专利名称：具有金属肽酶抑制活性的膦酸衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗心血管疾病的膦酸衍生物，更具体地讲，本发明涉及作为金属肽酶抑制剂用于治疗心血管疾病的膦酸衍生物。研究金属肽酶抑制分子的药理学重要性源自所述酶对心脏循环系统有一定作用。
众所周知，具有血管紧张肽转化酶(ACE)抑制活性的化合物主要用于治疗高血压、心脏衰竭和梗塞后疾病(post-infarct)，这是由于它们抑制增高血压的一种物质——血管紧张肽II的形成。
具有内皮肽转化酶(ECE)抑制活性的化合物用作抗血管收缩剂，这是基于它们抑制一种具有血管收缩剂活性的、含21个氨基酸的肽——内皮肽的形成。
而具有中性内肽酶(NEP，也称作脑啡肽酶)抑制活性的化合物用作血管舒张剂和利尿剂，这是由于NEP酶的作用是不仅灭活内源性脑啡肽，而且也灭活一些促尿钠排泄因子，例如，心脏分泌的血管舒张激素——动脉促尿钠排泄因子(ANF)。
因此，即使对心血管系统发挥作用的机理不同，基于金属肽酶抑制活性的这些化合物一般也单独或联合用于治疗高血压、肾衰竭、充血性心脏衰竭及梗塞后疾病。
US专利4432972(E.R.Squibb ＆ Sons，Inc.)中描述了氨基酸的磷酸化衍生物，例如，特别是具有ACE-抑制及脑啡肽酶抑制活性的磷酰胺化酶。
这些化合物也用作降压药和镇痛药。
EP0518299(Takeda Chemical Industris，Ltd.)描述了一些膦酸衍生物，它们具有ECE抑制活性，用于治疗高血压、脑血管病及肾病。
现在，我们发现了具有血管紧张肽转化酶和中性内肽酶抑制活性(双重ACE/NEP-抑制活性)的膦酸衍生物，这些活性使它们特别适用于心血管疾病的治疗。
因此，本发明的目的是下式的化合物及其药用盐
其中，R是直链或支链C1-C6烷基，该烷基上可无取代或取代有一个或多个氟原子，芳基或芳烷基，此芳烷基的烷基部分含1至6个碳原子，其芳基部分是苯基、1-萘基、2-萘基或含1或2个选自氮原子、氧原子及硫原子的杂原子的5或6元芳杂环，该芳基上可无取代或取代有一个或多个相同或不同的取代基，该取代基选自卤原子、羟基、烷基、烷氧基、烷硫基、烷基部分有1至3个碳原子烷基磺酰基或烷氧羰基、羧基、氨基羰基、酰氨基、氨基磺酰基、烷基部分含1至3个碳原子的单或二烷基氨基羰基；R1和R2相同或不同，表示氢原子或直链或支链C1-C4烷基；R3是直链或支链C1-C6烷基或芳烷基，该芳烷基的烷基部分含1至6个碳原子，其芳基是苯基、1-萘基、2-萘基或含1或2个选自氮原子、氧原子及硫原子的杂原子的5或6元芳杂环，如R所述该芳基可无取代或被取代；R4是含1或2个选自氮原子、氧原子及硫原子的杂原子的5或6元芳杂环，该芳杂环可无取代或取代有含1或2个选自氮原子、氧原子及硫原子杂原子的5或6元芳杂环或苯基；或者是被含1或2个选自氮原子、氧原子及硫原子的杂原子的5或6元芳杂环取代的苯基；苯基及杂环基可无取代或取代有一个或多个相同或不同的取代基，该取代基选自卤原子、烷基、烷氧基、烷硫基或烷基部分含1至3个碳原子的烷氧羰基；X是单键或-O-CONH-或者-CONH-基团；用星号标记的碳原子是不对称碳原子。条件是R4不是咪唑基或吲哚基。
式I化合物至少含两个不对称碳原子并可以立体异构体的形式存在。
因此，本发明的目的是立体异构体化合物形式及单一立体异构体形式的式I化合物。
本发明的目的化合物式I化合物具有双重ACE/NEP-抑制活性并可用于治疗心血管疾病。
在本说明书中，除非另外说明，术语烷基指直链或支链烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、异戊基、叔戊基、正己基和异己基；术语烷氧基是指直链或支链烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基及异丙氧基；术语卤原子指氟、氯、溴或碘原子；术语酰基指由脂族或芳族羧酸如乙酸、丙酸、丁酸及苯甲酸衍生的酰基；术语芳基指如苯基、1-萘基、2-萘基或含1或2个选自氮原子、氧原子及硫原子的杂原子的5或6元杂环基，如噻唑基、异噁唑基、噁唑基、异噻唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基和呋喃基，它们可以与苯环稠合或不稠合。
式I化合物的药用盐的例子是与碱金属或碱土金属形成的盐及与药用有机碱形成的盐。
优选的式I化合物是R4表示4位被杂环基取代的苯基的化合物。
在这一类中，特别优选的是R1和R2表示氢原子而R3表示直链或支链C1-C4烷基的式I化合物。
式I化合物的药用盐的优选实例是与碱金属如钠、锂及钾形成的盐。
本发明的目的，优选的式I化合物的特定实例为N-(N′-丙基膦酰基-亮氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-亮氨酰基)-[4-(3-呋喃基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-亮氨酰基)-[4-(2-噻吩基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-亮氨酰基)-[4-(3-噻吩基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-亮氨酰基)-[4-(N″-甲基-2-吡咯基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-亮氨酰基)-[4-(N″-甲基-3-吡咯基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-亮氨酰基)-[4-(2-噻唑基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-亮氨酰基)-[4-(2-吡啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-亮氨酰基)-[4-(3-吡啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-亮氨酰基)-(4-吡