剂使铁化合物的沉淀点移动至相互关联起来，从而在氧化铁晶体的不同阵点上同时沉淀和插入。通过选择适当的配位剂，可在很宽范围内控制所使用的铁化合物的沉淀点。除了表1中的“经典”物质，上述有机离子可用作配位剂。在任何需要时将铁(II)和铁(III)的配盐、有机离子盐和无机盐组合起来。表1当在赤铁矿合成中pH值增加时，选择用于移动沉淀点的配合剂和螯合剂<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="886">配位剂(螯合剂)铁(II)logK1*铁(III)logK1*COTA反式-1，2-二氨基-环己基-N，N，N’，N’-四乙酸16.2728.05EDTA乙二胺四乙酸14.3325.10EGTA乙二醇-O，O’-二-(2-氨基乙基)-N，N，N’，N’-四乙酸11.9220.50DTPA二亚乙基三胺五乙酸16.5028.60HEDTAN-(2-羟乙基)-乙二胺-N，N’，N’-三乙酸12.2019.80NTA次氮基三乙酸8.8415.87TTHA三亚乙基四胺-N，N，N，N’，N’，N’-六乙酸17.1026.80</table></tables>*K1为绝对稳定常数，与pH无关。它是指螯合剂的去质子化形式K1＝[ML]/[M]·[L]，其中[ML]、[M]和[L]为螯合物、金属离子和螯合剂(配位体)的浓度。表1列举的螯合剂只是用来证明适当范围的化合物，不能仅仅限制于解释这些物质。在合成方法中，首先分别生成氢氧化铁(II)和氢氧化铁(III)。惊奇的是，通过结合分别制备的氢氧化铁溶液可成功地制备氧化铁晶体；加热结合的溶液，可加速转变和结晶。沉淀是会铁核制备中的重要步骤。通过增加pH值，可由低分子量铁化合物形成特殊铁化合物；在考虑形成中，胶体氢氧化铁是任意的中间产物。能够提高溶解的酸性铁前体的任何物质均可适用于增加pH值。除了氢氧化钠浓溶液，优选使用气体氨或铵盐、碱性胺或挥发性缓冲物来增加pH值。令人惊奇的是，用于沉淀的碱以如下方式影响整个性能“生物”效果如人体器官中考虑分布的差异变得很明显。碱性物质的浓度必须在0.1至10N之间；由于pH值快速增加可优选地形成小核尺寸的颗粒，因此优选大约1至4N的浓溶液。在30分钟内加入碱，优选在30秒钟内加入。铁化合物在0-120℃温度范围内沉淀在颗粒上，优选50-80℃。根据一般规则，当直接形成氧化铁时，温度可低一些；而当所述形成包括作为中间步骤的氢氧化物时，温度必须高一些。沉淀后中和产物，接着，特别是当形成作为中间产物的氢氧化物时，回流原物质；加热时间必须在0分钟至24小时之间，一些30分钟至1小时。中和和回流可以以相反的顺序进行。当用作外科可见监测的对比介质(光学标记物质)时，物质的本身颜色是非常需要的。在磁共振X线体层照相术中的应用需要由纳米级颗粒磁性性能确定的高效性。由于氧化铁磁铁矿和赤铁矿在应用于临床磁共振X线体层照相术的场强中显示出高的饱和磁化，所以当纳米级颗粒用作磁共振对比材料时，氧化铁磁铁矿和赤铁矿似乎是特别适合的。特殊铁核晶体结构确定了特殊磁性性能，但是，令人惊奇的是，外来离子也可以插入到该晶体结构中，仍可得到类似于磁铁矿的晶体结构。这种与非含铁金属离子掺和可通过两种方法进行。一方面，铁(II)和/或铁(III)离子在其网格位置上由其它顺磁金属离子置换；另一方面，利用抗磁离子替代。为了更好地理解，应当记住，由于铁(III)离子占据了平行/逆平行网格位置，以致于其各自磁矢量被中和了，因此磁铁矿晶体中的磁化只产生于铁(II)离子。净磁化量可通过使用具有比铁更高磁矩的离子而增加，或通过使用顺磁或抗磁离子改变由铁(III)离子占据平行/逆平行网格位置的平衡而增加。如果所述替代涉及具有高磁矩的顺磁金属如钆，磁矩的增加量等于与置换铁比较的磁矩之差。如果由抗磁金属替代铁(III)，将不再有铁(III)离子的补偿量能够贡献给总磁矩。作为一种变化方法，抗磁或顺磁离子可一起插在类似于磁铁矿的晶体网格中。与非铁离子的掺和可在合成中通过部分取代低分子量含铁母体化合物而进行。制备含铁核的一般方法是合成类似于磁铁矿的晶体网格。用于此目的的铁(II)和铁(III)离子的比例范围为1∶1至1∶20。利用精确的1∶2化学计量比可很容易地完成合成。在合成中，通过使用还原剂可维持铁(II)与铁(III)的比例。铁(II)和铁(III)离子可由高达总铁离子量25％(重量)的其它金属离子替代。除了顺磁离子如钆或锰之外，也可使用抗磁离子如锂、镁或钙或者顺磁和抗磁离子混合物。磁铁矿或类似于磁铁矿的结构是优选的结构。例如，如果所述制备首先得到氢氧化物，或者将磁铁矿晶体转变成其它晶体如通过氧化，将磁铁矿转变成赤铁矿，这种所谓的尖晶石或反尖晶石可作为副产物而形成。用作磁共振X线体层照相术对比材料的纳米级颗粒的特殊性能需要超顺磁特性。超顺磁只存在于金属物质中；因而另一要求就是晶体具有金属性能，也就是它们是特殊晶体或至少为多原子群。最少的铁含量必须为每个晶体含50个铁原子(或金属原子)。通过改变合成条件可在很宽范围(由1至大约30nm)内控制含铁核大小，但是，合成具有直接小于15nm且最少90％颗粒在0.7倍平均直径至1.3倍平均直径范围内(平均直径由电子显微镜测定)的小颗粒为优选。本发明制备方法的一个特点在于该方法在选择合成聚合物方面具有很大的灵活性；术语“聚合物”不能理解为字面含义，低分子量物质及低分子量和多分子量的混合物均可用于制备含铁核。特别优选使用分子中含负电荷载体的低分子和多分子物质。下列物质优选羧酸盐或类似物、磷酸盐(或其它含磷基团)和硫酸盐(或其它含硫基团)。这些衍生物可简单地含有一个官能团或含有几个官能团。此理论的基础基于含铁核表面亲和力是由于氧化铁表面正电荷与合成聚合物中的负电荷之间的相互作用的假设。如果合成聚合物含有几个这种基团，那么相互作用特别特殊(“多向接触”)。由于具有许多合适的物质，所以这里不能全部列举。在合成过程中特别适合于稳定的几类物质有低分子量物质如羧基多元醇、聚羧基多元醇、聚羧基醇、羧基醇、醇、单糖、低聚糖，以及合成聚合物如聚乙二醇、聚丙二醇和混合物(嵌段共聚物)、聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乳酸(聚交酯、聚交酯缩水甘油)，以及天然或特别是部分合成或化学和/或酶解修饰的天然聚合物如葡聚糖及其衍生物、阿拉伯糖酸、葡糖氨基聚糖及合成类似物、淀粉及其衍生物以及明胶衍生物。特别优选含负电荷载体的葡聚糖低分子量衍生物。(单)羧基葡聚糖可作为一个实例，其合成公开在如Bremner等人[Bremner，I.；Cox，JSG；Moss，GF；CarbohrdateReseach11；77-84；1969]中；另一优选实例是多羧基葡聚糖，该葡聚糖是通过6-溴己酸与葡聚糖羟基之间的醚键制备的[Noguchi，A.；Takashida，M.；Sezaki，H；Bioconjugatechemistry3；132-137；1992]。由于多羧基葡聚糖的许多负电荷，因此多羧基葡聚糖能够通过“多向接触”与氧化铁表面相互作用。制备中用于稳定的合成聚合物的量为含在每批容量中的金属离子总重量的0.5至20倍；当使用合成聚合物时，其在反应混合物中的总百分数选择应保证混合每批容量的粘度(＜50％g/V)。使用的合成聚合物重量必须优选地超过金属离子总重量的3至15倍。在粗物质制备后，可通过解吸过程减少每批容量中的合成聚合物成分。色谱方法、磁分离方法、渗析、离心或超滤或其它适宜的方法可用于吸附。在与一种解吸方法结合中，解吸可在升温下进行。另一种影响解吸程度的方法是使用解吸物质如脂溶液或表面活性剂。解吸粗物质后，可获得一种稳定的物理优化溶液/悬浮液，它代表了用于制备特殊纳米级颗粒的基本结构单元。该基本结构单元是由含铁核和(残余)合成聚合物组成。根据解吸过程调节的比例，残余合成聚合物的量为0.01至1，其中以0.25至0.75为优选，这是因为在此范围内可达到基本结构单元稳定性与吸附性之间的最佳折衷。基本结构单元的总尺寸(水力直径)随着含铁核的大小变化，因此所用的合成聚合物应小于100nm，优选小于50nm。优选制备总直径小于5倍核直径的基本结构单元。基本结构单元与靶向聚合物结合产生最终纳米级颗粒。