专利名称：稳定的磷脂组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及稳定的水性磷脂组合物。
磷脂组合物可用于诊断、治疗、化妆等各个领域。例如，脂类组合物，特别是脂质体，可用来加入到诊断和治疗剂中，作为遗传物质的转运载体，作为免疫辅剂，用在疫苗的制备以及癌症检测中。很清楚，磷脂的稳定性对降解反应中残存的任何物质的保护以及得到磷脂本身的最佳性能均有重要作用。
感兴趣的一个特别的领域是用于诊断成像方面。造影剂在各种诊断技术中使用，增强了成像的效果，在以上诊断技术中最重要的是X-射线成像，磁共振成像(MRI)，超声波成像以及核医学成像。仍需要结合有良好贮存和活体中稳定性的造影剂。感兴趣的另一个特别领域是用于有关高压灭菌技术中的稳定磷脂组合物的发展。
研究显示，[三(羟甲基)]甲基胺以及有关的缓冲化合物的使用对磷脂的水解有特殊的影响。其中许多研究显示，通过[三(羟甲基)]甲胺缓冲剂的一般的酸/碱催化作用中随缓冲剂种类浓度提高，磷脂的水解作用增强，(实例可参见《药物科学杂志》82362-366(1993))。
然而，由组合物中[三(羟甲基)]甲胺和磷脂酶的相互作用而引起的磷脂组合物水解的抑制作用也已有报道(实例参见《生物化学和生物物理研究通报》84238-247(1978)；《生物化学杂志)》203799-801(1982)；《昆虫生物化学和生理学档案》141-12(1990)；以及《细菌学杂志》1754298-4306(1993))。
在《脂质化学和物理》6093-99(1991)中，研究了空气条件下，在脂质体水性悬浮液中磷脂的抗氧化降解稳定性。证明了卵磷脂在[三(羟甲基)]甲胺缓冲剂中与在纯水中相比，具有更强的抗水解作用。指出这与天然出现的磷脂有特别关系，其中这种磷脂具有多不饱和脂肪酸链，而该链容易对自由基机理的过氧化反应敏感。如在公开中指出的那样，众所周知水的超声辐射促使产生氢氧自由基和过氧化氢，而这些活性氧类与磷脂的氧化降解有关。表面看来，[三(羟甲基)]甲胺对水解有抵抗作用，但文献中指出观察到的氧化作用/水解作用的减小归因于[三(羟甲基)]甲胺起到了有效的氢氧自由基的清除剂作用。在《药物药理学杂志》45490-495(1993)中也得到了类似的结论，其中还报道了缓冲剂的保护效应如[三(羟甲基)]甲胺抗脂类过氧化。
在WO-95/26205(Nycomed/Dauchi)中描述了含有多层脂质体的诊断组合物，而多层脂质体中含有至少一种成像剂，并且悬浮在含有上述成像剂的水性介质中，其中该脂质体含一种中性磷脂和一种带电的磷脂，并且脂质体的平均颗粒直径是50-3000nm，而填充于脂质体内部在任一水相中的成像剂浓度与脂质体悬浮的水性介质中的成像剂浓度基本相同。
令人惊奇的是，现已发现基本饱和的磷脂化合物可通过缓冲剂被稳定，这种缓冲剂降低了磷脂的水解程度。
因此，从一方面看，本发明提供了一种水性脂类组合物，优选一种脂质体组合物并且优选组合物以在生理上可行的形式存在，该组合物中包含一种或多种基本饱和的磷脂，该磷脂与含有氨和的水溶性胺的缓冲体系结合，此体系在15℃时，pH小于或等于9.5，其条件是上述的磷脂包含一带电磷脂和中性磷脂的结合体，而且上述组合物是一种含有一种非离子性的多羟基化的X-射线造影剂的脂质体组合物，而且上述造影剂不以在基本相同的浓度存在于脂质体及和周围水性介质中。
因此，特别提出放弃公开在WO-95/26205中的诊断组合物的权利要求。