嗪基)-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-亮氨酰基)-[4-(5-嘧啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-缬氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-缬氨酰基)-[4-(3-呋喃基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-缬氨酰基)-[4-(2-噻吩基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-缬氨酰基)-[4-(3-噻吩基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-缬氨酰基)-[4-(N″-甲基-2-吡咯基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-缬氨酰基)-[4-(N″-甲基-3-吡咯基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-缬氨酰基)-[4-(2-噻唑基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-缬氨酰基)-[4-(2-吡啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-缬氨酰基)-[4-(3-吡啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′丙基膦酰基-缬氨酰基)-(4-吡嗪基)-苯丙氨酸；N-(N′-丙基膦酰基-缬氨酰基)-[4-(5-嘧啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(3-呋喃基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(2-噻吩基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(3-噻吩基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(N″-甲基-2-吡咯基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(N″-甲基-3-吡咯基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(2-噻唑基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(2-吡啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(3-吡啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-亮氨酰基)-(4-吡嗪基)-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(5-嘧啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(3-呋喃基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(2-噻吩基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(3-噻吩基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(N″-甲基-2-吡咯基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(N″-甲基-3-吡咯基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(2-噻唑基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(2-吡啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(3-吡啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-缬氨酰基)-(4-吡嗪基)-苯丙氨酸；N-(N′-(2-噻吩基甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(5-嘧啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(3-呋喃基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(2-噻吩基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(3-噻吩基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(N″-甲基-2-吡咯基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(N″-甲基-3-吡咯基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(2-噻唑基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(2-吡啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(3-吡啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-(4-吡嗪基)-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(5-嘧啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