合成聚合物/含铁核单元周围的吸附靶向聚合物形成第二涂层，由此该涂层主要地决定了系统的表面，以及颗粒的特殊性质和体内性能。这种制备方法的特别优点在于可被基本结构单元吸附的每种物质可用于控制纳米级颗粒的生物性能。由于靶向聚合物不暴露于合成中，所以敏感物质和至今不能使用的物质可用作控制生物性能的支持分子。下列是适宜靶向聚合物的实例天然低聚糖或多糖如分子量小于100,000Da的葡聚糖、不同葡聚糖的混合物、不同由来的葡聚糖、特别纯化的葡聚糖(FP＝无热源性能)、岩藻依聚糖、阿拉伯半乳聚糖、软骨素及其硫酸盐、皮肤素、肝素、类肝素、透明质酸、角质素、聚半乳糖醛酸、聚葡糖醛酸、聚甘露糖醛酸、菊粉、聚乳糖、聚乳胺、聚肌苷酸、多糖、直链淀粉、支链淀粉、糖元、葡萄糖、黑曲酶多糖、支链淀粉、鸢尾素、天冬酰胺素、海葱糖、麦黄酮素、critesin、裸麦果糖胶、sitosin、地衣淀粉、异地衣糖、半乳聚糖、galactocaolose、淡黄青霉多糖、甘露聚糖、甘露多糖、石脐素、昆布多糖、氧杂蒽、木聚糖及共聚物、阿拉伯木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯聚糖、左旋糖(果聚糖)、teichinicacid、血型多糖、瓜拉那糊(guaran)、卡如宾、苜蓿、葡甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖、磷酸甘露聚糖、胱氧半乳聚糖、果胶、环糊精、藻酸、黄蓍胶及其它胶、壳多糖、聚氨基葡糖、琼脂、furcellaran、角叉菜、纤维素、纤维素糖醛酸或阿糖胶酸。另外，所列物质的化学和/或酶解制备的衍生物以及多分子化合物的低分子量分解产物是要求保护的。任意地，这些物质或衍生物可被其它物质所取代。聚氨基酸和假聚氨基酸也是适合的。合成低聚物和聚合物的实例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙烯醚、磺酸聚对丙烯基茴香醇酯、聚乙烯亚胺、聚马来酰亚胺、聚乙烯醇、聚氯乙烯、乙酸聚乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯硫酸盐、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙交酯、聚丙交酯缩水甘油。单糖至低聚糖及相关物质如醛糖和丙酮糖至醛糖和庚酮糖、辛酮糖和壬酮糖、脱水糖、主链含5或6个碳原子的单羧酸及衍生物、二溴苄、氨基和二氨基糖、脱氧糖、氨基脱氧糖和氨基糖羧酸、氨基二溴苄、单体至低聚物的含磷衍生物。具有抗肿瘤性能的单体或低聚物羧酸盐或衍生物(高级植物、真菌、地衣和细菌)如脂多糖或含有一个或多个下列结构β-2，6-果聚糖、β-1，3-葡聚糖、甘露葡聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖、β-1，3/1，6-葡聚糖、β-1，6-葡聚糖、β-1，3/1，4-葡聚糖、阿糖基木聚糖、半纤维素、β-1，4-木聚糖、阿糖基葡聚糖、阿糖基半乳聚糖、阿糖基岩藻葡聚糖、α-1，6/1，3-葡聚糖、α-1，5-阿拉伯糖、α-1，6-葡聚糖、β-2，1/2，6-果聚糖、β-2，1-果聚糖。抗肿瘤多糖作用的一个重要的必要条件是在水中的溶解性，这可由β-1，3/1，6-葡聚糖6位上的支链得到保证。在水中不溶的多糖的溶解性可通过亲水基团和水解很好的基团而得到改善。氨基、乙酰基、羧甲基或硫酸盐基团可用作取代基，其中包括甲基和乙基。表面活性剂或表面活性物质如铌表面活性剂、烷基葡糖苷、葡酰胺、烷基麦芽糖苷、单和多分散的聚氧乙烯、季铵盐、胆汁酸、烷基硫酸酯、甜菜碱、CHAP衍生物。作为实例，为了说明大量控制选择及单元系统的优点，用于控制体内性能(特殊性)的分子还可以是细胞片断，细胞，细菌片断，选自大量植物血凝素、激素和媒介物质，蛋白质和新蛋白质，肽和多肽，抗体，抗体片断或整合蛋白(ELAM、LECAM、VCAM等等)或特殊受体物质(如Lewis-X、Sialyl-Lewis-X等等)“分子识别单元”，或大量血液/血浆/血清成分和调理素，低聚核苷酸和合成低聚核苷酸，DNA和RNA或其衍生物或片断或类似物(PNA)和同系物，低聚多糖，脂蛋白质，甘油酯，胆固醇和酯，细胞生长抑制剂，医用物质，医用物质结合物，化学治疗物质和细胞生长抑制剂。除了或替代上述物质外，也可使用化学和/或酶解制备的衍生物和分解产物作为靶向聚合物。衍生物或“天然”靶向聚合物可包括另外的官能团。这些官能团可位于基本靶向分子的一端或两端或位于其它位置。官能团可以相同或者是不同基团的组合。优选的衍生物及官能团为含N、S、O或P原子的衍生物或基团，酸或类似物，羟基，醚基或酯基。纳米级颗粒的精确组成取决于适应症的需要。靶向聚合物可能是单个的物质或如合成或非合成、低分子或多分子、衍生或非衍生的靶向聚合物的任何组合。特殊的合成方法是使用相同的聚合物作为合成和靶向聚合物。正如已经描述，合成后存在的合成聚合物不再与合成中使用的聚合物相同，所以这就意味着靶向聚合物与合成中使用的聚合物是相同的。尽管靶向聚合物与所述的合成聚合物相同，但是由于靶向聚合物不暴露于存在于合成中的关键的深度条件中，因此仍维持“生物”状态。最终纳米级颗粒溶液中的靶向聚合物含量可在很宽范围内变化，一般在所含金属离子总重量的0.5至50倍之间变化，优选1至25倍重量。吸附调节剂/增强剂是能改善或促进靶向聚合物或靶向聚合物混合物被含铁核表面或含铁核和第一涂层表面吸附的所有物质。一般地，吸附调节剂/增强剂必须具有双功能性质一部分分子具有基本结构单元的亲和力；另一部分分子可能与第一功能部分相同，具有靶向分子的亲和力。适宜的物质是那些具有双官能团或具有疏水和亲水分子部分的物质。具有铁核或铁核加上第一涂层亲和力的肽是优选的吸附调节剂/增强剂。这类肽可选自使用先进生化方法的肽库(peptidelibraries)。优选的肽含有或其分子中部分含有RRTVKHHVN或RRSRHH或RSKRGR序列[氨基酸的单字母编码；参见如Stryer，Biochemistry；FreemanandComp.；NewYork；1988]。使用肽作为吸附调节剂/增强剂的优点在于不需要亲和力的分子部分可与靶向聚合物或聚合物任意地共价偶合，这就使得靶向聚合物的亲和力具有选择性能。所用吸附调节剂的量取决于所使用的物质(吸附媒介强度)和靶向聚合物和聚合物的性能；总量小于或等于核中所含金属离子的总重量。根据功能的不同，将可含在纳米级颗粒溶液中的药物添加剂或助剂分为五类防腐剂、pH稳定剂、抗氧化剂、等渗添加剂、解胶剂和硫醇溶解加速剂。其它助剂可以是医用溶剂如糖溶液、血浆增容剂、电解质溶液、生理盐水或注射用水，以及非肠道应用的油状“溶剂”。可含在纳米级颗粒溶液中的药物的实例总结如下抗过敏剂、抗过敏原剂或预防剂、血管舒张药或血管收缩药、影响血流物质、影响纳米级颗粒代谢物质、影响纳米级颗粒药物动力学物质、改变铁平衡物质、酶诱导剂或抑制剂物质，或者一般介体和抗介体。在用于治疗的医用物质中，主要感兴趣的物质是细胞生长抑制剂、化学治疗剂、激素和抗糖尿病剂。药物可作为任选的成分加入到纳米级颗粒溶液中去，或者可以与靶向聚合物偶合；然后聚合物和医用物质的结合物用作靶向聚合物。纳米级颗粒的“生理”分布不可能仅仅通过影响“生理”因素如血流、淋巴液流和淋巴液产生等等的药物改变；体内分布可通过简单的理疗手段变化。已经发现，例如对于室内患者，可直接通过散步或在测力计上锻炼的运动和与其相反的静止和/或在麻醉等条件下应用，其结果将会导致完全不同的分布性能和分布形式。进一步地，这里必须提及热输入，它可通过对整个身体或身体的部分施加红外线而完成。特别优选用在许多临床的高温治疗设备，该设备用于肿瘤辅助治疗目的的热输入。有目的的局部加热有助于伴随理疗手段中的“选择性”。单元制备设计的很大灵活性在于允许靶向聚合物、吸附介质、药物助剂和药物的自由组合，以及伴随理疗手段的不同纳米级颗粒组成的应用。