Ob受体及诊断和治疗体重疾病的方法

专利名称：Ob受体及诊断和治疗体重疾病的方法
技术领域：
本发明涉及编码Ob受体(ObR)-一种参与哺乳动物体重调节的受体蛋白-的核苷酸的发现、识别和鉴定。本发明包括obR核苷酸，宿主细胞表达系统，ObR蛋白，融合蛋白，多肽和肽，所述受体的抗体，能表达obR转基因的转基因动物或不能表达ObR的重组失效动物，所述受体的拮抗剂和激动剂，以及能调节obR基因表达或ObR活性的其它化合物，可将上述化合物用于体重疾病的诊断、药物筛选、临床试验监测和/或治疗，所述体重疾病包括，但不限于肥胖、恶病质和厌食。
肥胖是最为流行的体重疾病，而且是西方世界最重要的营养疾病，据估计，中年人群中的发病率为30-50％。诸如神经性厌食和神经性食欲过盛的其它体重疾病使西方世界的女性群体的大约0.2％受到困扰，这种病同样对健康造成严重威胁。另外，诸如厌食和恶病质(消瘦)的疾病还是诸如癌、囊性纤维化和AIDS的其它疾病的突出特征。
被定义为相对瘦体重而言的体脂肪过剩的肥胖还可引起其它疾病。例如，这种疾病决定着诸如冠状动脉病、中风和糖尿病的疾病的高发病率(例如，参见Nishina,P.M.等，1994,Metab.43:554-558)。肥胖不仅是一种行为问题，即随意多食的结果。而且，观察到的肥胖与正常被试者的身体组成差异是由于代谢和神经/代谢相互作用的差异造成的。这些差异似乎在一定程度上归因于基因表达、和/或基因产物量或活性的不同(Friedman,J.M.等，1991,Mammalian Gene 1:130-144)。
肥胖的流行病学有力地证实了这种疾病具有遗传特征(Stunkard,1990,N.Eng.J.Med.322:1483)。Moll等报导，在很多群体中，肥胖似乎只受少数基因位点的控制(Moll等，1991,Am.J.Hum.Gen.49:1243)。此外，人类双生子研究可靠地提供了有关体重控制的丰富的遗传基础，估计的遗传力为80-90％(Simopoulos,A.P和Childs B.，著，1989，见“肥胖的遗传变异和营养”(“Genetic Variation and Nutrition in Obesity”)，营养和糖尿病综述(WorldReview of Nutrition and Diabetes)63,S.Karger,Basel,Switzerland；Borjeson,M.,1976,Acta.Paediatr.Scand.65:279-287)。
对通过有意地系统性多吃而试图增重的非肥胖人体所做的研究发现，这种人更难于以这种方式增加体重，而且仅能通过极高的热量摄入维持升高的体重。相反，自发性肥胖个体以正常或中等偏高地热量摄入即可保持其肥胖状态。另外，动物饲养中的普通经验是，不同品系的猪、牛等具有不同的肥胖诱因。对人类肥胖和动物肥胖模型的遗传学研究表明，肥胖是由于食物摄入、食物诱发的能量消耗和脂质与瘦体合成代谢之间的平衡的复杂的缺陷型调节而造成的。
人类和其它物种的很多以肥胖为特征的遗传病，其较突出的症状通常还包括畸形特征和智力迟钝。例如，大约在20,000个活产儿中就有一个受到Praderwilli综合症(PWS)的困扰，并且会出现新生儿肌肉健康状况较差，面部和生殖畸形，和总体上的肥胖。
除了PWS以外，还鉴定了包括肥胖症状在内的很多其它的多效性综合症。这些综合症在遗传学上更为直接，并且似乎涉及常染色体隐性等位基因。这些疾病尤其包括Ahlstroem、Carpenter、Bardet-Biedl、Cohen和Morgagni-Stewart-Monel综合症。
现有很多供研究肥胖用的模型(例如，参见Bray,GA.,1992，脑研究进展(Prog.Brain.Res.)93:333-341,和Bray,G.A.,1989，美国临床营养杂志(Amer.J.Clin.Nutr.)5:891-902)。例如，业已鉴定了具有能导致包括肥胖症状在内的综合症的突变的动物，并且尝试过将这种动物用作肥胖研究的模型。迄今为止，用于遗传性肥胖研究的做过最深入的研究的动物模型是小鼠模型。例如，为了回顾其发展，可参阅Friedman,J.M.等，1991，哺乳动物遗传(Mamm.Gen.)1:130-144；Friedman,J.M.和Liebel,R.L,1992，细胞(Cell)69:217-220)。
用小鼠所做研究已经证实，肥胖是一种具有很高遗传力的极为复杂的性状。业已鉴定了发生在多个基因座的能导致肥胖表型的突变。其中包括常染色体隐性突变肥胖(ob)、糖尿病(db)、多脂肪(fat)和矮胖(tub)。另外，已证实发生于agouti(野鼠色)和脂肪(Adipose)(Ad)基因座上的常染色体显性突变Yellow(黄色)会产生肥胖表型。
ob和db突变分别发生在6号和4号染色体上，但都能产生一种复杂的、临床上类似的肥胖表型，其症状大约始于1月龄时，其症状包括多食、葡萄糖和胰岛素代谢的极度异常、极差的体温调节能力和非战栗性产热，极度迟钝和瘦肉体重的发育不全。这种复杂的表型使得人们难于确定其主要缺陷归因于哪一种突变(Bray GA.，等，1989美国临床营养杂志(Amer.J.Clin.Nutr.)5:891-902)。
使用分子遗传标记和经典遗传标记已将db基因定位于4号中等染色体上(Friedman等，1991,Mamm.Gen.1:130-144)。小鼠基因组的一个片段的突变图谱与人的一致表明，如果存在db基因的人类同系物的话，它很可能位于人类染色体色体1p上。
所述ob基因及其人类同系物最近已被克隆(Zhang,Y等，1994,Nature372:425-432)。该基因似乎能产生4.5kb的脂肪组织信使RNA，它含有一个167个氨基酸的开放读框。该ob基因的推定氨基酸序列表明，它是一种分泌蛋白，并因此作为来自脂肪组织的信号途径的一部分起作用，用于调节体脂肪沉积的某些方面。另外，最近的研究已证实，当外源服用重组ob蛋白(又被称作莱普亭(leptin))时，至少能够部分纠正ob小鼠所表现出的与肥胖相关的表型(Pelleymounter,M.A.等，1995,Science 269:540-543；Halalas,J.L.等，1995,Science269:543-546；Campfield,L.A.等，1995,Science 269:546-549)。最新的研究已揭示，肥胖人和肥胖啮齿类动物(ob/ob小鼠除外)其产生ob mRNA或蛋白的能力并无缺陷，而且其生产量通常会高于瘦型个体(Maffei等，1995，自然医学分册(Nature Med.)1(11):1155-116l；Considine等，1995，临床研究杂志(J.Clin invest.)95(6):2986-2988；Lohnqvist等，1995,Nature Med.1:950-953；Hamilton等，1995,Nature Med.1:953-956)。以上资料表明，对于人类肥胖来说，对正常或较高含量Ob的耐受性可能比Ob产生不足更为重要。不过，被认为是在下丘脑中表达的ob基因产物的受体仍难于捉摸。
由发生于fat或tub基因座的纯合突变所导致的肥胖，其发展比发生在ob和db小鼠上的肥胖的发展缓慢(Coleman,D.L,和Eicher,E.M.,1990，遗传学杂志(J.Heredity)81:424-427),tub肥胖的发展较fat动物的肥胖的发展缓慢。tub肥胖表型的这种特征使得tub肥胖表型的发展与人类肥胖的发展方式最为接近。不过，即使这样这些动物的肥胖表型仍可以超重为特征，其中，这些动物的体重最终可接近正常小鼠体重的两倍。
业已将fat突变定位于小鼠8号染色体上，而tub突变被定位于小鼠7号染色体上。据Naggert等报导，fat突变最近已得到鉴定(Naggert,J.K.,等，1995，自然遗传学分册(Nature Genetics)10:135-141)。具体地讲，fat突变好象是发生在编码羧肽酶(Cpe)E蛋白的Cpe基因座上的一种突变。Cpe是一种参与包括胰岛素原在内的激素原加工的外肽酶。
agouti基因座上的显性Yellow突变，可导致一种多效性综合症，它会引起中度成体发胖，黄色皮毛颜色，肿瘤生成的高发病率(Herberg,L.和Coleman,D.L.,1977，新陈代谢(Metabolism)26:59)，和体脂肪的异常解剖分布(Coleman,D.L.,1978,Diabetologia 14:141-148)。这种突变是可导致体重增加而不是下降的多效性突变的唯一已知例子。这种突变会导致一种在正常情况下仅能在新生儿皮肤中出现的蛋白被广泛表达(Michaud,E.J.等，1994，发育遗传学(Genes,Devel.)8:1463-1472)。
其它动物模型包括fa/fa(fatty)大鼠，它们与上文所述的ob/ob和db/db小鼠有许多相似之处。有一点不同的是，尽管fa/fa大鼠对寒冷极为敏感，但其非战栗性产热的能力是正常的。迟钝在保持fa/fa大鼠的肥胖方面所起的作用似乎要大于其在相应的小鼠突变体上的作用。另外，诸如NZO小鼠和日本KK小鼠的小鼠近交系是中度肥胖的。某些杂交小鼠，如Wellesley小鼠会自发地发胖。另外，某些沙漠啮齿类动物，如刺毛小鼠在其天然生存环境下不会发胖，但在用标准实验饲料饲养时会发胖。
通过物理或药理学方法已建立了被用作肥胖模型的动物。例如，大鼠腹侧正中下丘脑(VMH)和腹外侧下丘脑(VLH)的双侧病变分别与多食症和过度肥胖以及吞咽不能、恶病质和厌食相关。另外，业已证实给新生小鼠喂食谷氨酸-单钠(MSG)或硫代葡萄糖金也会导致肥胖综合症。
上述每一种啮齿类模型都伴有糖类代谢的改变，类似于人类的Ⅱ型糖尿病。例如，同类系的C57BL/KS ob和db小鼠均可能出现严重糖尿病，最终使β细胞坏死和发生胰岛萎缩，造成相对的胰岛素缺乏，而同类系的C57BL/6J ob和db小鼠会发生瞬时型耐胰岛素糖尿病，但最终会被β细胞胞肥大所补偿，与人类的Ⅱ型糖尿病相似。
就ob和db小鼠而言，这些小鼠的表型与人类肥胖的相似之处在于，与瘦型对照相比，突变型小鼠吃的更多，所消耗的能量更少(与胖人相似)，而不在于糖尿病的发展。这种表型与具有腹侧正中下丘脑病变的动物的表型也十分相似，这表明两种突变均会干扰在中枢神经系统中对营养信息作出正确综合或反应的能力。上述假设得到了异种共生实验结果的支持(Colemom,D.L.1973，糖尿病学(Diabetologica)9:294-298)，该实验证明，ob小鼠缺乏循环饱因子，而db小鼠能耐受ob因子的作用。由上述实验得出的结论是，所述突变型小鼠的肥胖是由控制机体组成的假设的反馈机制的传入环和/或整合中心的不同缺陷而造成的。
因此，总而言之，构成世界范围内的问题的肥胖，是一种复杂的、遗传力很高的性状。由于这种病的严重性、流行性及潜在的异质性，导致迫切需要鉴定参与体重控制的基因和基因产物。
本发明的一个目的是提供体重调节剂、提供诊断体重疾病的方法、提供治疗这种疾病的方法和提供用于筛选可用于控制体重的物质的测试系统。
本发明涉及编码Ob受体(ObR)-一种参与哺乳动物体重控制的受体蛋白-的核苷酸的发现、鉴别和鉴定。在本文中首次披露的ObR是一种跨膜蛋白，它一次跨越细胞膜，并参与通过其天然配体Ob结合而触发的信号转导，所述Ob又被称为莱普亭。ObR具有发现于Ⅰ型细胞因子受体家族的氨基酸序列基序，并且与IL-6受体、G-CSF受体和LIF受体的gp130信号转导成分最为相关。在本发明的工作实例中得到的结果表明，长形的ObR(主要在下丘脑中表达)通过一种信号转导及转录活人蛋白(STAT)介导的途径转导信号，它通常为IL-6型细胞因子受体，而存在于肥胖db/db小鼠中的主要为天然存在的截短形式的或突变形式的ObR则不然。长形ObR可以介导STAT蛋白的激活，并通过IL-6效应基因因子刺激转录。重组实验证明，尽管ObR能以类似于IL-6型细胞因子受体的特异性介导胞内信号，但其信号似乎独立于IL-6型细胞因子受体的gp130信号转导成分。
长度大约为5kb的ObR mRNA转录物是在脉络丛、下丘脑和包括肺和肝在内的其它组织中表达的。本文所披露的鼠类短形编码894(图1)和893个氨基酸的受体蛋白；而本文所披露的鼠类长形obR cDNA和人类obR cDNA分别编码1162个氨基酸和1165个氨基酸的受体蛋白(分别见图6和图3)。所述ObR有一个典型的疏水前导序列(两种形式的鼠类ObR中的长度均约为22个氨基酸，而在人类ObR中的长度大约为20个氨基酸)；一个胞外域(在两种形式的鼠类ObR中的长度均约为815个氨基酸，而在人类ObR中的长度约为819个氨基酸)；一个短的跨膜区(在两种形式的鼠类ObR和人类ObR中的长度均大约为23个氨基酸)；以及一个胞质域。编码鼠类ObR短形(图1)和长形(图6)的转录物，在短形终止密码子5＇末端的第15个密码子之前是相同的，然后完全趋异，这暗示可能存在可变剪接。正如本文所披露的，由894个氨基酸的鼠类短形obR cDNA编码的胞质域为34个氨基酸，而由鼠类长形obR cDNA(302个氨基酸)编码的胞质域大约和由人类obR cDNA(303个氨基酸)编码的胞质域的长度相同。由鼠类长形ObR和人类ObR推测出的氨基酸序列在编码区范围内是同源的，并具有75％的同一性(图7)。
db小鼠的肥胖表型是由obR基因上的G→T颠换而造成的。这种颠换可产生一个剪接供体位点，该位点又会导致db突变型中obR长型mRNA的异常加工。在db突变型中，由这种异常加工所产生的长型mRNA，其编码截短形式的并且与894个氨基酸的短形ObR相同的ObR蛋白。与短形ObR类似，该突变型长形ObR缺乏大部分胞质结构域，而且不能通过STAT介导的途径转导信号。在db/db小鼠体内所缺乏的信号感受态的长形ObR是保持体重所必须的。
本发明涉及以下核苷酸，表达这些核苷酸的宿主细胞，和这些核苷酸的表达产物(a)编码哺乳动物ObR的核苷酸，包括人ObR及该obR基因产物；(b)编码ObR的各个部分的核苷酸，这些部分相应于其各个功能域，以及由这些核苷酸序列所确定的多肽产物，包括，但不限于胞外域(ECD)、跨膜域(TM)、和胞质域(CD)；(c)编码ObR突变型的核苷酸，在该ObR突变型中，所述功能域之一的全部或一部分缺失或改变了，以及由这些核苷酸序列所编码的多肽，包括，但不限于其TM全部或部分缺失的可溶性受体，和其CD全部或部分缺失的非功能性受体；(d)编码含有与另一种多肽融合的所述ObR或其一个功能域(例如，胞外域)的融合蛋白的核苷酸。
本发明还涉及ObR的激动剂和拮抗剂，其中包括能与天然Ob竞争的小分子、大分子、突变型Ob蛋白，以及抗体，和可用于抑制obR基因表达的核苷酸序列(例如，反义和核酶分子，以及基因或调控序列置换结构)或用于加强ObR基因表达的核苷酸序列(例如，能使ObR基因受一种强启动子系统控制的表达结构)，和能表达obR转基因的转基因动物或不能表达ObR的“失效”动物。
另外，本发明涉及用于包括肥胖和恶病质的体重疾病的诊断评估、分型和预测以及用于鉴定具有这种病的诱因的患者的方法和组合物。举例来说，可将本发明的obR核苷酸分子用作诊断性杂交探针或诊断性PCR分析的引物，用于鉴定obR基因上的obR基因突变、等位变异和调控缺陷。本发明还提供了用于实施上述方法的诊断试剂盒。
另外，本发明还涉及将所述obR基因和/或obR基因产物用于鉴定能调节obR基因表达和/或obR基因活性，即作为其激动剂或拮抗剂的化合物的方法。这种化合物可被用作体重控制剂，特别是用作治疗剂，治疗包括肥胖、恶病质和厌食在内的体重和体重疾病。
再者，本发明涉及用于治疗包括肥胖、恶病质和厌食在食的体重疾病的方法和组合物。所述方法和组合物可以调节obR基因的表达水平和/或obR基因产物的活性水平。
本发明部分地基于在对很多细胞系和组织、对脑脉络丛中的对Ob有高度亲和力的受体进行广泛研究之后得到的惊人发现，源于由脉络丛mRNA制备的文库的obR cDNA的鉴定和克隆，其新型序列的鉴定，以与db基因图谱相同的遗传间距将该obR基因作图于小鼠基因组上，和作为Ⅰ型细胞因子受体家族的跨膜受体的ObR的鉴定。在包括下丘脑在内的其它组织中检测到过obR mRNA。
主要在下丘脑中表达的全长ObR通过激活STAT蛋白并通过IL-6效应基因因子刺激的转录进行信号转导。全长的长形ObR转导信号的能力与存在于db/db小鼠中的天然存在的截短形式或突变形式的不同，后者不能介导信号转导。本发明还包括缺少一个或另一个对于信号转输和诱导基因表达有重要作用的胞内域的ObR类型。
A..定义本文中，以下的术语无论是单数形式还是复数形式，均具有以下含义Ob是指由Zhang等(1994,Nature 372:425-432)所披露的Ob蛋白，它又被称作莱普亭(Leptin)，该文献被全文收作本文的参考资料。Ob包括与Ob同源或与ObR结合的分子。具有N-末端碱性磷酸酶功能域的Ob融合蛋白在本文中被称为AP-Ob融合蛋白，而具有C-末端碱性碱酸酶功能域的Ob融合蛋白在本文中被称为Ob-AP融合蛋白。
obR核苷酸或编码序列是指编码ObR蛋白、ObR蛋白的多肽或肽片段、或ObR融合蛋白的核苷酸序列，obR核苷酸序列所涉及的DNA包括基因组DNA(例如，obR基因)或cDNA或RNA。
ObR是指Ob受体蛋白。ObR蛋白的多肽或肽片段被称为ObR多肽或ObR肽。与一种不相关的蛋白融合的ObR、或ObR多肽或肽片段在本文中被称为ObR融合蛋白。功能性ObR是指在体内或体外能以高亲合力结合Ob的蛋白。
ECD是指“胞外域”。
TM是指“跨膜域”。
CD是指“胞质域”。
Ⅳ..


图1．编码鼠类短型ObR蛋白(894个氨基酸)的鼠obR(短型)cDNA的核苷酸序列(序列1)和推定的氨基酸序列(序列2)。短型鼠ObR的功能域有信号序列(氨基酸残基1至22左右)，胞外域(大约为氨基酸残基23-837)，穿膜域(大约为氨基酸残基838-860)，和胞质域(大约为氨基酸残基861-894)。胞外域中潜在的N-连接的糖基化位点通过N-X-S和N-X-T基序第一个氨基酸上方的星号标出。字下划线表示Ⅰ型细胞因子受体家族的保守基序。
图2A-2B.AP-Ob融合蛋白的结合研究。
图2A．用ObR cDNA转染的COS-7细胞，用1nM(稀释于DMEM+10％FBS)的各种AP或AP-Ob融合蛋白处理。柱体表示2次结合测定的平均值，而误差柱表示两次测定之间的差异。1)未融合的AP,2)AP-Ob(小鼠)，3)AP-Ob(小鼠)+100nM小鼠Ob,4)AP-Ob(小鼠)+100nM人Ob,5)AP-Ob(人),6)Ob-AP(小鼠),7)AP-Ob(小鼠)，与模拟转染的(载体-无插入片段)COS-7细胞一起培养过。
图2B.AP-Ob与ObR相互作用的结合等温线和Scatchard分析。用各种浓度的AP-Ob(小鼠)融合蛋白培养由obR cDNA转染过的COS-7细胞。用插图表示Scatchard转化作用。
图3．编码人ObR蛋白的人obR cDNA的核苷酸序列(序列3)和推定的氨基酸序列(序列4)。人ObR的功能域有信号序列(从氨基酸残基1至20左右)，胞外域(大约为氨基酸残基21-839)，跨膜域(大约为氨基酸残基840-862)，和胞质域(大约为氨基酸残基863-1165)。还示出了5′-非翻译核苷酸序列。胞外域中潜在的N-连接糖基化位点用N-X-S和N-X-T基序的第一个氨基酸上方面的星号表示。字下划线表示Ⅰ型细胞因子受体家族的保守基序。
图4．鼠ObR和人gp130胞外域的比较。通过在相应的氨基酸周围描影表示相同的残基(黑体)和保守置换(灰体)。所示保守置换的定义同FASTA定义。
图5．鼠ObR(图1所示的短型)与人ObR的比较。两种序列之间相同的氨基酸用星号表示。
图6．编码鼠长型ObR蛋白的鼠长型obR cDNA的核苷酸序列和推定的氨基酸序列。长型鼠ObR的功能域有信号序列(从氨基酸残基1至22左右)，胞外域(大约为氨基酸残基23-837)，跨膜域(大约为氨基酸残基838-860)，和胞质域(大约为氨基酸残基861-1162)。
图7．长型人与鼠ObR的比较。相同的残基和保守置换分别用2个星号和1个星号表示。所示保守置换的定义同FASTA定义。缩略语mobr-1，鼠ObR长形；hobr，人类同系物。
图8．编码ObR的基因在小鼠4号染色体上的定位。
图9．db/db长型转录物上的106bp插入片段的核苷酸序列。示出了其在推定的氨基酸序列中接近插入区的精确插入位置。
图10．表示ObR-Ig对OB蛋白的中和作用的柱形图。用ObR cDNA对COS细胞进行瞬时转染，并测定其结合0.5nM AP-OB的能力。柱1示在无ObR-IgG融合蛋白时出现的高水平的特异性结合。柱2、3和4表示用3种不同柱级分的纯化ObR IgG所产生的对结合作用的近乎完全的抑制作用。
图11A．示意性地表示ObR蛋白的各种C-末端缺失突变型。在每种蛋白的上方标出了其名称和预测长度(aa)。胞外域用斜线表示，跨膜域用黑体表示，胞质域用白框表示。胞质域中酪氨酸残基的位置用水平线条表示(Y986、Y1079和Y1141在人ObR与鼠ObR之间是保守的)。胞质域的长度(aa)在每种蛋白的下面标出。
图11B．表示用IL-6RE-CAT表达结构(上图)或HRRE-CAT表达结构(下图)和图11A的ObR缺失突变型进行CAT测试的结果的柱形图。用编码所述ObR突变型和IL-6RE-CAT或HRRE-CAT的cDNA转染H-35细胞。用无血清的培养基本身(-)或含有鼠莱普亭的无血清培养基(+)处理细胞的传代培养物24小时。测定CAT活性，并以用未处理过的对照培养物得到的值的相对值形式表示。
图12．表示AP-Ob融合蛋白结合测试的结果的柱形图。用编码所示ObR蛋白的cDNA转染COS-7细胞。48小时后，用1mM AP-Ob融合蛋白培养细胞。柱体表示两次结合测试的平均值。误差柱表示两次测试的差异。
图13A．各种突变型ObR蛋白的示意图。示出了酪氨酸残基986和1079的位置。还标出了“框1”序列的位置。
图13B．表示HRRE-CAT诱导试验结果的柱形图。用HRRE-CAT和OB-RY986F,OB-RY1079F或OB-R(框(box)1mt)的表达结构对H-35细胞进行共转染。用含有人莱普亭的无血清培养基处理细胞的传代培养物24小时。测定CAT活性，并用未处理过的对照培养物得到的值的相对值形式表示。
图14A．各种受体嵌合体的示意图。其中，阴影部分为源于G-CSFR的部分；而非阴影部分源于ObR。标出了预测的框1、框2和框3基序的位置。
图14B．表示IL-6RE-CAT(左图)和HRRE-CAT诱导测定结果的柱形图。用所示受体(ObR,G-CSFR或嵌合体)的表达质粒和IL-6-RE-CAT或HREE-CAT表达结构对H-35进行共转染。用适当配体刺激细胞，并按图11B所示实验的方法测定CAT活性。所有的值均以非处理对照培养物的相对值形式表示(3-4次实验的平均值+标准误)。
图15A．表示HRRE-CAT诱导测定结果的柱形图。用HRRE-CAT和所示量的ObR和OB-RΔ868-1165对H-35细胞进行共转染。用莱普亭刺激细胞，并按照图11所示实验的方法测定CAT活性。所有的值均以非处理培养物的相对值形式表示。
图15B．表示IL-6RE-CAT诱导测定结果的柱形图。用IL-6RE-CAT和标明量的ObR/G-CSFR和OB-RΔ868-1165对H-35细胞进行共转染。用莱普亭刺激细胞，并按照图11所示实验的方法测定CAT活性。所有的值均以非处理培养物的相对值形式表示。
图15C．表示IL-6RE-CAT诱导测定结果的柱形图。用IL-6RE-CAT和标示量的G-CSFR和G-CSFR(Δcyto)对H-35细胞进行共转染。用G-CSF刺激细胞，用按照图11所示实验的方法测定CAT活性。所有的值均以非处理培养物的相对值形式表示。
图15D．表示IL-6RE-CAT诱导测定结果的柱形图。用IL-6RE-CAT和标示量的G-CSFR/ObR和G-CSFR(Δcyto)对H-35细胞进行共转染。用G-CSF刺激细胞，并按照图11所示实验的方法测定CAT活性。所有的值均以非处理培养物的相对值形式表示。
图15E．表示IL-6RE-CAT诱导测定结果的柱形图。用IL-6RE-CAT和标示量的ObR和OB-RY1141F对H-35细胞进行共转染。用莱普亭处理细胞，并按照图11所示实验的方法测定CAT活性。所有的值均以非处理培养物的相对值形式表示。
Ⅴ．发明的详细说明在本文中首次披露的ObR，是一种参与体重调节的新型受体蛋白。ObR是一种跨膜蛋白，它从膜中跨越一次，并属于细胞因子受体的Ⅰ型家族，而且，与IL-6受体、G-CSF受体和LIF受体的gp130信号转导成分的关系最为密切。信号转导是由Ob与其受体的结合触发的。中和Ob、清除Ob或干扰它与ObR的结合可导致体重增加。在脉络丛和包括下丘脑在内的其它组织中检测到过ObRmRNA。
本发明涉及下列物质在体重疾病的诊断和治疗中的用途obR核苷酸，ObR蛋白和肽，以及ObR的抗体(例如，它可以作为ObR激动剂或拮抗剂)，能抑制受体活性或表达的拮抗剂，或能激发受体活性或加强其表达的兴奋剂，所述疾病包括，但不限于包括人在内的动物的肥胖、恶病质和厌食。患者体内ObR异常或ObR信号转导途径异常的诊断，有助于设计出合适的处理或治疗方案。另外，可将obR核苷酸和ObR蛋白用于鉴定能有效治疗受ObR调节的体重疾病的化合物。
具体地讲，在以下的各小节中所披露的本发明涉及ObR，相应于该ObR的各功能域(例如，ECD、TM或CD)的多肽或肽，突变的、截短的或缺失的ObR(例如，缺失了一个或几个功能域或其部分的ObR，如ΔTM和/或ΔCD)，ObR融合蛋白(例如，ObR或ObR的一个诸如ECD的功能域与不相关的蛋白或诸如免疫球蛋白恒定区的肽(即IgFc)融合)，编码上述产物的核苷酸序列，以及能产生上述ObR产物的宿主细胞表达系统。
本发明的特征还在于具有与一种特定氨基酸序列大致相同的氨基酸序列的Ob受体。
“大致相同”是指一种多肽或核酸的序列与参考氨基酸或核酸的序列的相同性至少为85％，优选地为90％，更优选地为95％或更高。对多肽而言，参考多肽序列的长度通常至少为16个氨基酸，优选至少为20个氨基酸，更优选至少为25个氨基酸，最好为35个氨基酸，对核酸而言，参考核酸序列的长度通常至少为50个核苷酸，优选至少为60个核苷酸，更优选至少为75个核苷酸，最好为110个核苷酸。
可以用序列分析软件测定序列同一性(例如，Wisconsin大学遗传学计算机组的序列分析软件包，生物技术中心，1710 University Avenue,Madison,WI 53705)。
当多肽序列与参考序列的相同性不到100％时，不相同的位点优选是，但不一定是参考序列的保守置换。保守置换通常包括下列各组的内部置换甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。
在说一种特定的多肽与特定长度的参考多肽有特定百分比的同一性时，该百分相同性是相对该参考肽而言的。因此，与长度为100个氨基酸的参考多肽的相同性为50％的一种肽，可以是一种50个氨基酸的多肽，它与参考多肽的一个50个氨基酸长的部分完全相同。也可以是长度为100个氨基酸的多肽，它与参考多肽整个长度的相同性为50％。当然，有很多其它多肽都满足同一标准。
本发明还涉及ObR的抗体和抗特应抗体(包括Fab片段)、拮抗剂和激动剂，以及能抑制ObR基因表达的化合物或核苷酸结构(转录因子抑制剂，反义和核酶分子，或基因或调控序列置换结构)或能促进ObR表达的化合物或核苷酸结构(例如，其obR编码序列可操纵地与诸如启动子、启动子/增强子之类的表达控制因子结合的表达结构)。本发明还涉及遗传工程产生的宿主细胞和动物，使其能表达人ObR(或其突变型)或抑制或“剔除”该动物内源ObR的表达。
可将ObR蛋白或肽、ObR融合蛋白、obR核苷酸序列、抗体、拮抗剂和激动剂用于检测突变型ObR或表达不正确的ObR，以便诊断诸如肥胖、厌食或恶病质的体重疾病。可将ObR蛋白或肽、ObR融合蛋白、obR核苷酸序列、宿主细胞表达系统、抗体、拮抗剂、激动剂和遗传工程产生的细胞和动物用于筛选能有效治疗上述体重疾病的药物。使用遗传工程宿主细胞和/或动物的优点是，该系统不仅可以鉴定能与ObR的ECD结合的化合物，而且还能鉴定可影响由活化ObR而转导的信号的化合物。
最后，可将ObR蛋白产物(尤其是可溶性衍生物，如相应于ObR ECD的肽或缺少TM域的截短了的多肽)和融合蛋白产物(尤其是ObR-Ig融合蛋白，即ObR或ObR的一个诸如ECD、ΔTM的功能域与IgFc的融合体)，抗体和抗特应抗体(包括Fab片段)、拮抗剂或激动剂(包括能调节信号转导的化合物，它可以作用于ObR信号转导途径的下游目标)用于治疗上述疾病。例如，服用有效量的可溶性ObR ECD，能模拟ObR ECD的ΔTM ObR或ECD-IgFc融合蛋白或抗特应抗体(或其Fab)，可以“清除”或“中和”内源Ob，并抑制或减弱其结合和受体激活，导致体重增加。可将编码上述ObR产物的核苷酸结构用于通过遗传工程方法产生宿主细胞，以便在体内表达这种ObR产物；这种遗传工程细胞在体内像“生物反应器”一样起作用，源源不断地提供能“清除”或中和Ob的ObR、ObR肽、可溶性ECD或ΔTM或ObR融合蛋白。可将编码功能性ObR、突变型ObR的核苷酸结构，以及反义和核酶分子用于“基因治疗”方法中，用于在治疗体重疾病时调节ObR表达和/或活性。因此，本发明还涉及治疗体重疾病的药物制剂和方法。
本发明在某种程度上基于以下惊人发现Ob的高亲和力受体能以很高浓度在脉络丛中表达。这一发现使得用一种新型碱性磷酸酶/Ob(AP-Ob)融合蛋白对细胞和组织进行原位染色成为可能。用未标记的Ob所做的竞争研究证实，所观察到的原位结合是对Ob特异的。用AP-Ob融合蛋白对鼠obR cDNA进行鉴定，以筛选由鼠脉络丛mRNA合成并瞬时转染到哺乳动物COS细胞中的cDNA表达文库。鉴定了一个能表达Ob的短形高亲和力受体的克隆，famj 5312，并进行了测序。序列分析显示，所述obR cDNA和预测的氨基酸序列是含有表明该ObR是受体蛋白Ⅰ型家族一员的氨基酸片段的新型序列。本文所披露的作图研究表明，所述obR基因位于db位点。本文所提供的资料还进一步表明，该db基因是一种突变型obR基因，它可以表达一种编码与短型鼠ObR相同的蛋白的异常剪接的obR长型信息。将famj5312序列用于筛选人胎脑cDNA文库，结果鉴定了本文所披露的人obRcDNA克隆fahj5312d。本文中还披露了将根据人cDNA序列设计的寡核苷酸引物用于克隆人基因组DNA克隆h-ObR-p87。采用根据人ObR胞质域设计的简并引物由鼠下丘脑克隆了编码鼠长型ObR的mRNA。
在以下各小节中将对本发明做更详细地说明。
A..ObR基因在图1和6中分别示出了鼠短型(长度为894个氨基酸)和鼠长型ObR的cDNA序列(序列1)和推定的氨基酸序列(序列2)。鼠短型和长型ObR的信号序列在图1和6中分别从氨基酸残基1延伸到22左右；两种型式的鼠ObR的胞外域在图1和6中大约从氨基酸残基23延伸至837；两种型式的鼠ObR的跨膜域在图1和6中大约从氨基酸残基838延伸至860；鼠短型ObR的胞质域在图1中大约从氨基酸残基861延伸至894，而长形ObR的胞质域在图6中从氨基酸残基861延伸至1162。至少已鉴定到一种另类短型鼠ObR，它比图1所示序列少一个氨基酸(即893个氨基酸)。其C-末端序列与图1所示序列的差别在于，没有残基890-893(RTDTL)；而第二种短形ObR的残基890-893的序列为IMWI。
人ObR的cDNA序列(序列3)和推定的氨基酸序列(序列4)如图3所示。人ObR信号序列在图3中从氨基酸残基1延伸至20左右；人ObR的胞外域在图3中大约从氨基酸残基21延伸至839；人ObR的跨膜域在图3中大约为氨基酸残基840-862；而人ObR的胞质域在图3中大约从氨基酸残基863延伸至1165。将源于人cDNA克隆的序列用于设计引物，在下文所述的实施例中用这些引物克隆人基因组obR,h-obR-p87。
在下文的实施例中所提供的资料表明，obR基因位于db位点，而db基因是一种突变型obR基因，它能以异常剪接的转录物形式在db小鼠体内表达，所产生的mRNA种在其编码ObR的胞质域的部分具有一个大约为106个核苷酸(nt)的插入片段。该插入片段能产生一种突变，由此所产生的转录物编码一种超前截短了的长型，其与鼠短型ObR相同。