(3-呋喃基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(2-噻吩基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(3-噻吩基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(N″-甲基-2-吡咯基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(N″-甲基-3-吡咯基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(2-噻唑基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(2-吡啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(3-吡啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-(4-吡嗪基)-苯丙氨酸；N-(N′-(苄氧羰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(5-嘧啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(3-呋喃基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(2-噻吩基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(3-噻吩基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(N″-甲基-2-吡咯基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(N″-甲基-3-吡咯基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(2-噻唑基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(2-吡啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(3-吡啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-(4-吡嗪基)-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-亮氨酰基)-[4-(5-嘧啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(3-呋喃基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(2-噻吩基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(3-噻吩基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(N″-甲基-2-吡咯基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(N″-甲基-3-吡咯基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(2-噻唑基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(2-吡啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(3-吡啶基)]-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-(4-吡嗪基)-苯丙氨酸；N-(N′-(乙酰基氨甲基)膦酰基-缬氨酰基)-[4-(5-嘧啶基)]-苯丙氨酸；本发明的目的还包括式I化合物的制备，其包括将式II的磷酸化衍生物与式III的二肽衍生物反应，
其中R、R1和X的含义同上，W表示卤原子，优选氯原子，而Y表示保护基，优选C1-C4烷基、苯基或烷基部分含1至4个碳原子的苯基烷基；
其中R2、R3和R4的含义同上。
式II的磷酸化衍生物由式IV的相应化合物制备，
其中R、R1和X的含义同上，而Z都表示W或OY基团，其中W和Y的含义同上。
按照常规技术，通过与卤代试剂或与Y的含义同上的式YOH的化合物反应，由相应的式IV化合物制备式II化合物。
其中X为单键或-O-CONH-基团的式II化合物的制备，可参见，例如，D.S.Karanewsky等，J.Med.Chem.1988，31，204-212及B.P.Morgan等，J.Am.Chem.Soc.1991，113，297-307。
其中X为-CONH-基团的式II化合物可按照如下制备，例如，由其中X为-O-CONH-基团而R为苄基的式II的相应化合物通过将氨基甲酰基团(R-O-CONH-)氢解并随后与式V的化合物反应，R-COW1(V)其中R的含义同上，且W1表示氯或溴原子。
反过来式III的二肽衍生物，可在式VI的氨基酸和式VII的丙氨酸衍生物之间通过缩合反应制备，
其中R2和R3的含义同上；
其中R4的含义同上。
按照肽化学的常规技术进行此缩合反应。
在进行反应之前，对可干扰反应的选择性官能团进行适当保护是有用的。
此选择性保护按照常规技术进行。
例如，在式II的磷酸化衍生物和式III的二肽衍生物之间进行的反应中，保护式III化合物的游离羧基官能团及膦酸基团的羟基官能团是有用的。
同样，式VI的氨基酸和式VII的丙氨酸衍生物间的反应中，保护式VI衍生物的氨基官能团和式VII衍生物的羧基官能团是有用的。
对选择性保护益处的评价及根据进行的反应和所要保护的官能团性质采取的适当保护类型的选择是本领域技术人员的一般知识。
选择性保护基团的除去可按照常规技术进行。