根据本发明的另一方面，我们提供了一种方法可稳定基本饱和的磷脂组合物，该方法包含包括在一基本饱和的磷脂组合物中的一缓冲体系，该缓冲体系含有氨或一种水溶性的胺，在15℃时，其pH值小于或等于9.5，而不是将一种上述缓冲体系加入到一含有一种非离子性的多羟基化X-射线造影剂的脂质体(liposomal)组合物中，并且上述造影剂同时以基本相同的浓度存在于脂质体中和周围的水性介质中。
对于脂质体组合物，该缓冲剂可在脂质体生成前或生成后加入。
从更深一个方面看来，本发明还提供了增强对比的成像方法，在这个方法中，对实验对象(例如一个人或非人的动物，优选一种哺乳动物)上使用一种对比介质(contrast medium)，得到实验对象的一幅影像，其特征在于上述使用的对比介质是根据本发明的一种组合物，其中含有一种对比有效材料(contrast effective materials)。如果需要，该对比介质可在对比有效材料活化后使用，例如可通过超极化作用。
从另一方面看来，本发明提供了一种处理方法，其中，将一种治疗剂或预防剂施用于一实验对象(例如人或非人动物，优选一种哺乳动物)上，其特征在于其使用了一种根据本发明得到的组合物，该组合物中含有上述的治疗或预防剂。
从另一方面看来，本发明提供了一种化妆处理方法，其中，将一种化妆剂施用于一实验对象上(例如，一个人或非人的动物，优选一种哺乳动物)，其特征在于使用的组合物是根据本发明得到的，其中含有上述的化妆剂。
在这些方法中，使用的该组合物中应含有有效量的活性试剂(对比有效材料，治疗剂或预防剂或化妆剂)，亦即足够的数量以达到对比增强效果或达到理想的治疗，预防或化妆的效果。
本发明的组合物和方法中使用的磷脂可以是带电的或中性的(即，不带净电荷)。然而，特别优选使用中性磷脂，由于它们通过缓冲体系的抗水解保护作用特别显著。本发明组合物中特别优选的磷脂，全部或基本全部是中性磷脂。
用于本发明方法或组合物中的缓冲剂体系优选在室温下(15℃)pH值为6.0-9.5，更优选6.5-8.0，特别优选6.8-7.8。
与未包括特定缓冲体系的配方相比，本发明组合物表现出磷脂水解度降低。根据本发明优选的组合物在给定时间(例如一个正常贮存期限，例如30天或更长)，相比于未包含本缓冲体系的配方其水解程度降低超过5％；更优选的组合物其水解程度降低超过10％，最优选降低超过25％。
达到的稳定性，在贮存、加工和磷脂组合物曝露于温度中，包括高压灭菌过程特别有利。
本发明优选的实施方案中，该磷脂组合物在4-30℃的范围内是稳定的；在更优选的实施方案中，该组合物在4-50℃的温度范围内是稳定的；在另一更优选的实施方案中，组合物在4-125℃的范围内是稳定的(包括高压灭菌过程)。
优选地，磷脂组合物贮存时稳定期达两年，更优选至3年，特别优选到5年。“稳定的”在本文中意味着至少75％，优选至少80％，更优选至少90％的未降解磷脂在上文所述的贮存期后存在于组合物中。
如上所述，本发明稳定方法的一个特殊的优点是得到的磷脂组合物在短期内可承受宽的温度范围的能力。因此，为使需被高压灭菌的磷脂组合物稳定，优选地在高压灭菌前加入缓冲体系。
用于本发明方法或组合物中的缓冲剂优选其分子式I为NR1R2R3I其中R1，R2和R3可以是相同的，也可以是不同的，每一个代表一个氢原子、一个糖残基，一含1-6个碳原子的烷基(其可携带一个或多个羟基，巯基，羧基，磺酸，烷氯酰氨基，咪唑基，吲哚基或羟基取代的苯基)，一个有1-6个碳原子的烷基硫代和/或一个分子式为NR4R5的基团(其中R4和R5可以相同也可以不同，每一个代表一个氢原子，一个烃氧酰胺基或-C(＝NH)NH2基团或带有1-6个碳原子的烷基)；或者R1、R3和R3中的任意两个连同插入氮原子，代表为吡咯烷，吗啉或哌啶环，它们可携带羟基、羧基、磺酸基或烃氧酰氨基基团。