本发明的obR核苷酸序列包括(a)如图1、3或6所示的DNA序列，或含于由美国典型培养物保藏中心(ATCC)保存的大肠杆菌531284F3菌株中的cDNA克隆famj5312上的或含于由ATCC保存的大肠杆菌h-obRD菌株中的cDNA克隆fahj5312d上的或含于由ATCC保存的人基因组克隆h-obR-p87上的核苷酸序列；(b)编码图1、3或6所示氨基酸序列的或由ATCC保存的cDNA克隆famj5312或由ATCC保存的cDNA克隆fahj5312d编码的或含于由ATCC保存的人基因组克隆h-obR-p87中的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)能在高度严格的条件下与图1、3或6所示DNA序列或含于由ATCC保存的cDNA克隆famj5312中的或含于由ATCC保存的cDNA克隆fahj5312d中的或含于由ATCC保存的人基因组克隆h-obR-p87中的DNA序列的补体(complement)杂交，并编码一种功能上等同的基因产物的一切核苷酸序列，例如，在65℃下，在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)中与滤膜结合的DNA杂交，并在68℃下在0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤(Ausubel F.M.等著，1989,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.I,Green Rublishing Asso-ciaties,Inc.,and John Wiley & Sons Inc.,New York,见P.2.10.3)；和(d)能在不太严格的条件下，例如，在诸如42℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤的中等严格的条件下(Ausubel等，1989，同上)，与编码图1、3或6所示的氨基酸序列的DNA序列或含于由ATCC保存的cDNA克隆famj5312中的或含于由ATCC保存的cDNA克隆fahj5312d中的或含于由ATCC保存的人基因组克隆h-ObR-p87中的DNA序列的补体杂交，并且还能编码一种功能上等同的ObR基因产物的一切核苷酸序列。ObR的功能性等同物包括存在于其它物种的天然生成的ObR，和天然生成的或遗传工程合成的突变型ObR。本发明还包括序列(a)至(d)的简并变体。
本发明还包括优选为DNA分子的核酸分子，它能与前一段落中的核苷酸序列(a)至(d)杂交，因此，也是所述核苷酸序列的补体。如上文所述，该杂交条件可以是高度严格的或不太严格的。在所述核酸分子是脱氧寡核苷酸(“寡聚体”)的场合下，高度严格的条件是指诸如在6×SSC/0.05％焦磷酸钠中在37℃(适用于14个碱基的寡聚体)、48℃(适用于17个碱基的寡聚体)、55℃(适用于20个碱基的寡聚体)和60℃(适用于23个酰基的寡聚体)的温度下洗涤。上述核酸分子可以编码obR后义分子或起到该分子的作用，例如，用于obR基因调节(在obR基因核酸序列的扩增反应中编码和/或作为反义引物)。就obR基因调节而言，上述方法可用于调节诸如恶病质和/或厌食的疾病。而且，可将上述序列用作核酶和/或三螺旋序列的部分，还可用于obR基因调节。另外，可以把上述分子用作诊断方法的要素，以便能检测出决定导致诸如肥胖的体重疾病的特定obR等位基因的存在。
除了上述obR核苷酸序列之外，用本领域众所周知的分子生物学方法，无须过多的实验即可鉴定并顺利分离到存在于同一物种中的全长obR cDNA或其因序列和/或存在于其它物种中的所述obR基因的同系物。在相关物种中鉴定的ObR同系物可用于开发与人类关系更密切的动物模型系统，用于药物的发现。例如，由源于感兴趣的生物的脉络丛mRNA合成的cDNA表达文库，可以用源于同一物种的标记Ob，如AP-Ob融合蛋白进行筛选。另外，可以用本文所披露的核苷酸作为杂交或扩增探针，通过杂交筛选源于所述感兴趣的生物的这种cDNA文库或基因组DNA文库。而且，还可以通过类似方法鉴定编码与所述ObR基因产物的一个或几个功能域有高度同源性的蛋白的位于所述基因组中的其它遗传基因座上的基因。就cDNA文库而言，上述筛选方法可以鉴定源于相同或不同物种的可变剪接的转录物的克隆。
筛选可以用双重滤膜通过滤膜杂交进行。标记过的探针可至少含有图1、3或6所示obR核苷酸序列的至少15-30个碱基对。当cDNA文库源于不同于产生标记序列的生物的生物类型时，所采用的杂交洗涤条件应当是低严格性的。对于人obR同系物的克隆来说，采用诸如鼠obR探针的探针时，杂交可以在诸如65℃的温度、在Church′s缓冲液(7％SDS,250mMNaHPO4,2 μMEDTA,1％BSA)中的条件下进行。洗涤可以这样进行在65℃下在2×SSC,0.1％SDS中洗涤，然后在65℃下在0.1×SSC,0.1％SDS中洗涤。
低严格条件为本领域技术人员所熟知，并可根据产生所述文库和标记序列的具体生物可预见地加以改变。例如，有关这些条件的指南可以参阅以下书目Sambrook等，1989，分子克隆实验手册，冷泉港出版社(MolecularCloning,A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Press,N.Y)；和Ausubel等，1989，分子生物学通用方法(Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y)。
另外，同样可以用适度严格的条件，将标记的obR核苷酸探针用于筛选源于感兴趣的生物的基因组文库。人基因组克隆的识别和鉴定有助于设计出治疗人类患者的体重疾病的诊断性试验和临床方案。例如，可将源于人基因的内含子/外显子边界附近部位的序列用来设计引物，将该引物用于扩增试验中，检测外显子、内含子、剪接位点(例如，剪接受体和/或供体位点)等中可用于诊断的突变。
另外，通过使用根据本文所披露的obR基因产物中的氨基酸序列所设计的简并寡核苷酸引物库进行的PCR，可以从感兴趣的生物的核酸中分离obR基因同系物。反应模板可以是通过mRNA的逆转录而获得的cDNA，例如，所述mRNA可以从已知的或猜测的能表达obR基因的等位基因的人或非人细胞系或诸如脉络丛的组织中制备。
可以对PCR产物进行亚克隆并测序，以确保所扩增的序列是obR基因的序列。然后可将该PCR片段用于通过各种方法分离全长cDNA克隆。例如，可以标记所扩增的片段，并将其用于筛选cDNA文库，如，噬菌体cDNA文库。另外，可通过筛选基因组文库的方式将标记的片段用于分离基因组克隆。
还可以利用PCR技术分离全长cDNA序列。例如，可以用标准方法从合适的细胞或组织来源(即已知的或猜测的能表达obR基因的来源，例如脉络丛或脑组织)中分离RNA。对该RNA实施逆转录反应，用对所述扩增片段的大多数(most)5′-末端特异的寡核苷酸引物引发第一股链的合成。然后通过标准的末端转移酶反应用鸟嘌呤对所产生的RNA/DNA杂合体加尾，可以用RNAase H消化该杂合体，再通过聚胞苷酸(poly-C)引物引发第二股链的合成。因此，很容易分离扩增片段上游的cDNA序列。为了回顾可以采用的克隆方法，可以参阅诸如Sambrook等的著述(1989，同上)。
另外，可将obR基因序列用于分离突变型obR基因的等位基因。可以从已知的或怀疑其具有造成诸如肥胖、恶病质或厌食的体重疾病基因型的个体中分离上述突变型等位基因。然后可将突变型等位基因和突变型等位基因产物用在下文所述的治疗和诊断系统中。另外，可将这种ObR基因序列用于检测可能会影响体重的obR基因调节(例如，启动子或启动子/增强子)缺陷。
例如，可以用为本领域技术人员所熟知的PCR方法分离一种突变型obR基因的cDNA。在这种场合下，可以用如下方法合成第一条cDNA链让Oligo-dT(寡聚脱氧胸苷酸)寡核苷酸与自推测其携带突变型obR等位基因的个体的已知的或怀疑能表达该基因的组织中分离的mRNA杂交，并用逆转录酶延长这条新链。接着用能特异性地与正常基因的5＇末端杂交的寡核苷酸合成第二条cDNA链。然后用本领域技术人员熟知的方法，采用上述两种引物通过PCR扩增所述产物，克隆到适当载体上，并进行DNA序列分析。通过比较突变型obR等位基因和正常obR等位基因的DNA序列，可以查明决定突变型obR基因产物的功能丧失或改变的突变。
另外，可以用获自被怀疑或已知其带有突变型obR等位基因的个体的DNA构建基因组文库，或用获自已知的或怀疑能表达该突变型obR等位基因的组织的RNA构建cDNA文库。然后可以对正常的obR基因或其任何适当的片段进行标记，并用作探针，在上述文库中鉴定相关的突变型ObR等位基因。然后可以纯化含有该突变型ObR基因序列的克隆，并用本领域技术人员所熟知的方法进行序列分析。
另外，可以用cDNA构建表达文库，该cDNA是用诸如从被怀疑或已知其携带突变型ObR等位基因的个体的已知的或被怀疑能表达这种突变型等位基因的组织中分离的RNA合成的。如下文的5.3.节所述，由所述推测的突变型组织以所述方法制备的基因产物，可以表达并用标准的抗体筛选技术结合抗正常obR基因的抗体进行筛选(例如，筛选技术可以参阅Harlow,E.和Lane著，1988，“抗体实施手册”，冷泉港出版社(“Antibodies:ALaboratory Manual”,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor))。另外，可以用诸如AP-Ob或Ob-AP融合蛋白的标记的Ob融合蛋白进行筛选以实现所述筛选。对于能导致表达的基因产物具有改变了的功能的obR突变来说(例如，由错义突变或移码突变所导致的改变)，有一类ObR的多克隆抗体可以与突变型ObR基因产物发生交叉反应。可以用本领域技术人员所熟知的方法纯化通过其与上述标记抗体的反应检测的基因文库克隆并进行序列分析。
本发明还涉及编码突变型ObR、ObR的肽片段、截短的ObR和ObR融合蛋白的核苷酸序列。其中，包括，但不限于编码以下产物的核苷酸序列在下文的5.2节中所披露的突变型ObR；相应于ObR的ECD、TM和/或CD域或这些功能域的部分的多肽或肽；其中缺失了所述功能域中的一个或两个的截短了的ObR，例如，缺少TM或同时缺少TM和CD区的可溶性ObR，或缺少全部或一部分CD区的截短了的、无功能的ObR。编码融合蛋白的核苷酸可以包括，但不限于编码以下产物的核苷酸全长ObR，截短的ObR或与不相关的蛋白或肽融合的ObR肽片段，例如，将ObR ECD固定在细胞膜上的跨膜序列；能提高血液中所产生的融合蛋白(如ObR-Ig)的稳定性和半衰期的IgFc；或可以用作标记的酶，荧光蛋白，发光蛋白。
本发明还涉及(a)含有上述ObR编码序列和/或其补体(即反义链)中任一个的DNA载体；(b)含有上述ObR编码序列中任一个的DNA表达载体，所述ObR编码序列可操纵地与能指导该序列表达的调节元件连接；和(c)通过遗传工程方法产生的含有上述ObR编码序列中任一个的宿主细胞，该编码序列可操纵地与能指导其在该宿主细胞中表达的调节元件连接。在本文中，调节元件包括，但不限于诱导型和非诱导型启动子、增强子、操纵子以及本领域技术人员所知的能启动或调节表达的其它元件。所述调节因子包括，但不限于巨细胞病毒hCMV立即早期基因，SV40腺病毒的早期或晚期启动子，lac系统，trp系统，TAC系统，TRC系统，噬菌体A的主要操纵子和启动子区，fd外壳蛋白的操纵区，3-磷酸甘油酸激酶的启动子，酸性磷酸酶的启动子，以及酵母α-交配因子的启动子。
B..ObR蛋白和多肽可以制备ObR蛋白，ObR的多肽和肽片段，ObR的突变、截短或缺失的型式和/或ObR融合蛋白，将其用于各种目的，包括，但不限于制备抗体，作为诊断试验中的试剂，鉴定参与体重调节的其它细胞基因产物，用作筛选能用于治疗体重疾病的化合物的试验的试剂，并用作可用于治疗与ObR相关的体重疾病的药用制剂。
图1和6分别表示鼠短型和长型ObR蛋白。在上述两型式的ObR中，信号序列从氨基酸1延伸到氨基酸22左右；ECD大约从氨基酸23延伸至837；而TM大约从氨基酸838延伸至860。在短型鼠ObR上，CD大约从氨基酸861延伸至894(或在第二种短型中延伸至893)；而在其长型上大约从氨基酸861延伸至1162。图3表示人ObR的氨基酸序列。其信号序列从氨基酸残基1延伸至20左右；ECD大约从氨基酸残基21延伸至839；TM大约从氨基酸残基840延伸862；而CD大约从氨基酸残基863延伸至1165。
ObR序列始于一个甲硫氨酸，它在DNA序列中的位置与一个翻译起始位点一致，其后是一个典型的肽分泌的疏水信号序列。以上两种型式的鼠ObR的预测的成熟胞外域是一样的，并且长度均为815个氨基酸，而预测的人ObR的ECD长度为819个氨基酸。ObR胞外域具有很多Ⅰ型细胞因子受体家族的特征(其综述见Heldin,1995，细胞(Cell)80:213-223)，并且与IL-6受体(Taga等，1989,Cell 58:573-581)、G-CSF受体(Fukunaga等，1990,Cell 61:341-350)和LIF受体(Gearing等，1991,科学(Science)255:1434-1437)的gp130信号转导因子的关系最为密切。事实上，本文所提供的资料表明，长型ObR通过激活STAT蛋白-由IL-6型细胞因子受体家族介导的信号转导途径的标志-转导信号。
在图4中对鼠ObR和gp130之间的胞外域进行了比较。尽管这两种分子之间总体上的氨基酸序列同一性较低(24％)，但所保留的有特色的半胱氨酸残基、Trp-Ser-X-Trp-Ser基序(图1所示鼠序列的氨基酸残基317-321和620-624；图3所示人序列的氨基酸残基319-323和622-626)、和这一类蛋白中其它残基的保守(其综述见Kishi-moto等，1994,Cell 76:253-262)都是显而易见的。鼠短型ObR和人ObR的氨基酸序列在鼠短型ObR的长度范围内是高度同源的(图5)。事实上，鼠短型和人克隆的推定氨基酸序列之间的同一性(78％)等于或大于在对鼠和人的gp130型式(Saito等，1992，免疫学杂志(J.Immunol.)148:4066-4071)、LIF受体(Gough等，1988，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)85:2623-2627)和G-CSF受体(Fukanaga等，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.87:8702-8706)进行比较时所观察到的同一性。类似地，由鼠和人长型ObR推定的氨基酸序列在其编码区长度范围内是同源的，并具有75％的相同性(图7)。
在鼠和人ObR的ECD中均存在潜在的N-连接的糖基化位点(即氨基酸序列基序N-X-S或N-X-T)。在图1和6所示的鼠ECD序列中，至少可以确认20个潜在的N-连接的糖基化位点(参见始于下列氨基酸残基的三肽基序23、41、56、73、81、98、187、206、276、347、397、433、516、624、659、670、688、697、728、和750)；而在图3所示的人ObR ECD序列中至少可确认16个潜在的N-连接的糖基化位点(参见始于下列氨基酸残基的三肽基序41、56、73、98、187、275、345、431、514、622、657、668、686、695、698和726)。在鼠和人ObR胞外域后面的是23个氨基酸的预测跨膜域。
图1所示的鼠cDNA编码一种短的胞质域(34个氨基酸)。鼠ObR胞质域的氨基酸5-24(即图1中的氨基酸残基865-884)与LIF受体的胞内域的近膜序列有47％的同一性，并含有一个box1 Jak相互作用序列(Navazaki等，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.91:2285-2289)。有趣的是，由所述cDNA编码的一种蛋白具有长于鼠短型ObR胞内域的胞内域。虽然所述鼠短型和人胞内域在直到鼠短型ObR的最后5个残基的范围内都是高度保守的，但人的胞内域一直延续到类似于gp130的长度。所述鼠短型克隆和人克隆的核苷酸序列在鼠短型ObR的整个编码区范围内也是极其相似的，但随后在接近鼠短型ObR终止密码子处完全趋异。
本文所披露的鼠短型cDNA的短胞质域具有几种Ⅰ型细胞因子受体多肽的特征(其综述见Kishimoto等，1994,Cell 76:253-262)。不过，本文所报导的结果表明，短型ObR不能通过STAT途径启动信号转导，该途径是由长型ObR介导的。事实上，所述与ObR具有很高同源性的3个受体均具有在胞内信号转导中有重要作用的长的胞质域。这加大了所分离的鼠短形ObR克隆是嵌合体或编码一种罕见的、不代表脉络丛中的主要表达型式的异常剪接型式的可能性。为了解决这一问题，选择8个在文库筛选中分别鉴定的鼠克隆，并用制备到终止密码子的序列3＇的引物通过PCR扩增每一个克隆(各自为有150个克隆的亚集合体)。结果表明，所有8个克隆均含有相同的3′非翻译序列。另外，对5个分别分离到的克隆的C-末端测序，均表现出有相同的终止密码子。最后，用从不同于产生所述cDNA的小鼠品系(C57B1/KsJ)的脉络丛中提取的全RNA进行逆转录PCR，产生了在同一位点上含有终止密码子的相同的PCR产物。上述结果表明，所分离到的鼠短型克隆既非嵌合型式，亦非罕见的异常剪接型式，而很可能是该受体在鼠脉络丛中的主要型式。本文所提供的资料表明，小鼠ObR的可变剪接的型式具有较长的胞内域(长型)；即野生型obR基因以两种型式表达一种mRNA转录物具有一个大约为100个核苷酸的插入片段，它编码具有一种短的胞质域的ObR；另一种mRNA转录物编码具有一种长的胞质域的ObR，该胞质域与人的CD同源。
图6所示的鼠cDNA克隆编码长型ObR。如上文所述，编码鼠长型ObR的ECD和TM的氨基酸与编码鼠短型的氨基酸相同。不过，由鼠长型cDNA编码的胞质域(302个氨基酸)的长度大致与由人ObR cDNA编码的胞质域相同。与obR短型不同的是，由鼠长型的核苷酸序列编码的obR直到整个胞质域的范围内都是与人ObR相似的。
本文所提供的资料还表明，db是长型鼠obR基因的一种突变型。db突变型能表达一种异常剪接的转录物，在该转录物的编码CD的mRNA部分含有一个大约为106个核苷酸的插入片段。虽然该转录物是长的，但由插入序列形成的突变所产生的转录物编码一种截短的ObR蛋白，该蛋白与所述短型ObR相同，因此，它缺少大部分CD。本文所提供的资料表明，与长型ObR不同，短型ObR，即与db/db小鼠的肥胖表型相关的受体型式不能转导由STAT途径介导的信号。因此，好像是信号转导感受态的长型ObR积极参与了体重的调节和保持。
总之，已鉴定了几种主要ObR型式的信使RNA。存在于大部分组织中的优势ObR mRNA能编码一种具有一个由34个氨基酸残基组成的短的胞质域的跨膜蛋白，它被称为短型。在下丘脑中存在一种obRmRNA，它所编码的蛋白具有与短型相同的胞外域，但有一个302个残基长的胞质域，它被称为长型。所述db突变能导致长型转录物的异常剪接产物的产生，从而形成一种具有截短了的胞质域的蛋白。有趣的是，在db/db小鼠中长型ObR的mRNA，能编码一种结构与天然存在的短型相同的蛋白。其C-端区的丧失被认为使ObR失去了活性，并推测能导致db/db小鼠的肥胖表型。
序列资料表明，ObR可能产生类似于G-CSFR、LIFR和gp130的信号转录作用(Stahl和Yancopoulos,1993，细胞(Cell)74:587-590；Kishimoto等，1995，血液(Blood)86:1243-1254)。由上述受体进行的信号转导，尤其能实现Janus激酶家族的受体相关激酶的激活，由此导致磷酸化作用，并激发STAT1、STAT3和STAT5的DNA结合活性(Ihle,1995,Nature 377:591-594；Kishimoto等，1995,Blood 86:1243-1254)。这一过程反过来又与诱导的基因转录相关(所述基因具有STAT蛋白的结合位点)，如编码急相血浆蛋白的肝基因(Lai等，1995，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)270:23254-23257)。为了验证所克隆的ObR同种型是否确系信号转导受体分子，将ObR导入已建立的组织培养细胞系中，并将细胞对OB处理的反应与由结构上相关的IL-6-型细胞因子受体介导的反应加以比较。在下文的实施例中所提供的结果表明，该长型ObR是一种信号转导分子。具体地讲，所述结果证实了该长型ObR具有IL-6-型细胞因子受体的功能特异性。所述结果还证实，短型ObR不能通过由所述ObR长型转导的STAT途径转导信号。因此，好像是长型ObR，而不是短型ObR与体重的保持相关。
本发明的ObR氨基酸序列包括图1(序列2)、图3(序列4)或图6所示的氨基酸序列，或由保存于ATCC的cDNA克隆famj5312或保存于ATCC的cDNA克隆fahj5312d或保存在ATCC的人基因组克隆h-obR-p87编码的氨基酸序列。而且，本发明还包括其它物种的ObR。事实上，由上面的5.1节中所披露的obR核苷酸所编码的一切ObR蛋白均属于本发明的范畴。
本发明还涉及作为由5.1节中所披露的核苷酸序列编码的ObR的功能性等同物的蛋白，这种功能性等同物可以用众多标准中的任一种判断，所述标准包括，但不限于结合Ob的能力，对Ob的结合力，Ob结合所产生的生物学效应，例如，当ObR等同物存在于适当细胞型中时的信号转导、细胞代谢的变化(例如，离子流动、酪氨酸磷酸化)或表型的变化(如减轻、抑制或延缓肥胖表型，即db或ob表型)、或体重减少。所述功能性等同的ObR蛋白包括，但不限于在由上文的5.1节中所披露的obR核苷酸序列编码的氨基酸序列中的氨基酸残基的添加或置换，但这种变化导致的是沉默改变，由此产生一种功能上相同的基因产物。氨基酸置换，可基于有关残基在极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两亲性方面的相似性完成。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、笨丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；而带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
尽管可以对obR DNA进行随机突变(采用本领域技术人员所熟知的随机诱变技术)并检测所得到的突变型ObR的活性，但也可以通过工程方法使obR编码序列发生定点突变(采用本领域技术人员所熟知的定点诱变技术)产生突变型ObR，该突变型ObRs具有增加的功能，例如，对Ob的较高结合力和/或较大的信号转导能力；或具有降低的功能，例如，对Ob的较低的结合力和/或较弱的信号转导能力。
例如，小鼠短型ObR(图1)和人ObR同系物(图3)的比较示于图5中，其中，相同的氨基酸残基用星号标出。可以对突变型ObR进行工程操作，以使相同的区域(在图5中用星号标出)得以保存，而可变残基(图5中未加星号的残基)被改变，例如，通过缺失或插入一个或几个氨基酸残基或置换一个或几个不同的氨基酸残基。可以对可变位置上的保守性变性进行工程操作，以产生仍保留有功能的突变型ObR；例如，保留了Ob结合力或信号转导能力或同时保留了这两种能力。可以在这些可变位置上用工程操作方法产生非保守性变化，以改变其功能，例如，Ob结合力或信号转导能力或这两种能力。另外，如果需要改变功能，可以用工程操作方法使所述保守区域(即图5中用星号标示的相同的氨基酸)发生缺失或非保守性变化。例如，可以通过工程操作使CD发生缺失或非保守性变化(置换或插入)，例如，鼠ObR的氨基酸残基861-894(图1)，或人ObR的氨基酸残基863-1165(图3)，或CD的各个部分，例如，鼠ObR的氨基酸残基861-884(图1)，或人ObR(box 1 Jak相互作用域)的氨基酸残基863-886，以产生一种突变型ObR，该突变型ObR能结合Ob，但不能转导信号。可以对图5所示ECD中的标有星号的残基进行工程操作，以使其发生非保守性变化，从而产生具有改变了的Ob结合力的突变型ObR。根据图7中对鼠长型ObR和人ObR同系物的比较，可以将相同的突变方法用于设计突变型ObR，在图7中，相同的氨基酸残基用双星号表示。
图4中示出了鼠ObR的ECD与人gp130的比较，其中，相同的残基用黑体表示，而保守性变化用灰体表示。据推测，在保持ECD的三级结构方面相同区域和保守区域有着重要作用，而可变区可产生每一种受体对其配体的特异性。因此，通过改变图4所示的可变区，可以通过工程方法产生具有改变了的Ob结合力的ObR突变型。可以对所述ObR突变型进行设计，以保留在图4中被框出(包括黑框和灰框)的ObR氨基酸序列，或含有一个或几个由图4的灰框所示gp130序列所产生的保守性置换。
可以使obR编码序列发生其它突变，以产生更适于在所选定的宿主细胞中表达、放大等的ObR。例如，为了消除二硫键，可以缺失或用另一种氨基酸置换半胱氨酸残基；可以改变或消除N-连接的糖基化位点，以实现诸如均相产物表达的目的，这种产物更容易从酵母宿主中回收和纯化，已知上述位点为高糖基化N-连连接位点。为此，发生在ECD上的一个或几个糖基化识别序列(N-X-S或N-X-T)中任一个的第一或第三氨基酸位置上的各种氨基酸置换和/或发生在ECD上的一个或几个所述识别序列中任一个的第二位置上的一个氨基酸的缺失，可以抑制ObR在修饰过的三肽序列上的糖基化作用(例如，参见Miyajima等，1986，欧洲分子生物学协会杂志(EMBO J.)5(6):1193-1197)。
相当于ObR的一个或几个功能碱(如ECD、TM或CD)的肽、截短了的或缺失的ObR(例如，缺失了其中的TM和/或CD的ObR)、以及由全长ObR、ObR肽或截短的ObR与一种不相关的蛋白融合而成的融合蛋白也属于本发明范畴，并可以根据在本节和上文的5.1节中所披露的obR核苷酸序列和ObR氨基酸序列进行设计。所述融合蛋白包括，但不限于IgFc融合蛋白，它能稳定ObR蛋白或肽，并延长其在体内的半衰期；或与能使融合蛋白固定在细胞膜上的一切氨基酸序列融合，以使其ECD被呈现在细胞表面上；或是与具有标记功能的酶、荧光蛋白或发光蛋白融合。
虽然可用化学方法合成ObR多肽和肽(例如，参见Creighton,1983，蛋白质结构和分子原理(Proteins:Structures and Molecular Principles)，W.H.Freeman & Co.,N.Y)，但源于ObR的大型多肽和全长ObR本身最好用本领域广为人知的技术通过重组DNA方法产生，以表达含有ObR基因序列和/或编码序列的核酸。可将这种方法用于构建含有5.1节中披露的obR核苷酸序列合适的转录及翻译控制信号的表达载体。例如，所述方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组技术。例如，参见披露于Sambrook等(1989，同上)和Ausubel等(1989，同上)的著述中的技术。或者，可以用诸如合成仪的装置化学合成能编码obR核苷酸序列的RNA。例如，参见披露于寡核苷酸合成(“Oligonucleotide Synthesis”)(1984,Gait,M.J.著，IRLPress,Oxford)中的技术，该文献的全文被收作本文参考。
可以用各种宿主表达载体系统表达本发明的obR核苷酸序列。如果该ObR肽或多肽是可溶性衍生物(例如，相当于ECD的ObR肽；截短的或缺失的ObR，其中的TM和/或CD已缺失)的话，在ObR肽或多肽不是分泌性的时可从培养物，即宿主细胞中回收该肽或多肽，而在ObR肽或多肽是由宿主细胞分泌的时可从培养基中回收。不过，该表达系统还包括遗传工程产生的宿主细胞，该细胞可原位表达ObR或其功能性等同物，即固定在细胞膜上。可以用适当的洗涤剂和脂微团以及本领域技术人员所熟知的方法实现从这种表达系统中纯化或富集ObR。不过，可将这种用工程方法产生的宿主细胞本身用于以下场合它不仅对于保持ObR的结构和功能特征起着重要作用，而且对评估其生物学活性有重要意义，例如，用于药物筛选试验中。
可用于本发明目的的表达系统包括，但不限于诸如用含有obR核苷酸序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化过的细菌(例如，大肠杆菌、枯草芽胞杆菌)的微生物；用含有obR核苷酸序列的重组酵母表达载体转化过的酵母(例如，酵母属、毕赤酵母属)；用含有obR核苷酸序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染过的昆虫细胞系统；用含有obR核苷酸序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染过的或用含有obR核苷酸序列的重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化过的植物细胞系统；或获得了重组表达结构的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHD、BHK、293、3T3)，所述表达结构含有源于哺乳动物细胞的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。
在细菌系统中，可以根据被表达的obR基因产物的预期用途对若干表达载体进行适当选择。例如，当需要产生大量的此类蛋白以制备ObR蛋白的药用组合物或制备该ObR蛋白的抗体时，需要用诸如能指导便于纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体。这种载体包括，但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Pruther等，1983,EMBO J.2:1791)，其中，obR编码序列可以与lacZ编码区单独在读框中的连接到该载体，以产生所述融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye,1985，核酸研究(Nucleic Acids Res.)13:3101-3109；Van Heeke和Schuster,1989，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264:5503-5509)；以及类似载体。还可将pGEX载体用于表达外源多肽，该多肽是一种与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般，这种融合蛋白是可溶性的，而且便于从裂解的细胞中纯化，其做法是将其吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠上，然后在有游离的谷胱甘肽的条件下洗脱。将PGEX载体设计成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点，以便能从GST部分分离出克隆的目标基因产物。
在昆虫系统中，用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPN)作为载体表达外源基因。该病毒生长于草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)细胞中。可将obR基因编码区单独克隆到该病毒的非必需区(例如，多角体蛋白基因)上，并置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制之下。ObR基因编码序列的成功插入，可导致多角体蛋白基因的失活和无包被重组病毒(即缺少由多角体蛋白基因编码的蛋白质外被的病毒)的产生。然后再用这种重组病毒感染草地贪夜蛾细胞，其中，所插入的基因得以表达(例如，参见Smith等，1983，病毒学杂志(J.Virol.)46:584；Smith，美国专利US 4,215,051)。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用多种病毒基表达系统。当腺病毒被用作表达载体时，可将感兴趣的obR核苷酸序列连接在腺病毒转录/翻译控制复合体上，例如，晚期启动子和三联前导序列。然后通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。如果插入点是在病毒基因组的非必需区上(例如，E1或E3区)，将会产生一种有活力的并能在感染的宿主中表达obR基因产物的重组病毒(例如，参见Logan和ShenR,1984，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 81:3655-3659)。插入的obR核苷酸序列的有效翻译可能还需要特殊的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子及相邻的序列。在完整的obR基因或cDNA(包括其自身的起始密码子及相邻序列)被插入合适的表达载体的情况下，无须额外的翻译控制信号。不过，当插入的仅仅是一部分obR编码序列时，必须提供外源翻译控制信号，可能包括ATG起始密码子。而且，该起始密码子必须与所需的编码序列的读框同相，以确保整个插入片段的翻译。所述外源翻译控制信号和起始密码子可有多种来源，它可以是天然的和合成的。通过包含合适的转录增强元件、转录终止子等可以提高表达的效率(参见Bittner等，1987，酶学方法(Methods inEnzymol.)153:516-544)。