作为在有机化学中使用保护基的一般性参考，见Theodora W.Greene和Peter G.M.Wuts“有机化学中的保护基(Protetive Groupsin Organic Synthesis)”，John Wiley & Sons，Inc.，第二版，1991。
式VI及式VII的化合物是已知的，或者是按照已知方法容易制备的。
作为制备式VII化合物的参考，例如，见W.C.Shieh和T.R.Bailey分别在J.Org.Chem.1992，57，379-381及Tetrahedron Letters，27，4407-4410中描述的合成方法。
本发明的目的，化合物式I可按照另一种合成路线进一步制备，该路线包括下式的磷酸化衍生物与式VII的丙氨酸衍生物反应，
其中R、R1、R2、R3、X和Y的含义同上。
与前面报道的类似，在该反应中按照常规技术保护在此反应中可能被干扰的最终官能团是有利的。
式VIII的化合物是已知的或按照已知方法容易制备。
例如，可通过式II的磷酸化衍生物与式VI的氨基酸按照肽化学的常规方法反应制备式VIII化合物。
基于上述内容，选择性地由X是-O-CONH-基团而R＝苄基的式I化合物开始制备X是-CONH-基团的式I化合物，对本领域技术人员来说是显而易见的，前者按照上述合成方法之一制备。
按照常规方法，通过立体选择合成或立体异构体混合物拆分来制备单一立体异构体的式I化合物。
本发明的目的，式I混合物的盐的制备也可按照常规技术进行。
本发明的目的化合物式I具有双重ACE/NEP-抑制活性并有助于治疗心血管疾病。
通过体外及体内试验具体评价式I化合物的抑制活性。
与具有ACE-抑制或NEP-抑制活性的已知分子比较，评价式I化合物的体外抑制活性(实施例3)。
卡托普利，作为第一种口服有活性的ACE-抑制剂(The MerckIndex，XI版，No.1773，267-268页)，用作ACE-抑制活性的对照化合物。
而被看作NEP-抑制剂母体化合物的已知分子并由Roques等在Nature，vol.288，286-288页(1980)中首次描述的，Thiorphan[DL-(3-巯基-2-苄基丙酰基)甘氨酸]被用作NEP-抑制活性的对照化合物。
在上述US专利4432972中列举的N-[N′-(4-苯基)丁基膦酰基-L-苯丙氨酰基]-L-苯丙氨酸二锂盐(下文中称为化合物R-1)被看作评价式I化合物体外抑制活性的另一种对照化合物。
以IC50值表达的式I化合物的体外抑制活性，对于在nM浓度产生的结果其具有药学显著性。
所述活性在涉及ACE-抑制活性时至少与卡托普利类似，在涉及NEP-抑制活性时至少与Thiorphan类似。
此外，与化合物R-1相比，式I化合物的双重ACE/NEP-抑制活性显著提高。
如上所述，也通过体内试验用上述化合物R-1作对照化合物评价式I化合物的抑制活性(实施例4)。
式I化合物的体内双重ACE/NEP-抑制活性比对照化合物显著提高。
为了在临床中使用，式I化合物可以配制成适于口服或非肠道给药的固体或液体药物组合物。
因此，含与药用载体混合的有效量的式I化合物的药物组合物是本发明的另一个目的。
本发明的药物组合物的具体实例为片剂、包衣片剂、胶囊、颗粒剂、适于口服给药的溶液及混悬液、适于非肠道给药的溶液或混悬液。
本发明的目的——药物组合物可按照常规技术制备。
虽然式I化合物如此具有活性，为了满足特殊治疗或药物性质，将其转变为相应的生物学前体药物可能是有利的。
因此，按照常规技术制备磷酸化和酰氨基衍生物，例如可通过将羧基或膦酸官能团酯化得到适宜的前体药物。
前体药物形式的式I化合物，特别是通过羧基或膦酸官能团酯化得到的化合物及含前体药物形式的式I化合物，特别是含羧基或膦酸具体被酯化的式I化合物的药物组合物在本发明的范围内。
式I化合物或其相应前体药物的每日剂量依赖于若干因素，如疾病的严重性、患者的个别反应或制剂的种类，但通常为0.01mg至20mg每千克体重，将其分成单一剂量或每日多剂量给药。
为了举例说明本发明，现请见如下实施例。
除非另外说明，用Backer公司的闪式层析硅胶(编号7024-00)进行闪式层析。参考实施例1N-[N′-(4-苯基)丁基膦酰基-L-苯丙氨酰基]-L-苯丙氨酸二锂盐(化合物R-1)所述化合物按照US4432972(实施例36)描述的方法制备。实施例1N-(N′-丙基膦酰基-L-亮氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-L-苯丙氨酸二锂盐(化合物1)a)N-(N′-叔丁氧羰基-L-亮氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-L-苯丙氨酸甲酯的制备将二环己基碳二亚胺(1.75g；8.50mmol)加入N-叔丁氧基-L-亮氨酸单水合物(0.98g；3.93mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(0.45g；3.93mmol)在1，4-二噁烷(40m1)的溶液中。
室温将反应混合物搅拌1小时，随后将形成的二环己基脲滤出。
然后向所得溶液中加入[(2-呋喃基)]-L-苯丙氨酸甲酯(0.75g；3.27mmol)，该甲酯按照W.C.Shieh在J.Org.Chem.，1992，57，379-381中描述的合成方法制备)。
将此反应混合物搅拌18小时，随后减压蒸出溶剂。
用乙醚回收所得残余物并将此混合物再次过滤。
减压蒸出溶剂并通过硅胶闪式层析(石油醚∶乙酸乙酯＝75∶25；氮气压力为0.1atm)将所得粗品纯化得到N-(N′-叔丁氧羰基-L-亮氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-L-苯丙氨酸甲酯(0.98g；产率30％)，为白色固体。1H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)0.85-0.93(2d，6H)；1.4(s，9H)；1.50-1.70(m，3H)；3.00-3.20(m，2H)；3.70(m，3H)；4.00-4.12(m，1H)；4.70-4.90(m，2H)；6.52(d，1H)；6.41-7.41(m，3H)；7.1-7.6(m，4H).