因此，例如可用作缓冲剂的水溶性胺包括氨基醇和氨基糖。更优选的胺包括[(三(羟甲基)]甲胺(表示为TRIS)，N，N-双(2-羟乙基)-三(羟甲基)甲胺(表示为BIS-TRIS)，2-氨基-2-甲基丙烷-1，3-二醇(表示为AMPD)，TES，2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙烷磺酸、表示为HEPES)，二乙醇胺，葡甲胺，三乙醇胺和氨。
根据本发明特别优选使用的胺是TRIS，BIS-TRIS，TES和葡甲胺，其原因在于它们有利的生理上的可接受性和/或室温下有利的pH值。
如上所表明的，包括在本发明组合物中的磷脂是基本饱和的磷脂。术语“基本饱和”是指磷脂的脂肪酸残基是充分饱和的(亦即不含有碳碳双键)或者其不饱和度很低，例如显示的碘值不大于10，优选不大于5。整体上达到类似不饱和度的一小部分不饱和磷脂也可存在于本发明的组合物中。磷脂可以是带电的或者是中性的，而且可是在天然的，合成的或半合成的起始物(包括化学改性的基本饱和磷脂)。如上所述，优选使用中性磷脂。
脂肪酸残基中的碳原子数通常至少为14个，优选至少16个。脂肪酸残基中的碳原子数也优选26或更少，例25或更少，优选24或更少。
本发明有用的中性磷脂包括，例如，中性甘油磷脂，例如全氢化天然产物(如，大豆或蛋黄衍生的)或合成的卵磷脂，特别是半合成的二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)或二硬脂酰基卵磷脂(DSPC)，磷脂酰乙醇胺(PE)或磷脂酯乙醇胺-聚乙二醇(PE-PEG)，可使用多于一种的中性磷脂。
本发明中有用的带电磷脂包括，例如，带正电或负电的甘油磷脂。带负电的磷脂包括，例如，磷脂酰丝氨酸，例如全氢化的天然产物(例如，大豆或蛋黄衍生的)或者半合成的磷脂酰丝氨酸，特别是半合成的二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(DPPS)或二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸(DSPS)；磷脂酰甘油(PG)，例如全氢化的天然产物(如大豆或蛋黄衍生的)或半合成的磷脂酰甘油，特别是半合成或合成的二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)；或二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)；磷脂酰肌醇，例如全氢化的天然产物(如大豆或蛋黄衍生的)或半合成的磷脂酰肌醇，特别是半合成的或者合成的二棕榈酰基磷脂酰肌醇(DPPI)或二硬脂酰基磷脂酰肌醇(DSPI)；磷脂酸，例如，全氢化天然产物(如大豆或蛋黄衍生的)或半合成的磷脂酸，特别是半合成或合成的二棕榈酰基磷脂酸(DPPA)或二硬脂酰磷脂酸(DSPA)。带正电的磷脂包括，例如，磷脂酸和氨基醇的酯，例如二棕榈酰磷脂酸的脂或二硬脂酰磷脂酸与羟乙二胺的脂。虽然这种带电的磷脂通常单独使用，但也可以使用多于一种的磷脂。
本发明的方法或本发明的组合物中所用的缓冲剂的浓度优选在2mM-200mM的范围内，更优选在2mM-100mM的范围内，特别优选在2mM-20mM的范围内。