另外，可以选择宿主细胞品系，该品系能调节插入序列的表达，或以所需的特定方式修饰并加工其基因产物。蛋白产物的这种修饰(如糖基化)和加工(如裂解)可能对该蛋白的功能至关重要。不同的宿主细胞具有进行蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性的、特殊机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统，以确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为达此目的，可以使用具有用于正确加工初级转录物、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞器的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括，但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38，尤其是脉络丛细胞系。
为了长期、高得率地生产重组蛋白，稳定的表达是优选的。例如，可以制备出可稳定表达上述obR序列的细胞系。可以用由适当的表述控制元件(例如，启动子、增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制并有一种选择标记的DNA转化宿主细胞，而不是用含有病毒复制起点的表达载体转化。在导入外源DNA之后，可以让制备出的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后将其转移到选择培养基上。重组质粒上的选择标记可以产生选择抗性，并使得该细胞能将所述质粒稳定地整合到其染色体中，生长型成转化灶，随后可以对该转化灶进行克隆并扩增成细胞系。可将该方法适当用于制备能表达obR基因产物的细胞系。由此制备的细胞系特别适用于筛选和评价能影响obR基因产物的内在活性的化合物。
有多种选择系统可供使用，包括，但不限于可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977,Cell 11:223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(Szybalska和Szybalski,1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:2026)、和腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因(Louy等，1980,Cell 22:817)。另外，可以将抗代谢物抗性用作以下基因的选择基础dhfr，它能产生对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，1980,Natl.Acad.Sci.USA 77:3567；O′Hare等，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78:1527)；gpt，它可以产生对霉酚酸的抗性(Mulligan & Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072)；neo，它能产生对氨基糖苷G-418的抗性(Colbeme-Garapin等，1981,J.Mol.Biol.150:1)；以及hvgro，它能产生对潮霉素的抗性(Santere等，1984,Gene30:147)。
另外，可以用对被表达的融合蛋白特异的抗体方便地纯化一切融合蛋白。例如，由Janknecht等所披露的一种系统可用于方便地纯化在宿主细胞系中表达的非变性融合蛋白(Jamknecht等，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8972-8976)。在该系统中，将感兴趣的基因亚克隆到痘苗重组质粒上，以使该基因的开放读框被翻译融合到由6个组氨酸残基构成的氨基末端尾上。将获自由重组痘苗病毒感染的细胞的提取物加样到Ni2+次氮基乙酸-琼脂糖柱上，并用含有咪唑的缓冲液选择性地洗脱由组氨酸标记的蛋白。
还可以在转基因动物中表达obR基因产物。任何物种的动物均可用于生产obR转基因动物，其中包括，但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猪、微型猪(micro-pigs)、山羊和非人灵长类，如狒狒、猿、和黑猩猩。
本领域已知的任何方法均可用于将obR转基因导入动物中，以产生转基因动物的起始系。这些方法包括，但不限于原核显微注射法(Hoppe,PC.和Wagner,-33T.E.,1989，美国专利US 4,873,191)；由逆转录病毒介导的基因向种系中的转入(Van der Putten等，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:6148-6152)；胚胎干细胞中的基因定向(Thompson等，1989,Cell 56:313-321)；胚胎的电穿孔法(Lo,1983，分子细胞生物学(Mol Cell.Biol.)3:1803-1814)；以及精子介导的基因转移(Lavitrano等，1989,Cell 57:717-723)等。为了回顾这此方法，可参阅Gordon,1989，转基因动物(TransgenicAnimals),Intl.Rev.Cytol.115:171-229，该资料被全文收作本文参考。
本发明提供了在其所有细胞中均携带有obR转基因的转基因动物，以及在其某些，而不是所有细胞中都携带有该转基因的动物，即嵌合型动物。所整合的转基因可以是一个转基因，或是多联体，例如，头-头连接或头-尾连接的多联体。还可以将该转基因选择性地导入特定的细胞类型并将其激活，例如，按照Lasko等披露的方法进行(Lasko,M.等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6232-6236)。这种细胞型特异激活所需的调控序列，取决于感兴趣的具体细胞类型，而且，对于本领域技术人员来说是显而易见的。当希望把obR基因的转基因整合到内源obR基因的染色体位点上时，优选基因定向法。简单地讲，当使用这样一种方法时，出于整合的需要设计含有某些与内源obR基因同源的核苷酸序列的载体，通过与染色体序列的同源重组进入内源obR基因的核苷酸序列，并破坏其作用。还可以将转基因选择性地导入特定的细胞类型，并由此仅仅失活该细胞类型中的内源obR基因，例如，通过Gu等披露的方法进行(Gvu等，1994,Science 265:103-106)。这种细胞型特异失活所需的调控序列取决于感兴趣的特定细胞类型，而且，对于本领域技术人员来说是显而易见的。
一旦制备出转基因动物，即可用标准方法测定重组obR基因的表达。初步筛选可以通过Southern印迹分析或PCR技术而实现，对动物组织进行分析，以验证是否也发生了转基因的整合。还可以用如下方法测定转基因在组织中的表达水平，这些方法包括，但不限于对获自动物的组织样品进行Northern印迹分析、原位杂交分析和RT-PCR。还可以用对obR转基因产物特异的抗体通过免疫细胞化学方法对ObR基因表达组织样进行评价。
C..ObR蛋白抗体本发明还涉及能特异识别ObR的一个或几个表位，或ObR的保守变体或ObR的肽片段的表位的抗体。所述抗体包括，但不限于多克隆抗体、单克隆抗体(mAbs)、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab＇)2片段、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(anti-Id)抗体、以及上述任何抗体的表位结合片段。
例如，可将本发明的抗体用于检测生物学样品中的ObR，并因此可被用作诊断或预测方法的一部分，以检测出有异常ObR含量的患者。例如，还可将这些抗体用于在下文的3.5节中所述的化合物筛选方法中，以评价试验化合物对obR基因产物表达和/或活性的影响。另外，还可将这些抗体用于在下文的5.6节中所述的基因治疗方法中，例如，用于在把正常和/或制备出的ObR-表达细胞导入患者体内之前对其进行评估。还可将这种抗体用作抑制异常ObR活性的方法。因而可将所述抗体用作体重疾病治疗方法的组成部分。
为了制备抗体，可以通过注射ObR、ObR肽(例如，相当于所述受体的一个功能域，如ECD、TM或CD的肽)、截短的ObR多肽(其中的一个或几个功能域，如TM或CD已缺失的ObR)、ObR的功能性等同物或ObR突变体的方法使各种宿主动物免疫。所述宿主动物可以包括，但不限于兔、小鼠、和大鼠，仅列举以上几种。为了加强免疫反应，可根据宿主的物种使用各种佐剂，包括，但不限于Freund＇s(完全和不完全)佐剂、诸如氢氧化铝的矿物凝胶，诸如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚的表面活性物质，以及诸如BCG(卡介苗)和小棒杆菌的潜在可用的人的佐剂。多克隆抗体是源于免疫动物血清的抗体分子的异质群体。
单克隆抗体是特定抗原的抗体的均质群体，这种抗体可以用任何方法获得，这些方法以在培养物中延续细胞系的方式产生抗体分子。所述方法包括，但不限于Kohler和Milstein的杂交瘤技术(1975,Nature 256:495-497；和US 4,376,110)，人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等，1983，当代免疫学(Immunology Today)4:72；Cole等，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:2026-2030),和EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985，单抗和癌症治疗(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy),Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)。所述抗体可以是任何类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其所有亚型。可以在体外或体内培养能产生本发明mAb的杂交瘤。在体内生产高效价的mAbs是现有的优选生产方法。
此外，还可以使用为了制备“嵌合型抗体”而发展起来的技术(Morrison等，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855；Neubergor等，1984,Nature,312；604-608；Takeda等，1985,Nature,314:452-454)，该方法是通过剪接源于具有适当抗原特异性的抗体分子的基因和源于具有适当生物学活性的人抗体分子的基因而实现。嵌合型抗体是一种其不同的部分源于不同的动物种的分子，如具有源于鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。
另外，可以改进已知的用于制备单链抗体的方法(US专利4,946,778；Bird,1988,Science 242:423-426；Huston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；和Ward等，1989,Nature 334:544-546)以制备抗obR基因产物的单链抗体。单链抗体是通过由一个氨基酸桥将Fv区的重链和轻链片段连接而形成的一种单链多肽。
可以用已知方法制备能识别特异表位的抗体片段。例如，这些片段包括，但不限于可用胃蛋白酶消化抗体分子而产生的F(ab＇)2片段，以及可通过还原F(ab＇)2片段的二硫键而产生的Fab片段。另外，可以构建Fab表达文库(Huse等，1989,Sciece,246:1275-1281)，以便能快速、方便的鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段。
反过来，又可以将ObR的抗体用于通过本领域技术人员熟知的技术制备“模拟”ObR的抗独特型抗体(例如，参见Greenspam和Bona,1993，美国联邦实验生物学会杂志(FASEB J)7(5):437-444；和Nissinoff,1991,J.Immunol.147(8):2429-2438)。例如，可将能与ObR ECD结合并竞争性抑制Ob与ObR结合的抗体用于制备“模拟”ECD的抗独特型，因此，该抗独特型又能结合并中和Ob。可将上述中和性抗独特型或该抗独特异的Fab片段用于治疗方法中，用于中和Ob并促进体重增加。
D..体重疾病异常性的诊断可将多种方法用于诊断和预测性评估体重疾病，所述疾病包肥胖、恶病质和厌食，并用于确认具有这种疾病诱因的对象。
例如，所述方法可以使用诸如在5.1节中所披露的obR核苷酸序列和在5.3节中所披露的ObR抗体的制剂。具体地讲，可将上述制剂用于诸如(1)检测obR基因的存在，或检测ObR mRNA相对无体重疾病状态而言是过表达还是表达不足；(2)检测相对无体重疾病状态而言obR基因产物过量还是不足；和(3)检测由ObR介导的信号转导途径的干扰或异常性的场合。
例如，本文所披露的方法可以用预先包装好的诊断试剂盒实现，该试剂盒至少含有一种本文所披露的特殊obR-核苷酸序列或ObR抗体制剂，该试剂盒可方便地用于诸如临床试验的场合，以诊断具有体重疾病异常现象的患者。
为了检测obR突变，可将任何具核细胞用作基因组核酸的来源。为了检测ObR基因表达或ObR基因产物，可以使用表达过ObR基因的任何细胞型或组织，如脉络丛细胞。
在下文的5.4.1节中披露了以核酸为基础的检测技术。在5.4.2节中披露了肽检测技术。
1..检测obR基因及转录物可以用多种方法检测出发生在obR基因上的突变。可将来自任何具核细胞的核酸用作这种测定方法的起点，并可以用本领域技术人员熟知的核酸制备方法提取核酸。
可将DNA用于生物学样品的杂交或扩增测试中，以检测与obR基因结构相关的异常性，包括点突变、插入、缺失和染色体重排。所述测试包括，但不限于Southern分析、单链构象多态性分析(SSCP)和PCR分析。
例如，所述用于检测obR基因特异突变的诊断方法可能包括接触并培养荻自诸如源于患者的样品或其它适当细胞来源的含有重组DNA分子、克隆的基因或其简并变体的核酸，和在5.1节中所披露的一种或几种包括重组DNA分子、克隆的基因或其简并变体的标记核酸制剂，培养是在有利于所述制剂与其在obR基因中的互补序列特异退火的条件下进行的。优选的是，所述核酸制剂的长度至少为15-30个核苷酸。在培养之后，将所有未退火的核酸从核酸obR分子杂合体上除去。然后检测杂交过的核酸分子的存在，如果存在这种分子的话。例如，用这种检测方法可将来自感兴趣的细胞类型或组织的核酸固定在诸如薄膜的固相支持物上，或固定在塑料表面上，如微滴定板或聚苯乙烯珠的表面上。在这种情况下，在培养之后，未退火的、在5.1节中所述类型的标记核酸制剂容易被清除。对保留的、退火的、标记的ObR核酸制剂的检测可以用本领域技术人员熟知的标准方法完成。可将与所述核酸制剂退火的ObR基因序列与根据正常ObR基因序列预测的退火模式加以比较，以确认是否存在ObR基因突变。
用于检测患者样品或其它合适细胞来源中的ObR基因特异性核酸分子的其它诊断方法可能包括对该分子进行扩增，例如，通过PCR(由Mullis,K.B.,1987，在US 4,683,202中提出的实验方案)方法扩增，然后用本领域技术人员熟知的方法检测扩增的分子。可将所得到的扩增序列与根据当扩增的核酸中仅含有正常拷贝的obR基因时所预期的序列加以比较，以确定是否存在obR基因突变。
另外，可以用众所周知的基因型分类方法鉴定带有obR基因突变的个体。例如，这类方法包括限制性片段长度多态性(RFLP)的使用，其中涉及所使用的特定限制酶的识别位点之一的序列变化。
另外，所披露的可用于鉴定obR基因突变的分析DNA多态性的改进方法，利用的是限制酶位点之间可变数量的短的、串联重复的DNA序列的存在。例如，Weber(US 5,075,217，其全文被收作本文参考)披露了一种DNA标记，该标记是基于(dC-dA)n-(dG-dT)n短串联重复模序的长度多态性。估计(dC-dT)n-(dG-dT)n模序的平均长度为30,000-60,000bp。排列如此紧密的标记具有高频率的共遗传性，而且在诸如obR基因的突变的遗传突变的鉴定和与obR突变相关的疾病和异常的诊断方面极为有用。
另外，Caskey等(US 5,364,759，其全文被收作本文参考)披露了一种用于检测短的3核苷酸和4核苷酸重复序列的DNA分布测定。该方法包括提取诸如obR基因的感兴趣的DNA，扩增所提取的DNA，以及标记重复的序列，从而作出有关个体的DNA的基因型图。
还可以通过检测并测定obR转录测定obR基因的表达水平。例如，可以分离已知的或被怀疑能表达obR基因的细胞类型组织，如脑、尤其是脉络丛细胞的RNA，并用上文所披露的杂交和PCR方法进行测定。所分离的细胞可以源于细胞培养物或患者体内。对取自培养物的细胞进行分析可能是对细胞进行测定的必要步骤，该细胞被用作基于细胞的基因治疗方法的一部分，或被用于检测化合物对ObR基因表达的影响。上述分析可以揭示obR基因表达方式的定量及定性特征，包括obR基因表达的激活或失活。
在所述检测方法的一种实施方案中，cDNA是由感兴趣的RNA合成的(例如，将RNA分子逆转录成cDNA)。然后将该cDNA上的一段序列用作核酸扩增反应，如PCR扩增反应等的模板。在该方法的逆转录和核酸扩增步骤中被用作合成起始试剂(如引物)的核酸试剂是从披露于5.1节的obR核酸试剂中选择的。这种核酸试剂的长度优选为9-30个核苷酸。为了检测扩增产物，可以用放射性标记的或非放射性标记的核苷酸。另外，要制备足够的扩增产物，以便能通过标准的溴化乙锭染色或通过其它合适的核酸染色方法显现该产物。
另外，还可以“在原位”进行obR基因表达的测定，即直接测定在活体解剖或切除术中获得的患者组织的组织切片(固定的和/或冷冻的)。可将披露于5.1节中的核酸试剂用作这种原位方法的探针和/或引物(例如，参见Nuovo,G.J.,1992，“原位杂交PCR方法和应用(PCR In Situ Hybridization:Protocols And Applications)”Raven Press,NY)。
另外，如果能得到足够数量的适当细胞，则可以实施标准Northern分析，以测定obR基因的mRNA表达水平。
2..检测obR基因产物在上文的5.3节中所披露的抗野生型obR基因产物或其保守性变体或肽片段的抗体还可用于本节所述的体重疾病诊断和预测方法中。可将这种诊断方法用于检测ObR基因表达水平上的异常性，或ObR在结构和/或时序、组织、细胞或亚细胞定位方面的异常性，并可以在体内或体外，如在活体解剖组织上实施该方法。
例如，可将抗ObR ECD表位的抗体用于体内检测ObR在体内的表达型式和表达水平。可以用诸如不透射线的或其它合适的化合物标记所述抗体，并将其注射到受治对象体内，以便用诸如X-射线、CAT-扫描或MRI的方法显现其与体内表达的ObR的结合。标记过的抗体片段，例如，含有抗原结合区的最小部分的Fab或单链抗体可优选用于促进血脑屏障交联的目的，并能够标记在脉络丛中表达的ObR。
另外，任何能检测到其存在的ObR融合蛋白或ObR缀合蛋白均可以服用。例如，可以服用由不透射线的或其它合适化合物标记的ObR融合或缀合蛋白，并进行体内显现，如上文结合标记的抗体所做说明。可将诸如AP-Ob或Ob-AP融合蛋白的其它融合蛋白用于体外诊断方法中。
另外，还可将上述免疫测定或融合蛋白的检测测定用于活体解剖和尸体解剖样品的体外测定，以评价ObR的表达型式。所述测定并不局限于使用限定ObR ECD的抗体，而且还可包括使用针对ObR的任何功能域，如ECD、TM和/或CD的表位的抗体。所述每一种或所有标记抗体的使用，可提供有关ObR翻译和朝向细胞表面的胞内转运的有用信息，并可以鉴定其在加工方面的缺陷。
接受分析的组织或细胞类型通常包括已知的或被怀疑能表达ObR基因的组织或细胞，例如，脉络丛细胞。例如，本文所使用的蛋白提取方法，可以是诸如由Harlow和Lane所披露的方法(Harlow,E.和Lane,D.,1988,“Antibodies:ALaboratory Manual”,Cold Spring Harber Laboratory Pross,Cold Spring Harbor,New York)，该书被全文收作本文参考。所分离的细胞可源于细胞培养物或源于患者。对来自培养物的细胞进行分析是评价细胞的一个必要步骤，该细胞可被用作基于细胞的基因治疗方法的一部分，或用于检验化合物对obR基因表达的影响。
例如，可以在本发明中使用的诸如在上文的5.3节中披露的抗体，或抗体片段可被用于定量或定性检测obR基因产物或其保守性变体或肽片段的存在。例如，这一目的可以这样实现通过采用荧光标记的抗体(参见本节以下的内容)的免疫荧光技术，同时结合光学显微检测、流式细胞计量术或荧光测定。当obR基因产物被表达于细胞表面上时，上述方法尤其适用。
可用于本发明的抗体(或其片段)或Ob融合蛋白或缀合蛋白，还可用于组织学测定，如免疫荧光、电子显微或非免疫测定，用于原位检测obR基因产物或其保守性变体或肽片段，或用于Ob结合(针对标记过的Ob融合蛋白)。
原位检测可以这样实现从患者体内取出组织学样品，并将本发明的标记抗体或融合蛋白涂在样品上。最好通过将标记过的抗体(或片段)涂在生物学样品样上的方式使用所述抗体(或片段)或融合蛋白。采用上述方法不仅可以测定obR基因产物或保守性变体或肽片段的存在，或Ob结合的存在，而且可以测定其在检查的组织中的存在。通过使用本发明，本发明普通技术人员将很容易领会到，可以对多种组织学方法(如染色方法)中的任一种加以改进，以便实现所述原位检测。
对ObR基因产物或其保守性变体或肽片段的免疫测定和非免疫测定，通常包括在有能确认obR基因产物或其保守性变体或肽片段的可检测的标记抗体存在的条件下培养诸如生理液体、组织提取物、新采集的细胞或在细胞培养物中培养过的细胞的裂解液的样品，和通过多种本领域公知技术中的任一种检测结合抗体。
可以使所述生物学样品接触并固定在诸如硝酸纤维素膜的固相支持物或载体上，或固定在其它能固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白的固相支持物上。然后可以用合适的缓冲液洗涤所述支持物，然后再用可检测地标记过的ObR抗体或Ob融合蛋白进行处理。接着，用所述缓冲液再次洗涤所述固相支持物，以除去未结合的抗体或融合蛋白。然后，可以用常规方法测定固体支持物上的结合标记物的量。
“固相支持物或载体”是指能够结合抗原或抗体的任何支持物。众所周知的支持物包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。对于本发明来说，所述载体的性质或者有一定程度的可溶性或是不溶性的。实际上，所述支持材料可以为任何可能的结构构型，只要所连接的分子能够与抗原或抗体结合即可。因此，所述支持物构型可以是球形的，如呈球状，或为筒状，如在试管的内表面或棒的外表面。另外，其表面可以是平的，如板、试条等。优选的支持物包括聚苯乙烯球。本领域技术人员可以理解，用常规实验方法可以确定很多其它适于结合抗体或抗原的载体。
可以用公知方法测定特定的多种ObR抗体或Ob融合蛋的白结合活性。本领域技术人员通过常规实验方法确定每一种测定的可操作的和最佳测试条件。
就抗体而言，对ObR抗体进行可检测地标记的方法之一是将其同一种酶连接，并将其用于酶免疫测定(EIA)中(Voller,A.，“酶联免疫吸附检测(TheEnzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA))”,1978,Diagnostic Horizons2:1-7,Microbiological Associates Quarterly Publication,Walkersvslle,MD；Voller,A.等，1978，临床病理学(J.Clin.Pathol.)31:507-520；Butler,J.E,1981,Meth.Enzyme.73:482-523；Maggio,E.(著)，1980，酶免疫检测(Enzyme lmmuno-assay),CRC Press,Boca Raton,FL；Ishikawa,E.等，(著)，1981,Enzyme,Immunoassay,Kgakushoin,Tokyo)。所述与抗体结合的酶可以和适当的底物，优选为显色底物反应，以生成能通过诸如分光光度装置、荧光测定装置或目测装置检测到的化学成分。可用于可检测地标记抗体的酶包括，但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油盐，脱氢酶、磷酸三糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。检测过程可以通过比色法实现，该方法使用特定酶的一种显色底物。检测过程还可以通过目测比较某种底物的酶促反应程度和以类似方法制备的标准物的反应程度而实现。
检测还可以用多种其它免疫测定方法中的任一种而实现。举例来说，通过放射性方法标记抗体或抗体片段，可以用放射免疫测定(RIA)方法检测ObR(例如，参见Weintraub,B.，放免原理，放射配体格测技术的第七次培训教程(Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques),The Endocrine Society,1986年3月，该资料被收作本文参考)。可通过诸如使用γ-计数器或闪烁计数器的方法或放射性自显影法检测放射性同位素。
还可以用荧光化合物标记所述抗体。当用荧光标记过的抗体遇到波长合适的光照时，就可通过荧光检测到它的存在。最常用的荧光标记化合物有荧光素异硫氰酸盐、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。
还可用诸如152Eμ或镧系其它成员的荧光发光金属对抗体进行可检测地标记。可以用诸如二乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团将所述金属连接在抗体上。
还可以通过连接化学发光化合物的方法对所述抗体进行可检测地标记。然后通过检测发光现象确定化学发光标记抗体的存在，所述发光现象是在化学反应过程中发生的。特别有用的化学发光标记化合物的例子有鲁米诺、异鲁米诺、theromatic acridinium ester、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
类似地，还可将生物发光化合物用于标记本发明的抗体。生物发光是存在于生物系统中的一种化学发光，其中，一种催化性蛋白可提高化学发光的效率。通过测定发光现象测定生物发光蛋白的存在。可用于标记目的的重要生物发光化合物有荧光素、荧光素酶和水母素。
E..能调节ObR表达或活性的筛选测定设计以下测定是为了鉴定如下化合物能与ObR(包括，但不限于ObR的ECD或CD)相互作用(如与之结合)的化合物，能与可以和ObR(包括，但不限于ObR的TM或CD)相互作用的胞内蛋白相互作用(如与之结合)的化合物，能干扰ObR与参与ObR-介导的信号转导的跨膜蛋白或胞内蛋白的相互作用的化合物，以及能调节obR基因活性(即调节ObR基因表达水平)或调节ObR水平的化合物。还可以使用鉴定能与ObR基因调控序列(如启动子序列)结合的化合物和能调节ObR基因表达的化合物的测定方法。例如，参见Platt,K.A.,1994,J.Biol.Chem.269:28558-28562，该资料被全文收作本文参考。
可以根据本发明进行筛选的化合物包括，但不限于肽，抗体及其片段，以及其它能与ObR的ECD结合并模拟由天然配体(即激动剂)触发的活性或抑制由天然配体(即拮抗剂)触发的活性的有机化合物(例如，肽模拟物)；以及肽，抗体或其片段，和其它能模拟ObR的ECD(或其一部分)并能结合和“中和”天然配体的有机化合物。
所述化合物可以包括，但不限于诸如可溶性肽的肽，包括，但不限于随机肽文库的成员(例如，参见Lam,K.S.等，1991,Nature 354:82-84；Houghten,R.等，1991,Nature 354:84-86)；由D型和/或L型构型的氨基酸组成的组合型化学衍生的分子文库；磷酸肽(包括，但不限于随机的或部分简并的定向磷酸肽文库；例如，参见Songyang,Z.等，1993,Cell 72:767-778)；抗体(包括，但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、抗独特性抗体、嵌合型或单链抗体、和FAb、F(ab＇)2和FAb表达文库片段，及其表位结合片段)，以及小型有机或无机分子。
可以用本发明方法筛选的其它化合物包括，但不限于能够通过血脑屏障进入适当细胞(例如，脉络丛或下丘脑细胞)、并影响obR基因或与ObR信号转导途径有关的某些其它基因的表达(例如，通过与参与基因表达的调控区或转录因子相互作用)的小型有机分子；或能影响ObR活性(例如，通过抑制或加强CD的酶促活性)或与ObR信号转导相关的某些其它胞内因子，如gp130的活性的化合物。
计算机模拟和检索技术可用于化合物鉴定，或改进已鉴定的能调节ObR表达或活性的化合物。已鉴定到这样的化合物或组合物，其活性位点或区域已被鉴定。所述活性位点通常是配体结合位点，Ob与ObR本身的相互作用域。所述活性位点可以用本领域已知方法鉴定，例如，包括基于肽的氨基酸序列、核酸的核苷酸序列或对相关化合物或组合物与其天然配体的复合体所做的研究进行鉴定。在后一种情况下，可以用化学或X-射线晶体学方法发现活性位点，其是通过寻找因子上复合的配体的存在位置而进行。
然后，测定活性位点的三维几何结构。这一目的可通过包括X-射线晶体学在内的已知方法而实现，该方法可以测定完整的分子结构。另一方面，可以用固相或液相NMR方法测定某些分子内距离。可以使用任何结构测定的其它实验方法来测定部分或整个几何结构。在测定几何结构时，可以使用天然或人工的复合配体，该配体可以提高活性位点测定的精度。
如果测得一种不完全的或不够精确的结构，可以用基于计算机的数字模拟方法来完善其结构或提高其精度。可以使用一切识别模拟方法，包括专用于特定生物聚合物，如蛋白或核酸的参数模拟，基于计算分子运动的分子动态模拟，基于热集团的统计力学模拟或复合模拟，对于大部分类型的模型来说，标准分子力场表示组成性原子和基团之间所必需的力，并可以从物理化学中已知的力场中力加以选择。不完全的或不够精确的实施结构可被用作由上述模拟方法计算出来的完整的、更精确的结构的限制。
最后，在通过实验方法、模拟方法或其综合方法测定了活性位点的结构之后，通过检索包括化合物及其分子结构信息的数据库，可以确定能候选的调节化合物。上述检索所找到的化合物的结构与测定的活性活点结构相吻合，并能与构成该活性位点的基团相互作用。上述检索可以人工完成，但最好由计算机辅助完成。通过检索所发现的化合物为潜在的ObR调节化合物。
另外，还可将上述方法用于从已知的调节化合物或配体中鉴定改进的调节化合物。可以改变已知化合物的组成，并可以用上述实验和计算机模拟方法对新的组成进行分析，以测定这种改变的结构效应。然后将改变了的结构与该化合物的活性位点结构加以比较，以确定是否取得了改进的适用性或相互作用效果。用这种方法可以快速评估组成的系统性变化，例如侧基的改变，以获得具有提高了的特异性或活性的改进的调节化合物或配体。
对于本领域技术人员来说，可用于根据Ob、ObR和相关的转导和转录因子的活性位点鉴定的其它实施和计算机模拟方法是显而易见的。
分子模拟系统的例子有CHARMm和QUANTA程序(PolygenCorporation,Waltham,MA)。CHARMm执行能量最低化和分子动力学功能。QUANTA执行分子结构的构建、作图模拟和分析功能。QUANTA可以完成对各分子之间相互作用的构建、修饰、显现和行为分析。