b)N-(L-亮氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐的制备在0℃，向如实施例1a描述制备的N-(N′-叔丁氧羰基-L-亮氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-L-苯丙氨酸甲酯(0.98g；2.14mmol)的甲醇(20ml)溶液中加入亚硫酰氯(0.31ml；4.28mmol)。
室温将反应混合物搅拌24小时并减压蒸出溶剂得到N-(L-亮氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(0.79g；产率93％)，以此形式用于随后的反应中。
c)N-(N′-苯氧基丙基膦酰基-L-亮氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-L-苯丙氨酸的制备将苯酚(0.28g；3.00mmol)和三乙胺(0.42ml；3.00mmol)在二氯甲烷(17ml)中的溶液缓慢滴加至丙基膦酰二氯(0.37ml；3.00mmol)在二氯甲烷(4ml)的溶液中，在0℃及氮气氛下冷却。
然后，向此反应混合物中滴加如实施例1b所述制备的N-(L-亮氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(0.79g；2.00mmol)和三乙胺(0.7ml；5.00mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液，室温搅拌3小时并随后在0℃冷却。
将此反应混合物室温搅拌3小时，然后加入水。
将水相和有机相分离，并将有机相用硫酸钠干燥并减压蒸发。
将所得残余物通过硅胶闪式层析(洗脱液石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1，氮气压力为0.1atm)纯化得到N-(N′-苯氧基丙基膦酰基-L-亮氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-L-苯丙氨酸甲酯(0.4g；产率40％)，为白色固体。1H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)0.70-1.90(m，16H)；2.90-3.20(m，2H)；3.35-3.51(m，1H)；3.65(s，3H)；3.70-3.90(m，1H)；4.65-4.80(m，1H)；6.70-6.85(m，1H)；6.40-7.40(m，3H)；7.00-7.60(m，9H).d)N-(N′-丙基膦酰基-L-亮氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-L-苯丙氨酸二锂盐的制备将氢氧化锂单水合物(90mg；2.16mmol)的水(2ml)溶液加至如实施例1c所述制备的N-(N′-苯氧基丙基膦酰基-L-亮氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-L-苯丙氨酸甲酯(0.4g；0.72mmol)的四氢呋喃(5ml)溶液中。
室温将反应混合物搅拌1小时。随后减压蒸发此混合物并用乙醇收集所得残余物，再蒸发，将此步骤重复两次。
然后用乙酸乙酯收集此残余物并将此混合物在室温搅拌24小时。
然后将此混合物过滤得到N-(N′-丙基膦酰基-L-亮氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-L-苯丙氨酸二锂盐(0.3g；产率90％)，为白色固体。1H-NMR(200MHz，D2O)δ(ppm)0.58-0.73(m，9H)；0.98-1.46(m，7H)；2.71-3.11(m，2H)；3.26-3.38(m，1H)；4.27-4.33(m，1H)；6.39(dd，1H)；6.63(d，1H)；7.33(d，1H)；7.10-7.52(m，4H).实施例2N-(N′-丙基膦酰基-L-缬氨酰基)-[4-(2-噻唑基)]-L-苯丙氨酸二锂盐(化合物2)按照实施例1描述的步骤a-d处理，制备下列化合物a)N-(N′-叔丁氧羰基-L-缬氨酰基)-[4-(2-噻唑基)]-L-苯丙氨酸甲酯的制备1H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)0.80-0.95(m，6H，CH3-CH-CH3)；1.42[s，9H，C(CH3)3]；2.00-2.19(m，1H，CH3-CH-CH3)；3.03-3.22(m，2H，CH2-亚苯基)；3.70(s，3H，COOCH3)；3.83-3.93(m，1H，NH-CH-CH)；4.72-5.05(m，2H，NHCOO，CHCOO)；6.40(bd，1H，NH-CH-COO)；7.13-7.90(m，6H，芳基).