纳米级颗粒或溶液可包括许多不同成分，所以只能通过总结的方式描述取决于特定应用的精确组成表2本发明纳米级颗粒的组成(百分数/量)<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="759">相对份(重量)基本结构单元铁＝1总计＝1与其它金属掺和≤0.25合成聚合物0.01-1吸附调节剂≤1靶向聚合物0.5-50药物根据需要药物助剂根据需要</table></tables>包括所有添加剂的纳米级颗粒总体直径(利用动态激光线散射DLS测量)不大于10倍含铁核直径(利用转换电子显微术TEM测量)。下述组合是优选的在这些组合中，基本结构单元(核+第一涂层)的直径只根据靶向聚合物或靶向聚合物加上任意助剂的组合增加至较小的程度。DLS测量直径可最多超过基本结构单元直径的20％。能够适用于需要很高生物特殊性和很高物理性能(颗粒大小、磁性性能)的具有史无前例灵活性和性能的纳米级颗粒可通过基本结构单元的优化物理性能与许多潜在靶向聚合物的组合而制备。单元设计和许多允许的组合使其具有非常广泛的应用。由于纳米级颗粒通过相当于不同问题的靶向聚合物(第二涂层)的灵活调节(单元设计)，将高物理性能与优良的靶向能力结合起来了，所述颗粒能够适用于许多特殊适应证如静内或局部间质给药后的磁共振淋巴照相术、肿瘤造影术、机能或机能失常造影术、蚀斑造影术(动脉粥样硬化成像)、血栓和血管闭合、磁共振血管造影术、灌注成像、梗塞造影术、内皮损伤造影术、受体成像、血脑屏障完整性造影术等等，以及用于不同的诊断，特别是用于区分增生组织肿瘤/转移瘤。由于纳米级颗粒的格外制备灵活性，该颗粒也能够适用于大多数不同的体外诊断应用，例如用作用于EIAs(酶-免疫测定法)中磁分离检查的特殊载体。血液特殊因子的选择性排放(体外血液脱氧)是治疗路线的体外方法的结合。本发明纳米级颗粒显示出明显的本身颜色。当与能够在淋巴结中形成特别高浓度的靶向聚合物结合时，这些颗粒非常适合用作淋巴结染色的手术中标记物质。由于淋巴结经常与肿瘤手术切除，纳米级颗粒的预给药使得外科医师更加容易分辨这些组织周围的淋巴结，所述淋巴结可能相当小。纳米级颗粒具有为此目的的特别长的时间窗口，可在手术前大约60分钟至多于24小时内应用。除了淋巴结造影术之外，肿瘤内的应用或肿瘤外周的应用促进了肿瘤外周的染色，有助于将肿瘤从周围组织中区分出来；另外，肿瘤区域中的颗粒通过相同的淋巴脉管带走，由此肿瘤细胞将会转移扩散。颗粒使优选转移扩散的淋巴脉管或淋巴结染色。除了用作静脉内应用的对比材料外，颗粒可局部应用。在如乳腺癌情况下，由于只需要造影有限的区域，因此局部应用具有优势；局部给药有助于形成靶向区域内对比材料的高浓度，而且不影响系统的其它部分。为了证实静脉内给药后猜疑或怀疑的诊断，需要对某些淋巴结周围的间质组织间接应用。纳米级颗粒的另一应用领域是其用作体内诊断的增强物质，所述诊断是基于确定磁化或磁场/通量密度高感度测量方法(SQUID)的。该领域中研制的高感度测量方法有助于体内追踪磁性颗粒，因此，类似于闪烁法中使用的放射活性物质的磁性颗粒可用作机能失常和损伤诊断。在治疗领域中，颗粒可用作医用物质的载体。纳米级颗粒的特性是用于医用物质到其作用位置的传输。医用物质可掺和到含铁核中或化学键合到合成聚合物和/或靶向聚合物中。这可看着是聚合物和医用物质的结合物的吸附或医用物质与吸附调节剂/增强剂的键合。例如，可制备对氧化铁表面具有高亲和力的特殊肽序列。根据治疗需要，例如对于许多涉及存在于网状内皮系统(RES)细胞的微生物的疾病，可能的征兆应当是吞噬细胞中低分子量化学治疗剂的高浓度聚集。在所有治疗方法中，纳米级颗粒和医用物质系统可通过使用内部磁场可选择地聚集在其靶向区域。对于治疗非常特殊的疾病，可选择在靶向区域如肿瘤区植入局部控制的小磁铁。除了将纳米级颗粒用作医用物质到特殊组织的传输介质，可以制备以改性活性剂释放为特征的药物类型。活性剂的释放可通过使用生物可分解结合剂或通过在具有不同生物降解能力的各种纳米级颗粒成分中掺入医用物质而得到控制。潜在的征兆是将纳米级颗粒用作施用激素的贮藏处。将纳米级颗粒用于新的治疗系统中也是可相信的。在所述系统中，纳米级颗粒的磁性性能通过可在外部控制的“磁性开关”诱导和控制医用物质的释放。一个重要应用领域是研制用于控制胰腺糖尿病治疗中抗糖尿病剂释放的治疗系统。适用于通过纳米级颗粒直接传输至其作用位置的医用物质首先是化学治疗剂和细胞生长抑制剂。抗菌治疗也经常需要将医用物质传输至其作用位置(例如结核、存在于巨噬细胞中的微生物)。特别地，适合于通过纳米级颗粒磁性释放的医用物质为抗菌剂、激素、抗糖尿病剂、细胞生长抑制剂和化学治疗剂。纳米级颗粒可在作为医用物质本身的间接治疗用途之外用作如高温或Mossbauer核吸收治疗中的吸收剂，或者如果适当地与硼或钆掺和，用于中子捕获治疗(neutroncapturetherapy)。另一应用是医用放射治疗，其中纳米级颗粒在核中与放射性元素掺和或在基本结构单元中吸附有含同位素的适当分子。在放射治疗中，纳米级颗粒的优选应用是(例如)纳米级颗粒含有放射性55Fe同位素的“自放射源”，或者是纳米级颗粒含有通过外部“活化”诱导出放射性同位素的同位素。例如，核中含有能够通过中子外部活化的157Gd。在放射治疗中，纳米级颗粒的另一应用是基于下述事实引起的其核、合成或靶向聚合物或吸附介质可修饰为含有自放射源如123I或125I。另外，纳米级颗粒可含有通过外部激发能够转变成放射性同位素的同位素。另一实例是利用碘和碘-K边界(iodine-Kedge)的外部活化标记靶向聚合物，所述活化利用了单能X-光辐射。通过借助于由与纳米级颗粒本身相互作用或与RES相互作用辨别结合物/吸附介质引起的灭活和接着的细胞内失活，本发明纳米级颗粒还可用于从脉管中消除细菌、病毒、内毒素和外毒素。基于下述实施例以及附图1至35，将更详细地说明本发明，其中图1具有含铁核、第一涂层(合成聚合物)和第二涂层(靶向聚合物)的纳米级颗粒结构剖面2合成本发明纳米级颗粒的总流程3单羧基葡聚糖及其母体化合物葡聚糖4的FTIR光谱图4多羧基葡聚糖及其母体化合物葡聚糖T10和6-溴己酸的FTIR光谱图5大鼠的琼脂糖包埋的淋巴结磁共振X线体层照片图6不同大鼠淋巴结中SE2000/15相对信号强度的定量评估(由图5)图7不同大鼠淋巴结中SE135/15/15°相对信号强度的定量评估(由图5)图8在质子-密度负荷的旋转回声序列(proton-densityweightedspinechosequence)(SE2000/15)中兔的骨盆区域的正面对比前后磁共振X线体层照片图9在质子-密度负荷的旋转回声序列(proton-densityweightedspinechosequence)(SE2000/15)中兔的骨盆区域的正面对比前后磁共振X线体层照片图10不同兔24hp.i.淋巴结中SE2000/15相对信号强度图11在T2*-负荷的梯度回声序列(weightedgradientechosequence)(GE135/15/15°)中兔的骨盆区域的正面前后对比磁共振X线体层照片图12在T2*-负荷梯度回声序列(weightedgradientechosequence)(GE135/15/15°)中兔的骨盆区域的正面对比前后磁共振X线体层照片图13改性物质与原物质不同兔24hp.i.淋巴结中GE135/15/15°相对信号强度图14兔的琼脂糖包埋的淋巴结体外磁共振X线体层照片图15不同兔24小时p.i.