有很多文章对药物与特异蛋白的相互作用的计算机模拟进行了综述，例如，Rotivinen等，1988,Acta Pharmaceutical Fenmica 97:159-166；Ripka，新科学家(New Scientist)54-57(June 16,1988)；Mckinaly和Rossmanm,1989，药学，毒理学年度综述(Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.)29:111-122；Pemy和Davies，药物设计中的结构-活性定量关系(OSAR:Quantrtative Structure-Activity Relationships in Drug Design)pp.189-193(Alan R.Liss,Inc.1989)；Lewis和Dean,1989Proc.R.Soc.Lond.236:125-140和141-162；有关核酸成分的模型受体，可参考Askew等，1989,J.Am.Chem.Soc.111:1082-1090。可用于筛选并图解说明化合物的其它计算机程序可由诸如BioDesign,Inc.(Pasadena,CA)、Allelix,Inc.(Mississauge,Omario Canada)和Hypercube,Inc.(Cambridge,Ontario)的公司提供。虽然这些程序的设计主要是用于对特定蛋白特异的药物的，但也可将其修改成针对DNA或RNA的区域特异的药物，一旦所述区域得以鉴定的话。
尽管以上说明是就设计并制备可以改变结合的化合物而言，但也可用于筛选已知化合物文库，其中包括天然产物或合成化合物，以及包括蛋白在内的生物活性材料，以寻找到可作为抑制剂或激活剂的化合物。
通过诸如本文所披露的测定方法所鉴定的化合物可用于诸如阐明obR基因产物的生物学功能和用于缓解体重疾病的目的。在下文的5.5.4节中将讨论用于检测由诸如5.5.1至5.5.3节所述方法鉴定的化合物的作用的测定方法。
1..能与ObR结合的化合物的体外筛选测定为了鉴定能与ObR(包括，但不限于ObR的ECD、或CD)相互作用(例如，与之结合)的化合物，可以设计体外系统。例如，所鉴定的化合物可用于调节野生型和/或突变型obR基因产物的活性；可用于阐明ObR的生物学功能；可用于筛选能破坏正常的ObR相互作用的鉴定化合物；或由其本身破坏这种相互作用。
用于鉴定能与ObR结合的化合物的测定方法的原理包括制备ObR与试验化合物的反应混合物，在足于使以上两个部分相互作用并结合的条件下和反应时间里反应，以形成可以从该反应混合物中清除和/或检测到的复合物。所用的ObR类型可根据筛选测定的目的而有所变化。例如，在寻找天然配体的激动剂时，可以使用全长ObR或可溶性截短ObR，如，其分子中缺失了TM和/或CD的ObR，相当于ECD的肽或含有与有利于该测定系统(例如，所得到的复合物的标记、分离等)的蛋白或多肽融合的ObR ECD的融合蛋白。一旦鉴定所寻找的能与所述胞质域相互作用的化合物，就可以使用相当于ObR CD的肽和含有ObR CD的融合蛋白。
可以多种方式实施所述筛选测定。例如，实施上述测定的一种方法包括将ObR蛋白、多肽、肽或融合蛋白或试验化合物固定在一种固相上，并在反应结束时测定固定在所述固相上的ObR/试验化合物复合物。在所述方法的一种实施方案中，可将ObR反应剂固定在一种固体表面上，而未被固定的试验化合物可进行直接或间接固定。
在实践中，微量滴定板可被方便地用作所述固相。被固定的组分可以是通过非共价或共价结合而固定的。非共价结合可以通过将蛋白溶液简单地涂在固体表面上并干燥而实现。另外，可以用对待固定的蛋白特异的固定化抗体，优选为单克隆抗体，把所述蛋白固定在固体表面上。可事先制备好所述固体表面待用。
为了实施所述测定，将非固定化的组分加到含有该固定组分的涂层表面上。在反应结束之后，除去未反应的组分(例如，用洗涤方法)，其作业条件为使所有形成的复合物仍固定在固体表面上。可以用多种方法完成对固定在固体表面上的复合物的检测。如果对事先未固定的组分进行预标记的话，检测到固定在固体表面上的标记即表明形成了复合物。如果不对事先未固定的组分进行预标记的话，则可以用一种间接标记来检测固定在固体表面上的复合物，例如，用对所述事先未固定的组分特异的标记抗体(该抗体可以是用标记过的抗-Ig抗体直抗或间接标地标记的)。
另外，可以在液相中进行反应，将反应产物和未反应的组分分离，并检测复合物；例如，用对ObR蛋白、多肽、肽或融合蛋白或试验化合物特异的固定化抗体固定生成于溶液中的一切复合物，并用对有可能生成的复合物的其它组分特异的标记抗体检测被固定的复合物。
另外，可以用基于细胞的测定鉴定能与ObR相互作用的化合物。为此，可以使用能表达ObR的细胞系或通过遗传工程方法产生的(例如，通过ObRDNA转染或转导)能表达ObR的细胞系(例如，COS细胞、CHO细胞、成纤维细胞等)。可以通过与天然Ob比较或竞争的方式测定试验化合物与诸如由宿主细胞表达的obR ECD的相互作用。
2..测定能与ObR相互作用的胞内蛋白任何适用于测定蛋白与蛋间相互作用的方法均可用于鉴定能与ObR相互作用的跨膜蛋白或胞内蛋白。可以使用的常规方法有共免疫沉淀、交联，以及通过梯度柱或层析柱对细胞裂解液或获自细胞裂解液的蛋白和ObR进行共纯化，以鉴定所述裂解液中能与ObR相互作用的蛋白。为了进行上述测定，所使用的ObR组分可以是全长ObR、缺乏膜固着区(membrane-anchoringregion)的可溶性衍生物(例如，一种截短的ObR，其中的TM已缺失，所产生的截短分子含有与CD融合的ECD)、相当于CD的肽或含有ObR的CD的融合蛋白。一旦分离到这种胞内蛋白，即可对其进行鉴定，然后再将其用于标准方法中鉴定能与它相互作用的蛋白。例如，用本领域技术人员所熟知的技术，例如，通过Edman降解技术(例如，参见Creighton,1983，“蛋白质结构和分子原理(Proteins:Structures and Molecular Principles)”,W.H.Freeman & Co.,N.Y,pp.34-49)至少能测定与ObR相互作用的胞内蛋白的部分氨基酸序列。所得到的氨基酸序列可用于指导能被用于筛选编码所述胞内蛋白的基因序列的寡核苷酸混合物的制备。例如，可以用标准杂交或PCR技术实现筛选。用于制备寡核苷酸混合物和筛选的技术是众所周知的(例如，参见Ausubel的著述，同上，和PCR方法方法和应用指南(PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications),1990 Innis,M.等著，Academic Press,Inc.,New York)。
另外，可以采用能同时鉴定编码能与ObR相互作用的跨膜蛋白或胞内蛋白的基因的方法。例如，所述方法包括以与公知的入gtl1文库抗体检测技术类似的方法，用标记的ObR蛋白、或ObR多肽、肽或融合蛋白，例如，与一种标记(如酶、荧光剂、发光蛋白或染料)融合的ObR多肽或ObR功能域、或Ig-Fc功能域检测表达、文库。
详细披露了一种用于体内检测蛋白相互作用的方法双杂交系统，但其用意仅在于说明，而不是限定。该系统的一种型式业已披露(Chien等，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:9578-9582)并可通过商业途径从Clontech(Palo Alto,CA)获得。
简单地讲，用上述系统构建编码两种杂合蛋白的质粒一种质粒由编码转录激活蛋白的DNA结合域的核苷酸和与之融合的编码ObR、ObR多肽、肽或融合蛋白的核苷酸序列组成，而另一种质粒由编码所述转录激活蛋白的激活域的核苷酸和与之融合的编码一种未知蛋白的、作为cDNA文库的一部分重组进入该质粒的cDNA组成。将所述DNA-结合域融合质粒和cDNA文库转入一种酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)菌株，该菌株具有一个报道基因(例如，HBS或lacZ)，其调控区含有转录激活物结合位点。仅有任一种杂合蛋白都不能激活该报导基因的转录DNA-结合域的杂交不能实现，因为它不能产生激活功能，激活域的杂交也不能实现，因为它不能定位于激活物结合位点。两种杂合蛋白的相互作用可以重建功能性激活蛋白，并导致所述报导基因的表达，通过测定报导基因产物可以检测出该基因的表达。
可将上述双杂交系统或相关方法用于筛选能与“诱铒”基因产物相互作用的蛋白的激活域文库。举例来说，而不是要进行限定，可将ObR用作诱铒基因产物。将全基因组或cDNA序列同编码激活域的DNA融合。将该文库和编码与所述DNA结合域融合的杂合诱饵obR基因产物共转化到酵母报导菌株中，并筛选所得到的能表达该报导基因的转化体。例如(其用意不是限定)，可以将诸如在图1、图3或图6中示出的obR(或obR的一个功能域)的开放读框的诱饵obR基因序列克隆到一种载体上，以使其可翻译地融合于编码GAL 4蛋白的DNA-结合域的DNA上。纯化所述克隆，并提取决定报导基因表达的文库质粒。然后用DNA测序方法鉴定由该文库质粒编码的蛋白。
然后，可以用本领域经常采用的方法构建所述细胞系的cDNA文库，可用该文库检测能与诱饵基因产物相互作用的蛋白。例如，按照本文所披露的特定系统，可将所述cDNA片段插入一种载体，以使其可翻译地与GAL 4的转录激活域GAL 4融合。可将该文库随诱饵ObR基因-GAL 4融合质粒一起共转化到含有lacZ基因的酵母菌株中，该基因由含有GAL 4激活序列的启动子启动。将一种由cDNA编码的蛋白与能与诱饵ObR基因产物相互作用的GAL 4翻译激活域融合，可以重建一种活性GAL 4蛋白，并因此启动HIS3基因的表达。通过其在含有缺少组氨酸的半固体琼脂基培养基的培养皿上的生长，可以测定能表达HIS3的克隆。然后从这些菌株中纯化cDNA，并将其用于通过本领域常用的方法制备并分离所述诱铒obR基因相互作用蛋白。
3.测定能干扰ObR/胞内或ObR/跨膜大分子的化合物相互作用所述能与ObR相互作用的大分子在本文中是指“结合配偶体”。所述结合体配偶体很可能与ObR信号转导途径有关，并因此参与ObR对体重的调节。因此，希望鉴定能干扰或破坏上述结合配偶体与Ob的相互作用的化合物，可将该化合物用于调节ObR活性并控制与ObR活性相关的体重疾病。
用于鉴定能干扰ObR与其配偶体之间的相互作用的测定系统的基本原理包括制备一种反应混合物，该混合物含有在上文的5.5.1节和5.5.2节中所披露的ObR蛋白、多肽、肽或融合蛋白，以及所述结合配偶体，反应是在使以上两种组分相互作用并结合成复合物的条件下进行，并反应足够的时间。为了试验一种化合物的抑制活性，在有和没有该试验化合物的条件下制备反应混合物。试验化合物可在一开始即包含于反应混合物中，或在加入ObR组分及其配偶体一段时间之后再加入。对照反应混合物是在没有试验化合物的条件下培养或与空白对照剂一起培养。然后检测由ObR组分和结合配偶体所生成的任何复合物。在对照反应中可生成复合物，但在含有试验化合物的反应混合物中不能，这表明所述试验化合物能干扰ObR与其互作型结合配偶体的相互作用。另外，可将在含有试验化合物和正常ObR蛋白的反应混合物中的复合物生成与在含有试验化合物和突变型ObR的反应混合物中的复合物生成加以比较。在希望鉴定能破坏突变型ObR，而不是正常ObR的相互作用的条件下，这种比较可能很重要。
能干扰ObR及其结合配偶体的相互作用的测定可以异相或均相型式进行。异相测定包括将ObR组分的产物或其结合配偶体固定在一种固相上，并在反应结束时检测固定在该固相上的复合物。在均相测定中，整个反应是在液相中进行的。在每一种方法中，反应物的加入顺序可以改变，以获得有关被试验化合物的不同资料。例如，通过在有试验物质的条件下进行反应可以鉴定能通过竞争作用干扰其相互作用的试验化合物；即在加入ObR组分和可相互作用的结合配偶体之前或同时加入试验物质。另外，通过在复合物生成之后将试验化合物加入反应混合物中的方法可以检验能破坏预先生成的复合物的试验化合物，例如，有高结合常数的化合物，它能将复合物中的一种成分排斥出去。下面将对各种方法作扼要说明。
在异相测定系统中，将ObR组分或可相互作用的结合配偶体固定在固体表面上，而对未固定的一类组分进行直接或间接标记。在实践中，经常使用微量滴定板。被固定的组分可以是通过非共价键或共价键结合固定化的。非共价结合可以通过简单地将obR基因产物或结合配偶体的溶液涂在固体表面上并干燥而实现。另外，可以用对待固定的组分特异的固定化抗体将该组分固定在固体表面上。该表面可事先制备并贮存待用。
为了进行所述测定，让固定组分的配偶体在有或没有试验化合物的条件下接触涂过的表面。在反应结束后，将未反应的组分除去(例如，通过洗涤)，所生成的一切复合物将仍然固定在所述固体表面上。可以用多种方法实施对固定在固体表面上的复合物的检测。在对非固定的组分作过预先标记的情况下，通过检测固定在所述表面上的标记物可以表明复合物的生成。在未对非固定的组分进行预先标记的情况下，可以用一种直接标记物检测固定在所述表面上的复合物；例如，使用一种对开始时非固定的组分特异的标记抗体(该抗体是用标记过的抗-Ig抗体直接或间接标记过的)。根据反应组分的加入顺序，可以检测出能抑制复合物生成或破坏预先生成的复合物的试验化合物。
另外，可以在液相中，在有或没有试验化合物的条件下进行反应，将反应产物和非反应的组分分离，并检测复合物；例如，用对结合组分之一特异的固定化抗体固定溶液中所生成的任何复合物，并用一种对另一个配偶体特异的标记抗体检测固定的配偶体。同样，根据向液相中加入反应物的顺序，可以鉴定能抑制复合物或能破坏预先生成的复合物的化合物。
在本发明的另一种实施方案中，可以采用均相测定。在该方法中，制备一种由ObR组分和可相互作用的结合配偶体组成的预先生成复合物，其中的ObR或其结合配偶体是预先标记过的，但由标记物所产生的信号因复合物的生成而被猝灭(例如，参见Rubenstein的美国专利US 4,109,496，该专利使用这种方法进行免疫测定)。加入能竞争并排斥预先生成的复合物中的一种组分的试验物质，会导致出现高于背景的信号。通过这种方法可以鉴定能破坏ObR/胞内结合配偶体相互作用的试验物质。
在一种具体实施方案中，可制备一种用于固定的ObR融合体。例如，可以用诸如pGEX-5X-1的融合载体将ObR或诸如与CD相当的肽片段融合于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因上，用这种方法保留其在所产生的融合蛋白中的结合活性。可以用在上文的5.3节中所述的本领域中常用的方法纯化可相互作用的结合配偶体，并制备单克隆抗体。例如，可以用本领域中常用的方法用放射性同位素125I标记所述单克隆抗体。例如，在异相测定中，可将GST-ObR融合蛋白固定在谷胱甘肽-琼脂糖颗粒上。然后在有或没有试验化合物的条件下，以使得相互作用和结合能够发生的方式加入可相互作用的结合配偶体。在反应时间结束后，可将未结合的材料洗去，并可将标记过的单克隆抗体加入该系统中，使其与复合的组分结合。通过测定仍然与谷胱甘肽-琼脂糖球结合的放射性活性量，可以测定obR基因产物与可相互作用的结合配偶体之间的相互作用。试验化合物对上述相互作用的成功抑制可导致所测得放射性活性的下降。
另外，可以在没有固体谷胱甘肽-琼脂糖颗粒的条件下在液体中混合GST-ObR融合蛋白和可相互作用的结合配偶体。可以在以上组分相互作用期间或之后加入试验化合物。然后将该混合物加入谷胱甘肽-琼脂糖颗粒中，并洗去未结合的材料。同样，可通过加入标记过的抗体并测定与所述颗粒相关的放射性活性的方法检测对ObR/结合配偶体相互作用的抑制程度。
在本发明的另一种实施方案中，可以用相当于ObR和/或可相互作用或结合的配偶体(此时该结合配偶体是蛋白)的结合域的肽片段取代一种或两种全长蛋白，实施相同的技术。可以用本领域中常用方法的任一种鉴定并分离结合位点。所述方法包括，但不限于诱变编码所述蛋白之一的基因，并通过共免疫沉淀测定对结合的破坏作用。然后可以选择编码复合物中第二种组分的基因的补偿突变。对编码相应蛋白的基因所作的序列分析将揭示出相应于参与相互作用结合的蛋白区域的突变。另外，可以用上述方法将一种蛋白固定在一种固体表面上，并使其相互作用于并结合于其标记过的结合配偶体上，该结合配偶体曾用诸如胰蛋白酶的蛋白酶处理过。在洗涤之后，一种短的、含有所述结合域的标记过的肽仍保持与固相材料结合，可以分离并通过氨基酸测序鉴定该肽。而且，一旦得到编码胞内结合配偶体的基因，即可制备出能表达所述蛋白的肽片段的短的基因片段，然后可测试其结合活性并进行纯化或合成。
例如(不是出于限定目的)，可以通过制备GST-ObR融合蛋白并使其结合于谷胱甘肽琼脂糖颗粒上而将obR基因产物固定在一种如上所述的固体材料上。可以用诸如35S的放射性同位素标记可相互作用的结合配偶体，并用诸如胰蛋白酶的蛋白酶进行裂解。然后将裂解产物加入固定的GST-ObR融合蛋白中，并使其结合。在洗去未结合的肽之后，可以用众所周知的方法洗脱代表胞内结合配偶体结合域的标记过的结合材料，纯化、并分析其氨基酸序列。可以通过合成方法生产所鉴定的肽，或用重组DNA技术将其融合在合适的易化蛋白。
4..鉴定能缓解体重疾病的化合物的测定方法可以检测包括，但不限于通过诸如在上文的5.5.1至5.5.3节中所披露的测定方法鉴定的化合物在缓解包括肥胖在内的体重疾病综合症方面的能力。上述测定方法可以鉴定影响ObR活性的化合物(例如，能与ObR结合、抑制天然配体结合，和激活信号转导(激动剂)或封阻激活作用(拮抗剂)的化合物，和能与ObR的天然配体结合并中和配体活性的化合物)；或能影响obR基因活性的化合物(通过影响obR基因的表面，包括分子，例如，能影响或干扰剪接过程的蛋白或小的有机分子，以便调节全长或截短型式的ObR的表达)。不过，应当指出的是，所披露的测定方法还可用于鉴定能调节ObR信号转导的化合物(例如，能影响下游信号转导过程的化合物，如酪氨酸激酶或磷酸酶活性的抑制剂或增强剂，所述酶参与由Ob与ObR结合而激活的信号转导)。能影响ObR信号转导途径的另一步骤的化合物的鉴定和使用也属于本发明范畴，其中，obR基因和/或obR基因产物参与了这一途径，并可以通过影响这一途径来调节ObR对体重疾病发展的影响。所述化合物可被用作治疗体重疾病方法的一部分。
本发明涉及基于细胞和基于动物模型的、用于鉴定具有减轻体重疾病综合症能力的化合物的测定方法。所述基于细胞的测定系统还可被用作测定天然配体Ob，包括重组或合成产生的Ob和Ob突变体的纯度和效力的“金标准(gold standard)”。
可将基于细胞的系统用于鉴定能起到缓解体重疾病综合症作用的化合物。例如，所述细胞系统可以包括重组或非重组细胞，如能表达obR基因的细胞系。例如，可以使用脉络丛细胞、下丘脑细胞或源于脉络丛或下丘脑的细胞系。另外，可将通过遗传工程方法产生的能表达功能性ObR可效应于通过天然Ob配体的激活作用的表达宿主细胞(例如，COS细胞、CHO细胞、成纤维细胞)用作测定的终止，例如，通过化学或表型变化、另一个宿主细胞基因诱导、离子流动的变化(例如，Ca+)+、宿主细胞蛋白酪氨酸磷酸化等的测定而实现。
在使用所述细胞系统时，用被怀疑具有缓解体重疾病综合症的能力的化合物处理细胞，化合物的浓度高到、而且处理时间长到足于诱发被处理的细胞产生这种体重疾病的缓解作用。处理之后，对细胞进行测定，以测定obR基因表达的变化，例如，测定细胞裂解液中的obR mRNA转录物(例如，通过Northern分析法)或测定细胞中ObR蛋白的表达；能调控或调节obR基因表达的化合物是治疗剂的优良候选对象。另外，对细胞进行检查，以确定是否有一种或几种体重疾病样细胞表型已变得接近更正常或更野生的表型、非体重疾病表型或一种更倾向于产生低发病率或严重度的疾病综合症的表型。另外，可以测定ObR作为其一个部分的信号转导途径的组分的表达和/或活性，或ObR信号转导途径本身的活性。
例如，在照射之后，通过与源于未照射过的对照细胞的裂解液进行比较测定处理细胞裂解液中宿主细胞蛋白的酪氨酸磷酸化的存在。在上述测定系统中，试验化合物抑制宿主细胞蛋白酪氨酸磷酸化的能力表明，该试验化合物能抑制由ObR激活作用起动的信号转导。可用Western印迹法对细胞裂解液进行方便地测定；即通过凝胶电泳分离宿主细胞、转移并用一种抗-磷酸酪氨酸检测抗体(例如，用诸如放射性标记物、荧光剂、酶等的信号发生化合物标记过的抗-磷酸酪氨酸抗体)检测(例如，参见Glenney等，1988，免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)109:277-285；Fradkelton等，1983,Mol.Cell.Biol.3:1343-1352)。另外，可以采用ELISA方法，其中，用一种对目标宿主细胞蛋白特异的固定抗体固定参与ObR信号转导途径的一种特定宿主细胞蛋白，并用标记过的抗磷酸酪氨酸抗体检测固定化宿主细胞蛋白上磷酸酪氨酸的有或无(参见king等，1993，生命科学(Life Sciences)53:1465-1472)。在另一种方案中，作为ObR刺激信号转导的终止，可以测定离子流动，如钙离子流动。
另外，可以测定STAT蛋白的激活作用和由IL-6效应基因元件介导的转录刺激作用。例如，可以制备一种重组表达载体，使其含有克隆在接近一个报导基因处的IL6效应元件序列，并可通过测定报导基因活性测定ObR活性的调节。可以使用的报导基因包括，但不限于编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤火虫荧光素酶或人生长激素的基因。
另外，可将包括诸如ob、db和ob/db小鼠的基于动物的体重疾病系统用于鉴定能缓解体重疾病样综合症的化合物。可将所述动物模型用作鉴定能有效治疗上述疾病的药物、药剂、疗法和处置方法的被作用物。例如，可以用被怀疑具有缓解体重疾病综合症的化合物处理动物模型，该化合物的浓度高到、而且处理时间长到足于引起被处理动物发生体重疾病的缓解作用。可以通过评价与诸如肥胖的体重疾病相关的疾病的恢复监测动物对上述处理的反应。就处置方法而言，任何能恢复体重疾病样综合症的任何方面的治疗均被视为用于人类体重疾病治疗处置的可选方案。如将在下面的5.7.1节中讨论的，可通过绘制剂量效应曲线的方法测定试验剂的剂量。
F..包括体重疾病在内的体重治疗本发明涉及用于改变体重并治疗体重疾病的方法和组合物，所述疾病包括，但不限于肥胖、恶病质和厌食。由于正常obR基因产物功能的丧失会导致肥胖表型的发展，提高obR基因产物活性或激活ObR途径(例如，下游激活)有利于使表现出缺陷型obR基因表达水平和/或obR活性水平的肥胖个体逐渐趋于接近正常状态。
另外，通过降低obR基因表达水平和/或obR基因活性和/或下调ObR途径的活性(例如，通过定向下游信号转导过程)，可以缓解某些体重疾病的综合症，例如，涉及低于正常体重表型的恶病质。下面探讨不同的方法
1..制ObR表达或ObR活性，促进体重增加任何能中和Ob或抑制obR基因表达(抑制转录或翻译)的方法均可用于实现体重增加。所述方法可被用于治疗诸如厌食或恶病质的疾病。还可将所述方法用于农业目的；即提高家畜动物的体重。
例如，可通过服用能结合并“中和”循环Ob的可溶性肽、蛋白、融合蛋白或抗体(包括抗独特型抗体)，和ObR的天然配体实现体重增加。为此，可以使用相当于ObR的ECD的肽、ObR的可溶性缺失突变型(例如，ΔTMObR突变型)或ObR功能域中的任一个或融合于另一种多肽(例如，IgFc多肽)的突变型。另外，可以使用能模拟ObR ECD并中和Ob的抗独特型抗体或抗独特型抗体的片段(参见5.3节，同上)。给受治对象服用的上述ObR肽、蛋白、融合蛋白、抗独特型抗体或Fab的量足于中和Ob并实现体重增力。
可使用相当于ECD具有图1或6中所示的氨基酸序列，大约从23-837号氨基酸残基，或具有图3所示的氨基酸序列，从约从21-839号氨基酸残基的ObR肽。还可以使用ObRΔTM突变体中23个氨基酸的疏水锚定序列(例如，大约为图1或6中的838-860号氨基酸残基，或大约为图3中840-862号氨基酸残基)。ObR、ObR ECD或ΔTM ObR与IgFc多肽的融合不仅可以提高该制剂的稳定性，而且可以延长ObR-Ig融合蛋白在体内的半衰期和提高其活性。可对该融合蛋白的Ig部分的Fc片段作进一步的修饰，以降低免疫球蛋白的效应子功能。参见下文的第10节。
在本文所披露的一种特定实施方案中，将小鼠或人ObR的胞外域同IgG恒定区融合。如图10所示，纯化的ObR-IgG能够有效地抑制或中和AP-OB融合蛋白与细胞表面ObR的结合(参见10.4.节)。
在中和循环Ob的另一种实施方案中，可以给患者服用经过遗传工程操作的、能表达所述可溶型式或分泌型式ObR的细胞，使其能在体内起到“生物反应器的作用，以便能连续供应Ob中和蛋白。所述细胞可以获自所述患者或一个MHC相容性供体，并可以包括，但不限于成纤维细胞、血细胞(例如，淋巴细胞)、脂肪细胞、肌细胞、内皮细胞等。可以用重组DNA技术对所述细胞进行体外遗传工程操作，以便将ObR ECD、ΔTM ObR或ObR-Ig融合蛋白(例如，ObR-、ECD-或ΔTM ObR-IgFc融合蛋白)的编码序列导入该细胞中，例如，通过转导(使用病毒载体，优选使用能将转基因整合到细胞基因组中的载体)或转染方法，包括，但不限于使用质粒、粘粒、YAC、电穿孔、脂质体等。可将ObR编码序列置于一个强组成型或诱导型启动子或启动子/增强子的控制之下，以实现所述ObR肽或融合蛋白的表达和分泌。可将所制备的能表达并分泌所需ObR产物的细胞系统地导入患者体内，例如，通过腹膜内注射方法导入循环系统，位于脉络丛或下丘脑。另外，可将所述细胞掺入一种基质，并植入体内，例如，可将通过遗传工程方法产生的成纤维细胞作为皮肤移植物的一部分植入；而通过遗传工程方法产生的内皮细胞可以作为血管移植物的一部分植入(例如，参见Anderson等，US5,399,349；和Mulligan & Wilson,US 5,460,959，它们分别被作为整体收作本文参考)。
如果待服用的细胞是非自体细胞，则可以用众所周知的方法服用这种细胞，只要该方法可以预防针对导入细胞的宿主免疫反应的发生。例如，可以胶囊化型式导入所述细胞，虽然可以与紧邻的胞外环境进行组分交换，但所导入的细胞不会被宿主的免疫系统识别。
在另一种实施方案中，可以设计体重增加疗法，以降低内源ObR基因表达的水平，例如，用反义或核糖酶方法抑制或阻止obR mRNA转录物的翻译；用三重螺旋方法抑制obR基因的转录；或通过定向同源重组使obR基因或其内源启动子失活或“失效”。由于obR基因是在大脑中，包括脉络丛和下丘脑中表达，给药技术最好被设计成能通过血脑屏障(参见PCTWO89/10134，该专利被作为一个整体收作本文参考)。另外，可将本文所披露的反义、核糖酶或DNA结构直接给药至含有目标细胞的部位；例如，脉络丛和/或下丘脑。
反义方法包括设计能与ObR mRNA互补的寡核苷酸(DNA或RNA)。反义寡核苷酸能与互补的ObR mRNA转录物结合，并抑制其翻译。绝对互补性尽管是优选的，但是没有必要。在本文中，“互补”于一部分RNA的序列是指具有足于与该RNA杂交，形成稳定的双链体的序列；对于双链反义核酸来说，可以对该双链DNA的一条链进行检测，或测定三链体的形成。杂交能力同时取决于其互补程度和反义核酸的长度。一般，杂交的核酸越长，它所包含的与RNA错配的碱基越多，并仍然可形成稳定的双链体(或三链体，如果条件许可的话)。本领域技术人员通过用标准方法测定杂交复合体的熔点可以确定错配的允许度。
互补于所述信息(message)5＇末端，例如，5＇非翻译序列直至并包括AUG起始密码子在内的序列的寡核苷酸，能最有效地抑制翻译作用。不过，最近已证实互补于mRNA3＇非翻译序列的序列也能有效抑制mRNA的翻译。大致参阅Wagner,R.,1994,Nature 372:333-335。因此，在反义方法中，可以用互补于图1(鼠短型)、图6(鼠长型)或图3(人长型)所示obR的5′-或3＇-非翻译、非编码区的寡核苷酸抑制内源obR mRNA的翻译。互补于该mRNA的5＇非翻译区的寡核苷酸应当包括AUG起始密码子。互补于mRNA编码区的反义寡核苷酸是翻译的不十分有效的抑制剂，但可用于本发明中。反义核酸无论被设计成能与ObR mRNA的5＇、3′-或编码区杂交，其长度均至少应为6个核苷酸，而且，优选为长度为6至大约50个核苷酸的寡核苷酸。在特定场合下，该寡核苷酸至少为10个核苷酸，至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。
无论靶序列的选择如何，最好首先进行体外研究，以便对该反义寡核苷酸抑制基因表达的能力进行定量。这些研究优选使用能区分反义基因抑制和寡核苷酸的非特异生物学效应的对照。同样理想的是，该研究能比较目标RNA或蛋白的含量和内在对照RNA或蛋白的含量。另外，预计将用所述反义寡核苷酸获得的结果与用对照寡核苷酸获得的结果进行比较。理想的是，对照寡核苷酸的长度大致与试验寡核苷酸的长度相同，而且，该寡核苷酸的核苷酸序列与反义序列的差异不超过抑制与靶序列进行特异杂交所必须的程度。
所述寡核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修饰型式。举例来说，可以对该寡核苷酸的碱基部分、糖部分或磷酸骨架进行修饰，以提高该分子的稳定性、杂交能力等。该寡核苷酸可以包括其它附属基团，如肽(例如，用于在体内寻靶宿主细胞受体的肽)，或能促进跨细胞膜转运(例如，参见Letsinger等，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:6553-6556；Lemaitre等，1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:648-652；PCT公开号WO 88/09810，出版日1988年12月15日)或通过血脑屏障转运(例如，参见PCT公开号WO 89/10134，出版日1988年4月25日)的制剂，杂交触发的裂解剂(例如，参见Krol等，1988，生物技术(BioTechniques)6:958-976)或嵌入剂(例如，参见Zon,1988，药学研究(Pharm.Res.)5:539-549)。为此，可将所述寡核苷酸缀合于另一种分子上，例如，肽、杂交触发的交联剂、转运剂、杂交触发的裂解剂上。
所述反义寡核苷酸可以包括至少一个修饰的碱基部分，该碱基部分选自包括，但不限于由下列化合物组成的一组5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖queosine、肌苷、N6-异戊基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖queosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧代乙酸(Ⅴ)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧代乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧代乙酸(Ⅴ)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)W、和2,6-二氨基嘌呤。
所述反义寡核苷酸还可以包括至少一个修饰过的糖部分，该部分选自包括，但不限于下列化合物组成的一组阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
在另一种实施方案中，该反义寡核苷酸包括至少一个修饰过的磷酸骨架，该骨架选自由下列化合物组成的一组硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯和formacetal或其类似物。
在另一种实施方案中，所述反义寡核苷酸是一种α-端基异构寡核苷酸。α-端基异构寡核苷酸能与互补RNA形成特殊的双链杂合体，其中，与常见的β-单元不同，所述链是彼此平行地取向的(Gautier等，1987,Nucl.Acids.Res.15:6625-6641)。所述寡核苷酸是2＇-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987,Nucl.Acids Res.15:6131-6148)、或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等，1987,FEBS Lett.215:327-330)。
本发明的寡核苷酸还可以用本领域公知的标准方法合成，例如，使用一台自动化DNA合成仪(如由Biosearch,Applied Biosystems等出售的合成仪)。举例来说，可以用Stein等的方法(1988,Nucl.Acids Res.16:3209)合成硫代磷酸酯寡核苷酸，甲基磷酸酯寡核苷酸可用可控孔度玻璃聚合物支持体(Sarin等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:7448-7451)等进行制备。