b)N-(L-缬氨酰基)-[4-(2-噻唑基)]-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐的制备1H-NMR(200MHz，D2O)；δ(ppm)0.77-0.83(m，6H，CH3-CH-CH3)；1.93-2.10(m，1H，CH3-CH-CH3)；2.96-3.21(m，2H，CH2-亚苯基)；3.55(s，3H，COOCH3)；3.62(d，1H，CH-NH2)；4.60-4.70(m，1H，CH-COO)；7.25-7.74(m，4H，亚苯基)；7.64-7.87(m，2H噻唑基).
c)N-(N′-苯氧基丙基膦酰基-L-缬氨酰基)-[4-(2-噻唑基)]-L-苯丙氨酸的甲酯制备1H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)0.70-1.07(m，9H，CH3-CH-CH3，CH3-CH2)；1.50-2.00(m，5H，CH2-CH2-P-NH-CH-CH)；2.90-3.18(m，2H，CH2-亚苯基)；3.22-3.70(m，2H，P-NH-CH)；3.64(s，3H，COOCH3)；4.71-4.87(m，1H，CH-COO)；6.75-6.86(m，1H，NHCO)；7.05-7.89(m，11H，aryl).
d)N-(N′-丙基膦酰基-L-缬氨酰基)-[4-(2-噻唑基)]-L-苯丙氨酸二锂盐的制备1H-NMR(200 MHz，D2O)；δ(ppm)0.40-0.80(m，9H，CH3-CH-CH3，CH3-CH2)；1.00-1.70(m，5H，CH2-CH2-P-NH-CH-CH)；2.75-3.24(m，3H，P-NH-CH-CH2-亚苯基)；4.25-4.39(m，1H，CH-COO)；7.16-7.70(m，6H，aryl)实施例3药学活性的体内评价a)NEP-抑制活性在鼠肾皮质膜内评价NEP-抑制活性，该肾皮质膜按照T.Maeda等在Biochim.Biophys.Acta 1983，731(1)，115-120中描述的方法制备。
在0-4℃下操作，由重约300g的雄性Sprague-Dawley鼠体内摘取肾脏。
小心地分离皮质，细细绞碎并以1∶15(重量/体积)悬浮于均浆混悬液(10mM磷酸钠，pH7.4，其中含有1mM氯化镁、30mM氯化钠、0.02％NaN3)中。
然后用Ultra-Turrax均浆器将此组织均浆化30秒。
将约10ml均浆置于10ml蔗糖(41％，重量/体积)上并在4℃，在固定角离心机中，以31200rpm离心30分钟。
由缓冲液/蔗糖界面收集膜，用50mM TRIS/HCl缓冲液(pH7.4)洗涤两次并在悬浮于相同的缓冲液中保存。
用前将此膜以小等分在-80℃下保存。
如下文中报道，按照C.Llorens等，在Eur.J.Pharmacol.，69，(1981)，113-116中描述的方法，评价NEP-抑制活性。
在30℃，将如上所述制备的膜混悬液等分样(蛋白质浓度为5μg/ml)在一种氨肽酶抑制剂(苯丁抑制素-1mM)的存在下预孵育10分钟。
加入[3H][Leu5]-脑啡肽(15nM)和pH7.4的TRIS/HCl缓冲液(50mM)，最终体积为100μl。
在30℃孵育20分钟后，加入0.1M HCl(100μl)停止孵育。