淋巴结中GE135/15/15°相对信号强度图16不同大鼠淋巴结中SE2000/15相对信号强度作为注射纳米级颗粒后应用24小时的剂量的函数图17相对信号强度作为应用纳米级颗粒24小时后不同大鼠淋巴结中GE135/15/15°的剂量的函数图18不同大鼠淋巴结中SE2000/15相对信号强度作为应用(对照物质)后时间的函数图19不同大鼠淋巴结中SE2000/15相对信号强度作为应用特殊纳米级颗粒后时间的函数图20不同大鼠淋巴结中GE135/15/15°相对信号强度作为应用(对照物质)后时间的函数图21不同大鼠淋巴结中GE135/15/15°相对信号强度作为应用特殊纳米级颗粒后时间的函数图22淋巴结中由热输入引起的聚集作用图23大鼠腹部的横断动力学研究，所述研究是在静内注射实施例D2的特殊纳米级颗粒(剂量20μmolFe/kg)后利用T1-重量SE序列(T1-weightedSEsequence)(TR200ms，TE10ms)进行的图24对实施例D2特殊纳米级颗粒和实施例C2非特殊对照物质在静脉血管和肝脏实体中SETR/TE200ms/10ms的相对信号强度的比较图25对实施例D2特殊纳米级颗粒和实施例C2对照物质的3D快速X线体层照片(TR40ms，TE6ms，FA60°)的冠状MIPS(最大强度投影)图26作为淋巴结可见检测“手术中”标记物质的纳米级颗粒(详图)图27作为淋巴结可见检测“手术中”标记物质的纳米级颗粒(详图)图28兔中转移性淋巴结可见检测的淋巴结转移瘤的论证图29与非特殊对照物质(不含转铁蛋白的纳米级颗粒)对比的特殊纳米级颗粒(含转铁蛋白)的细胞X线体层照片图30含修饰D7的兔的主动脉动脉粥样硬化斑块的体外磁共振X线体层照片31具有Prussian蓝染色的兔主动脉的动脉粥样硬化膜中铁的组织学检测图32Watanabe兔主动脉中实施例E6纳米级颗粒聚集的组织化学检测(Prussian蓝染色)图33静脉内注射实施例D2纳米级颗粒(200μmolFe/kg)后肿瘤信号行为的横断T1-负荷的旋转回声动力学研究(TR300ms，TE15ms)图34肿瘤相对信号强度(聚集)曲线图35应用实施例D2纳米级颗粒(200μmolFe/kg)后取决于时间的横断质子-密度负荷(SE2000/15)X线体层照片实施例制备和应用A制备合成聚合物A1合成(单)羧基葡聚糖(CDx)将100g葡聚糖4(Serva，Germany)溶解在500ml水中并加热至60℃，搅拌的同时加入大约55ml的约10N的浓氢氧化钠溶液。反应5小时后将溶液(部分)中和至pH8。在混合床离子交换器(AmberliteIRA-400和IR-120)上纯化褐色溶液，收集具有酸性性能的溜分，并在40℃下，在旋转蒸发器上真空浓缩，然后将其冻干。表3分析数据改性葡聚糖(＝羧基葡聚糖)的FTIR光谱(溴化钾)如图3所示。A2合成多羧基葡聚糖(P-CDx)将10g葡聚糖T10(Pharmacia，Germany)称入250ml二颈烧瓶中，与100ml4NNaOH混合。在单颈烧瓶上安装回流冷凝器，将溶液加热至大约80℃。在常速搅拌下(磁性搅拌器)通过第二颈口分批加入30g6-溴己酸(Aldrich，Germany)。加入物质后塞上颈口，再搅拌反应3小时。利用6NHCl在通风橱下中和反应混合物，然后在旋转薄膜蒸发器(60℃，真空)上通过预先浓缩还原。通过乙醇沉淀进行未转化反应物的分离或清洗改性的羧基葡聚糖。洗涤白色沉淀，在二次蒸馏水中再溶解，最后通过0.22μm滤纸(SchleicherandSchull，Germany)过滤并冻干。表4</tables>多羧基葡聚糖的FTIR光谱如图4所示(参见附图)。B制备原物质B1利用氨气由Cdx制备将具有分子量大约为2000Da的5.0g单羧基葡聚糖(CDx，实施例A1)溶解在17.5ml二次蒸馏水中，溶液通过吹入氮气脱气。在试管中制备6.7ml1-mol氯化铁(III)六水合物溶液，利用氮气脱气。向铁(III)溶液中加入648mg氯化铁(II)四水合物，溶解在氮蒸汽中。聚合物溶液加热至大约75℃，加入铁溶液(暴露在氮气中)。通过由气体圆筒快速引入氨气，调节加热的反应混合物至碱性，同时彻底搅拌。然后回流反应溶液大约1小时。接着在开口烧瓶中再加热10分钟，除去未转化的氨。冷却后在2500g下离心30分钟，利用旋转蒸发器将滤液蒸发至大约7ml；如果需要，检查pH值并中和。确定浓度后，用二次蒸馏水调节溶液至大约1-mol铁浓度，利用0.22μm滤纸过滤。溶液可在高压釜中灭菌(方法A121)。表5分析数据注释1至3确定血液中的半衰期·从血液中清除的半衰期将装有肝素化氯化钠溶液(0.2ml)的长50.5cm导管插在醚麻醉的实验动物(大鼠，大约200g)中并推入离心脏大约1.5cm处。引出导管的自由段并由组织丙烯酸盐固定。手术结束后大约1小时，通过尾侧静脉应用试验物质i.v.(大约1ml/分钟)。动物苏醒后，根据所需的试验物质排除速率，在不同时刻取出血液样品。试验结束时，通过染色腔静脉血液，在麻醉下处死动物。·T1和T2作用的半衰期在2900rmp(1000g)下离心血液样品15分钟。吸出0.250ml上清液，利用二次蒸馏水将样品装至2.0ml，然后混合物在40℃下恒温。通过利用cp120应力松弛计(Bruker，Germany)测量T1，2弛豫时间来确定降低的血液浓度。测量是利用180°-90°-IR(inversionrecovery)序列(T1)或CPMG序列(T2)进行的。在药物代谢动力学两室模型基础上分析结果；利用TOPFIT药物代谢动力学计算机程序计算数据，所述程序是以T1，2时间倒数(弛豫速率)减去空白读数为计算式，在时间上延伸浓度。TOPFIT首先可以利用由“浓度”和时间浮点标志的线性回归计算直线的斜率，然后由所得的数值计算有效半衰期。·铁含量的半衰期利用移液管吸取用于确定弛豫时间的800μl溶液，用浓硝酸溶解，用二次蒸馏水装至10.0ml。然后用原子发射光谱(AES)定量铁含量。将结果转化为血液浓度并利用TOPFIT的浓度-时间图分析，其中应当考虑相对稀释因子。B2利用NaOH和柠檬酸铁(III)及葡糖酸铁(II)制备P-CDx将具有分子量大约为12000Da的5.0g多羧基葡聚糖(实施例A2)溶解在17.5ml二次蒸馏水中，溶液通过吹入氮气脱气。在试管中制备6.7ml1-mol柠檬酸铁(III)一水合物溶液，加入1.635g葡糖酸铁(II)三水合物并溶解在氮蒸汽中。聚合物溶液加热至大约75℃，加入铁溶液(暴露在氮气中)。在30秒内向热的反应混合物中加入大约12ml3N浓氢氧化钠，同时彻底搅拌。然后利用大约6N盐酸中和并回流大约1小时。接着在开口烧瓶中再加热10分钟，除去未转化的氨。冷却后在2500g下离心30分钟，利用旋转蒸发器将滤液蒸发至大约7ml；如果需要，检查pH值并中和。确定浓度后，用二次蒸馏水调节溶液至大约1-mol铁浓度，利用0.22μm滤纸过滤。溶液可在高压釜中灭菌(方法A121)。表6分析数据*P-CDx含量是由葡萄糖当量乘以1.64计算而来的(100mgP-CDx＝61mg葡萄糖当量)B3利用Fe(III)NTA和氢氧化铵由CDx制备将具有分子量大约为2000Da的5.0g(单)羧基葡聚糖(CDx，实施例A1)溶解在35ml二次蒸馏水中，溶液通过吹入氮气脱气。在加热和彻底搅拌的同时向反应混合物中加入浓氢氧化铵(32％)，直至pH值调至11。在试管中制备6.85ml1-mol铁(III)溶液，与等摩尔量的NTA混合，利用氮气脱气。向铁(III)溶液中加入667mg氯化铁(II)四水合物并溶解在氮蒸汽中。在20秒内将铁溶液加入到碱性聚合物溶液中，然后利用大约6N盐酸中和并回流大约1小时。冷却后在2500g下离心30分钟，利用旋转蒸发器将滤液蒸发至大约6ml，测量pH值。确定浓度后，用二次蒸馏水调节溶液至大约1-mol铁浓度，利用0.22μm滤纸过滤。溶液可在高压釜中灭菌(方法A121)。表7分析数据</tables>B4利用铁(III)和还原剂、浓氢氧化钠由CDx制备将具有分子量大约为12000Da的5.0g多羧基葡聚糖(实施例A2)溶解在17.5ml二次蒸馏水中，溶液通过吹入氮气脱气。将聚合物溶液中加入10ml1-mol氯化铁(II)六水合物溶液，然后利用氮气继续脱气。聚合物溶液加热至大约75℃，在氮气下加入113.6mg羟胺HCl。在30秒内向热的反应混合物中加入大约12ml3N浓氢氧化钠，同时彻底搅拌。然后利用大约6N盐酸中和并回流大约1小时。冷却后在2500g下离心30分钟，利用旋转蒸发器将滤液蒸发至大约7ml；检查pH值。确定浓度后，用二次蒸馏水调节溶液至大约1-mol铁浓度，利用0.22μm滤纸过滤。溶液可在高压釜中灭菌(方法A121)。表8分析数据</tables>B5利用葡聚糖4和葡聚糖15混合物制备将具有分子量各自大约为6,000-4,000Da和15,000-20,000Da的5.0g1∶1葡聚糖4和葡聚糖15(均出自Serva，Germany)混合物多羧基葡聚糖溶解在20ml二次蒸馏水中，利用3N浓氢氧化钠将无色聚合物溶液调至pH值大约12，回流1小时，用大约6NHCl中和。