虽然可以使用互补于obR编码区序列的反义寡核苷酸，但互补于转录的非翻译区的寡核苷酸最佳。例如，可将具有如下序列的反义寡核核苷酸用于本发明中a)5＇-CATCTTACTTCAGAGAA-3＇，它互补于图3中的核苷酸-14至+3。
b)5＇-CATCTTACTTCAGAGAAGTACAC-3＇，它互补于图3中的核苷酸-20至+3。
c)5＇-CATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAA-3＇，它互补于图3中的核苷酸-26至+3。
d)5＇-CATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCCTCT-3＇，它互补于图3中的寡核苷酸-32至+3。
e)5＇-AATCATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3，它互补于图3中的核苷酸-29至+6。
f)5′-CTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3，它互补于图3中的核苷酸-29至-1。
g)5′-TCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3，它互补于图3中的核苷酸-29至-7。
h) 5＇-AAGTACACCCATAATCC-3，它互补于图3中的核苷酸-29至-13。
所述反义分子应当被输入能在体内表达ObR的细胞中，例如，脉络丛和/或下丘脑。已建立起多种用于将反义DNA或RNA送入细胞的方法；例如，可将反义分子直接注射到组织位点，或全身性给药针对目标细胞而设计的修饰过的反义分子(例如，与能特异结合表达于靶细胞表面的受体或抗原的肽或抗体的反义分子)。
不过，要使该反义分子达到足以抑制内源mRNA表达的胞内浓度通常是很困难的。因此，优选的方法是使用一种重组DNA结构，其中，该反义寡核苷酸被置于强polⅢ或polⅡ启动子的操纵之下。用这种结构转染患者体内的靶细胞，可导致足够量的单链RNA转录，这些单链RNA能与内源obR转录物形成互补的碱基对，从而阻止obR mRNA的翻译。例如，可以体内导入一种载体，以便该载体能被细胞摄入，并指导反义RNA的转录。所述载体可以保持其附加体型式或进行染色体整合，只要它能够转录产生所需的反义RNA即可。所述载体可以用本领域规范化的重组DNA技术制备。载体可以是用于在哺乳动物细胞中复制和表达的质粒、病毒或本领域公知的其它载体。编码反义RNA的序列的表达可以通过本领域公知的任何启动子在哺乳动物中实施，优选在人细胞中实施。所述启动子可以是诱导型的或组成型的。所述启动子包括，但不限于SV40早期启动子片段(Bernoist和Chambon,1981,Nature 290:304-310)、包含于Rous肉瘤病毒的3＇长的末端重复中的启动子(Yamamoto等，1980,Cell 22:787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441-1445)、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等，1982,Nature 296:39-42)等。任何类型的质粒、粘粒、YAC或病毒载体均可用于制备能被直接导入诸如脉络丛或下丘脑的组织位点的重组DNA结构。另外，可将病毒载体用于选择性地感染目标组织(例如，可将疱疹病毒用于感染脑组织)，在每一种情况下均可通过其它途径(例如，全身给药)实现给药。
被设计用于催化裂解obR mRNA转录物的核酶分子也可被用于抑制obR mRNA的翻译和ObR的表达(例如，参见PCT国际公开WO 90/11364，
公开日1990年10月4日；Sarver等，1990,Science 247:1222-1225)。虽然可以用能在特异的识别序列上裂解mRNA的核酶来破坏obR mRNA,但优选使用锤头状核酶。锤头状核酶能在由旁侧区限定的部位裂解mRNA，该旁侧区与靶mRNA形成互补碱基对。唯一的要求是，所述靶mRNA具有如下的2个碱基的序列5＇UG-3′。锤头状核酶的构建和制备为本领域所熟知，并由Haseloff和Gerlan作过更全面的描述(1988,Nature,334:585-591)。在人ObR cDNA的核苷酸序列上(图3)有数百个潜在的锤头状核酶裂解位点。理想的是，所述核酶通过遗传工程方法生产的，以使其裂解识别位点位于接近ObR mRNA的5＇末端处；即提高效率，同时减少非功能性mRNA转录物的胞内积累。
例如，可将具有如下序列的锤头状核酶用于本发明中a)5＇-ACAGAAUUUUUGACAAAUCAAAGCAGANNNNUCUGAGNAGUCCUUACUUCAGAGAA-3＇，它可以裂解图3所示人obR mRNA的核苷酸-1至1。
b)5＇-GGCCCGGGCAGCCUGCCCAAAGCCGGNNNNCCGGAGNAGUCGCCAGACCGGCUCGUG-3＇，它可以裂解图3所示核苷酸-175至-176。
c)5＇-UGGCAUGCAAGACAAAGCAGGNNNNCCUGAGNAGUCCUUAAAUCUCCAAGGAGUAA-3＇，它可以裂解图3所示核苷酸102至103。
d)5＇-UAUAUGACAAAGCUGUNNNNACAGAGNAGUCCUUGUGUGGUAAAGACACG-3′，它可裂解图3所示核苷酸994至995。
e)5＇-AGCACCAAUUGAAUUGAUGGCCAAAGCGGGNNNNCCCGAGNAGUCAACCGUAACAGUAUGU-3＇，它可裂解图3所示核苷酸2142至2143。
f)5＇-UGAAAUUGUUUCAGGCUCCAAAGCCGGNNNNCCGGAGNAGUCAAGAAGAGGACCACAUGUCACUGAUGC-3＇，它可裂解图3所示核苷酸2736至2737。
g)5＇-GGUUUCUUCAGUGAAAUUACACAAAGCAGCNNNNGCUGAGNAGUCAGUUAGGUCACACAUC-3＇，它可裂解图3所示核苷酸3492至3493。
h)5＇-ACCCAUUAUAACACAAAGCUGANNNNUCAGAGNAGUCAUCUGAAGGUUUCUUC-3′，它可裂解图3所示核苷酸3521至3522。
本发明的核酶还包括RNA内切核糖核酸酶(以下称“Cech型核酶”)，如天然存在于嗜热四膜虫(Tetrahymena Thermophila)中的一种酶(被称为IVS或L-19 IVS RNA),Thomas Cech及其合作者对此做过详尽说明(Zaug等，1984,Science,224:574-578；Iang和Cech,1986,Science,23:470-475；Zang等,1986,Nature,324:429-433；国际专利申请公开号WO 88/04300，由University PatentInc.公开；Been和Cech,1986,Cell,47:207-216)。Cech型核酶具有一个有8个碱基对的活性位点，它能与靶RNA序列杂交，然后裂解该靶RNA。本发明涉及能寻靶ObR上的8个碱基对的活性位点序列的Cech型核酶。
在反义方法中，所述核酶可以由修饰的寡核苷酸(例如，为了提高其稳定性、定向性等)组成，并应当送入能在体内表达ObR的细胞中，例如，下丘脑和/或脉络丛。一种优选的输送方法包括受一个强的组成型palⅢ或polⅡ启动子控制的“编码”所述核酶的DNA结构，以便转染的细胞能产生足够数量的核酶，以破坏内源obR信息，并抑制翻译。由于核酶不同于反义分子，它是催化性的，较低的胞内浓度即可有效。
通过使用定向的同源重组方法使obR基因或其启动子失活或“失效”，也可以降低内源ObR基因的表达(例如，参见Smithies等，1985,Nature317:230-234；Thomas & Capecchi,1987,Cell 51:503-512；Thompson等，1989 Cell 5:313-321；以上文献分别被以全文型式收作本文参考)。例如，可以用有或没有选择标记和/或负选择标记的、其旁侧为与内源obR基因(该ObR基因的编码区或调控区)同源的DNA的突变型非功能性ObR(或一种完全无关的DNA序列)转染能在体内表达ObR的细胞。通过定向同源重组插入该DNA结构，可导致obR基因失活。这种方法特别适用于农业领域，其中，对ES(胚胎于)细胞的修饰可用于产生具有失活ObR的动物子代(例如，参见Thomas和Capecchi1987和Thompson1989，同上)。不过，也可以对该方法加以改进，以适用于人，用合适的病毒载体将所述重组DNA结构直接给药或导引至所需的体内部位，例如，用疱疹病毒载体向诸如下丘脑和/或脉络丛的脑组织输送。
另外，通过定向互补于obR基因调控区(即obR启动子和/或增强子)脱氧核糖核苷酸序列)形成三重螺旋结构，抑制obR基因在体内的靶细胞中表达，可以减弱内源obR基因表达(大致参见Helene,C.1991,Anticancer DrugDes.6(6):569-84；Helene,C.等，1992,Ann,N.YAccad.Sci.660:27-36；和Maher,L.J.,1992,Bioassays 14(12):807-15)。
在本发明的又一个实施方案中，用“显性失活”方法降低ObR活性，以实现体重增加。为此，可将编码缺陷型ObR的结构用于基因治疗方法中，以减弱适当靶细胞中的ObR活性。例如，如将能指导宿主细胞表达ObRs的核苷酸序列导入脉络丛或下丘脑的细胞中(通过上述体内或来自体内的基因疗法)，所表达的ObRs的CD(例如，图1中861-894号氨基酸残基；图6中861-1162号氨基酸残基；或图3中863-1165号氨基酸残基)或CD的一部分(例如，框1Jak相互作用序列；图1和6的氨基酸残基861-884；或图3的氨基酸残基863-886)是缺失的或突变的。另外，可以用定向同源重组的方法将这种缺失或突变导入受治对象下丘脑或脉络丛的内源ObR基因中。这种用工程方法所得到的细胞可以表达非功能性受体(即一种能结合其天然配体，但不能进行信号转导的固着受体)。存在于脉络丛或下丘脑中的上述工程细胞对内源Ob配体应当表现出较弱反应，从而导致体重增加。
2..恢复或加强ObR表达或活性，促进体重下降就提高正常obR基因表达和/或obR基因产物活性而言，可将obR核酸序列用于治疗包括肥胖在内的体重疾病。当肥胖的原因是缺陷型ObR时，可以诸如基因替代疗法型式施治。具体地讲，可以用载体将一个或几个拷贝的正常obR基因或能指导具有正常功能的obR基因产物产生的obR基因的一部分插入患者或动物受治对象体内的合适细胞中，所述载体包括，但不限于腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒和疱疹病毒载体，此外，还有能将DNA导入细胞的其它颗粒子，如脂质体。
由于obR基因是在包括脉络丛和下丘脑的脑组织中表达的，所述基因替代疗法技术应当能够将obR基因送至患者体内的上述类型细胞中。因此，应将输送ObR基因的方法设计成能顺利通过血-脑屏障，这种方法为本领域技术人员所熟知(例如，参见PCT申请，公开号WO 98/10134，该专利被以全文型式收作本文参考)，或者，该方法应包括将所述obR基因序列直接给药至待表达该obR基因序列的细胞部位。另外，可以用定向同源重组的方法纠正诸如脉络丛和/或下丘脑的适当组织中的缺陷型内源ObR基因。在动物中，可将定向同源重组用于纠正ES细胞中的缺陷，以产生具有纠正了的性状的子代。
可用于提高obR基因表达的总体水平和/或ObR活性的其它方法包括，将适当的ObR表达细胞，优选为自体细胞导入患者体内，导入的部位和数量足于缓解包括肥胖在内的体重疾病综合症。所述细胞可以是重组型的或非重组型的。可被用于提高患者体内obR基因表达的总体水平的细胞包括正常细胞，尤其是能表达obR基因的下丘脑细胞。可将所述细胞用于大脑的解剖部位，或作为组织移植物放置在身体的不同部位。这种基于细胞的基因治疗技术为本领域技术人员所熟知，例如，参见Anderson等的美国专利US5,399,349；Mulligan和Wilson的美国专利US 5,460,959。
最后，可将在上述测定中鉴定的能激发或加强由ObR激活的信号转导，例如，通过激活ObR级联的下游信号转导蛋白，并由此避开缺陷型ObR的化合物用于实现体重的减少。有关制剂及服用方式取决于该化合物的物理化学特性。所述服用方式包括可通过血脑屏障的已知技术。
G..药用制剂和给药方法可以给患者服用治疗有效剂量的被确认能影响obR基因表达或ObR活性的化合物，以治疗或缓解包括肥胖、恶病质和厌食在内的体重疾病。治疗有效剂量是指足于导致体重疾病症状减轻的所述化合物用量。
1..有效剂量可以通过标准药理学方法，用细胞培养物或实验动物测定所述化合物的毒性和疗效，例如，测定其LD50(使群体的50％致死的剂量)和ED50(对群体的50％有治疗效果的剂量)。毒性作用和治疗作用的剂量比为治疗指数，并可以LD50/ED50之比型式表示。优选具有较大治疗指数的化合物。尽管可以使用具有毒副作用的化合物，但要采取防范措施，以设计出能将所述化合物定向给药至受治组织的给药系统，以减少对无关细胞的潜在危害，从而减轻其副作用。
可将在细胞培养试验和动物研究中取得的资料用于制备供人体使用的各种剂量。所述化合物的剂量优选处于这样的循环浓度范围内其中包括ED50，少有或没有毒性。根据所用的剂型和给药途径，其剂量可以在该范围内变动。对于用于本发明方法的任何化合物来说，都可以通过细胞培养试验初步计算出其治疗有效剂量。在动物模型中，可以制备能达到包括IC50(即能实现对症状的半数最大抑制的试验化合物浓度)在内的循环血浆浓度范围的剂量，这一剂量是在细胞培养中测定的。上述资料可被用于更精确地确定适用于人体的剂量。例如，通过高效液相层析可以测定在血浆中的浓度。
2..制剂及用途可以通过常规方法，用一个或几种生理学上可以接受的载体或赋形剂制备适用于本发明的药用组合物。
因此，可将所述化合物及其生理学上可以接受的盐和溶剂化物制成适于通过吸入或吹入(经口或鼻)或口服、颊服(buccal)、肠胃外或直肠使用方法给药的型式。
对于口服而言，该药用组合物可以采用诸如通过常规方法，用诸如粘结剂(例如，预凝胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)的可以药用的赋形剂、填料(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或硅石)、崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠)、或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)制备成的片剂或胶囊型式。可以用本领域众所周知的方法对片剂进行包衣。用于口服的液体制剂可以采用诸如溶液、糖浆或悬液的型式，或以干制品型式提供，在使用之前用水或其它合适载体制成液体。上述液体制剂可以通过常规方法用诸如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)、乳化剂(例如，卵磷脂和阿拉伯胶)；非水媒介物(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油)和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)的可以药用的添加剂制备。如有必要，该制剂还可以含有合适的缓冲盐、矫味剂、着色剂和增甜剂。
用于口服的制剂适于被制成能可控制地释放活性化合物的型式。
对于颊服来说，所述组合物可以采用以常规方法制备的片剂或锭剂型式。
对于吸入服用来说，用于本发明的化合物通常是以气溶胶喷雾型式给药，该喷雾剂由加压装置或喷雾器用诸如二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷、CO2或其它合适气体的合适的推进剂提供。就加压气溶胶而言，其剂量单位可以通过设置一个阀以输送定量气溶胶的型式确定。可将用于吸气器或吹气器的诸如明胶的胶囊和药筒制成含有由所述化合物和诸如乳糖或淀粉的合适粉状基质组成的粉状混合物的型式。
可将上述化合物制成适于通过注射的肠胃外给药型式，例如，通过块(bolus)注射或连续输注型式服用。适于注射的制剂可以单位剂量型式提供，例如，装于安瓿瓶或多剂量容器中，并添加有防腐剂。该组合物可以采用诸如含于油性或水性媒介物中的悬液、溶液或乳液型式，并可以含有诸如悬浮剂、稳定剂/或分散剂的配制剂。另外，该活性成分可以是适于与适当媒介物组配的粉状型式，例如，在使用之前用灭菌的无热原水组配。
还可将上述化合物制成诸如栓剂或保留灌肠剂型式的直肠组合物，例如，含有诸如可可油或其它甘油酯的常见栓剂基质。
除了上述制剂以外，还可将上述化合物制备成缓释制剂。这用长效制剂可以通过植入方法(例如，皮下或肌内植入)或肌内注射方法使用。因此，举例来说，所述化合物可以用合适的聚合材料或疏水材料(例如，溶于可以接受的油中的乳剂)或离子交换树脂制备，或制成微溶性衍生物，例如，微溶性盐。
如果必要，所述化合物可以包装或分配装置型式提供，其中可以容纳含有活性成分的一个或几个单位剂量型式。例如，所述包装可以包括金属或塑料泊，如发泡包装。在所述包装或分配装置上还可带有使用说明。
Ⅵ..实施例ObR的原位定位在本文所提供的实施例中，通过用Ob(莱普亭(leptin))-碱性磷酸酶(AP)融合蛋白所做的结合研究证实，在哺乳动物脉络丛组织中存在高亲和性Ob受体。还发现，所观察到的融合蛋白结合是Ob-特异性的，而不是由非特异性碱性磷酸酶产生的假象。
A..材料和方法Ob-碱性磷酸酶融合蛋白的构建和表达。
制备两种类型的融合蛋白。具体地讲，制备Ob-AP融合蛋白，其中，AP部分位于该融合蛋白的羧基末端；制备AP-Ob融合蛋白，其中，AP部分位于该融合蛋白的氨基末端。
为了制备小鼠和人Ob-Ap和Ap-Ob融合结构，通过标准的聚合酶链式反应方法扩增cDNA序列。对于小鼠和人Ob-AP融合蛋白而言，分别由相应的cDNA扩增编码小鼠和人Ob的整个开放读框的核苷酸序列。用HindⅢ和BamHⅠ裂解位于扩增引物末端的限制位点(小鼠)，并将其插入APtag-2的HindⅢ-BglⅡ多接头位点；或用BamHⅠ和BglⅡ裂解(人)，并将其插入APtag-2的BglⅡ位点。对于小鼠和人AP-Ob融合结构而言，首先制备能表达一种具有其自身信号肽的新型AP融合蛋白(APtag-3)，做法是用分泌性胎盘碱性磷酸酶(包括信号序列)的PCR扩增序列置换Aptag-2上位于HindⅢ和XhoⅠ位点之间的序列。设置一个BglⅡ位置，以便导入该位点的融合蛋白符合AP蛋白的读框。然后由相应的cDNA通过PCR扩增预测的成熟型式的小鼠和人Ob的序列。用BamHⅠ和BglⅡ裂解位于扩增引物末端的限制位点，并将其插入APtag-3的BglⅡ位点。
将各个质粒瞬时转染到COS-7细胞中(11.25μg/150mm板)。让细胞生长至铺满，再用条件培养基(media-conditioned)3天。然后对细胞进行离心，0.45μm过滤，并用20mMHepes(pH7.0)和0.05％叠氮钠保存于4℃温度下。按照Flanagam和Leder(Flanagan,J.G.和Leder,P.,1980,Cell 63:185-194)披露的方法在96孔平板读数器上测定条件培养基，并定量AP活性，所不同的是，在所有测定中均省去了高精氨酸。
原位融合蛋白结合。
在12孔平板中用HBHA(含有0.5mg/ml BSA、0.1％NaN3、20mMHEPES[pH7.0])的Hank＇s平衡盐溶液漂洗四分小鼠脑、分离的脉络丛、细胞和细胞系一次。然后，在室温下将组织和含有AP-Ob融合体、Ob-AP融合体的组织培养上清液或对照上清液(即仅含有未融合的AP的上清液、含有AP-OB或OB-AP融合蛋白+80倍摩尔过量大肠杆菌产生的重组OB的上清液或获自模拟转染的COS细胞的上清液)一起培养75分钟，同时伴以缓慢转动。随后按前文所述方法处理样品(Cheng,H.J.和Flangan,J.G.,1994,Cell 79:157-168)。
B..结果为了找到Ob受体,构建O-b碱性磷酸酶融合蛋白，其可通过比色法检测其Ob结果。具体地讲，将编码小鼠和人Ob蛋白的cDNA分子插入上文6.1节中所述的表达载体APtag-2和APtag-3上。插入表达载体Aptag-2后所产生的融合蛋白，其Ob位于该融合蛋白的N-末端，而胎盘碱性磷酸酶(AP)位于该融合蛋白的C-末端。所得到的融合蛋白被称为Ob-AP。插入载体APtag-3之后所产生的融合蛋白，其AP位于N-末端，它与位于C-末端的预测的成熟型式的Ob蛋白融合。所得到的融合蛋白被称为AP-Ob。两种型式的鼠融合蛋白均为分泌性的，并且均以大致为81KDa的预测分子量型式生成。
为了鉴定能表达Ob受体的细胞或组织，采用了几种方法。用本文所述方法试验的每一种细胞、细胞系和组织都至少可能参与体重调节。所采用的第一种方法试图指导Ob-AP和AP-Ob融合蛋白结合试验。用该方法检测过的细胞系包括胎盘细胞系Be WO(ATCC No.CCL98)和JAR(ATCC No.HTB144)；肌细胞系L6(ATCC No.CRL 1458)和BC3H(ATCC No.CRL 1443)；神经细胞系PC12(ATCC No.CRL 1712)和NB41A3(ATCC No.CCL147)；前脂肪细胞系3T3-L1(ATCC No.CRL 173)；和肝细胞系Hepa1-6(ATCCNo.CRL 1830)。还用该方法试验了来自下丘脑的原代培养物和来自小脑的原代培养物。上述研究无一产生阳性结合结果。
其次，还尝试过通过检测基因表达随重组Ob蛋白的存在而发生的变化来鉴定能表达Ob受体的细胞系。其原理是，基因表达的变化，无论是obR基因的表达，还是Ob/ObR-相关的信号转导途径更下游处的基因的表达，可用于鉴定其中存在ObR的细胞。
上述分析是通过对源于Ob处理过的或未处理过的细胞的RNA进行的标准示差演示分析(参见Pardee等，US 5,262,311)完成的。简单地讲，从用Ob处理过的或未经处理的细胞中提取RNA，并以如下方式进行RT-PCR扩增可以对存在于源于Ob处理的细胞系和源于未经Ob处理的细胞系的RNA中的单个转录物含量进行直接的定量比较。用该方法试验过的Ob细胞系有INS-1、3T3-L1、Hepa1-6、L6、PC12、NB41A3和BC3H。另外，还试验了原代下丘脑培养物。在试验过的细胞中，无一表现出因该细胞是否用Ob处理过而产生的在表达型式方面的可检测的定量差异。
第三，还尝试过通过用重组Ob蛋白处理细胞，并测定信号转导途径激活的迹象的方法来鉴定能表达Ob受体的细胞。具体地讲，通过3H的摄入监测cAMP的变化，并通过由抗磷酸酪氨酸抗体处理过的Western印迹测定酪氨酸磷酸化的变化。用这种方法对20个以上的细胞系进行了检验。具体地讲，这些细胞系包括小鼠细胞系Y1(肾上腺皮层；ATCC No.CCL79)、BC3H(平滑肌-脑瘤；ATCC No.CRL1443),P19(胚胎癌性细胞；ATCCNo.CRL 1825)、3T3L1(前脂肪细胞；ATCC No.CRL173)、Hepa1-6(肝癌；ATCC No.CRL1830)、C2C12(成肌细胞；ATCC No.CRL1772)、NMUMG(乳腺，正常上皮；ATCC No.CRL1636)、MM5MT(乳腺；ATCCNo.CRL 1637)、NB41A3(成神经细胞瘤；ATCC No.CCL 147)、AtT20(脑垂体；ATCC No.CCL89)、N MU LI(肝；ATCC No.CRL 1638)、BNLCL2(肝；ATCC No.TIB 73)和NCTC-1469(肝；ATCC No.CCL 91)；大鼠细胞系，包括L6(成肌细胞；ATCC No.CRL 1458)、PC12(肾上腺嗜铬细胞；ATCC No.CRL 1721)、和H-4-H-E(肝癌；ATCC No.CRL 1548)；和人细胞系，包括SW 872(脂肪肉瘤；ATCCNo.HTB 92)、HepaG2(肝；ATCCNo.HB8065)、和成神经细胞瘤细胞系，包括SK-N-SH(ATCC No.HTB11)。在该试验中，同样未能在试验过的任何细胞中观察到取决于Ob的差异。
在对哺乳动物细胞系和组织作过深入研究之后，将成年小鼠脑四分剖开，用AP-Ob融合蛋白处理，洗涤，并用上文的6.1节所披露的组织学方法测定该融合蛋白的结合AP活性。在啮齿类动物的脑脉络丛中(位于侧向和第三脑室)观察到了AP-Ob融合蛋白的再现性结合。不过，在脉络丛周围的脑组织中未发现AP-Ob染色。脉络丛是主要决定脑脊液产生的组织。而且，脉络丛被认为是血脑屏障的“保护者”之一。
用由非融合的AP处理过的组织和由AP-Ob处理过的组织进行对照AP染色，是在有加入的过量非结合Ob的条件下进行，以便竞争结合所述融合蛋白。在这些对照的任一个中都未出现类似于Ab-Ob融合蛋白的染色现象，这表明所观察到的AP-Ob结合是Ob特异的，而不是由AP导致的假象。
因此，总体来说，只有在采用几种方法之后才能定位一种结合Ob的细胞表面分子；而该细胞表面分子存在于大脑的特定部位-脉络丛中。
Ⅶ..实施例克隆鼠ObR基因在下面的7.2.1节中，披露了由用鼠脉络丛RNA构建的表达文库成功地克隆了一种短型Ob受体cDNA,famj5312。用上文第6节中所提供的实施例中披露的方法，用AP-Ob融合蛋白筛选表达文库。在下文的7.2.2节披露了短型Ob受体编码区的核苷酸序列，而且，还披露了Ob短型受体蛋白的氨基酸序列。在下文的7.2.3节中披露的竞争结合研究表明，由提取的编码一种受体的cDNA编码的蛋白，表现出对小鼠和人Ob蛋白有高的亲和结合力。7.2.4节所披露的研究证实了所分离的ObRcDNA克隆的真实性。
如下文所述，由ObR表现出的高亲和力Ob结合和其与细胞因子受体Ⅰ型家族的同源性相关，这表明ObR是通过与Ob配体结合触发的信号转导参与哺乳动物的体重控制。
A..材料和方法脉络丛mRNA分离。
按照RSelden在分子生物学通用方法(Current Protocols for MolecularBiology)(4.2.3增补14)中披露的Chirgwin等的异硫氰酸胍/CsCl方法(1979，生物化学(Biochemistry)18:5294)每100只小鼠一批地从300只小鼠脉络丛中分离总RNA。在进行定量之后，用蒸馏过的去离子水将RNA稀释至1mg/ml，并用等体积的DNase溶液(20mM MgCl2、2mM DTT、0.1单位DNase、0.6单位RNase抑制剂，溶于TE中)在37℃下培养30分钟，以除去掺杂的DNA。用苯酚/三氯甲烷/异戊醇萃取所述RNA，并用乙醇沉淀。在260nm波长下定量，然后对一个等分试样进行电泳，以检测其完整性。一共纯化了320μg总RNA。
用Qiagen(Chatsworth,CA)出售的Oligotex-dT试剂盒(产品目录号70042)提取PolyA+RNA，按照生产商的说明操作。在进行定量以后，用乙醇使mRNA沉淀，并以1mg/ml的浓度重新悬浮于蒸馏过的、去离子的、DEPC处理过的水中。一共纯化了11μg Poly A+RNA。
文库构建。
按照Gubler和Hoffman的方法(Gene,1983,25:263)，用购自LifeTechnologies(Gaithersburg,MD)的Superscript Plasmid cDNA合成试剂盒(产品目录号Series 8248)合成cDNA。所得到的cDNA连接到哺乳动物表达载体pMET7的NotⅠ/SalⅠ位点上，pMET7是pME18S的改进型式，它使用上文所述的SRα启动子(Takebe,Y等，1988，分子细胞生物学(Mol.Cel.Bio.)8:466)。之所以选择该载体，是因为它含有在COS7细胞中表达的强真核启动子，含有AMP抗性基因，而且长度仅为3.0kb。该载体小的尺寸之所以重要，是因为它能增加克隆大型cDNA的可能性。其它相当的载体为4.8kb，而且较大，因此增加了不完全复制的机率，并降低了克隆大型cDNA的可能性。用乙醇沉淀连接的cDNA，并以25mg/ml的浓度重新悬浮于蒸馏过的、去离子的、DEPC处理的水中。通过电穿孔法，在0.1cm的杯中用1μl DNA转化40μl电感受态DH10B大肠杆菌。
进行2次cDNA合成，并将其用于构建两个独立的小鼠脉络丛文库mCP(小鼠脉络丛)A和mCPD。
DNA制备。
根据cDNA转化的效价用初级转化体以150cfu/孔的浓度接种96深孔平板，接种1ml的LB-amp中。在使用等分试样之前，仅让初级转化体在37℃下生长1小时，以避免较小插入克隆的过分生长，并因此使得在150cfu的库(pool)中较大的克隆表现不足。在37℃下使培养物通气生长15-16小时。在制备之前，取出100μl细胞悬浮液，并加入100μl 50％的甘油中，混合，并于-80℃保存(甘油冷冻板)。
用WizardTMMiniprops DNA Purification System(Promega,Madison,WI；产品目录号A7100)制备DNA，采用改进的96孔方案。该方法如下1)在4℃下，以3200rpm的速度在96深孔板中离心培养物。除去上清液。
2)顺序加入140μl每种细胞重悬液(50mM Tris-HCl,pH7.5,10mMEDTA,100μg/ml RNaseA)、细胞裂解液(0.2M氢氧化钠，1.0％SDS)和中和液(1.32M乙酸钾，pH4.8)，在加入每一种试剂后涡旋14秒钟，以确保混合良好。
3)将板在冰水中放置15分钟。
4)在4℃下，以3200rpm的速度离心样品10分钟。
5)将上清液转至96孔Polyfiltronic聚丙烯过滤板上(10μm,0.8ml)。
6)加入500μl WP树脂，并在室温下培养3-5分钟；对所述板施加吸力。
7)用640μl的重悬液将样品洗涤3遍。
8)在室温下，以3200rpm的速度离心样品5分钟，以除去残留缓冲液。
9)用40μl室温下的水洗脱样品2-5分钟。
10)在室温下，以3200rpm的速度使洗脱的DNA通过微孔板。
11)定量DNA。
收集方法。
设计收集方法，以得到大小最佳的1200cfu的库，适于转染和检测，并可迅速降至150cfu的较小的库。一旦鉴定到150的阳性库，为了提供该库的表现度，需要400-800个独立的克隆。开始使用一个1200cfu的库，意味着需要较少的DNA探针，但在最后的鉴定步骤中需要更多独立的克隆(3200-6400)，因此，需要更多的时间来鉴定阳性克隆。
从组成排的8个孔中等量收集共5μg DNA，共得到1200cfu。因此，每个96孔板可产生12份收集的DNA，用于转染到COS-7细胞中。
在鉴定到阳性库之后，从构成该库的8个孔中的每一个中制备DNA，并再转染到COS-7细胞中。在鉴定到一个阳性孔之后，通过将该孔的一份甘油冷冻等分试样铺平板破坏该孔，以得到数以千计的独立克隆。每一个阳性克隆挑选400-800个克隆，并排列在96孔板中，用上述方法获得DNA，并收集24个孔中的DNA用于转染。从阳性排中提取代表每一个克隆的DNA，并转染，以作最终鉴定。
定量Ob细胞表面结合分析。
大致按以前就Kit-AP所述的方法(Flanagcm,J.G.和Leder,P.,1990,Cell 63:185-194)用AP-Ob融合蛋白进行定量细胞表面结合试验。
Ob蛋白。
本文所使用的重组鼠Ob蛋白是以前披露的(Campfield等，1995,Science 269:546-549)。本文所用的重组人Ob蛋白，是用含有抗人Ob的单克隆抗体的单克隆抗体柱从杆状病毒上清液中纯化的。通过标准考马斯蓝染色判定，所纯化的重组人Ob蛋白的纯度大于95％。
DNA测序。
测序及序列组合是按以前披露的方法进行的(International PolycysticKidney Consortium,1995,Cell 81:289-298)。
Northern分析通过标准方法(Chirgwin,J.M.等，1979,Biochemistry 18:5294-5299)，用由编码鼠ObR胞外域的序列扩增的标记DNA对源于各种组织的PolyA+mRNA(Clontech)进行Northern印迹分析检测。
rt-PCR。
用标准方法(Zhang,Y.等，1994,Nature 372:425-432)对1μg总RNA进行逆转录PCR(rt-PCR)反应。具体地讲，用随机六聚体制备第一条cDNA链。然后用源于编码ObR胞外域的序列的引物或G3PDH对照引物通过PCR扩增所述第一条cDNA链。