本发明组合物中，缓冲剂和脂类的摩尔比优选在1∶60-2000∶1的范围内(例如1∶60-100∶1)，更优选1∶60-1∶0.02，特别优选1∶60-1∶0.1。对于一些诊断和其它医疗的应用，缓冲剂与脂类另一优选的摩尔比是1∶50-1∶0.1，更优选1∶20-1∶0.5，特别优选1∶5-1∶1。
用于成像和医疗用途的本发明组合物中磷脂的浓度优选在0.01mM-120mM的范围内，例如1mM-120mM。
本发明的磷脂组合物可以是通常遇到的任一配方类型，例如脂质体，乳状液，胶束，微(滴)乳状液，脂类颗粒，脂类溶液和微气泡的形式。对于每一特定配方类型，其可依传统的又程序生产出来。
本发明的方法和磷脂组合物适用于各种用途，特别是当增强的稳定性尤为重要时。稳定的组合物可用于诊断、治疗和化妆的用途以及特别提及的由磷脂组合物制成，可与对比介质(X-射线、MRI、US和闪烁照相法)一起使用，还可用于治疗癌症，化疗，霉菌感染的治疗以及牛皮癣的医治。
对于用作诊断成像对比介质，本发明的脂质组合物将包括一种对比有效材料，例如，在脂质体内腔中，附着于脂质体膜的内壁和外壁上或者包含在膜的内部或者在分散脂质体的液体介质内。通过对比有效材料，其意味着该种材料能够提高感兴趣的成像方式的对比度。对于传统的成像方式，例如X-射线，MR，超声波，磁断层照相术，电子阻碍断层照相术，闪烁照相术，SPECT，PET等，合适的对比有效材料的性质是为人熟知的，例如气体(如空气，氙，氟化物等)，辐射发射体，顺磁的，超顺磁的，亚铁磁和铁磁材料(如顺磁的过渡金属或镧系元素螯合物)，重原子(如原子序数47或更高)化合物，例如，碘化物(如三碘基苯基化合物)。当对比有效材料是气态的(在周围温度或体温条件下)，例如，空气，氙，氦，氩，氢气，一氧化二氮，氧气，氮气，二氧化碳，六氟化硫，甲烷，乙炔，氟化的低分子量(如C1-C7)的烃(优选全氟化碳，如C2F6，C3F8，C4F10和C5F12)，含19F的气体等时，其适宜包含在脂质体膜内。当对比有效材料是水溶性的(例如一种可溶的三碘苯基化合物或一种顺磁的金属螯合剂)时，优选它在脂质体的核心溶液中，且特别优选也在悬浮介质溶液中。
治疗剂或化妆剂可类似的分散在脂质体核心内，在脂质体膜上或内部和/或在悬浮介质中。可使用能起脂质体传递作用的常规治疗剂或化妆剂。
对诊断组合物而言，例如对X-射线和MRI/核医学来说，总脂类的浓度通常为5mg/ml-100mg/ml(例如20-100mg/ml，合适地至少为40或50mg/ml)，优选10mg/ml-90mg/ml，更优选10mg/ml-80mg/ml，其目的是要提高脂类中造影剂的封装。然而，对超声诊断组合物而言，总脂类的浓度范围通常优选为0.01mg/ml-20mg/ml，更优选0.01mg/ml-10mg/ml(例如0.5mg/ml-10mg/ml)。
其中，试剂被封装在磷脂中(特别是在脂质体中)，优选以等渗压的溶液或等渗压的悬浮体形式存在(与体内的生理渗透压有关)。为了得到等渗压的溶液或悬浮体，该试剂通常以可提供等渗压溶液的浓度溶解或悬浮在介质中。其中单独的该试剂不能提供一种等渗压溶液，因为，例如，该试剂的溶解度不够，这种情况下，可在介质中加入其它常规的增补调节剂(例如无毒的水溶性物质)以形成等渗压的溶液。这类物质的实例包括盐如氯化钠；糖如甘露糖醇、葡萄糖、蔗糖、甘露糖、半乳糖、山梨醇以及相似物质；和多元醇例如丙二醇、甘油及相似物质。如果使用山梨醇，其浓度优选1-500g/l，更优选0.1-20g/100ml。如果使用甘油，其浓度优选0.05-10g/100ml。如果磷脂组合物是脂质体组合物时，所用盐的量优选尽可能小促进贮存和高压灭菌过程中脂质体的稳定性。