微赤褐色溶液通过吹入氮气脱气。在试管中制备6.7ml1-mol氯化铁(III)六水合物溶液并利用氮气脱气。向铁(III)溶液中加入648mg氯化铁(II)四水合物并溶解在氮蒸汽中。聚合物溶液加热至大约75℃，加入铁溶液(暴露在氮气中)。在30秒内向热的反应混合物中加入大约11.5ml3N浓氢氧化钠，同时彻底搅拌。然后反应混合物回流大约1小时。冷却后在2500g下离心30分钟，利用旋转蒸发器将滤液蒸发至大约8ml；检查pH值。确定浓度后，用二次蒸馏水调节溶液至大约1-mol铁浓度，利用0.22μm滤纸过滤。溶液可根据方法A121在高压釜中灭菌。表9分析数据C制备基本物质C1水渗析将5ml实施例B1的溶液装入Visking渗析管(Servia，Germany)中，渗析五次，每次6小时，用1l新鲜二次蒸馏水。通过二次蒸馏水稀释，将滞留物调节至铁浓度为200mmol/l，并且通过0.22μl滤纸(醋酸纤维素酯，“Rotrand”，Fa.Schleicher&amp;Schull，Germany)每5ml为一批地装入10ml无菌小瓶内。解吸溶液可在高压釜中灭菌。C220mMol柠檬酸钠渗析将5ml实施例B1的溶液装入Visking渗析管(Servia，Germany)中，渗析五次，每次6小时，用1l新鲜乳酸钠溶液(20mmol/l，pH7)。渗析重复两次，每次5稀释，用1l新鲜二次蒸馏水。通过二次蒸馏水稀释，将滞留物调节至铁浓度为200mmol/l，并且通过0.22μl滤纸每5ml为一批地装入10ml无菌小瓶内。C3利用超视粒(Amicon)超滤利用移液管将5ml实施例B1的溶液移至制备超滤装置中，用二次蒸馏水(Centriprep100，Cutoff100kDa，Fa.Amicon，Germany)装至15ml界线，在1000g下超滤1小时。然后排除滤液，用二次蒸馏水将滞留物容器装至15ml，再超滤。此步骤重复两次。通过二次蒸馏水稀释，将滞留物调节至铁浓度为200mmol/l，并且通过0.22μl滤纸(醋酸纤维素酯)每5ml为一批地装入10ml无菌小瓶内。C4色谱分离在S5400HRsephacryl柱(100×5cm)上，将5ml实施例B1的溶液装在超环(superloop)(Fa，Pharmacia)中，在50mM柠檬酸/250mM甘露糖醇中以300ml/h流速洗脱。收集450ml至840ml的溜分并在真空中、在60℃下利用旋转蒸发器浓缩至大约50ml。浓缩液用二次蒸馏水渗析三次、6小时，再在旋转蒸发器上浓缩，调节至确定后的铁浓度为200mmol铁/l。通过二次蒸馏水稀释，将滞留物调节至铁浓度为200mmol/l，并且通过0.22μl滤纸每5ml为一批地装入10ml无菌小瓶内。解吸溶液可在高压釜中灭菌。表10实施例C1-C4的基本化合物的分析数据关于磁性性能和颗粒大小的物理化学数据对应于母体化合物(实施例B1)数值。D用于应用的溶液D1葡聚糖T10在10ml小瓶中制备5ml浓度为200mmolFe/l(对应于56mg总铁含量)的实施例C1溶液。作为靶向聚合物的33.6mg葡聚糖T10溶解在6.0ml蒸馏水中并在无菌条件下，利用含过滤装置(0.22μm)的注射器将5ml此溶液加入到氧化铁溶液中。聚合物与铁重量之商为1(残余合成聚合物＝28mg+靶向聚合物＝28mg)。该制剂中含有10ml100mmol(铁)溶液，此制剂可立即适用于静脉内磁共振淋巴系造影术中的应用。D2葡聚糖FP1由2溶液制备在10ml小瓶中制备5ml浓度为200mmolFe/l(对应于56mg总铁含量)的实施例C1溶液。作为靶向聚合物的302.4mg葡聚糖FP1溶解在6.0ml蒸馏水中并在无菌条件下，利用含过滤装置(0.22μm)的注射器将5ml此溶液加入到氧化铁溶液中。聚合物与铁重量之商为5(残余合成聚合物＝28mg+靶向聚合物＝252mg)。该制剂中含有10ml100mmol(铁)溶液，此制剂可立即适用于静脉内磁共振淋巴系造影术中的应用。D3作为冻干剂的葡聚糖FP1在10ml小瓶中制备5ml浓度为200mmolFe/l(对应于56mg总铁含量)的实施例C1溶液。作为靶向聚合物的302.4mg葡聚糖FP1溶解在6.0ml蒸馏水中并在无菌条件下，利用含过滤装置(0.22μm)的注射器将5ml此溶液加入到氧化铁溶液中。聚合物与铁重量之商为5(残余合成聚合物＝28mg+靶向聚合物＝252mg)。该溶液在注射瓶中冻干，此瓶子塞上塞子。通过加入10ml生理盐水制备应用的溶液；此瓶中含有10ml100mmol(铁)溶液，此制剂可立即适用于静脉内磁共振淋巴系造影术中的应用。D4葡聚糖FP1将作为靶向聚合物的252mg葡聚糖FP1称入5ml注射瓶中，装入5ml浓度为200mmolFe/l(对应于56mg总铁含量)的实施例C1溶液，塞紧烧瓶。通过转动注射瓶溶解葡聚糖FP1。聚合物与铁重量之商为5(残余合成聚合物＝28mg+靶向聚合物＝252mg)。该制剂中现在含有10ml200mmol(铁)溶液，此制剂可立即适用于静脉内磁共振淋巴系造影术中的应用。D5昆布多糖在10ml小瓶中制备5ml浓度为200mmolFe/l(对应于56mg总铁含量)的实施例C1溶液。作为靶向聚合物的33.6mg昆布多糖溶解在6.0ml蒸馏水中并在无菌条件下，利用含过滤装置(0.22μm)的注射器将5ml此溶液加入到氧化铁溶液中。聚合物与铁重量之商为1(残余合成聚合物＝28mg+靶向聚合物＝28mg)。该制剂中含有10ml100mmol(铁)溶液，此制剂可立即适用于静脉内磁共振淋巴系造影术中的应用。D6含转铁蛋白在10ml小瓶中制备5ml浓度为200mmolFe/l(对应于56mg总铁含量)的实施例C1溶液。作为靶向聚合物的33.6mg人的Fe2转铁蛋白溶解在6.0ml蒸馏水中并在无菌条件下，利用含过滤装置(0.22μm)的注射器将5ml此溶液加入到氧化铁溶液中。聚合物与铁重量之商为1(残余合成聚合物＝28mg+靶向聚合物＝28mg)。该制剂中含有10ml100mmol(铁)溶液，此制剂可立即适用于造影增生细胞(肿瘤)的特殊对比介质。D7含内皮素激动剂在10ml小瓶中制备5ml浓度为200mmolFe/l(对应于56mg总铁含量)的实施例C1溶液。作为靶向聚合物的33.6mg内皮素受体专一七肽[cys-his-leu-asp-ile-ile-trp]溶解在6ml蒸馏水中并在无菌条件下，利用含过滤装置(0.22μm)的注射器将5ml此溶液加入到氧化铁溶液中。聚合物与铁重量之商为1(残余合成聚合物＝28mg+靶向聚合物＝28mg)。该制剂中现在含有10ml100mmol(铁)溶液，此制剂可立即适用于静脉内磁共振斑块成像(动脉粥样硬化成像)的应用。E应用应用实施例E1·大鼠中的磁共振淋巴系造影术目的在大鼠中进行母体化合物(合成聚合物＝靶向聚合物)与根据解吸-吸附-方法制得的改性物(合成聚合物≠靶向聚合物)之间的淋巴结的不同淋巴结/组中的相对信号强度的比较。物质特殊纳米级颗粒(实施例D5)；比较＝实施例C1的基本结构单元(＝没有靶向聚合物的D5)剂量100μmolFe/kg体重(体重wt)时间24小时p.i.(注射之后)磁共振方法装置SiemensMagnetom1.5TMR具有末端旋管的全身磁共振扫描仪磁共振参数观察区域(FOV)＝150mm，型片＝256×256；片厚＝3mm，剖面取向＝正面序列1质子密度负荷旋转回声序列(SE)TR＝2000ms，TE＝15ms序列2T2负荷的梯度回声序列(GE)TR＝135ms，TE＝15ms；FA＝15°体外模型·在大鼠和兔淋巴结中的聚集将体外琼脂人体模型用于检查物质在淋巴结的不同淋巴结/组中的聚集和分布。该体外模型的优点在于即使是很小的实验动物(小鼠、大鼠、兔)，也可测定不同中枢和末梢淋巴结或淋巴结组中的聚集；还可能得到分布均匀的结论；信号抵触可定量化。通过尾侧(小鼠、大鼠)或耳朵(兔)静脉，在实验动物中注射(静脉注射造影剂)纳米级颗粒溶液。处死动物后24小时，制备不同淋巴结或淋巴结组(腘、髂骨、腋窝、下颌骨、腹沟股淋巴结)。然后将淋巴结置于琼脂人体模型中并维持冷冻直至进行磁共振测量(最多24小时)。