B..结果1..克隆源于小鼠脉络丛的Ob受体在上文的第6节中提供的实施例中所披露的AP-Ob融合蛋白与鼠脉络丛的强Ob-特异结合表明，在该组织中可能有一种Ob受体高水平表达。因此，为了实现克隆编码该Ob受体的cDNA，解剖获自300只小鼠的脉络丛，并从该组织中一共提取到11μg polyA+RNA用于按上文7.1节所披露的方法构建cDNA文库。
开始，将3μg poly A+用于制备cDNA，再将该cDNA用于构建小鼠脉络丛cDNA文库A。收集一切大小大于500bp的制备的cDNA(261ng)，并将其中的90ng连接在pMET7上。将这种连接的cDNA转化到电感受态DH10B大肠杆菌中，得到一个大致为7.2×105cfu的文库，其平均大小为1Kb。
鉴于cDNA文库A没有足够数量的含有大到足于以统计学上合理的频率编码一种受体的插入片段，将另3μg poly A+RNA用于制备758ngcDNA。收集32ng代表cDNA最大的两种级分的cDNA，并将其连接到pMET7上。用这种连接的cDNA分子进行转染，得到2.4×105cfu的小鼠脉络丛文库D，其平均插入片段大小为2kb。仅使用cDNA最大的两种级分可保证该文库倾向于大的cDNA。这一点通过鉴定10个克隆的插入片段大小得到了证实；其中7个克隆的插入片段的长度大于2kb，未发现插入片段小于1kb的克隆。这与文库A形成了对照，在文库A中，20个克隆中的16个小于1kb。
从小鼠脉络丛文库A中制备并收集代表6×105cfu(40个板)的DNA。从小鼠脉络丛文库D中制备代表2.4×105cfu(16个板)的DNA。
为了进行筛选，将所述文库制备成有150个克隆的库，并将8个库的混合物用于每一次转染(即1200克隆/转染)。将收集的DNA瞬时转染到COS-7细胞中，并通过与含有鼠AP-Ob融合蛋白的上清液一起培养对细胞进行筛选，洗涤，并染色以原位测定AP活性，一切操作尽如上文的6.1和6.2节所述。一旦鉴定到阳性克隆，便对8个亚库中的每一个分别进行检测，并对所得到的亚库进行一步细分，直到鉴定到单一的阳性克隆。
一共由文库A和D产生了632个DNA库，共鉴定了10个独立的阳性库。所有阳性库均被成功地分解为各有150个克隆的亚库，并对阳性亚库进一步细分，直到鉴定单个阳性克隆。该克隆含有一个5.1kb的cDNA插入片段，被命名为famj5312。
2..Ob受体(ObR)及ObR基因用上文7.2.1节所述方法提取的famj5312鼠obRcDNA克隆含有一个大约为5.1kb的插入片段。由该克隆所得到的核苷酸序列示于图1中(序列1)。该克隆的核苷酸序列表明，有一个开放读框，由该序列所产生的ObR的氨基酸序列也示于图1中(序列2)。
该鼠ObR蛋白的推断的894个氨基酸的序列始于一个甲硫氨酸，其密码子位于与翻译起始位点吻合的DNA序列内。该ObR氨基酸序列始于一个从氨基酸残基1-23的一个疏水信号序列，这种序列常见于膜结合性或分泌性蛋白。
所述鼠Ob受体蛋白含有一个从氨基酸残基836-860的疏水性跨膜域，这表明该Ob受体跨过细胞膜一次。
该跨膜域的位置表明，成熟鼠ObR蛋白的胞外部分是从氨基酸残基24至氨基酸残基837。数据库检索显示，ObR的胞外域含有同源片段，该片段使得ObR被归入细胞因子受体的Ⅰ型家族(例如，为了回顾其发展，可参阅Heldin,C.-H,1995,Cell 80:213-223；和Kishimoto,T.和Tetsuya,T.,1994,Cell 76:253-252)。ObR似乎与IL-6受体、GSF受体和LIF受体的gp130信号转导成分的关系最为密切。对ObR和gp130的氨基酸序列进行对比研究揭示，尽管两种蛋白之间总体上的序列相同性不高，但特征性的保守性的半胱氨酸残基、Trp-Ser-X-Trp-Ser基序和Ⅰ型蛋白家族内保守的其它氨基酸残基却显而易见。
在该鼠Obr蛋白的单一跨膜域之后，有一个由34个氨基酸(即氨基酸残基861-894)的短的胞质域。同源性比较还表明，该ObR胞质域的前23个氨基酸与LIF受体的近膜序列有30％的相同性。
对获自总RNA的obR mRNA进行的逆转录PCR扩增证实了在脉络丛中存在obR转录物(单链约为5kb)，而且还证实了其在下丘脑中的存在。另外，对源于几种小鼠组织的poly A+RNA所做的Northern印迹分析表明，obR mRNA还存在于诸如肺和肾的其它组织中。
3..OB受体能有效结合OB蛋白对AP-Ob与由上文的7.2.2节所披露的obR cDNA编码的ObR的结合进行分析。该分析的结果示于图2中，它证实了该ObR对小鼠和人Ob蛋白均有很强的Ob-特异性结合力。
在图2中示出了对AP融合蛋白结合力的定量分析结果。在把所述ObR克隆瞬时转染到COS细胞中以后，检查到1nM鼠AP-Ob的强力结合(相对模拟转染的COS细胞或ObR转染的COS细胞与非融合AP-一起培养而言)(图2A)。这种结合几乎能完全被100nM未标记的重组小鼠或人莱普亭蛋白所抑制，这表明，该受体可以结合天然Ob。AP和人Ob的融合体还能以高亲合力结合小鼠ObR，象一种在其N-末端为小鼠莱普亭，C-末端上为AP的融合蛋白(Ob-AP)一样起作用。对小鼠AP-Ob的结合进行Scatchard分析(图2B)，所得到的解离常数值(KD)为0.7×10-9M。
4..famj5312克隆的真实性用几种方法检验所分离的ObR famj5312克隆的真实性。首先，用引物对8个分别分离的克隆(分别在150个克隆的亚库中)PCR扩增，制备至终止密码子的obR序列3＇末端。序列分析证实，所有8个克隆均含有相同3＇非翻译序列。另外，对分别分离的编码ObRC-末端的5个克隆进行测序，并发现其分别利用相同的终止密码子。最后，对获自不同于产生所述cDNA文库的品系的小鼠品系(C57/BLKsJ)的脉络丛总RNA进行逆转录PCR(rt-PCR)，得到一种在相同的位点上含有终止密码子的相同PCR产物。这些资料表明，所分离到的famj5312 cDNA克隆，既不是嵌合克隆，也不是罕见的异常剪接过程的结果，而是代表了一种编码脉络丛中主导型式的ObR受体的克隆。
5..克隆小鼠长型ObR编码核酸如本文所述，本发明人克隆了鼠ObR长型。
为了找到人长型ObR基因(图3)的小鼠同系物，对自小鼠下丘脑、Ks、和脉络丛、db和Ks中提取的第一条cDNA链进行半嵌套PCR，所用的5′引物来自小鼠短型开始与人长型趋异的前面的片段，而3＇简并引物是由人ObR同系物胞内区域设计的。通过3＇RACE对全转录物作进一步鉴定。
从C57B1/KS(KS)和C57B1/KS-db(db)脉络丛和下丘脑中制备全mRNA。用购自GIBCO-BRL的Superscript Reverse Transcriptase的逆转录酶，以随机六聚体或Oligo dT为引物，由1μg mRNA的cDNA逆转录生成cDNA。共制备了24μg cDNA。为了进行PCR，以1∶200的比例稀释cDNA，并将3μg稀释的cDNA用于25μl反应物中。
第一轮PCR反应，使用编码小鼠ObR蛋白序列PNPKNCSW的5＇引物，其核苷酸组成为5＇-CCAAAC CCC AAG AAT TGT TCC TGG-3＇；互补于编码接近人长型的羧基末端的KIMENKMCD的核苷酸序列的反向简并引物，其核苷酸组成为5＇-TC(GA)CA CAT(CT)TT(GA)TT(GATC)CC CATTAT CTT-3′。
在第二轮PCR反应中，其3′引物相同，而5＇引物为第一轮反应5＇引物的内部，它编码的蛋白序列为AQGLNFQK，其核苷酸组成为5＇-GCACAAGGACTGAATTTCCAAAAG-3＇。
按上述方法进行PCR反应，所不同的是嵌套PCR的型式为94℃下3分钟；94℃下30秒，57℃下30秒，72℃下40秒，反应30轮；72℃下5分钟，反应1轮。
用Taq循环测序试剂盒，在自动ABI 373A和377 DNA测序仪(AppliedBiosystems,Foster City,CA)上进行DNA测序。用Sequencher进行序列分析。
另外，用自下丘脑中提取的mRNA对编码鼠长型ObR胞内域的核酸进行半嵌套PCR，以得到足够量的编码小鼠长型obR因的特定PCR产物。对该PCR产物测序(图6)证实，该DNA编码长型ObR的小鼠同系物。直到短型终止密码子5＇端的第5个密码子之前，短型和长型的转录物是相同的，然后完全趋异，暗示发生了可变剪接。由小鼠长型和人ObR推定的氨基酸序列在其编码区长度范围内是同源的，并具有75％的相同性(图7)。
6..ObR mRNA的表达特性作为了解ObR组织分布的第一个步骤，在各种鼠组织中检查其mRNA的表达。为此，用由编码ObR胞外域的序列扩增得到的标记DNA对源于各种小鼠组织(心、脑、脾、肺、肝、骨骼肌、肾和睾丸；Clontech,Palo Alto,CA)的polyA+mRNA(2μg/泳道)的Northern印迹进行检测分析。杂交是按照生产商的说明书，在65℃下在Rapid-hyb缓冲液中进行的。
在大部分组织中，ObR mRNA以略大于5kb的单一条带型式出现，表明这里所披露的5.1kb的cDNA克隆是全长的。在分析过的组织中，在肺、肾和全脑中观察到了表达。在睾丸中未检测到表达。
对获自总RNA的)bR mRNA进行的RT-PCR扩增，证实了该转录物在脉络丛中的存在，还证实了其在下丘脑中的存在。用从小鼠脉络丛或下丘脑中提取的1μg总RNA进行RT-PCR反应。从db/db小鼠(C57B1/BLKsJ背景)或+/+同窝仔对照中分离组织。对用随机六聚体制备的第一条cDNA链进行PCR扩增，所用引物源于编码ObR胞外域的序列或用G3PDH对照引物。在平行进行的总RNA对照的模拟逆转录扩增中，未检测到带。
Ⅷ..实施例obR基因即db基因下文披露的实验和研究证实，obR基因位于db位点，而db小鼠中的obR基因是一种突变型obR，它可导致一种具有106个核苷酸的插入片段的异常剪接mRNA的转录，产生一种截短的长型鼠ObR蛋白，该蛋白与鼠短型ObR相同。
A..obR基因位于db遗传间隙内在此处所提供的实施例中，所披露的研究表明，obR基因位于小鼠4号染色体的4-5cM区，它相当于db位点所处的同一区域。
1..材料和方法PCR扩增。
将下列由famj5312衍生的引物用于扩增小鼠基因组DNA正向引物5＇-GCTGCACTTAACCTGGC-3＇反向引物5＇-GGATAACTCAGGAACG-3＇。
PCR反应混合物含有6μl模板DNA(10ng/μl)1.4μl 10×PerkinElmer(Novwalk,CT)PCR缓冲液，1.12μl dNTPs(2.5mM)、1.05μl正向引物(6.6μM)、1.05μl反向引物(6.6μM)、0.38μl H2O和3μl AmpliTaq HotstartTM聚合酶(Perkin Elmer；0.5u/μl)。
扩增参数为94℃,2分钟，此时加入ampli Taq，然后94℃,40秒，55℃,50秒和72℃,30秒一轮的反应进行共30轮次。
在相同反应条件下使用第二组引物，所不同的是，55℃的轮次是在52℃下进行正向引物5＇-CACTATTTGCCCTTCAG-3＇反向引物5＇-GCCTGAGATAGGGGTGC-3＇电泳。
在以下两种条件下对样品进行电泳在室温下，在非变性的8％丙烯酰胺凝胶上，以45W电泳3小时；在4℃下，在非变性的10％丙烯酰胺SSCP(单链构象多形性)凝胶上，以20W电泳2.5小时。
用SYBR GreenⅠ对以上两种类型的凝胶进行染色，并在一台MD荧光计上扫描，获得了可以解释的结果。
2..对famj5312 obR cDNA克隆进行作图按照8.1节中所披露的方法，由famj5312 cDNA的编码序列设计PCR引物。这些引物扩增了C57B1/6J基因组DNA的1921bp片段，它与obR cDNA上两个引物之前的碱基对长度吻合，和源于由野生型衍生的Mus Spretus品系SPRET/Ei。位于Mus Spretus等位基因上的3bp插入片段编码一个位于45号和46号氨基酸之间的额外Asn。通过单链构象多形性(SSCP)凝胶电泳和非变性凝胶电泳进行的大小测定，在杂交(C57B1/6J×Mus Spretus)F1♀×C57B1/6J♂的182个回交子代中发现了ObR的Mus Spretus 195bp等位基因的遗传分离。将Mus Spretus等位基因的分离型式与该回交实验组中已作图的226个其它遗传位点的分离型式加以比较。通过减少obR与其它标记之间的复交换的次数证实，obR位于鼠4号染色体上，大致位于标记D4Mit9远端2.2±1.6cM处，并位于标记D4Mit46近端4.6±1.6cM处。通过对其它遗传学标记进行作图进一步精细ObR的遗传学图距。参见图8，该obR基因距离D4Mit255远端0.6±0.3CM，并距离D4Mitl55近端0.6±0.6CM。
由famj5312 cDNA 3＇序列设计的其它引物对(正向=CACTATTGCCCTTCAG；反向=GCCTGAGATAGGGGTGC)还证实了C57B1/6J基因组DNA与野生型衍生的Mus Spretus品系SPRET/Ei的基因组DNA之间在SSCP凝胶上的多态性。另外，这使得famj5312 cDNA的遗传作图可以用该克隆的另一个片段进行。该多态性的作图与上文披露的famj5312的作图100％一致，同时证实了obR的作图，并证实famj 5312 cDNA克隆不是嵌合型的。
3..鼠db遗传区的确定小鼠db基因最初被作图于小鼠4号染色体上(Hummel,K.-P.等，1966,Science 153:1127-1128)。对该遗传定位已作过进一步细化(Bahary,N.等，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8642-8646；Bahary,N.等，1993,Genomics 16:113-122)，以便将db定位于近鸟氨酸脱羧基酶4(Odc4)位点与无名远端标记D4Rck22和D4Rck69之间的1.5cM的遗传间距内。Bahary等在1993年还报导D4Mit 205接近Odc4 1.1cM。因此，相对D4Mit205而言，db基因位于大约2.2cM的远端。
db等位基因最初出现于C57B1/BLKsJ近交系。随后将所述db突变转移到其它遗传背景中，以形成同类品系。通过对同类品系C57B1/6J-m db动物定型，可以确定db基因在小鼠4号染色体上必然存在的遗传间距内。通过上述分析，确定了必然含有db基因的遗传间距，位于近端无名DNA标记D4Mit255与远端标记D4Mit 331和D4Mit 31之间，大致为4cM(在Mit图上确定的遗传距离；Dietvich,W.F.等，1994，自然，遗传学分册(NatureGenetics)7:220-245；Copeland,N.G.等，1993,Science 262:67；Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research，鼠遗传图谱，DatabaseRelease 10,April 28,1995)。应当指出的是，由Bahary等(1993，同上)确定的间距似乎比本文所确定的遗传图距小几个厘摩(cM)。参见图8，其中，D4Mit255和D4Mit31之间的距离大约为5.1cM。
通过比较上述famj5312的作图数据和db的作图数据发现，famj5312的图位距D4Mit255远端0.6±0.6cM，距D4Mit155近端0.6±0.6cM，完全符合obR是db基因的设想。
B..db小鼠的obR突变可产生一种截短的长型受体1..材料和方法由C57B1/KS(KS)和C57B1/KS-db(db)脉络丛和下丘脑制备总mRNA。用购自GIBCO-BRL的Superscript Reverse Transcviptase逆转录酶，用随机六聚体或Oligo dT作引物，由1μg mRNA的cDNA逆转录cDNA。共制备了24μg cDNA。为了进行PCR，将cDNA稀释1∶200倍，并将3μg稀释过的cDNA用于25μl的反应物中。
根据小鼠短型cDNA克隆、famj5312和长型cDNA克隆(图6)设计引物，使其覆盖短型和长型obR cDNA的编码区。由每种样品制备平均大小为600bp的重叠PCR片段。在0.8％的低熔点琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳。从凝胶上分离DNA并用琼脂糖酶酶解。用两种末端引物和内部引物对琼脂糖酶酶解的DNA片段测序。
PCR条件。25μl PCR反应物中含有2mM MgCl2,0.5mM每种引物，dATP、dTTP、dCTP和dGTP各200mM，和0.5单位的Taq聚合酶，溶于1×Taq聚合酶缓冲液(Perkin-Elmer)。所有PCR反应均在GeneAmp PCRSystem 9600(Pekin-Elmer)上进行。除非另作说明，一般的PCR参数为94℃下3分钟；94℃下10秒，57℃下10秒，72℃下40秒，35轮次，72℃下5分钟1轮次。
DNA测序和序列分析。在自动ABI 373A和377 DNA测序仪上，用Taq循环测序试剂盒(Applied Bio-systems,Fobter City,CA)进行DNA测序。用测序仪(Sequencher)进行序列分析。
2..结果用从KS和db小鼠的脉络丛中提取的mRNA进行半嵌套PCR。用dbcDNA作模板制备的PCR产物大约比用KsDNA作模板制备的产物长100bp。对两种PCR产物直接进行测序。在上述小鼠的脉络丛中表达的短型mRNA的编码序列内，未检测到序列差异。然而，在对由始于两种型式共有的跨膜域并止于长型所特有的胞内域所产生的PCR产物进行测序时，我们发现db/db和对照之间在几种组织中存在明显差异。测序数据表明，推定的db长型obR相比正常长型转录物量有一个106bp的插入片段(图9)。该106bp片段包括编码最后5个氨基酸的序列、终止密码子以及所述短型的88bp3′UTR区的序列。db长型能产生一种与所述短型相同的截短的ObR蛋白，它缺少胞内域。在所有db组织中均未检测到所述正常长型，在对照组织中也未检测到db长型。
为了了解这种明显的剪接错误的机制，我们比较了db/db小鼠和对照小鼠的obR基因组序列。在db/db小鼠的106bp插入位点之后紧邻的2bp处发现一个G→T的核苷酸变化。这种变化所产生的剪接供体能将所述106bp的片段转化成插入db长型中的外显子。由于上述插入作用，该db长型仅能产生一种不具备胞内信号域的截短蛋白。由于与ObR关系最密切的Ⅰ型细胞因子受体均具有长的胞间域，所述长型的长的胞间域对于启动胞内信号转导至关重要。上述资料所述受体在体重调节方面的作用，而不能产生ObR长型是db/db小鼠出现极度肥胖表型的原因。
Ⅸ..实施例克隆人ObR编码核酸本节将披露编码人ObR的cDNA和基因组DNA的克隆和鉴定。
A..克隆人Obr cDNA将所述famj 5312 cDNA插入片段用于检测购自Sratagene(La Jolla,CA)的建在Uni-Zap XR载体上的人胎脑cDNA文库。之所以选择源于人胎脑的cDNA文库，是因为该文库有可能含有存在于整个脑部的cDNA，包括脉络丛、小鼠obRcDNA组织源，以及存在于下丘脑中的cDNA。
以大约50,000pfu/板的密度将所述cDNA文库铺平板于20块平板上。用Amersham Hybond-N尼龙薄膜滤膜在每块板上重复进行滤膜吸附(lift)。按照标准方法将所述滤膜变性、中和和交联。在有32P标记的核苷酸的条件下，通过随机引导对探针进行放射性标记。让滤膜与探针在65℃下，在Church＇s缓冲液(7％SDS、250mM NaHPO4、2μM EDTA、1％BSA)杂交过夜。次日，在65℃下，在2×SSC/0.1％SDS中洗涤滤膜20分钟，然后在0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤10分钟。随后在-80℃下用其对Kodak胶片曝光5小时。
在对照比较重复的滤膜之后，获得了13个重复的信号。随后进行二次铺平板，将每种初级塞的10μl 1∶1000的稀释液铺平板。使用与上文所述相同的探针、杂交和洗涤条件。在80℃下对胶片曝光2小时。13个原始阳性信号中仅有一个在该胶片上产生重复信号。
对来自阳性平板的4个独立噬斑进行处理，并按照Stratagene披露的方法，用ExAssist辅助噬菌体、XLl-Blue细胞和SOLR细胞剪切。然后将剪切产物铺平板于LB/Amp平板上，并在37℃下培养过夜。从每个平板上挑取一个白色菌落，并在37℃下，在液体LB/Amp中生长过夜。次日，用Promega Witzard Mini-prep试剂盒进行小量制备。用EcoRⅠ和XhoⅠ消化该小量制备产物，测定插入片段的大小。4个克隆之一(d)具有一个大约6kb的插入片段。
用Qiagen Plasmid Maxi试剂盒制备供测序用的DNA。
图3表示人ObR cDNA的核苷酸序列(序列3)，它编码信号序列(氨基酸残基1至20左右)、胞外域(大约从氨基酸残基21～839)、跨膜域(大约从氨基酸残基840-862)和胞质域(大约从氨基酸残基863-1165)。
B..克隆人obR基因组DNA正如这里所披露的，本发明人克隆了人ObR基因组DNA。
将famj5312 cDNA插入片段用于检测购自Genome Systems Inc.的人高密度PAC滤膜(产品目录号FPAC-3386)。用Prime-It试剂盒(Stratagene；产品目录号300392)对探针进行随机引导的标记。按照生产商推荐的方法，在Amersham Rapid-hyb缓冲液中进行杂交。然后在65℃下，在2×SSC/1％SDS中洗涤滤膜，并在-80℃下对Kodak胶片进行曝光。
鉴定到11个推定的阳性PAC克隆。测定其方格位置，而所述克隆购自Geneme Systems,Inc.。
本发明人将方格位置P298-K6上的克隆命名为hobr-p87，通过用来自ObR开放读框的5＇(obRF4和obR R4)和3＇(obRS和obRO)末端的引物对进行的PCR测试进一步证实其含有整个ObR编码区。用于该验证实验中的引物如下obRF4:5＇-CTGCCTGAAGTGTTAGAAGA-3′obRR4:5＇-GCTGAACTGACATTAGAGGTG-3＇ohRS: 5＇-ACCTATGAGGACGAAAGCCAGAGAC-3′obRO: 5＇TGTGAGCAACTGTCCTCGAGAACT-3＇已于1995年12月28日将hobr-p87交由ATCC保存。
X..实施例构建ObR-免疫球蛋白融合蛋白A..制备OBR-IG融合蛋白将人ObR的胞外部分制备成与免疫球蛋白恒定区结合的融合蛋白。免疫球蛋白的恒定区可以具有遗传修饰，包括能减弱或消除免疫球蛋白结构所固有的效应活性的修饰(例如，参见PCT公开号WO 88/07089，
公开日1988年9月22日)。简单地讲，进行PCR重叠延伸，以便将编码人ObR的胞外部分的DNA连接于编码人IgG1的绞链区、CH2和CH3区的DNA。上述目的是按照在以下的小节中所披露的方法实现的。
B..制备基因融合体以100μl的最终体积制备PCR反应物，该反应物由Pfu聚合酶和含有引物(各1μM)、dNTPs(各200μM)、和1ng模板DNA的缓冲液(Stratagene)组成。
通过聚合酶链式反应(PCR)制备相当于结合Ob的编码ObR ECD或其一部分的DNA序列的DNA片段，所使用的引物对是为了扩增编码整个人ObRECD的序列以及少量5′非编码序列而设计的。例如，正向引物为5＇-GTCACGATGTCGACGTGTACTTCTCTGAAGTAAGATGATTTG-3＇相当于图3中的核苷酸-20至+8，在其5＇末端另有14个核苷酸(含有一个SalⅠ位点)。反向引物为5′-GTCAGGTCAGAAAAGCTTATCACTCTGTGTTTTTCAATATCATCTTGAGTGAA-3′相当于图3中核苷酸+2482至+2517的补体，在其5＇末端另有18个核苷酸(含有一个HindⅢ位点)。将一种编码人ObR的cDNA用作扩增胞外域的模板。用上述引物进行的PCR扩增能产生一种编码ObR胞外域的DNA片段。
在另一个PCR反应中，设计了用于扩增IgG恒定区(即绞链区、CH2区和CH3区)的第二组引物，以使反向引物有一个独特的限制位点，而正向引物的5＇末端互补于在前面的ObR ECD扩增中所用反向引物的5＇末端区(即5′-AAGCTTTTCTGACCTGACNNN-3＇)，这使得ObR编码核苷酸序列上的开放读框延伸至待扩增的IgG核苷酸序列的整个长度。该反应中所用的模板DNA是人IgG重链基因组DNA的2000个核苷酸的片段(Ellison等，1982,Nuc.Acids.Res 10:4071-4079)。
通过另一个PCR反应制备完整的人ObR-IgG融合片段。混合上述两个PCR反应的纯化产物，变性(95℃,1分钟)，然后复性(54℃,30秒)，使两种片段互补的末端退火。用dNTP和Taq聚合酶以及用第一个PCR反应的正向PCR引物和第二个PCR反应的反向PCR引物扩增的整个片段补平所述链。为了便于克隆到表达载体上，随后用能识别第一个PCR反应的正向PCR引物和第二个PCR反应的反向PCR引物上特别设计的位点的限制酶裂解所得到的片段。然后该消化过的片段克隆到同样用所述限制酶处理过的表达载体上。
将序列分析用于证实其结构，并将该结构用于转染COS细胞，以检测瞬时表达。
本领域技术人员知道，有多种因素影响待将所述ObR-IgG融合片段克隆至其中的表达载体的选择，如宿主生物的性质、实现所需转录和翻译控制的必需元件。例如，如果需要瞬时表达，可以上面制备的ObR-IgG融合片段克隆到表达载体pcDNA-1(Invitrogen)上。另外，通过将ObR-IgG融合片段克隆到表达载体pcDNA-3(Ivitrogen)上，可以实现融合蛋白的稳定表达。
另外，可以用诸如CD5-IgG1载体(由Amffo等披露，1990,Cell,61:1303-1313)的已含有IgG恒定区的表达载体制备小鼠和/或人ObR-IgG融合蛋白。按照上述方法，用一个PCR反应制备编码ObR胞外域的DNA片段，以使编码ObR胞外域的开放读框是连续的，并符合编码IgG恒定区的开放读框。
例如，用Extaq(PanVera Corp.)对小鼠和人ObR的胞外域(包括信号)肽进行PCR扩增。将以下引物用于在第一代表达结构中扩增小鼠和人ObR小鼠正向引物5′-CCCAATGTCGACATGATGTGTCAGAAATTCTAT-3＇反向引物5′-AAAAAGGATCCGGTCATTCTGCTGCTTGTCGAT-3＇人正向引物5′-CCCAATGTCGACATGGTGTACTTCTCTGAAGTA-3＇反向引物5′-TTTTTGGATCCCACCTGCATCACTCTGGTG-3＇上述每一个正向引物均含有一个SalⅠ限制位点，而上述每一个反向引物含有一个BamHⅠ限制位点。用所述小鼠和人obR cDNA作模板进行扩增，然后将所得到的PCR片段克隆到CD5-IgG载体(Aruffo等，1990,Cell)的XhoⅠ/BamHⅠ位点。将所得到的载体瞬时转染到COS细胞中，并制备条件培养基。用蛋白A对该条件培养基进行免疫沉淀(IP)，并通过SDS PAGE分析证实，小鼠ObR IgG融合蛋白的表达水平高于人ObR-IgG的表达水平。为了提高人ObR-IgG融合体的表达，设计能扩增人ObR胞外域(无信号肽)的引物，并将该片段和编码小鼠ObR的信号肽共连接到CD5-IgG载体上。将以下引物用于扩增与小鼠ObR信号肽融合的人ObRECD片段正向引物5′ -TTTAACTTGTCATATCCAATTACTCCTTGGAGATTTAAGTTGTCTTGC3＇反向引物5＇TTTTTGGATCCCACCTGCATCACTCTGGTG-3＇在扩增，限制酶消化和亚克隆之后，让所得到的结构在COS细胞中瞬时表达。对所得到的条件培养基所作的IP和SDS-PAGE分析证实了170KD人ObRIgG融合蛋白的成功表达。加强免疫球蛋白融合蛋白表达的另一种方法，包括以这种方式将ObR胞外域(不包括信号肽)插入CD5-IgG1载体中使CD5信号肽融合于成熟的ObR胞外域上。已证实这样一种信号肽的融合，可加强免疫球蛋白融合蛋白的表达。
C..制备修饰的CH2域可对按上述方法制备的ObR-IgG基因融合体的核苷酸序列进行修饰，用丝氨酸残基置换铰链区的半胱氨酸残基，和/或置换CH2域内被认为是IgG结合Fc受体及补体活化所必需的氨基酸。
修饰CH2域，置换被认为是与结合Fc受体相关的氨基酸的过程是按如下方法实现的。按上述方法制备质粒结构，提供用于修饰ObR-IgCγl CH2域的模板。用上文第一个PCR反应中所述的正向PCR引物和一种反向引物对该模板进行PCR扩增，将所述反向引物设计成与IgG1的CH2域的5′末端部分同源，所不同的是，所设计的改变氨基酸234、235和237的5个核苷酸置换(Canfield,S.M.和Morrison,S.L.(1991)实验医学杂志(J.Exp.Med.)173:1483-1491)分别为Leu-Ala、Leu-Glu、和Gly-Ala。用该PCR引物进行扩增，能产生一种由CH2域的修饰部分组成的DNA片段。在第二个PCR反应中，用上文所述第二个PCR反应中所用的反向引物和一种正向引物对该模板进行扩增，将所述正向引物设计成与该分子的Ig部分互补，并含有为CH2氨基酸置换所必须的5个互补核苷酸改变。用所述引物进行的PCR扩增，能产生一种由CH2域的修饰部分、一个内含子、CH3域和3＇端附加序列组成的片段。通过另一个PCR反应制备由修饰的CH2域组成的完整obR-IgCγl片段。混合上述两个PCR反应的纯化产物，变性(95℃,1分钟)，然后复性(54℃,30秒)，使两种片段的互补末端退火。用dNTP和Taq聚合酶以及用所述第一个PCR反应的正向PCR引物和第二个PCR反应的反向PCR引物扩增的完整片段补平所述链。为了便于克隆到所述表达载体上，随后用能识别所述第一个PCR反应的正向PCR引物和第二个PCR反应的反向PCR引物所特有的位点的限制酶裂解所得到的片段。然后将该消化过的片段克隆到同样用上述限制酶处理过的表达载体上。
将序列分析用于证实其结构，并将该结构用于转染COS细胞，以检验其瞬时表达。将hIgG ELISA用于测定/证实瞬时表达水平，对于所述结构来说，其表达水平为100ng蛋白/ml细胞上清液。转染CHO细胞系，以便永久表达该融合蛋白。
D..OBR-lg中和Ob蛋白为了证实ObR-IgG融合蛋白是否能在体外和在小鼠体内结合并中和OB蛋白(莱普亭)，用小鼠ObR-IgG融合蛋白对293个细胞进行大规模瞬时转染。在蛋白A柱上将ObR-IgG蛋白纯化至接近均相。并分析其抑制碱性磷酸酶-OB融合蛋白(AP-OB)结合细胞表面ObR的能力。
用小鼠ObR cDNA瞬时转染COS细胞，并测试其结合0.5nM AP-OB的能力。如图10所示，纯化的ObR-IgG能有效抑制或中和AP-OB融合蛋白与细胞表面ObR的结合。
图10中的第1栏表示在没有ObR-IgG融合蛋白的条件下观察到的高水平的特异结合。第2、3和4栏表示用3种不同的纯化ObR-IgG柱级分所观察到的对结合近乎完全的抑制。
Ⅺ..OBR长型具有IL-6型细胞因子受体的信号转导能力为了验证克隆的ObR同种型是否具有信号转导能力，将ObR基因导入所建立的组织培养细胞系，并将相应于OB处理的细胞反应与由结构上相关的IL-6型细胞因子受体介导的细胞反应加以比较。在该实例中所提供的结果证实了ObR长型是一种信号转导分子，并具有IL-6型细胞因子受体的功能特异性。
A..材料和方法1.细胞按已知方法培养COS-1、COS-7、H-35(Baumann等，1989,Ann.N.Y.Acad.Sci.557:280-297),HepG2和Hep3B(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257)细胞。在仅含有0.5％胎牛血清或添加了1μM地塞米松、0.1-1000ng/ml人OB、1000ng/ml小鼠OB、IL-6(Genetics Institute)或G-CSF(Immunex Corp.)的培养基中处理所述细胞。为了用gp130抑制信号转导，并用抗人gp130、B-R3的两种泛抑制的(pan-blocking)单克隆抗体(Chevalier等，1995,N.Y.Acad.Sci.762:482-484)和144的混合物(20μg/ml)处理细胞。