通过上述提到的物质得到的等渗压溶液，也优选包含在根据本发明的磷脂组合物中，在该组合物中未加入诊断、治疗、化妆剂。
除上述提到的组分外，本发明磷脂组合物也可含有各种任选的组分。例如，维生素E(α-生育酚)和/或维生素E乙酸酯可作为抗氧化剂加入，相比于脂类的总量其量为0.01-2％(摩尔百分含量)，优选0.1-1％(摩尔百分含量)。
以上所述的诊断、治疗和化妆剂可通过本领域已知的技术加入到本发明的磷脂组合物中。
象上面已指出的那样，在先技术描述了对磷脂水解的抑制是通过涉及抑制磷脂酶的间接机理进行的；很清楚，这样的机理不能用于本发明中，因为有关的组合物中不含有磷脂酶。类似地，在采用不饱和磷脂的已有技术中观察到的氧化/水解的降低对涉及饱和磷脂(本发明中不反对有微量的不饱和磷脂)的本发明是不重要的，本发明的方法看来证明了一种不同的抑制机理，该机理涉及对酸/碱催化的磷脂酯的通常的水解的抑制。
本发明方法涉及的准确的机理还没有被充分理解，特别是贮存过程中增强的稳定性方面。然而，众所周知(实例参见《药物科学杂志》82362-366(1993)和《磷脂手册》(Marcel Debber Inc.，1993，323-324页)，磷脂可水解形成游离脂肪酸和溶血磷脂，溶血磷脂可进一步水解给出对应的甘油膦化物和游离脂肪酸；最终一步水解通过磷酸酯首基的水解给出甘油磷酸。甘油和磷酸间酯键的水解似乎比较困难，因为未检测到游离磷酸和甘油。非常明显缓冲剂例如[三(羟甲基)]甲胺的使用，抑制了酸/碱催化的脂肪酯族的水解，已通过游离脂肪酸释放的减少证实；也可抑制最终水解步骤。但是，也可能涉及了其它的水解机理。
以下是非限制性实例，用来进一步阐明本发明的方法和组合物。
实施例1组合物1ml包括氢化蛋卵磷酯32mg1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷乙醇胺4mg1，2-二棕棕酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸钠4mg山梨醇50mg([三(羟甲基)]甲胺 1mg)注射用水 加至 1ml该组合物是将脂类与氯仿、甲醇和水(体积比为80∶20∶0.05)的混合物混合制备出。混合物在水浴(50℃)上加热使脂类溶解，然后在旋转蒸发器上加热溶液(50℃)除去溶剂。使用标准技术通过均化作用和挤压作用制备出脂质体(包括添加山梨醇)。然后将此分散体分为两部分，加入pH为7.4的三(羟甲基)甲胺/HCl于其中的一部分，得到的组合物装入管形瓶中，高压灭菌。试样分别在30℃、40℃、50℃贮存一个月。高压灭菌前、高压灭菌后以及贮放后，分别测量游离脂肪酸的含量。
磷脂组合物中游离脂肪酸(FFA)的存在通过洗脱薄层色谱(TLC)板被检测出来，该薄层色谱板上涂有0.25mm厚的硅胶60层，使用甲醇、氯仿和氨(体积比120∶70∶8)的混合物作为流动相。试样用甲醇和二氯甲烷(体积比2∶1)的混合物以1∶10稀释，并且将稀释试样的一份用到色谱板上。与该试样所得点的强度和棕榈酸标准样相比，游离脂肪酸的量可半定量化，棕榈酸标准样对应1.25mg/ml-25mg/ml的浓度。这些点用硫酸铜喷显剂在170℃下扩展大约1小时。