·体外琼脂人体模型的制备将10g微生物琼脂-琼脂悬浮在500ml二次蒸馏水中，其中已加入了0.5mlmagnevist(0.5mol/l钆DTPAdimeglumin)，得到磁共振X线体层照片的均质信号背景。煮沸悬浮液，将琼脂溶液的一半注入一塑料碟中，形成具有0.5至1cm厚的薄层。溶液冷却后，标本安排在琼脂层上(根据左/右各半个身体，或以从头部到底部的“生理顺序”)并由少量琼脂溶液固定(巴斯德移液管)。然后在组织样品上倒入第二层琼脂溶液。在24小时内测量人体模型并维持冷冻直至测量进行完毕。为了参照，同时进行没有注射纳米级颗粒的动物，同等制备组织，或者制备对应的人体模型。除了进行造影检测，各组织中的相对信号降低可根据下式定量测量后小心地从琼脂溶液中除去组织样品，在浓盐酸中分解，利用ICPAES(inductivelycoupledplasmaatomicemissionspectroscopy)定量其铁含量。空白值可由不使用任何纳米级颗粒的适当处理的对照动物确定，而且当确定样品铁含量时，应考虑空白值。结果图5大鼠的琼脂糖包埋的淋巴结磁共振X线体层照片；切除术是在应用对照物质(实施例C2，左)或实施例D2改性物质(右)24小时之后进行的；剂量各种情况下为100μmolFe/kg图6改性物质对原始物质应用赤铁矿(100μmolFe/kg)24小时之后不同大鼠淋巴结中SE2000/15相对信号强度的定量评估(由图5)图7改性物质对原始物质应用赤铁矿(100μmolFe/kg)24小时之后不同大鼠淋巴结中GE135/15/15°相对信号强度的定量评估(由图5)包含特殊颗粒相对淋巴结信号强度(图6＝SE；图7＝GE)抵触的分析明确表明与原始物质相比，改性物质更均匀地聚集在淋巴结上。由具有葡聚糖FP1第二涂层的改性物质引起的下颌骨、腋窝、髂骨、国骨淋巴结的淋巴信号降低以及在整个淋巴结组中的平均聚集量与非特殊母体化合物(图6和7)大不相同(T-试验，p＜0.05)。通过观察图5中各个淋巴结的“黑化”(图5)可令人信服地揭示本发明特殊颗粒的优势。在所有被检测的淋巴结中的均匀分布是非常显著的。应用实施例E2·兔中磁共振淋巴系造影术目的进行母体化合物(合成聚合物＝靶向聚合物)与根据解吸-吸附-方法制得的改性物(合成聚合物≠靶向聚合物)之间的淋巴结的不同淋巴结/组中的相对信号强度的比较。物质特殊纳未级颗粒(实施例D2)；比较＝实施例C2的基本结构单元(＝没有靶向聚合物的D2)剂量150μmolFe/kg体重(体重wt)时间24小时p.i.(注射之后)磁共振方法磁共振X线体层照相术(SE和GE方法)(参见应用实施例E1)体内模型具有诱导的淋巴结增生的兔体外模型琼脂糖人体模型结果图8在质子-密度负荷的旋转回声序列(proton-densityweightedspinechosequence)(SE2000/15)中兔的骨盆区域的正面对比前后磁共振X线体层照片。(左对比前；右特殊物质D2(150μmolFe/kg))。图9在质子-密度负荷的旋转回声序列(proton-densityweightedspinechosequence)(SE2000/15)中兔的骨盆区域的正面对比前后磁共振X线体层照片。(左对比前；右特殊物质D2(150μmolFe/kg))。图10特殊纳米级颗粒对非特殊颗粒不同兔24小时p.i.(150μmolFe/kg，n＝3)淋巴结中SE2000/15相对信号强度。(根据图8和9的定量评估)。图11在T2*-负荷的梯度回声序列(weightedgradientechosequence)(GE135/15/15°)中兔的骨盆区域的正面对比前后磁共振X线体层照片。(左对比前；右特殊物质D2(150μmolFe/kg))。图12在T2*-负荷的梯度回声序列(weightedgradientechosequence)(GE135/15/15°)中兔的骨盆区域的正面对比前后磁共振X线体层照片。(左对比前；右特殊物质D2(150μmolFe/kg))。图13改性物质对原物质不同兔24hp.i.(150μmolFe/kg，n＝3)淋巴结中GE135/15/15°相对信号强度。(根据图11和12定量评估)图14兔的琼脂糖包埋的淋巴结体外磁共振X线体层照片(GE序列)；剂量150μmolFe/kg；左非特殊对照颗粒；右特殊纳米级颗粒。图15特殊纳米级颗粒对非特殊颗粒不同兔24小时p.i.(150μmolFe/kg，n＝3)淋巴结中GE135/15/15°相对信号强度包含特殊颗粒相对淋巴结信号强度(图8、9＝SE；图11、12＝GE)抵触的分析明确表明与原始物质相比，改性物质更均匀地聚集在淋巴结上。由具有葡聚糖FP1第二涂层的改性物质引起的髂骨下、髂骨、国骨淋巴结的淋巴信号降低(GE序列)以及在整个淋巴结组中的平均聚集量与未改性的对照颗粒(图13)大不相同(成对t-试验，p＜0.05)。在琼脂糖包埋的淋巴结的磁共振X线体层照相术图片(图14)中可清楚地看到更均匀的淋巴结信号之间的抵触；与在大鼠中观察到的类似，对照物质显示出了很强的信号降低，所述降低仅限于肠系膜淋巴结。应用实施例E3·在大鼠中，淋巴结聚集对剂量的依赖关系目的进行作为应用剂量函数的母体化合物(合成聚合物＝靶向聚合物)与根据解吸-吸附-方法制得的改性物(合成聚合物≠靶向聚合物)之间的淋巴结的不同淋巴结/组中的相对信号强度的比较。物质特殊纳米级颗粒(实施例D2)；比较＝实施例C2的基本结构单元(＝没有靶向聚合物的D2)剂量50-200μmolFe/kg体重；(n＝3/剂量)时间24小时p.i.(注射之后)磁共振方法磁共振X线体层照相术(SE和GE方法)(参见应用实施例E1)体外模型琼脂糖人体模型(参见应用实施例E1)结果图16实施例D2特殊纳米级颗粒对非特殊颗粒不同大鼠淋巴结中SE2000/15相对信号强度作为注射纳米级颗粒后静脉内应用24小时的剂量的函数图17实施例D2特殊纳米级颗粒对非特殊颗粒相对信号强度作为应用颗粒24小时后不同大鼠淋巴结中GE135/15/15°的剂量的函数结果发现在半剂量(200μmolFe/kg(C2)对100μmolFe/kg(D2))时，对于除了肠系膜和腹沟股淋巴结之外的所有淋巴结组，信号降低(p＜0.05)随着实施例D2母体化合物改性而大大地改性。当观察所有淋巴结的平均信号抵触时，这种显著差异也是明显的(参见表11)。表11作为所应用的物质和剂量函数的所有淋巴结平均相对信号强度和标准偏差应用实施例E4·大鼠中淋巴结聚集的时间依赖关系目的进行作为应用后时间函数的母体化合物(合成聚合物＝靶向聚合物)与根据解吸-吸附-方法制得的改性物(合成聚合物≠靶向聚合物)之间的淋巴结的不同淋巴结/组中的相对信号强度的比较。物质特殊纳米级颗粒(实施例D2)；比较＝实施例C2的基本结构单元(＝没有靶向聚合物的D2)剂量200μmolFe/kg体重(体重wt)；(n＝3/时间)时间4-168小时p.i.(注射之后)方法磁共振X线体层照相术(SE和GE方法)(参见应用实施例E1)体外模型琼脂糖人体模型(参见应用实施例E1)结果图18实施例C2的对照物质不同大鼠淋巴结中SE2000/15相对信号强度作为应用后时间的函数。图19实施例D2的特殊纳米级颗粒不同大鼠淋巴结中SE2000/15相对信号强度作为应用后时间的函数。图20实施例C2的对照物质不同大鼠淋巴结中GE135/15/15°相对信号强度作为应用后时间的函数。图21实施例D2的特殊纳米级颗粒不同大鼠淋巴结中GE135/15/15°相对信号强度作为应用后时间的函数。对静脉内应用物质后的淋巴结信号降低的与时间有关的磁共振X线体层照相研究清楚地表明与实施例D2的特殊改性物质相比，非特殊母体物质在淋巴结中形成了较不均匀的信号降低。应用实施例E5·与物理治疗手段的结合温度目的进行作为由热浴调节的体温的函数，在淋巴结的各种淋巴结/组中相对信号强度比较物质特殊纳米级颗粒(实施例D2)；剂量100μmolFe/kg体重(体重wt)；(n＝3/组)时间24小时p.i.(注射之后)磁共振方法磁共振X线体层照相术(SE和GE方法)高温模型为了研究热对各种淋巴结组中对比介质的聚集影响，将大鼠麻醉3-4小时，然后部分置于水浴中2小时。