2..表达载体及CAT报导基因构建体上文披露了人ObR长型和小鼠ObR短型的表达载体(7-9节)。业已披露了截短的人G-CSFR(27)(Ziegler等，1993,Mol.Cell.Brol.,13:2384-2390)和大鼠STAT1、STAT3和STAT5B(Lai等，1995,J.Biol.Chem.,270:23254-23257；Ripperger等，1995,J.Biol.Chem.270:29998-30006)。通过重叠延伸PCR，用合成的编码特定氨基酸置换的寡核苷酸(Higuchi等，1988,Nucleic Acids Res.12:5707-5717)制备具有突变的框3(box3)序列(Y1141F)的ObR。该Y1141F的1141位上的酪氨酸被苯丙氨酸所取代。通过将密码子716和717转换成两个终止密码子，制备了含有截去55个羧基末端残基的大鼠STAT3的质粒SV-SPORT1(Life Technologies,Inc.)。先前已披露了CAT报导基因构建体，pHRRE_CAT和pIL-6RE-CAT(Lia等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257；Movella等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310)。
3..细胞转染及分析通过DEAE-葡聚糖方法(Lopata等，1989,Nucleic Acids Res.12:5707-5717)用质粒DNA转染COS-1、H-35和Hep3B细胞，通过磷酸钙方法(Graham等，1973，病毒学(Virology),52:456-461)转染HepG2细胞，并通过脂质转染胺方法转染COS-7细胞。将COS细胞的继代培养物在无血清培养基中保持16小时，然后通过用细胞因子处理15分钟激活STAT蛋白。按照Sadowski等(1993,Science,26:1739-1744)所披露的方法，用全细胞提取物通过EMSA测定STAT蛋白对DNA的结合作用。将高亲和性SIEm 67(Sadowski等，1993,Science,26:1739-1744)和TB-2(Ripperger等，1995,J.Biol.Chem.270:29998-30006)的双链寡核苷酸用作EMSA底物。用细胞因子或OB处理CAT基因转染过的细胞培养物24小时。通过检测细胞提取物系列稀释液对CAT活性进行定量，换算成共转染标记质粒pIE-MUP(Morella等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310)的表达，并以每一个实验系列的非处理对照培养物的值(定为=1.0)的相对值型式表示。大致按Cheng和Flangan所披露的方法(Cheng & Flanagan,1994,Cell,79:157-168)定量AP-OB融合蛋白的细胞表面结合力(6节)。
B..结果和讨论1..OBR活化STAT蛋白为了测定ObR是否具有恢复细胞信号转导器的能力，用两种代表性ObR型式-小鼠短型(也相当于在db/db小鼠中检测到的突变形)和人长型-的表达载体瞬时转染COS细胞。转染2天后，在1nM人或小鼠碱性磷酸酶-OB中培养细胞，通过所表现出的碱性磷酸酶-OB(AP-OB)融合蛋白的特异结合测定ObR的细胞表面表达。短型ObR的转染可导致结合作用比长型的结合作用大约高10倍。在多种AP-OB浓度下进行的Scatchard转化的结合数据表明，所观察到的长型的较低结合力主要为降低的细胞表面表达所致。小鼠短型结合鼠和人配体的亲和力为0.7nM，而人长型结合鼠和人配体的亲和力为1.0nM。
用人或小鼠ObR的表达载体(2μg/ml)和各种STAT蛋白(3μg/ml)对COS-1细胞进行共转染。通过ObR表达载体和各种STAT同种型所进行的共转染，可以分析由配体诱导的特定STAT蛋白的激活作用。在没有或有OB(100ng/ml)的条件下处理转染的细胞15分钟，并通过EMSA用诊断性寡核苷酸底物STE或TB-2鉴定对STAT蛋白结合DNA的激活作用。在上述实验中，仅有长型ObR能激活内源COS STAT蛋白或共表达的STAT1、STAT3或STAT5B。ObR对所有STAT同种型的激活作用都是配体依赖型的。相反，短型ObR不能激活任何内源或共转染的STAT蛋白，尽管其具有高的表面表达力。由于长型ObR能激活所有同样能由G-CSFR、LIFR和gp130激活的STAT蛋白(Kishimoto等，1995,Blood,86:1243-1245；Lia等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257)，推测该长型ObR能以IL-6型细胞因子受体的特异性刺激转录作用。
2..OBR信号诱导基因表达先前已将啮齿类和人肝癌细胞系用于确定异位表达的血细胞生成素受体的基因诱导作用(Baumann等，Mol.Cell.Biol.14:138-146)。随后，将3种互补的肝癌细胞系用于鉴定ObR信号转导。将长型或短型ObR或人G-CSFR连同HRRE-CAT报导基因结构一起导入大鼠H-35细胞，其在这些细胞中的表达通过许多血细胞生成素的信号而得以加强(Morrella等，1995,J.Biol.Chem.270:8289-8310)。仅用无血清培养基或含有细胞因子(mOB、LIF或IL-6)的有或没有地基米松的培养基处理继代培养物24小时。长型ObR介导了CAT基因表达的配体依赖型诱导。其激发作用得到了地塞米松的协同加强作用。由ObR介导的细胞反应十分类似于内源IL-6R的作用，但特征性地不同于内源LIFR的作用。相反，短型ObR未能诱导基因表达，这表明有34个残基的胞质域尽管有与框1相关的基序，但不能恢复细胞信号转导功能。具有被截短至27个残基的胞质域G-CSFR仍能在有配体的条件下诱导基因转录这一事实表明，所述细胞能对由一种血细胞生成素受体的短的、含有框1的胞质域作出反应。在G-CSFR-转染的对照细胞中不能诱导CAT基因表达这一事实表明，在没有转染的ObR的条件下，H-35细胞对OB无反应。
3..OBR独立于gp130起作用上面所披露的结果支持这样的模型长型ObR能重建类似于IL-6R的信号转导途径。接着，为了确定gp130是否是功能性ObR的一部分，将长型ObR连同HRRE-CAT或IL-6RE-CAT一起导入HepG2细胞，并测定抗gp130抗体的抑制作用。
用小鼠或人OB处理转染的HepG2细胞，能产生类似的、强的诱导作用，其作用强度落在由IL-6所产生作用的范围内(30-40倍的激发作用)。剂量效应分析表明，用100ng/ml OB可获得最大的调节作用。在4个独立实验中证实，1-5ng/ml OB可产生1/2最大激发作用，1000ng/ml的浓度所产生生的激发作用一致性地低于最大值。在有已知其能抑制所有IL-6型细胞因子受体的信号转导的抗人gp130单克隆抗体(Chevalier等，1995,N.YAcad.Sci.762:482-484)的条件下，IL-6对基因表达的激发作用正如预料般地被破坏了，而OB的调节作用未受影响。上述结果表明，ObR是独立于gp130起作用(对抗gp130不敏感)，而且，通过受体的同源寡聚化可以触发信号启动。
4..OBR的框3序列和STAT3与信号转导有关由IL-6 RE诱导转录是IL-10R的血细胞生成素受体的特征，该受体的胞质域内至少有一个拷贝的框3基序(YXXQ)(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257)。已证实框3序列因其在受体相关激酶激活方面的作用而参与重建STAT3与受体的结合(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257；Stahl等，1995,Science 267:1349-1353)。长型ObR(图3)在氨基酸位置1141-1144上含有一个拷贝的框3基序，这可能是STAT3的激活作用和IL-6RE-CAT的转录激发作用的原因。为验证ObR的框3基序和STAT3是否与ObR的基因诱导作用相关，使用两种互补的试剂一种框3突变型ObR和一种显性失活STAT3。通过将氨基酸位置1141上的酪氨酸诱变成苯丙氨酸(Y1141F)测定框3序列在长型ObR上所起作用。用野生型ObR或ObRY1141F的表达载体(2μg/ml)连同pHRRE-CAT或pIL-6RE-CAT一起转染HepG2和H-35细胞。用人OB(100ng/ml)处理细胞，并测定CAT活性的相对变化。将突变型ObR转染到HepG2细胞中所产生的对HRRE-和IL-6RE-CAT报导基因结构的激发作用低于野生型ObR的激发作用。例如，在HepG2细胞和H-35细胞中，HRRE-CAT表达的激发作用降低了40倍。IL-6RE-CAT的激发作用在HepG2细胞中降低了20倍，而在H-35细胞中降低了100倍。对照实验表明，突变型ObR的减了的信号转导活性并非由于破坏了表面表达，正如由AP-OB结合所证实的。突变的相对作用在IL-6RE上的表现比在HRRE上的表现更为明显。用H-35细胞所做的一个类似实验证实，框3突变与IL-6RE调节作用的丧失相关，而HRRE的调节作用仅受到很小的影响。这一结果与先前的观察一致，即在某些细胞系中，STAT3的恢复在由IL-6RE介导的基因诱导方面的作用大于在由HRRE介导的基因诱导方面的作用(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257；Morella等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310；Wang等，1995,Blood 86:1671-1679)。
Y1141F ObR突变型的降低的基因调控作用还与STAT蛋白较低的激活作用相关。当像转染野生型ObR般地将突变型ObR转染到COS-1细胞中时，未检测到内源COS STAT蛋白的激活作用。另外，ObR Y1141F在激活超量表达的STAT1和STAT3方面的作用比野生型ObR低大约10倍。不过，STAT5B的激活作用不受该突变的影响。由ObR Y1141F对STAT的激活作用的上述特征，与在框3缺陷型gp130(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257)和G-CSFR(Movella等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310)上所观察到的结果相吻合，并能解释在报导基因结构调节方面的特殊变化。
STAT3的信号转导作用是利用STAT3 55C的超量表达确定的，STAT355C是一种突变型STAT3，其羧基末端的55个残基被截去了，在对基因转录的作用方面，它起着STAT3的显性失活抑制剂的作用。诸如上文11.2.1节中所披露的DNA结合试验证实，长型ObR能有效激活STAT3 55C的DNA结合活性。STAT3 55C基本上能破坏由ObR介导的IL-6RE的诱导作用，并能将HRRE的作用减弱50％。上述资料表明，在肝细胞中，有ObR参与的信号转导途径同样为IL-6-型细胞因子受体所利用，而且对STAT3 55C敏感。
5..OBR能利用STAT3和STAT5B基因诱导特定的报导基因结构在HepG2或H-35细胞中的诱导作用最大，而且不会受到超量表达的野生型STAT蛋白的明显加强。为了证实由ObR激活的STAT蛋白是否起着正调节物的作用，用人ObR连同pIL-6RE-CAT或pHRRE-CAT和STAT蛋白的表达载体一起转染人Hep3B细胞。相对非处理的对照测定人OB(100ng/ml)对CAT活性的激发作用(平均值±S.D.；N=3-4)。所述肝癌细胞仍能表达功能性IL-6R，但缺乏针对其它IL-6-型细胞因子的受体(Baumam等，1994,Mol.Cell.Biol.14:138-146)。而且，所述细胞具有较低含量的STAT3和-5，因此，可通过STAT蛋白超量表达所获得的功能测定ObR的信号转导。由上述实验所得出的结果表明，超量表达的STAT3可介导IL-6RE的诱导作用增加15倍。超量表达的STAT31和STAT5B可分别将由ObR介导的HRRE-CAT的诱导作用提高5倍和30倍。
C..结论上文所提供的结果表明，全长ObR是一种信号转导受体，其作用模式与IL-6-型细胞因子受体相关。这些数据还支持这样的假设，即截短的ObR变体，如在很多组织中表达的或由db突变型转录物编码的短型，要么是信号转导不能的，要么产生一个减弱了的信号转导的所有组成成分，弱到无法用本文所使用的工具检测到。在肝细胞中在基因表达水平上实现的OB反应的重建这一事实有说服力的提示我们，同样的过程也可能发生在下丘脑细胞中或其它能正常表达全长ObR的细胞类型中。ObR是通过STAT蛋白与特定信号转导途径关联，以及有关这些蛋白是通过可鉴别的DNA结合元件控制基因的特异性的知识，可能有助于确定ObR的直接作用，这与理解OB在体内的作用相关。上文所提供的实验系统还可被用于研究有关天然存在的短型ObR在其长型的功能调节方面的功能性作用(如果有这样的作用的话)。
12..OBR的突变分析为了确定ObR胞质区上对激活基因重要的区域，产生了一系列突变体，并进行了分析。下面所披露的研究，确定了两个对诱导基因表达至关重要的ObR胞质域的独特区域。
12.材料和方法12.1.1细胞用Baumann等所披露的方法(1989,Ann.N.Y.Acad.Sci.557:280-297)培养COS-1、COS-7和H-35细胞。在含有0.5％胎牛血清和1μM地塞米松的培养基中进行模拟激发，或在添加了100ng/ml人莱普亭(Roche)、IL-6(Genetics Institute)或G-CSF(Immunex Corp)的同一种培养基中处理。
12.1.2表达载体和CAT报导基因结构用于长型人ObR的表达载体已在上文(第9节)中披露，而大鼠STAT1、STAT3和STAT5B已在现有技术中披露(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257；Ripperger等，1995,J.Biol.Chem.270:29998-30006)。通过PCR制备pOB-RΔ1115-1165、pOB-RΔ1065-1165和pOB-RΔ965-1165，它们均编码羧基末端截短的人ObR。简单地讲，将跨人ObR的胞内域的寡核苷酸用于制备特定氨基酸的框内终止密码子。用EcoRⅤ和XbaⅠ消化PCR片段，并将该片段亚克隆到用EcoRⅤ和XbaⅠ消化过的人ObR上。用类似方法制备pOB-RΔ868，但使用能产生一个MscⅠ-XbaⅠ片段的引物，由该片段取代内源人ObR序列。按照在11.1.2节中披露的方法制备编码具有突变的框3序列的人ObR的pOB-RY1141F。ObR突变体pOB-R(boxlmt)在其ObR框1基序中含有PNP→SNS的变化(aa876和878)；而突变型pOB-RY986F和pOB-RY1079F是通过重叠延伸PCR制备，制备时使用合成的寡核苷酸，该寡核苷酸编码特定的Tyr→Phe的氨基酸置换(Higuchi等，1988,Nucleic Acids Res.16:7351-7367)。CAT报导基因结构pHRRE-CAT和pIL-6-CAT已在现有技术中披露(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257；Movella等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310)。
12.1.3细胞转染及分析通过DEAE-葡聚糖方法(Lopata等，1984,Nucleic Acids Res.12:5707-5717)转染COS-1和H-35细胞，并通过脂转染胺方法(Tarstaglia等，1995,Cell 83:1263-1271)转染COS-7细胞。为了分析STAT的激活作用，将COS细胞在无血清培养基中保持16小时，接着用100ng/ml莱普亭或G-CSF处理细胞15小时。
为了进行CAT分析，将转染过的细胞培养物细分，并用配体处理24小时。测定CAT报导基因活性，并以每个实验系列的非处理对照所得到的值的相对值型式表示。按照Sadowski等所披露的方法(1993,Science 26:1739-1744)，通过对全细胞提取物进行电泳迁移率变动分析(EMSA)分析STAT蛋白对DNA的结合。在EMSA中，用放射标记的双链寡核苷酸SIEm67(用于STAT1和STAT3)和TB-2(用于STAT5B)作结合底物。按照Cheng和Flangan所披露的方法(1994,Cell 79:157-168)，通过定量AP-OB融合蛋白细胞表面结合力分析COS细胞中的受体表达。
12.1.4免疫印迹所有免疫印迹均按Baumann等所述方法(1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:XXX-XXX)进行，并按照生产商(Amersham)的说明，通过加强的化学发光检测显现免疫活性蛋白。对STAT5B特异的兔多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology。
12.2结果和讨论如上所述，ObR是Ⅰ型细胞因子受体超家族的一员。这一类型的受体缺乏内源性酪氨酸激酶活性，并且是由配体诱导的受体同源二聚化或异源二聚化激活的。在很多场合，活化作用需要激活Janus家族(JAKs)的受体相关激酶(Ihle等，1994，生物科学动态(Trends.Biol.Sci.)19:222-227)。JAK与细胞因子受体的胞内部分的近膜域相关，在由配体诱导的受体激活作用之后启动信号转导途径。JAK蛋白的下游目标包括转录因子的STAT(SignalTransducers and Activators of Transcription)家族的成员(Ihle等，1994,Trends.Biol.Sci.19:222-227)。STAT是DNA结合转录因子，它含有Src-同源(SH2)域，它能通过磷酸化酪氨酸残基与受体分子相互作用。STAT由酪氨酸的磷酸化作用激活，形成异源二聚体或同源二聚体，转运到胞核中，并调节靶基因的转录。
12.2.1 OBR胞内域至少包括2个对信号转导有重要作用的区域为了确定ObR胞质域中信号转导所需的区域，制造一系列的C-末端缺失突变体(图11A)。将编码这些突变体的cDNA连同IL-6RE-CAT或HRRE-CAT报导结构一起瞬时共转染到H-35细胞中，并测定其激发转录的能力(图11B)。除掉ObR的框3序列(aa 1141-1144)的C-末端截短作用，破坏了由IL-6-RE引起的转录激活作用(图11B；上图)。这一结果与单个框3基序中Y→F突变的事实或ObR在H-35细胞中通过IL-6RE彻底破坏信号转导(11.2.4节)的情况吻合。相反，除去极端C-末端序列对通过HRRE进行的ObR信号转导的减弱作用很小，直到除去位置868-965之间的大约97个氨基酸之后才能彻底破坏其信号转导作用(图11B)。
为了确保各种ObR突变体的表达载体能指导表面定位受体蛋白的合成，通过AP-OB结合研究测定用各种结构转染的COS细胞的受体表达。由ObR C-末端截短所产生的蛋白，是在表面上表达，并与配体结合(图12)。而且，ObR的表达水平随胞内域的渐进性截短而提高。
如上文所述，通过IL-6RE进行的ObR基因诱导与STAT1和STAT3的激活作用相关，而且，已证实通过HRRE完成的ObR基因诱导与STAT5B的激活作用相关。为了进一步评价HRRE激发和STAT5B激活作用之间的关系，用STAT5B的表达质粒和ObR缺失突变体共转染COS细胞。用这些细胞制备提取物，对该提取物所做的免疫印迹表明STAT5B是以相对均等的量在每一种转染培养物中表达。用莱普亭处理细胞。做EMSA分析，并通过Western印迹定量STAT蛋白含量。ObR的渐进性C-末端截短，可导致其激活STAT5B的能力减弱，而且，只有在除去近膜ObR片段之后(结构pOBRΔ868-1165)才丧失可检测的STAT5B激活作用。因此，ObR STAT5B激活作用的丧失和通过HRRE进行的基因诱导之间似乎存在相关性。
为了确定保守性胞内域酪氨酸残基和近膜框1基序在由HRRE进行的ObR信号转导中的作用，制备了突变体OB-RY1141F、OB-RY986F、OB-RY1079F和OB-R(boxlmt)(图13A)。当在COS细胞中分析时，AP-OB结合研究证实，上述突变体大致表达在细胞表面，野生型ObR也是如此。在将OB-RY986F和OB-RY1079F转染到H-35细胞中后，其调节HRRE的能力未变(图13B)。相反，ObR框1基序的突变会使由该元件实现的对基因诱导的调节作用完全丧失。因此，ObR的框1基序似乎是决定ObR激活能通过HRRE调节基因诱导的激活途径的重要决定因素。
由ObR通过IL-6RE进行的基因诱导需要接近ObR的极端C-末端的序列(图11B)。相反，通过HRRE进行的ObR基因诱导似乎不需要这些C-末端序列。另外，除去ObR胞内域序列的氨基酸965-1165之间的大约200个氨基酸之后仅对由所述元件进行的基因诱导产生很小的影响，而是取决于氨基酸868-965之间的大约17个氨基酸的近膜序列。因此，所提出的ObR框2基序(Lee等，1996,Nature 379:632-635)(从ObR aa 1066-1075)似乎对由HRRE进行的基因诱导不产生作用。EMSA分析表明，HRRE的基因诱导作用与ObR激活STAT5B的能力相关。有趣的是，已完全缺失了所有胞内域酪氨酸残基、并因此缺失了所有潜在的SH2停靠位点的OB-RΔ965-1165，依然能够低水平进行STAT5B激活，并通过HRRE进行转导激发。只有当ObR的近膜序列被除去之后(OB-RΔ868-1165)，HRRE基因诱导作用和STAT5B的激活作用才会完全丧失。与此吻合的是，含有突变型框1基序的OB-R(box lmt)同样不能诱导由HRRE实现的基因诱导作用，并可因此推测其不能激活STAT5B。
13.OBR的多聚化ObR的一级结构提示，它与IL-6-型细胞因子受体信号转导亚基的关系极为密切。这一类型的成员可通过异源二聚化或同源二聚化而被激活(Kishimeto等，1994,Cell 76:253-262；Heldm等，l995,Cell 80:213-223)。前者包括IL-6的受体、白血病抑制因子(LIF)、制癌蛋白M、IL-11和睫状神经营养因子(CNTF)，它们均拥有共同的信号转导物gp130(Kishimoto等，1994,1994,Cell 76:253-262；Taga等，1989.Cell58:573-581)。不过，早先我们已发现ObR似乎独立于gp130进行信号转导(Baumann等，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:XXX-XXX)。因此，ObR可以在有关其它辅助链的条件下起作用，如被IL-3、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-5(IL-3Rβ)、或IL-2、IL-4、IL-7和IL-9(IL-2Rγ)的受体所共用的信号转导亚基。不过，ObR可在不能表达IL-3Rβ或IL-R-γ的肝癌细胞中转导信号(Wang等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310)。另外，ObR可以被同源二聚化所激活，正如由粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)所证实的(Fukanaga等，1991,EMBO J.10:2855-2865；Ishezaka-Ikeda等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:123-127)。因此，为了确定ObR是否具有二聚化并以同源二聚体的型式进行信号转导，构建了编码与ObR的胞内域结合的G-CSFR胞外域的嵌合受体，或具有与G-CSFR的胞内域结合的ObR胞外域的反复受体(reciprocal receptor)，并对其进行了分析(图14)。
13.1材料和方法13.1.1.细胞按照Baumann等所披露的方法(1989,Ann.N.Y.Acad.Sci.557:280-297)培养COS-1、COS-7和H-35细胞。在含有0.5％胎牛血清和1μM地塞米松的培养基中对细胞进行模拟刺激，或用添加了100ng/ml人莱普亭(Roche)、IL-6(Genetics Institute)、或G-CSF(Immunex Corp.)的同一种培养基进行处理。
13.1.2表达载体及CAT报导基因结构长型人ObR的表达载体如上文所述(第9节)，全长G-CSFR或截短的G-CSFR(ΔCyto)(Ziegler等，1993,Mol.Cell.Bvol.13:2384-2390)，以及大鼠STAT1、STAT3和STAT5B已在现有技术中披露(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257；Ripperger等，1995,J.Biol.Chem.270:29998-30006)。在本文中，术语“Δcyto”是指胞质域的缺失。G-CSFR/ObR嵌合受体是通过PCR制备的，它编码人G-CSFR的胞外域(aa1-598)，该胞外域邻接人ObR的跨膜域和胞内域(aa829-1165)。通过PCR制备ObR/G-CSFR嵌合受体，它编码与人G-CSFR的胞内域(aa631-813)结合的小鼠ObR胞外域和跨膜序列(aa1-860)。CAT报导基因结构、pHRRE-CAT和pIL-6-CAT已在现有技术中披露(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257；Morella等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310)。
13.1.3细胞转染和分析用DEAE葡聚糖方法(Lopata等，1984,Nucleic Acids Res.12:5707-5717)转染COS-1和H-35细胞，并用脂转染胺方法(Tartaglia等，1984,Cell 83:1263-1271)转染COS-7细胞。为了分析STAT蛋白激活作用，在无血清培养基中保持COS细胞16小时，随后用100ng/ml莱普亭或G-CSF处理细胞15分钟。
为了做CAT测定，对转染的细胞培养物进行细分，并用配体处理24小时。测定CAT报导活性，并以所获得的每个实验系列的非处理对照培养物的值的相对值型式表示。按照Sadowski等所披露的方法(1993,Science 26:1739-1744)，用全细胞提取物作电泳迁移率变动分析，以分析STAT蛋白的DNA结合力。在该EMSA分析中，将放射标记的双链寡核苷酸SIEm67(用于STAT1和STAT3)和TB-2(用于STAT5B)用作结合底物。按照Cheng和Flangan所披露的方法(1994,Cell 79:157-168)，通过定量AP-OB融合蛋白的细胞表面结合力分析COS细胞中的受体表达。
13.1.4免疫印迹所有免疫印迹均按Baumann等所披露的方法进行(1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:XXX-XXX)，并按照生产商(Amersham)所披露的方法，通过加强的化学发光检测显现免疫活性蛋白。对STAT5B特异的兔多克隆抗血清购自Santa Curz Biotechnology。抗细菌表达的G-CSF-R胞外域的山羊多克隆抗血清是在Roswell Park Cancer Institute Springville Laboratories制备的。
13.2结果和讨论下面将披露的实验提示，尽管ObR胞质域的二聚化可能足以进行信号转导，但随着配体结合，也可形成较高级别的同源寡聚体。
13.2.1同源二聚化OBR胞内域可能足以进行信号转导由于已证实嵌合受体复合体对于分析细胞因子受体激活作用十分有效(Movella等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310；Vigon等，1993，癌基因(Oncogene)8:2607-2615；Baumann等，1994,Mol.Cell.Biol.14:138-146)，制备了ObR/G-CSFR和G-CSFR/ObR嵌合体，并进行了研究，作为分析ObR信号转导机制的一种工具(图14A)。为了分析G-CSFR/ObR嵌合受体是否能够产生与野生型ObR相当的配体诱导的信号，测试该嵌合体的STAT激活作用和转录激发作用。G-CSFR/ObR与STAT蛋白的共转染产生了一种由G-CSF-诱导的STAT1、STAT3和STAT5B激活作用。这一结果与由OB在ObR转染的细胞中诱导的STAT蛋白激活作用相似。通过对用G-CSFR/ObR转染的培养物进行免疫印迹分析证实了嵌合受体的表达。上述结果表明，由G-CSF介导的ObR胞质域的二聚化，可产生一种ObR-类型的STAT蛋白的激活作用。另外，已发现G-CSFR/ObR嵌合体可以激发转录作用，这一结果是在用IL-6RE和HRRE报导结构对H-35细胞进行受体共转染之后，通过检测该细胞中的基因诱导而测定的(图14B)。已发现所诱发的反应类似于ObR或内源IL-6R所述报导基因结构的诱导作用。
上述结果表明，两个ObR胞质域的同源二聚化可启动由ObR进行的信号转导，类似于由野生型G-CSFR实现的介导信号转导的机制。不过，G-CSFR/ObR嵌合体不能确切地证明OB配体具有使ObR胞外域二聚化的能力。因此，分析了由含有与G-CSFR胞内域结合的ObR胞外域的相互嵌合体产生的信号转导活性(图14A)。事实上，ObR/G-CSFR嵌合体可以介导相当于由野生型ObR、G-CSFR/ObR和野生型G-CSFR的基因诱导作用(图14B)。因此，综合上述结果表明，ObR无须辅助链来进行信号转导，而且，两个ObR胞内域的聚合似乎足以实现受体激活。
两个ObR胞内域的聚合足以产生一个伴随配体诱导的激活作用的信号这一事实表明，ObR可通过受体的同源二聚化起作用。如果是这样的话，由ObR实现的信号转导可能是“有害的”，即超量表达一种信号转导缺陷型同源二聚化配偶体，类似于受体酪氨酸激酶家族成员所表现出的特征(Paulson等，1989,J.Biol.Chem.264:17615-17618；Svensson等，1990,J.Biol.Chem.265:20863-20868；Wen等，1992,J.Biol.Chem.267:2512-2518；Fantl等，1993,Annu.Rev.Biochem.62:453-481)。如上文所述(第12节)，仅含有胞质域的6个近膜氨基酸的ObR是信号转导缺陷型(图11B)。因此，进行了实验，以确定一种截短的、信号转导缺陷型ObR的表达是否会破坏由全长ObR进行的信号转导。用截短的受体OB-RΔ868-1165和全长ObR对细胞进行共转染，并测定这种复合体激发一种报导基因结构表达的能力，其中，OB-RΔ868-1165的量相对全长ObR是逐渐加大的。用量逐渐加大的截短ObR不会减弱由野生型受体进行的信号转导(图15A)。不过，即使在截短受体的用量大大超出全长受体用量的情况下，所观察到的信号转导抑制也未能达到由超量表达和信号转导缺陷型截短G-CSFR(Δcyto)对G-CSFR信号转导的抑制(图15A和15C)。所观察到的ObR和G-CSFR对显性失活阻抑的不同的敏感性，是其胞外域的特征，这是由用受体嵌合体进行的显性失活研究所证实的(图15B和15C)。
对obR这种弱的显性失活阻抑加一种可能的解释是，两个ObR分子的相互作用可能需要位于所述受体胞内区的功能域。为了验证这种可能性，检验了由一种突变性受体进行的ObR显性失活阻抑，该突变型是通过ObR框3基序中的一个氨基酸置换(Y1141F)产生的信号转导缺陷而实现的。如上所述，这种突变可完全破坏H-35细胞中由IL-6RE实现的ObR调节基因诱导的作用(第12节)。因此，对OB-R(Y1141F)抑制由该增强因子实现的野生型ObR信号转导的能力进行了研究。所述研究表明，提高转染突变型OB-RY1141F对野生型受体的比例，不会明显抑制信号转导(图15E)。因此，ObR框3突变体和OB-RΔ868-1165在其反式阻抑野生型ObR的信号转导方面的能力表现相似。有趣的是，截短的或框3突变型ObR受体的低水平表达，可产生对野生型ObR信号转导作用的轻度加强作用。而且，在有用量逐渐加大的截短OB-RΔ868-1165的条件下，还可观察到ObR/G-CSFR信号转导的类似特征(图15A、15B和15C)。