磷脂的降解，用游离脂肪酸测定(mg/ml)不含有[三(羟甲基)]甲胺含有[三(羟甲基)]甲胺30℃贮存一个月≤5.0 ≤2.540℃贮存一个月≤12.5 ≤5.0实施例2组合物1ml包括氢化蛋卵磷脂 36mg1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-甘油磷酸钠 4mg山梨醇 50mg([三(羟甲基)]甲胺1mg)注射用水 加至 1ml制备方法如实施例1。
磷脂的降解，用游离脂肪酸测定(mg/ml)
不含有[三(羟甲基)]甲胺 含有[三(羟甲基)]甲胺30℃下贮存一个月≤1.25 ≤1.2540℃下贮存一个月≤2.5≤12.550℃下贮存一个月≤12.5 ≤2.5结果证明，含[三(羟甲基)]甲胺的试样与不含[三(羟甲基)]甲胺的试样相比，通过测定游离脂肪酸，磷脂的降解减少了。
根据本发明如实施例1的制备方法制备出的另外的组合物实施例如下所示实施例3卵磷脂20mg磷脂酰乙醇胺 20mg葡萄糖50mg[三(羟甲基)]甲胺 0.5mg注射用水 加至 1ml实施例 4磷脂酰甘油5mg蔗糖 100mg[三(羟甲基)]甲胺 1mg注射用水 加至 1ml实施例5PEG-磷脂酰乙醇胺 40mg山梨醇50mg[三(羟甲基)]甲胺 10mg注射用水 加至 1ml实施例6卵磷脂15mg豆油(soya oleum) 50mg甘油 74mg[三(羟甲基)]甲胺 1mg注射用水 加至 1ml实施例7作为证明本发明方法的另一实施例，下述组合物(公开在WO-95/26205)也如实施例1进行了测试。组合物1ml包括氢化蛋卵磷脂(H-PEC) 51mg氢化蛋磷脂酰丝氨酸钠(H-ERSNa)5mgIodixanol400mg山梨醇 17mg([三(羟甲基)]甲胺1mg)注射用水加至 1ml如实施例1制备出组合物，但是在脂质体形成前另外添加了Iodixanol和山梨醇的等渗压溶液。
磷脂的降解，用游离脂肪酸测定(mg/ml)不含[三(羟甲基)]甲胺 含有[三(羟甲基)]甲胺30℃下贮存一个月≤2.5 ≤1.2540℃下贮存一个月≤5.0 ≤2.550℃下贮存一个月≤25.0 ≤12.5该实施例的结果验证了本发明方法在稳定另外含有造影剂的磷脂组合物的用途。
以下的实施例8-13公开了稳定的脂质体悬浮液的制备。该稳定脂质体悬浮液适于在超声(实施例8-10)和磁性共振成像(实施例11-13)研究中用作对比介质。除非特别声明，比率和百分数比均指体积比，而脂类的比率是指重量比。如果实施例8-10中用到标注的19F的氟碳化物，那么这些组合物能被用作MR中的对比介质。
实施例8氢化蛋卵磷脂(HEPC)和二棕榈酰磷酸酯(10∶1)溶于氯仿-甲醇(2∶1)中，然后用旋转蒸发仪除去溶剂。将该脂类分散在纯化的水中，然后将该分散液引入配有高速乳化器的气密的玻璃反应器中。反应器中的气体是带有10％C5F12的空气。产生微气泡后，加入5mM的HEPE。
实施例9二硬脂酰卵磷脂(DSPC)，二棕榈酰磷脂酸(DPPA)和聚乙二醇(PEG 4000)以25∶1∶2的比例在叔丁醇中溶解，然后用旋转蒸发仪除去溶剂。然后将脂类分散在纯水中，接下来将该分散液引入一配有高速乳化器的气密的玻璃反应器内。反应器内的气体是C3F8。产生微气泡后，加入三(羟甲基)甲胺8mm。
实施例10二棕榈酰卵磷脂(DPPC)，二棕榈酰磷脂酸(DPPA)和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)(8∶1∶1)共同溶解于氯仿-甲醇-水(10∶20∶0.5)中，然后将溶剂用旋转蒸发仪除掉。接下来将该脂分散在纯水中，把此分散液引入配有高速乳化器的气密玻璃反应器中。反应器中的气体是C4H10。产生微气泡后，加入TES10mM。