大鼠身体的左侧放在热板上，右侧放在不加热的相同高度的合成绝缘板上。这种安排使得大鼠身体左侧和右侧上水温不同。大鼠左肩下的初始水温为41.0-41.5℃，30分钟后达到恒定值41.5-42.0℃。大鼠左肩下的初始水温为37.0-37.5℃，30分钟后达到恒定值37.5-38.0℃。置于水浴中30分钟后，以剂量为100μmolFe/kg体重wt在大鼠静脉内注射(静脉注射造影剂)纳米级颗粒。再在恒温水浴中维持1.5小时之后，将大鼠放回笼内，注射24小时后制备淋巴结并利用磁共振X线体层照相术检查。结果图22在淋巴结中有意应用热对聚集的影响。评估左侧对比前图片中的亮点只可能是国淋巴结。右侧图片深刻地说明了热处理的影响。动脉粥样硬化大鼠的左侧躺在绝缘合成板上并具有正常体温，而右侧置于41.5-42.0℃的水浴中加热。“冷的”一侧显示很少或没有聚集，而热的一侧在淋巴结内显示出均匀的纳米级颗粒聚集。(实施例D2的纳米级颗粒；100μmolFe/kg体重；24hp.i.；GE135/15/15)。体内X线体层照片(图22)清楚地表明了热处理的作用。冷的未经处理的大鼠身体左侧国淋巴结中没有可观察到的聚集，而在热的右侧国淋巴结中却显示出了很高且均匀的检测信号降低(聚集)。将大鼠麻醉并将其置于热浴中可特别清楚地显示热的作用。麻醉可造成末梢肌肉活性停止，消除了淋巴的流动，降低了血管的渗透性。因此在不加热下实际上测不到纳米级颗粒的聚集。应用实施例E6·磁共振血管造影术物质特殊纳米级颗粒(实施例D2)剂量20μmolFe/kgi.v.时间0-2小时p.i.磁共振设备仪器SiemensMagnetom1.5TMR，具有末端旋管的全身X线体层照片磁共振参数利用T1-负荷的SE序列(TR200ms，TE10ms)进行横断动力学研究，观察区域(FOV)＝170mm，型片256×256；SD3mm；3D快速冠状MIPS(TR40(60)ms，TE6ms，FA60(40)°)FOV240mm，型片256×256；；SD17mm；磁共振评估用户定义的感兴趣的血管(腔静脉)、肝脏、脂肪和肌肉区域中的信号强度。信号强度是标准化的且是指背景。结果图23大鼠腹部的横断动力学研究，所述研究是在静脉内注射实施例D2的特殊纳米级颗粒(剂量20μmolFe/kg)后利用T1-负荷SE序列(T1-weightedSEsequence)(TR200ms，TE10ms)进行的；在肝内血管和腔静脉中增强清楚的信号(1分钟p.i.)。图24对实施例D2特殊纳米级颗粒和实施例C2非特殊对照物质在静脉血管和肝脏实体中SETR/TE200ms/10ms的相对信号强度的比较；剂量为20μmolFe/kg。图25对实施例D2特殊纳米级颗粒(左)和实施例C2非特殊颗粒(右)的3D快速X线体层照片(TR40ms，TE6ms，FA60°)的冠状MIPS(最大强度投影)图23和25清楚地表明了与实施例C2母体物质相比的特殊纳米级颗粒(实施例D2)的优点。腔静脉或肝脏实体中的总结性信号时间历程图形(图24)揭示了用作磁共振血管造影术中对比介质的特殊纳米级颗粒的优良性能。增量比参照物质高3倍，发亮作用(brighteningeffect)持续很长时间且很稳定(诊断时间窗口＞60分钟)。应用实施例E7·健康大鼠及携带肿瘤的兔中淋巴结的造影术目的证明本发明纳米级颗粒用作外科药物可见标记物质的适用性物质特殊纳米级颗粒(实施例D2)动物大鼠，SPFHan-Wistar，大约150g；俄罗斯兔(ChbbHM，ThomaeGmbh)，移植了V×2肿瘤(DeutschesKrebsforschungszentrum肿瘤库，Heidelberg)，大约2.6kg。肿瘤是通过在股骨尾部外侧肌肉中注射3×106个肝肿瘤细胞植入的。移植后吸收20天。剂量大鼠静脉内注射500μmolFe/kg体重兔每爪间质应用20μmol时间大鼠1、4和24小时p.i.兔12小时p.I.结果图26说明作为健康大鼠中淋巴结可见检测中“手术内”标记物质适应性的本发明纳米级颗粒(全图)图27说明作为健康大鼠中淋巴结可见检测中“手术内”标记物质适应性的本发明纳米级颗粒(详图)图28兔中转移性淋巴结可见检测的淋巴结转移瘤的论证。转移瘤可通过淋巴结中的亮的凹进部分辨认，淋巴结的其它部分为黑色。大鼠成像(图26和27)显示大量改变的淋巴结/淋巴结组可通过单独地静脉内应用纳米级颗粒溶液而染色。淋巴结可清楚地从周围组织中分辨出来，因此如果需要的话，可通过容易地用于检测外科手术摘除。VX2携带肿瘤兔的研究表明间质应用后，支流区域中的淋巴结可被特殊纳米级颗粒均匀地染色；小的转移瘤可在染黑的健康淋巴组织中以亮隐窝形式可见分辨(图28)。应用实施例E8·证实特殊纳米级颗粒的细胞实验目的证实具有转铁蛋白第二涂层(靶向聚合物)纳米级颗粒的特殊细胞吸收(受体媒介的细胞摄粒作用)物质特殊纳米级颗粒(实施例D6)比较实施例C1的基本物质(没有转铁蛋白的D6)浓度0.5mmolFe/l介质时间37℃下培养18小时；5％CO2-95％空气细胞培养·人体骨髓瘤细胞的吸收在至少1×106细胞/mlRPMI164010％FCS(胎儿腓肠血清)和0.05mmol/L2-巯基乙醇(37℃，5％二氧化碳；225cm2培养烧瓶)浓度下培养人体骨髓瘤细胞(ATCCCRL9068；细胞系NCI929)。当细胞浓度到达大约1.5×106细胞/ml时，将其离心并在新鲜间质中再悬浮。细胞与纳米级颗粒一起在浓度为0.5mmol/l(以铁计算)下培养18小时。将细胞制成小丸并用PBS洗涤。然后确定细胞数量(Neubauer计数室)。通过加热将细胞丸溶解在浓度为500μl硝酸/100μl过氧化氢溶液中并装至体积为5.0ml。然后利用原子发射光谱(AES，检测极限为0.1ppm)确定铁浓度。结果图29与非特殊对照物质(不含转铁蛋白的纳米级颗粒)对比的特殊纳米级颗粒(含转铁蛋白)的细胞X线体层照片。NCI细胞(人的骨髓瘤细胞系)聚集了接近两倍于对照颗粒的特殊颗粒。特殊纳米级颗粒清楚地更大程度地被NCI骨髓瘤细胞吸收。低于50％不含靶向聚合物的纳米级颗粒被吸收的事实证实了本发明的特殊纳米级颗粒设计的优点。应用实施例E9·Watanabe兔中动脉粥样硬化成像(斑块造影)目的利用纳米级颗粒在兔中进行动脉粥样硬化斑块造影，所述纳米级颗粒根据解吸-吸附方法涂有对斑块具有亲和力的肽(第二涂层，靶向聚合物)。物质特殊纳米级颗粒(实施例D7)剂量200μmolFe/kg体重(体重wt)时间5小时p.i.(注射之后)磁共振方法仪器SiemensMagnetom1.5TMR，具有末端旋管的全身X线体层照片磁共振参数观察区域(FOV)＝150mm，型片256×256；片厚＝3mm；剖面取向＝正面序列1质子-密度-负荷的旋转回声序列(SE)，TR＝2000ms和TE＝15ms序列2T2-负荷的梯度回声序列(GE)，TR＝135ms和TE＝15ms，FA＝15°体外模型琼脂糖人体模型(参见应用实施例E1)切除主动脉，小心地切开并用冷的PBS溶液冲洗，从而除去游离的纳米级颗粒或未被吸收的那些纳米级颗粒。然后将主动脉二等分，倒入琼脂糖人体模型中并利用磁共振X线体层照相术检查。组织学Prussian蓝染色结果图30含实施例D7改性纳米级颗粒(剂量200μmolFe/kg，主动脉切除5hp.i.)的兔主动脉动脉粥样硬化斑块的体外磁共振X线体层照片图；左侧质子-密度负荷的旋转回声序列；右侧T*负荷梯度回声序列。图31具有Prussian蓝染色的兔主动脉的动脉粥样硬化膜中铁的组织学检测(上)。与磁共振X线体层照片(GE135/15/15°)比较表明由于纳米级颗粒的聚集，组织学检测的铁位于成像中清楚信号降低的地方。在静脉内给予200μmolFe/kgD7特殊纳米级颗粒5小时后切除主动脉。图32Watanabe兔主动脉中实施例E6纳米级颗粒聚集的组织化学检测(Prussian蓝染色)。图的上面部分给出了在琼脂上制备的主动脉全图，下面部分上面了主动脉弓中铁染色(蓝色颗粒)与可见检测斑块之间的良好对应关系，所述斑块已改变到了相当的程度。制备主动脉的磁共振X线体层照片(“体内X线体层照片”)描述了作为黑点的斑块(信号降低)。