在聚苯乙烯柱上进行色谱分离未反应的底物后，通过液体闪烁法测定相对放射性，定量测定代谢物[3H]Tyr-Gly-Gly的形成。相对于未处理膜制剂，在用式I化合物及对照化合物处理的膜制剂中，代谢物形成的抑制率用IC50(nM)值表示。
b)ACE-抑制活性按照B.Holmquist等在Analytical Biochemistry 95，540-548(1979)中报道的方法评价ACE-抑制活性。
在37℃，50μM ACE(250mU/ml，由兔肺中纯化，EC3.4.15.1SIGMA)与50μl式I化合物或对照化合物一起在恒温比色杯中预孵育。
通过加入0.8mM呋喃基丙烯酰基苯丙氨酰基甘氨酰基甘氨酸(FAPGG-SIGMA)开始反应。
同时，使用配有δA/分钟和酶动力学曲线回归系数计算程序的Beckman DU-50分光光度计，5分钟内连续记录340nm的吸收度。
式I化合物和对照化合物对酶活性的抑制用IC50(nM)值表示。
式I化合物是以锂盐的形式进行试验。
与化合物1和2及对照化合物R-1、Thiorphan以及卡托普利的ACE-抑制活性和NEP-抑制活性有关的IC50(nM)值在下表中报告。表1化合物1和2及对照化合物R-1、Thiorphan以及卡托普利的NEP-抑制活性和ACE-抑制活性，以IC50(nM)值表示。
表1中报告的数据表明本发明的目的式I化合物具有显著的双重ACE/NEP-抑制活性。
所述活性在ACE-抑制活性方面与卡托普利可比，在NEP-抑制活性方面与Thiorphan可比。
此外，式I化合物的双重ACE/NEP-抑制活性明显高于化合物R-1。实施例4药学活性的体内评价a)NEP-抑制活性按照M.Orlowsky等在Biochemistry 1981，20，494-4950中报告的方法进行体内NEP-抑制活性评价。
静脉注射被试化合物(21μmol/kg)5分钟后，用原发性高血压鼠(SHR)的肾脏评价式I化合物和化合物R-1的抑制活性。
摘取SHR的肾脏后，将肾脏组织均浆化并在37℃，pH7.6，在底物戊二酰基-Ala-Ala-Phe-2-萘基酰胺(GAAP)和氨肽酶M的存在下孵育15分钟。
加入10％三氯乙酸水溶液停止反应。
加入固紫染料(fast garnet dye)(2ml)测定释放的2-萘胺。
与用2-萘胺复合物与固紫获得的标准值相比，通过测定524nm的高密度的增加，测定酶反应速率。
式I化合物和化合物R-1的NEP-抑制活性以SHR肾脏中的抑制率表示。
b)ACE-抑制活性用J.W.Ryan等在Biochem.J.(1997)，167，501-504中报告的放射检测法进行体内ACE-抑制活性的评价。
静脉注射被试化合物(21μmol/kg)5分钟后，在原发性高血压鼠(SHR)的肺中，评价式I化合物和化合物R-1的抑制活性。
由SHR中摘取肺后，将肺组织均浆化并在底物[3H]Hyp-Gly-Gly的存在下在37℃孵育2小时。
加入盐酸停止反应。
用乙酸乙酯提取释放的放射标记hyppuric酸并通过液体闪烁光谱法按照常规方法计数。式I化合物和化合物R-1的ACE-抑制活性用SHR肺中的抑制率表示。