实施例11干混氢化蛋卵磷脂(HEPC)和甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(MPEG-DSPE)(9∶1)，然后将其溶于gadodiamide-caldiamide 0.5M溶液中，通过均化和挤压制备出脂质体。加入HEPE 8mM，将得到的产品用高压灭菌法消毒。
实施例12氢化蛋卵磷脂(HEPC)和二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)(9∶1)在干混，然后将其分散于dimeglumine gadopentatate-meglumine diethlenetriaminepente-tate-葡甲胺0.5M溶液中，通过均化作用和挤压制备出脂质体。加入50mMTRIS，将得到的产品通过高压灭菌消毒。
实施例13氢化蛋卵磷脂(HEPC)分散于gadodiamide 0.5M溶液中，通过均化和挤压制备出脂质体。加入TES 50mM，且将得到的产品高压灭菌消毒。
实施例14组合物DSPA**10mgDSPG**10mgInhexol 390mg缓冲剂 足量注射用水 加至 1mL**二硬脂酰磷脂酸++二硬脂酰磷脂酰甘油(均为带电的磷脂)该组合物如实施例1使用TRIS，HEPES或TES缓冲剂制备。
TES是1-[三(羟甲基)甲基]-2-氨乙烷磺酸。
选择这些缓冲剂的浓度在产品中给出一致的离子强度。pH值和降解数据全阵列于表1和表2中。
表1游离脂肪酸(mg/mL
NMT＝不超过)
表2pH
实施例15组合物H-PEC 60mgIodixand 200mg山梨醇 37mg缓冲剂 足量注射用水 加至 1ml*氢化蛋卵磷脂(中性磷脂)制备了三种组合物进行对照。第一种组合物中的缓冲剂是TRIS、HEPES或TES，第二种组合物中不使用缓冲剂用NaOH/HCl调节pH值，第三种组合物中使用磷酸盐缓冲剂或磷酸盐/柠檬酸缓冲剂。组合物的制备参照实施例1。
高压压菌和40℃下贮存三个月后的磷脂的降解结果，用游离脂肪酸(mg/mL)测定，如下40℃下，缓冲剂高压灭菌后 贮存三个月后TRIS mM，pH7.4 ≤0.25 ≤2.5磷酸盐缓冲剂75mM，pH7.4≤1.0 ≤5.0(选择这些缓冲剂的浓度，在产品中给出一致的离子强度)。pH值和降解数据全部列于表3和表4中。
表3游离脂肪酸(mg/mL)
表4pH
<p>因此，在三个月贮存期后，带有TRIS和TRIS类似的缓冲剂(HEPES和TES作为例子)的样品，与其它缓冲剂(磷酸盐缓冲剂和磷酸盐/柠檬酸缓冲剂))，以及没有缓冲剂的溶液(其pH调节通过NaOH/HCl)相比，可以看出游离脂肪酸的量减少了，显示磷脂的降解降低了。而且，高压灭菌和贮存后，含TRIS，HEPES和TES的试样(pH值降低了0.30个单位)与其它试样(pH值降低了0.30-1.00个单位)相比，试样中所观察到的pH值的降低不明显了。
实施例16组合物H-EPC 36mgMPEG-DSPE*4mgIodixanol 370mg缓冲剂足量注射用水 加至 1mL*甲氧基(聚乙二醇)二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(一种中性磷脂)。
制备中三类组合物进行对比。第一类中缓冲剂是TRIS，HEPES或TES，第二类中没有缓冲剂，用NaOH/HCl调节pH值，第三类中缓冲剂是磷酸盐缓冲剂或磷酸盐/柠檬酸缓冲剂。依实施1制备组合物。