当与磁共振X线体层照片(GE135/15/15°)相比，通过Prussian蓝染色(铁)方法的组织学证据显示检测的铁位于成像显示由纳米级颗粒聚集引起的明显信号降低的地方。磁共振X线体层照片的结果与清楚可见的斑块是一致的。最广阔的斑块位于主动脉弓处，这已由磁共振X线体层照片和组织学观察所证实；在磁共振X线体层照片和组织学图片中也可很好地检测更小的斑块。应用实施例E10·在携带肿瘤的小鼠中研究肿瘤中的聚集目的证明纳米级颗粒可聚集在肿瘤中。试验表明一方面，颗粒是化学治疗剂的适合载体，另一方面，纳米级颗粒可帮助检查治疗剂是否到达所需的作用地点即肿瘤，因此这是一个诊断和治疗的结合应用。物质特殊纳米级颗粒(实施例D2)动物具有植入治疗的瑞士裸体小鼠；(n＝5/剂量)(LS174T，s.c.实验前应用10天)麻醉法Rompun/Ketavet(1∶1)，大约0.5ml/kg体重i.m.剂量200μmolFe/kg体重(体重wt)时间应用后0-120分钟和12或24小时磁共振方法仪器SiemensMagnetom1.5TMR，具有末端旋管的全身X线体层照片磁共振参数观察区域(FOV)＝150mm，型片256×256；片厚＝3mm；剖面取向＝正面序列1质子-密度-负荷的旋转回声序列(SE)，TR＝2000ms和TE＝15ms序列2T2-负荷的梯度回声序列(GE)，TR/TE＝300ms/15ms磁共振评估用户定义的感兴趣的肿瘤、肌肉、脂肪和背景区域中的信号强度。不同组织中的相对信号强度是标准化的且是指脂肪中的信号强度。结果图33静脉内注射实施例D2纳米级颗粒(200μmolFe/kg)后肿瘤信号行为的横断T1-负荷的旋转回声动力学研究(TR300ms，TE15ms)。X线体层照片表明随着空间要求清楚的边界的增长，肿瘤中与时间有关的信号增量(聚集)也慢慢地增长。图34肿瘤中相对信号强度(聚集)的过程对剂量为200μmolFe/kg体重wt的信号(增量)时间历程(SE2000/15)。图35应用实施例D2纳米级颗粒(200μmolFe/kg)后与时间有关的横断质子-密度负荷(SE2000/15)X线体层照片。在T1负荷和质子-密度负荷的旋转回声序列(图33、35)中发现肿瘤中纳米级颗粒的聚集与信号增量在时间上的线性增长有关。注射135分钟后可观察到35至40％的信号增量，这就可以明显地区分肿瘤与健康组织并确定纳米级颗粒的聚集。与这里观察到的现象不同，血管照相术研究发现由灌注法形成的肿瘤中的增量将在最多30分钟之后完全消失(p.i.)。权利要求1.纳米级颗粒，其特征在于所述颗粒是由含铁核、第一涂层(合成聚合物)和第二涂层(靶向聚合物)以及任意的药物助剂、药物和/或吸附调节剂/增强剂组成。2.根据权利要求1的纳米级颗粒，其特征在于含铁核和第一涂层的基本结构单元在溶液中的流体动力学直径小于100nm且不大于所述含铁核直径的5倍。3.根据权利要求1或2的纳米级颗粒，其特征在于含铁核是由磁铁矿和/或赤铁矿组成，或者含有这两种化合物中的至少一种。4.根据权利要求1至3的纳米级颗粒，其特征在于含铁核中最多有25％重量的铁被其它金属离子取代。5.根据权利要求4的纳米级颗粒，其特征在于非铁金属离子为顺磁、抗磁或顺磁和抗磁金属离子的混合物。6.根据权利要求1至5至少之一的纳米级颗粒，其特征在于由电子显微镜测定的含铁核直径为小于30nm，所述核含有最少50个金属离子，所述颗粒大小分布为至少90％的含铁核在0.7×平均直径至1.3×平均直径倍之间。7.根据权利要求1至6至少之一的纳米级颗粒，其特征在于所述颗粒中合成聚合物含量为存在的总体金属离子的0.01至1倍之间[w/w]。8.根据权利要求1至7至少之一的纳米级颗粒，其特征在于合成聚合物为单体或聚合物物质、或这些物质或衍生物的混合物、或具有官能团的衍生物的混合物、或另外取代的衍生物的混合物，所述合成聚合物的分子量小于100,000Da。9.根据权利要求1至8至少之一的纳米级颗粒，其特征在于合成聚合物为葡聚糖或其衍生物或葡聚糖和/或葡聚糖衍生物的混合物。10.根据权利要求8或9的纳米级颗粒，其特征在于合成聚合物分子中含有一个或几个酸基团或几个含N、S、P或O原子的官能团。11.根据权利要求1至10至少之一的纳米级颗粒，其特征在于靶向聚合物和合成聚合物为相同或不同物质或为这些物质的混合物。12.根据权利要求1至11至少之一的纳米级颗粒，其特征在于靶向聚合物含量为存在的总体金属离子的0.5至50倍[w/w]。13.根据权利要求1至12至少之一的纳米级颗粒，其特征在于所述颗粒中吸附调节剂/增强剂含量小于或等于所含金属离子总重量。14.根据权利要求13的纳米级颗粒，其特征在于所述颗粒含有作为吸附调节剂/增强剂的肽。15.根据权利要求1至14至少之一的纳米级颗粒，其特征在于所有成分的流体动力学直径不大于含铁核直径的10倍及基本结构单元直径的1.2倍。16.根据权利要求1至15至少之一的纳米级颗粒，其特征在于所述颗粒是由各个单元如基本结构单元、靶向聚合物、药物和吸附调节剂组成，这些单元可在任何时间组合。17.制备权利要求1纳米级颗粒的方法，其特征在于第一步为在合成聚合物存在下，利用碱处理，制得含铁核；第二步为通过解吸方法改变离子与合成聚合物的比例；第三步为吸附靶向聚合物，以及任意地，加入吸附调节剂/增强剂、药物助剂和/或药物。18.根据权利要求17的方法，其特征在于铁(II)和铁(III)盐用于制备含铁核，其中二价与三价离子的比例为1∶1至1∶20。19.根据权利要求17或18的方法，其特征在于将铁(III)盐混合物与还原剂一起用于制备含铁核，其中还原剂的量以能够产生铁(II)与铁(III)比例为1∶1至1∶20为准。20.根据权利要求17至19至少之一的方法，其特征在于所用的铁化合物表示无机和有机盐的任何混合物及其配合物。21.根据权利要求17至20至少之一的方法，其特征在于含铁晶体是通过混合分别产生的氢氧化铁(II)和氢氧化铁(III)溶液制得的。22.根据权利要求17至21至少之一的方法，其特征在于含铁核中最多有25％重量的铁被其它金属离子取代。23.根据权利要求4的方法，其特征在于非铁金属离子为顺磁、抗磁或顺磁和抗磁金属离子的混合物。24.根据权利要求17至23至少之一的方法，其特征在于能够将由沉淀产生的晶体分离开来的物质或物质的组合物用作合成聚合物，在反应混合物中合成聚合物的量大于所含金属离子重量的0.5至20倍，但不大于反应混合物的50％(g/v)。25.根据权利要求17至24至少之一的方法，其特征在于0.1至10N的碱用于沉淀铁化合物，所述碱是快速加入的。26.根据权利要求25的方法，其特征在于氨气或盐、胺或胺衍生物或挥发性缓冲剂用于沉淀铁化合物。27.根据权利要求17至26至少之一的方法，其特征在于基本结构单元是在0℃至120℃温度范围内合成的。28.根据权利要求17至27至少之一的方法，其特征在于铁与合成聚合物的比例为1∶0.01至1∶1[w/w]。29.根据权利要求17至28至少之一的方法，其特征在于靶向聚合物的加入量是以存在的金属离子与靶向聚合物的比例为1∶0.5至1∶50为准选择的。30.根据权利要求17至29至少之一的方法，其特征在于纳米级颗粒是稳定溶胶或冻干剂，可利用简单的溶剂恢复成溶液，或者基本结构单元、靶向聚合物和任意的助剂是可得到的分开的溶液或冻干剂，它们可在特定的时间混合制得可应用的溶液。31.根据权利要求17至30至少之一的方法，其特征在于纳米级颗粒的各个单元可在任何时间组合。32.作为诊断对比介质的纳米级颗粒的用途，用作医学如手术中可见标记物质，以及用作活性剂的载体或用作治疗目的的活性剂。全文摘要本发明公开了单元含铁纳米级颗粒及其制备和在诊断和治疗中的应用。所述颗粒的特征在于其具有含铁核、第一涂层(合成聚合物)和第二涂层(靶向聚合物)，以及任意的辅助性药用物质、药物和/或吸附介质。文档编号A61K47/02GK1155844SQ95194525公开日1997年7月30日申请日期1995年7月10日优先权日1994年8月4日发明者M·克里斯,D·普费夫里尔,R·拉瓦泽克,S·瓦格纳,W·埃伯特,V·埃尔斯特,W·塞姆勒,M·塔尤皮兹,J·加达,A·赫尔曼,M·朱克尔,U·斯维德斯基申请人:柏林弗赖恩大学诊断研究学院有限公司