在SHR肾脏和肺中分别评价式I化合物和化合物R-1的NEP-抑制率和ACE-抑制率，结果报告于下表2。表2化合物1及化合物R-1静脉注射(21μmol/kg)后，以在SHR肾脏和肺中的抑制率分别表示NEP-抑制和ACE-抑制。化合物 NEP-抑制活性 ACE-抑制活性(肾脏) (肺)抑制率％ 抑制率％1 70 88R-1 20 25表2中报告的数据清除表明本发明目的式I化合物具有比化合物R-1明显高的双重ACE/NEP-抑制活性。
权利要求
1.下式的化合物及其用药盐
其中，R是直链或支链C1-C6烷基，该烷基上可无取代或取代有一个或多个氟原子，芳基或芳烷基，此芳烷基的烷基部分含1至6个碳原子，其芳基部分是苯基、1-萘基、2-萘基或含1或2个选自氮原子、氧原子及硫原子的杂原子的5或6元芳杂环，该芳基上可无取代或取代有一个或多个相同或不同的取代基，该取代基选自卤原子、羟基、烷基、烷氧基、烷硫基、烷基部分有1至3个碳原子烷基磺酰基或烷氧羰基、羧基、氨基羰基、酰氨基、氨基磺酰基、烷基部分含1至3个碳原子的单或二烷基氨基羰基；R1和R2相同或不同，表示氢原子或直链或支链C1-C4烷基；R3是直链或支链C1-C6烷基或芳烷基，该芳烷基的烷基部分含1至6个碳原子，其芳基是苯基、1-萘基、2-萘基或含1或2个选自氮原子、氧原子及硫原子的杂原子的5或6元芳杂环，如R所述该芳基可无取代或被取代；R4是含1或2个选自氮原子、氧原子及硫原子的杂原子的5或6元芳杂环，该芳杂环可无取代或取代有含1或2个选自氮原子、氧原子及硫原子杂原子的5或6元芳杂环或苯基；或者是被含1或2个选自氮原子、氧原子及硫原子的杂原子的5或6元芳杂环取代的苯基；苯基及杂环基可无取代或取代有一个或多个相同或不同的取代基，该取代基选自卤原子、烷基、烷氧基、烷硫基或烷基部分含1至3个碳原子的烷氧羰基；X是单键或-O-CONH-或者-CONH-基团；用星号标记的碳原子是不对称碳原子；条件是R4不是咪唑基或吲哚基。
2.权利要求1所述的化合物，其中R4表示4位被杂环基取代的苯基。
3.权利要求2所述的化合物，其中R1和R2表示氢原子而R3表示直链或支链C1-C4烷基。
4.权利要求1所述的化合物，其形式为与选自钠、锂和钾离子的碱金属形成的盐。
5.权利要求1所述式I化合物的制备方法，其中包括将式II的磷酸化衍生物与式III的二肽衍生物反应，
其中R、R1和X的含义同权利要求1，W表示卤原子，而Y表示保护基，该保护基选自C1-C4烷基、苯基或烷基部分含1至4个碳原子的苯烷基；
其中R2、R3和R4的含义同权利要求1。
6.一种药物组合物，其中含有与药用载体混合的、治疗有效量的、权利要求1所述的式I化合物。
7.权利要求6所述的组合物用于治疗心血管疾病。
8.一种治疗心血管疾病的方法，其中包括使用治疗有效量的、权利要求1所述的式I化合物。
9.权利要求1所述的式I化合物，选自N-(N′-丙基膦酰基-L-亮氨酰基)-[4-(2-呋喃基)]-L-苯丙氨酸和N-(N′-丙基膦酰基-L-缬氨酰基)-[4-(2-噻唑基)]-L-苯丙氨酸。
全文摘要
本文描述了式(Ⅰ)的化合物其制备方法及其药物组合物,其中R是烷基、芳基或芳烷基,此芳烷基的芳基是苯基、萘基或杂环基;R
文档编号A61P43/00GK1202901SQ96198523
公开日1998年12月23日 申请日期1996年11月11日 优先权日1995年11月23日
发明者G·诺茨尼, D·博塔, F·森塔格罗 申请人:萨宝集团公司