在高压灭菌后和40℃和50℃下贮存一个月后，用游离脂肪酸测定(mg/mL)表示的磷脂的降解如下缓冲剂 高压灭菌后 40℃贮存1个月后 50℃，贮存一个月后TES 172 mM≤0.25 -0.5 -1.0pH 7.4磷酸盐缓冲剂 ≤1.0 ≤2.5≤5.074mM，pH 7.4磷酸盐/柠檬酸 ≤2.5 ≤2.5≤5.067mM，pH 7.4选择这些缓冲剂的浓度使其在产品中给出一致的离子强度。
pH值和降解数据全部列于表5和表6中。
表5游离脂肪酸(mg/mL)
权利要求
1.一种水性脂类组合物，其中包括一种或多种基本饱和的磷脂与一缓冲体系的结合体，该缓冲体系含有氨或水溶性胺，15℃时pH值小于或等于9.5，其成立的条件是其中的所述磷脂包含一带电磷脂和中性磷脂的结合体，而且该组合物是一种脂质体组合物，其中含有一种非离子性多羟基化的X-射线造影剂，然后所述的造影剂不以相同的浓度存在于脂质体中和存在于周围水性介质中。
2.如权利要求1的一种组合物，其中含有脂质体。
3.如权利要求1或2的一种组合物，其中含有一种对比有效材料。
4.如权利要求3的一种组合物，其中所述对比有效材料是一种产生回波材料。
5.如权利要求3的一种组合物，其中所述的对比有效材料是一种顺磁材料。
6.如权利要求3的一种组合物，其中所述的对比有效材料是一种辐射发射材料。
7.如权利要求3的一种组合物，其中所述的对比有效材料是一种有机碘化物。
8.如权利要求3-7的任一种组合物，其中所述的对比有效材料存在于上述组合物的脂质体中。
9.如权利要求1或2的一种组合物，其中含有一种治疗剂或预防剂。
10.如权利要求1或2的一种组合物，其中含有一种化妆剂。
11.如权利要求1-10的任一种组合物，其中所述的缓冲体系包含TRIS、BIS-TRIS、AMPD、HEPES或TES。
12.如权利要求1-11的任一种组合物，其中所述的磷脂是中性磷脂。
13.一种使基本饱和的磷脂组合物稳定的方法，该方法包含在一基本饱和的磷脂组合物中包含一缓冲体系，该缓冲体系含有氨或水溶性胺，15℃时其pH值小于或等于9.5，而不是添加所述的缓冲体系到一含有一种非离子性多羟基化的X-射线造影剂的脂质体组合物中，并且所述造影剂同时以基本相同的浓度存在于脂质体中和周围水性介质中。
14.如权利要求13中的一种方法，其中所述的缓冲体系是加入一已预制成的脂质体组合物中。
15.如权利要求13的一种方法，其中所述的缓冲体系是掺入磷脂组合物中的，且在得到的含有混合物的磷脂和缓冲剂中产生脂质体。
16.一种对比度提高的成像方法，其中在对象上使用了一种对比介质，产生一幅该对象的影像，其特征在于所述使用的对比剂是如权利要求3-9中的任一组合物。
17.如权利要求16的一种方法，其中的影像由X-射线，超声波或MR成像产生。
18.一种化妆处理方法，其中在对象上施用了一种化妆剂，其特征在于使用一种如权利要求10的组合物。
19.一种治疗方法，其中在对象上施用了一种治疗剂或预防剂，其特征在于使用如权利要求9的一种组合物。
全文摘要
通过加入一缓冲体系,提高了磷脂组合物的稳定性。该缓冲体系包含氨或者水溶性胺,在15℃时其pH值小于或等于9.5。
文档编号A61K8/00GK1202830SQ9619858
公开日1998年12月23日 申请日期1996年9月25日 优先权日1995年9月27日
发明者凯里·戴维克, 哈拉尔德·杜格斯泰德, 罗尔德·斯科特威特, 乔·克莱弗尼斯, 乔尼·奥斯滕森, 谷内清人 申请人:耐克麦德英梅金公司, 第一制药株式会社