如上所述(第11节)，ObR可以在有IL-6-型细胞因子受体的gp130信号转导因子的中和抗体的条件下，在肝癌细胞中转导信号。而且，所述肝癌细胞不能表达其它特征性的细胞因子受体辅助链IL-2Rγ或IL-3Rβ(Wang等，1995,Blood 86:1671-1679；Morella等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310)。因此，ObR可能是通过一个与受体同源二聚化相关的机制起作用。在Ⅰ型细胞因子受体家族的成员中，推测由G-CSFR进行的信号转导，是通过配体诱导的受体同源二聚化而启动的(Fukanaga等，1991,EMBO J.10:2855-2865；Ishezaka-IKeda等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.90:123-127)。如上所述，已证实将嵌合受体用于分析细胞因子受体激活作用是十分有效的(Movella等，1995，同上；Vigon等，1993，同上；Baumann等，1994，同上)，制备了ObR/G-CSFR和G-CSFR/ObR嵌合体，并将其作为分析ObR信号转导的工具加以研究。所述研究揭示，G-CSFR/ObR嵌合体可有效启动IL-6RE-CAT和HRRE-CAT报导结构的转录作用(图14B)。由于G-CSFR在结合G-CSF时被认为可形成同源二聚体，这意味着两个胞内ObR域的聚合足以启动受体信号转导。ObR/G-CSFR嵌合体还以这种方式通过IL-6RE和HRRE介导转录激活作用(图14B)。上述结果表明，莱普亭结合可以使两个ObR胞外域二聚化，由此引发至少两个胞内G-CSFR域的结合，并激活所述受体复合体。而且，上述结果表明，可以制备出能像ObR激动剂那样通过两个ObR链的简单交联而起作用的小型分子或抗体。
正如就可通过简单的同源二聚化而激活的受体所预测的那样，一种信号转导缺陷型同源二聚化配偶体的共表达，可大大减弱由全长G-CSFR和G-CSFR/嵌合体实现的信号转导。不过，OB-RΔ868-1165不能如此有效地抑制由全长ObR或ObR/G-CSFR嵌合体进行的信号转导。因此，可能的情况是，莱普亭与细胞表面受体的结合可导致较高级别的寡聚化(受体数＞2/复合体)，正如在IL-10受体复合体上所证实的(Tan等，1995,J.Biol.Chem.21:12906-12911)以及在活化素/TGF-βR家族的成员上所证实的(Brand等，1993,J.Biol.Chem.268:11500-11503；Weiser等，1993,Mol.Cell.Biol.13:7239-7247；Wrana等，1994,Cell 71:1003-1014；Moustakas等，1993,J.Biol.Chem.268:22215-22218；Henis等，1994,J.Cell Biol.126:139-154)。按照这一模式，由全长ObR或ObR/G-CSFR嵌合体进行的配体结合，可导致两个以上受体链的聚合，而且，只是两个胞内域的并列对于信号发生来说就足够了。预计这种复合体对显性失活阻抑的抵抗力很强。含G-CSFR/ObR嵌合体的复合体中的G-CSFR(Δcyto)对信号转导的强有力的抑制表明，当处于简单的同源二聚体结构的前后时，ObR胞内域会受到有效抑制。尽管OB-RΔ868-1165有可能处于细胞膜上与野生型ObR不同的部位，但ObR胞内域的一个酪氨酸残基的突变(Y1141F)似乎不大可能导致改变了的受体膜定位。因此，我们对由OB-RΔ868-1165或OB-RY1141F介导的类似抑制效应的观察表明，我们的结果并非是由改变了的膜定位所致。OB-RΔ868-1165和OB-RY1141F低的表达水平，可以小规模地增强全长ObR和ObR/G-CSFR嵌合体的信号转导。我们推测，这一效果可归因于配体呈递(Andres等，1989,(细胞生物学杂志)(J.Cell Biol.)109:3137-3145；Massaugue等，1992,Cell 69:1067-1070；Lin等，1993，(细胞生物学动态)(Trends.Cell Biol.)3:14-19)或配体转移，正如早先在TNF受体上所证实的(Tarstaglia等，1993,J.Biol.Chem.268:18542-18548)。
如上所述，短型ObR可能在体内起着转运或清除功能(Tartaglia等，1995,Cell 83:1263-1271)。不过，长型和短型ObR可能在功能上相互作用的可能性提示我们，短型ObR可以调节长型ObR的活性。这一结论得到了在小鼠体内主要的天然形成的非信号转导短型ObR(含有34个氨基酸的胞内域)，它还相当于存在于db/db小鼠中的突变形ObR，可抑制长型受体信号转导的事实的支持。
14.微生物的保藏已于标明的日期将下列微生物交由美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville,Maryland)保藏，并被授予所标明的保藏号微生物 克隆ATCC保藏号 保藏日期大肠杆菌菌株 famj5312 6995211月22日19955312B4F3大肠杆菌h-ObRDfahj5312d6996312月5日1995大肠杆菌h-ObR-p87 h-ObR-p876997212月28日1995本发明并不局限于由本文所披露的具体实施方案限定的范围，这些实施方案只是就本发明的某一方面进行说明的，而且，功能上等同的方法及要素也属于本发明的范畴。事实上，除了本文所图示和说明的方案之外，本领域技术人员通过阅读上述说明书及附图可以很容易地理解本发明的各种改进。这些改进被视为落在所附权利要求书的范围内。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人Tartaglia,Louis A.
Tepper.RobertⅠ.
Culpepper,Janice A.
White,David W。
(ⅱ)发明名称Ob受体及诊断和治疗体重疾病的方法(ⅲ)序列数50(ⅳ)相关地址(A)收件人Fish和Richardson P.C.
(B)街道225 Franklin Street(C)城市Boston(D)州Massachusetts(E)国家U.S.A.
(F)邮编021001-2804(ⅴ)计算机可读型式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件WordPerfect(Version 5.1)(ⅵ)当前申请资料(A)申请号US 08/708,123(B)申请日1996.09.03(C)分类(ⅶ)在先申请资料(A)申请号US 08/638,524(B)申请日1996.04.26(ⅶ)在先申请资料(A)申请号US 08/599,455(B)申请日1996.01.22(ⅶ)在先申请资料
(A)申请号US 08/583,1 53(B)申请日1995.12.28(ⅶ)在先申请资料(A)申请号US 08/570,142(B)申请日1995.12.11(ⅶ)在先申请资料(A)申请号US 08/569,485(B)申请日1995.12.08(ⅶ)在先申请资料(A)申请号US 08/566,622(B)申请日1995.12.04(ⅶ)在先申请资料(A)申请号US 08/562,663(B)申请日1995.11.27(ⅷ)律师/代理人资料(A)姓名Meikeljohn,Ph.D.,Anita L.
(B)注册号35,283(C)文件/档案号07334/019001(ⅸ)电信资料(A)电话(617)542-5070(B)传真(617)542-8906(C)电传200154(2)序列1资料(ⅰ)序列特征(A)长度3097bp(B)类型核酸(C)链型双(D)拓朴结构不详(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS
(B)位置61..2742(ⅹⅰ)序列描述序列1GTCGACCCAC GCGTCCGGAG GAATCGTTCT GCAAATCCAG GTGTACACCT CTGAAGAAAG60ATG ATG TGT CAG AAA TTC TAT GTG GTT TTG TTA CAC TGG GAA TTT CTT108Met Met Cys Gln Lys Phe Tyr Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Leu1 5 10 15TAT GTG ATA GCT GCA CTT AAC CTG GCA TAT CCA ATC TCT CCC TGG AAA156Tyr Val Ile Ala Ala Leu Asn Leu Ala Tyr Pro Ile Ser Pro Trp Lys20 25 30TTT AAG TTG TTT TGT GGA CCA CCG AAC ACA ACC GAT GAC TCC TTT CTC204Phe Lys Leu Phe Cys Gly Pro Pro Asn Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu15 35 40 45TCA CCT GCT GGA GCC CCA AAC AAT GCC TCG GCT TTG AAG GGG GCT TCT252Ser Pro Ala Gly Ala Pro Asn Asn Ala Ser Ala Leu Lys Gly Ala Ser50 55 60GAA GCA ATT GTT GAA GCT AAA TTT AAT TCA AGT GGT ATC TAC GTT CCT300Glu Ala Ile Val Glu Ala Lys Phe Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Val Pro65 70 75 80GAG TTA TCC AAA ACA GTC TTC CAC TGT TGC TTT GGG AAT GAG CAA GGT348Glu Leu Ser Lys Thr Val Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gln Gly85 90 95CAA AAC TGC TCT GCA CTC ACA GAC AAC ACT GAA GGG AAG ACA CTG GCT396Gln Asn Cys 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GAG2988Ala Asn Phe Ser Gly Ser Gln Ser Thr Gln Val Thr Cys Glu Asp Glu965 970 975TGT CAG AGA CAA CCC TCA GTT AAA TAT GCA ACT CTG GTC AGC AAC GAT3036Cys Gln Arg Gly Pro Ser Val Lys Tyr Ala Thr Leu Val Ser Asn Asp980 985 990AAA CTA GTG GAA ACT GAT GAA GAG CAA GGG TTT ATC CAT AGT CCT GTC3084Lys Leu Val Glu Thr Asp Glu Glu Gln Gly Phe Ile His Ser Pro Val995 10001005AGC AAC TGC ATC TCC AGT AAT CAT TCC CCA CTG AGG CAG TCT TTC TCT3132Ser Asn Cys Ile Ser Ser Asn His Ser Pro Leu Arg Gln Ser Phe Ser101010151020AGC AGC TCC TGG GAG ACA GAG GCC CAG ACA TTT TTC CTT TTA TCA GAC3180Ser Ser Ser Trp Glu Thr Glu Ala Gln Thr Phe Phe Leu Leu Ser Asp1025103010351040CAG CAA CCC ACC ATG ATT TCA CCA CAA CTT TCA TTC TCG GGG TTG GAT3228Gln Gln Pro Thr Met Ile Ser Pro Gln Leu Ser Phe Ser Gly Leu Asp104510501055GAG CTT TTG GAA CTG GAG GGA AGT TTT CCT GAA GAA AAT CAC AGG GAG3276Glu Leu Leu Glu Leu Glq Gly Ser Phe Pro Glu Glu Asn His Arg Glu106010651070AAG TCT GTC TGT TAT CTA GGA GTC ACC TCC GTC AAC AGA AGA GAG AGT3324Lys Ser Val Cys Tyr Leu Glu Val Thr Ser Val Asn Arg Arg Glu Ser107510801085GGT GTG CTT TTG ACT GGT GAG GCA GGA ATC CTG TGC ACA TTC CCA GCC3372Gly Val Seu Leu Thr Gly Glu Ala Gly Ile Leu Cys Thr Phe Pro Ala109010951100CAG TGT CTG TTC ACT GAC ATC AGG ATC CTC CAG GAG AGA TGC TCA CAC3420Gln Cys Leu Phe Set Asp Ile Arg Ile Leu Gln Glu Arg Cys Ser His1105111011151120TTT GTA GAA AAT AAT TTG AGT TTA GGG ACC TCT GGT GAG AAC TTT GTA3468Phe Val Glu Asn Asn Leu Ser Leu Gly Thr Ser Gly Glu Asn Phe Val112511301135CCT TAC ATG CCC CAA TTT CAA ACC TGT TCC ACG CAC AGT CAC AAG ATA3516Pro Tyr Met Pro Gln Phe Gln Thr Cys Ser Thr His Ser His Lys Ile114011451150ATG GAG AAT AAG ATG TGT GAC TTA ACT GTG3546Met Glu Asn Lys Met Cys Asp Leu Thr Val11551160TAATCTCATC CAAGAAGCCT CAAGGTTCCA TTCCAGTAGA GCCTGTCATG TATAATGTGT3606TCTTTTATTG TTGTGGATGT GGGAGACAAG TGTCAGAATC TAGTGTGAAA ATGATTGTTT3666
CCAAACTAAG TGTGTCTATT TTCTCTCAGT AATACANATG AAACATATGA GGAAGCCCTC3726ATTAATCTAC TAATGTAGAT GGACTCTTAC TGAATATATT CCCAAGATAC TTGGGGAAGT3786CTCCCTAATT CTAGCTAAAA GAANTAGAAC TACTAAACAC TGAATCTGGA AAAAAAAAAA3846AAAAAAAG3854(2)序列43资料(ⅰ)序列特征(A)长度1162aa(B)类型氨基酸(D)拓朴结构不详(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述序列43Met Met Cys Gln Lys Phe Tyr Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Leu1 5 10 15Tyr Val Ile Ala Ala Leu Asn Leu Ala Tyr Pro Ile Ser Pro Trp Lys20 25 30Phe Lys Leu Phe Cys Gly Pro Pro Asn Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu35 40 45Ser Pro Ala Gly Ala Pro Asn Asn Ala Ser Ala Leu Lys Gly Ala Ser50 55 60Glu Ala Ile Val Glu Ala Lys Phe Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Val Pro65 70 75 80Glu Leu Ser Lys Thr Val Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gln Gly85 90 95Gln Asn Cys Ser Ala Leu Thr Asp Asn Thr Glu Gly Lys Thr Leu Ala100 105 110Ser Val Val Lys Ala Ser Val Phe Arg Gln Leu Gly Val Asn Trp Asp115 120 125Ile Glu Cys Trp Met Lys Gly Asp Leu Thr Leu Phe Ile Cys His Met130 135 140Glu Pro Leu Pro Lys Asn Pro Phe Lys Asn Tyr Asp Ser Lys Val His145 150 155 160Leu Leu Tyr Asp Leu Pro Glu Val Ile Asp Asp Ser Pro Leu Pro Pro165170 175Leu Lys Asp Ser Phe Gln Thr Val Gln Cys Asn Cys Ser Leu Arg Gly180 185 190Cys Glu Cys His Val Pro Val Pro Arg Ala Lys Leu Asn Tyr Ala Leu195 200 205Leu Met Tyr Leu Glu Ile Thr Ser Ala Gly Val Ser Phe Gln Ser Pro210 215 220Leu Met Ser Leu Gln Pro Met Leu Val Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu225 230 235 240Gly Leu His Met Glu Val Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser Trp245 250 255Asp Ser Gln Thr Met Ala Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys Tyr260 265 270Leu Glu Asn Ser Thr Ile Val Arg Glu Ala Ala Glu Ile Val Ser Ala275 280 285Thr Ser Leu Leu Val Asp Ser Val Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val290 295 300Gln Val Arg Ser Lys Arg Leu Asp Gly Ser Gly Val Trp Ser Asp Trp305 310 315 320Ser Ser Pro Gln Val Phe Thr Thr Gln Asp Val Val Tyr Phe Pro Pro325 330 335Lys Ile Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn Ala Ser Phe His Cys Ile Tyr340 345 350Lys Asn Glu Asn Gln Ile Ile Ser Ser Lys Gln Ile Val Trp Trp Arg355 360 365Asn Leu Ala 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Val Phe Asp Ala Lys Ser Lys580 585 590Ser Ala Ser Leu Leu Val Ser Asp Leu Cys Ala Val Tyr Val Val Gln595 600 605Val Arg Cys Arg Arg Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser610 615 620Ser Pro Ala Tyr Thr Leu Val Met Asp Val Lys Val Pro Met Arg Gly625 630 635 640Pro Glu Phe Trp Arg Lys Met Asp Gly Asp Val Thr Lys Lys Glu Arg645 650 655Asn Val Thr Leu Leu Trp Lys Pro Leu Thr Lys Asn Asp Ser Leu Cys660 665 670Ser Val Arg Arg Tyr Val Val Lys His Arg Thr Ala His Asn Gly Thr675 680 685Trp Ser Glu Asp Val Gly Asn Arg Thr Asn Leu Thr Phe Leu Trp Thr690 695 700Glu Pro Ala His Thr Val Thr Val Leu Ala Val Asn Ser Leu Gly Ala705 710 715 720Ser Leu Val Asn Phe Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val725 730 735Ser Ala Val Glu Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Ser Cys Val740 745 750Ile Leu Ser Trp Thr Leu Ser Pro Asp Asp Tyr Ser Leu Leu Tyr Leu755 760 765Val Ile Glu Trp Lys Ile Leu Asn Glu Asp Asp Gly Met Lys Trp Leu770 775 780Arg Ile Pro Ser Asn Val Lys Lys Phe Tyr Ile His Asp Asn Phe Ile785 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CGGTCATTCT GCTGCTTGTC GAT33(2)序列47资料(ⅰ)序列特征(A)长度33bp(B)类型核酸(C)链型单(D)拓朴结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列47CCCAATGTCG ACATGGTGTA CTTCTCTGAA GTA33(2)序列48资料
(ⅰ)序列特征(A)长度30bp(B)类型核酸(C)链型单(D)拓朴结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列48TTTTTGGATC CCACCTGCAT CACTCTGGTG30(2)序列49资料(ⅰ)序列特征(A)长度48bp(B)类型核酸(C)链型单(D)拓朴结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列49TTTAACTTGT CATATCCAAT TACTCCTTGG AGATTTAAGT TGTCTTGC48(2)序列50资料(ⅰ)序列特征(A)长度30bp(B)类型核酸(C)链型单(D)拓朴结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列50TTTTTGGATC CCACCTGCAT CACTCTGGTG30
权利要求
1．一种分离的核酸分子，它含有obR基因的核苷酸序列。
2．一种分离的核酸分子，它编码一种Ob受体或其片段，该分子具有如下的核苷酸序列编码图1所示氨基酸序列或由保藏于ATCC的保藏号69952的cDNA克隆famj5312中所含cDNA编码的氨基酸序列的；或编码图6所示氨基酸序列的；或编码图3所示氨基酸序列，或由ATCC保藏的保藏号为69963的cDNA克隆fahj5312d中所含的氨基酸序列，或由ATCC保藏的基因组克隆h-ObR-p87中所含的氨基酸序列的；或能在严格条件下与(a)、(b)或(c)的核苷酸序列或其补体杂交的。
3．一种分离的核苷酸序列，它编码一种相当于Ob受体蛋白的胞外域、跨膜域或胞质域的多肽，或编码Ob受体蛋白的一种其中缺失了跨膜域或胞质域的缺失突变型。
4．一种分离的核苷酸序列，它编码一种嵌合蛋白，该蛋白包括与一种异源多肽融合的权利要求3的多肽。
5．如权利要求4的分离的核苷酸序列，其中，所述异源多肽是一种免疫球蛋白的恒定区。
6．一种核苷酸载体，含有权利要求1,2,3,4或5的核苷酸序列。
7．一种表达载体，含有权利要求1,2,3,4,或5的核苷酸序列，该序列与一个核苷酸调控序列操作连接在一起，而该调控序列控制所述核苷酸序列在宿主细胞内的表达。
8．如权利要求7的表达载体，其中，所述调控序列选自巨细胞病毒hCMV立即早期基因、SV40腺病毒的早期或晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区、fd外被蛋白的操纵区、3-磷酸甘油酸激酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子和酵母α-交配因子的启动子。
9．一种用遗传工程方法产生的宿主细胞，它含有权利要求1,2,3,4或5的核苷酸序列。
10．一种用遗传工程方法产生的宿主细胞，它含有权利要求1,2,3,4或5的核苷酸序列，该核苷酸序列与一个核苷酸调控序列操作连接在一起，而该调控序列控制所述核苷酸序列在宿主细胞中的表达。
11．如权利要求10的遗传工程宿主细细胞，其中，所述宿主细胞是成纤维细胞、中国仓鼠卵(CHO)细胞、COS细胞、或VERO细胞、下丘脑细胞或脉络丛细胞。
12．一种分离的Ob受体蛋白。
13．一种分离的Ob受体蛋白，具有图1,3或6所示的氨基酸序列或由含于由ATCC保藏的保藏号为69952的cDNA克隆famj5312中的cDNA编码的氨基酸序列，或由含于由ATCC保藏的保藏号为69963的cDNA克隆fahj5312d中的cDNA编码的氨基酸序列，或由保藏于ATCC的基因组克隆h-obR-p87编码的氨基酸序列。
14．一种多肽，具有相当于Ob受体蛋白的胞外域、跨膜域或胞质域的氨基酸序列，或Ob受体蛋白的一种其中的跨膜域或胞质域已缺失的缺失突变型。
15．一种嵌合蛋白，含有与一种异源多肽融合的权利要求14的多肽。
16．如权利要求15的多肽，其中，所述异源多肽是一种免疫球蛋白的恒定区。
17．一种抗体，它能免疫特异地结合权利要求12或13的Ob受体蛋白。
18．一种抗体，它能免疫特异地结合权利要求14的多肽。
19．一种诊断哺乳动物的体重疾病的方法，包括测定患者样品中ObR基因的表达。
20．如权利要求19的方法，其中，所述表达是通过检测obR基因的mRNA转录物而测定的。
21．如权利要求19的方法，其中，所述表达是通过测定obR基因产物测定的。
22．一种诊断哺乳动物的体重疾病的方法，包括检测所述哺乳动物基因组中所含的obR基因突变。
23．一种筛选可用于治疗体重疾病的化合物的方法，包括让一种化合物接触一种能表达obR基因的培养的宿主细胞，并检测该obR基因表达方面的变化，由该培养的细胞表达的obR基因产物的活性的变化，或宿主细胞蛋白的酪氨酸磷酸化方面的变化，或该宿主细胞中离子流动方面的变化。
24．如权利要求23的方法，其中，所述obR基因的表达是通过测定该obR基因的mRNA转录物而检测的。
25．如权利要求23的方法，其中，所述obR基因的表达是通过测定Ob受体蛋白而检测的。
26．如权利要求23的方法，其中，宿主细胞的酪氨酸磷酸化是用一种抗-磷酸酪氨酸抗体测定的。
27．一种治疗哺乳动物的低体重疾病的方法，包括对该哺乳动物给药一种化合物，该化合物的用量足以抑制通过内源性Ob实现的Ob受体激活作用。
28．如权利要求27的方法，其中，所述低体重疾病是厌食、恶病质、食欲过盛、AIDS相关的消瘦或癌症相关的消瘦。
29．如权利要求27的方法，其中，所述化合物被释放至下丘脑或脉络丛中。
30．如权利要求27的方法，其中，所述化合物是一种拮抗剂，它能与所述Ob受体结合，并抑制该受体的激活作用。
31．如权利要求27的方法，其中，所述化合物能结合内源Ob，并中和Ob活性。
32．如权利要求31的方法，其中，所述化合物是一种相当于Ob受体胞外域的多肽或能与Ob结合的所述胞外域的一部分、一种缺少跨膜域或胞质域的缺失突变型Ob受体蛋白、一种包括Ob受体的胞外域的嵌合型融合蛋白、或能与Ob结合的所述胞外域的一部分，或一种与一种异源多肽融合的跨膜缺失突变型。
33．如权利要求32的方法，其中，所述嵌合型融合蛋白的异源多肽是一种免疫球蛋白的恒定区。
34．如权利要求32或33的方法，其中，所述化合物是通过对所述哺乳动物给药能在该哺乳动物体内表达并分泌所述多肽或融合蛋白的遗传工程细胞而释放至该哺乳动物体内的。
35．如权利要求31的方法，其中，所述化合物是一种抗独特型抗体，或其Fab部分，它能模拟Ob受体的胞外域并中和内源Ob。
36．一种治疗哺乳动物的低体重疾病的方法，包括对哺乳动物给药一种化合物，该化合物的用量足于抑制所述Ob受体在体内的表达。
37．如权利要求36的方法，其中，所述低体重疾病是厌食、恶病质、食欲过盛、AIDS相关的消瘦或癌症相关的消瘦。
38．如权利要求36的方法，其中，所述化合物被释放至下丘脑或脉络丛中。
39．如权利要求36的方法，其中所述化合物是一种反义寡核苷酸，它能抑制编码所述Ob受体的mRNA转录物的翻译。
40．如权利要求36的方法，其中，所述化合物是一种核酶，它能抑制编码所述Ob受体的mRNA转录物的翻译。
41．如权利要求36的方法，其中，所述化合物是一种寡核苷酸，它能与所述Ob受体基因的调控区形成三重螺旋，并抑制转录。
42．如权利要求36的方法，其中，所述化合物是一种重组DNA结构，它能通过定向同源重组使Ob受体基因或其调控区失活。
43．一种治疗哺乳动物的低体重疾病的方法，包括对该哺乳动物给药一种化合物，该化合物的用量足于抑制由内源Ob与该Ob受体结合所诱导的信号转导。
44．如权利要求43的方法，其中，所述低体重疾病是厌食、恶病质、食欲过盛、AIDS相关的消瘦或癌症相关的消瘦。
45．如权利要求43的方法，其中，所述化合物被释放至下丘脑或脉络丛。
46．如权利要求43的方法，其中，所述化合物能抑制Ob受体一诱导的信号转导的胞内介体的活性。
47．如权利要求46的方法，其中，所述化合物能抑制一种酪氨酸激酶或一种酪氨酸磷酸酶。
48．如权利要求43、44或45的方法，其中，所述化合物是一种受一个调控序列控制的编码一个不能转导信号的Ob受体的寡核苷酸结构，所述调控序列可指导该不能转导信号的受体在体内的靶细胞中的表达。
49．如权利要求48的方法，其中，所进寡核苷酸结构编码一种Ob受体的不能转导信号的缺失突变型，其中，所述胞质域全部或部分缺失。
50．一种治疗哺乳动物肥胖的方法，包括对哺乳动物给药一种化合物，该化合物的用量足以上调一种功能性Ob受体在该哺乳动物体内的表达。
51．如权利要求50的方法，其中，所述化合物被释放至下丘脑或脉络丛。
52．如权利要求50或51的方法，其中，所述的哺乳动物表达缺陷型ob受体而所述化合物包括一种受一个调控区控制的编码一种功能性Ob受体的核苷酸结构，所述调控区能指导该功能性受体在哺乳动物的靶细胞中表达。
53．如权利要求50或51的方法，其中，所述哺乳动物能表达一种突变型Ob受体，而所述化合物包括一种编码一种野生型Ob受体的核苷酸结构，该结构可通过定向同源重组校正所述内源突变。
54．一种编码一种Ob受体的分离的核酸分子，该核酸分子具有编码图3所示氨基酸序列的氨基酸1-868的核苷酸序列。
55．一种编码一种Ob受体的分离的核酸分子，该核酸分子具有编码图3所示氨基酸序列的氨基酸1-965的核苷酸序列。
56．一种编码一种Ob受体的分离的核酸分子，该核酸分子具有编码图3所示氨基酸序列的氨基酸1-1065的核苷酸序列。
57．一种编码一种Ob受体的分离的核酸分子，该核酸分子具有编码图3所示氨基酸序列的氨基酸1-1115的核苷酸序列。
58．一种编码一种Ob受体的分离的核酸分子，它能诱导IL-6RE介导的基因表达。
59．一种编码一种Ob受体的分离的核酸分子，它能诱导HRRE介导的基因表达。
60．如权利要求54-57中任一项的分离的核酸分子，所述分子编码一种氨基酸序列，该序列与图3所述氨基酸序列的相同性至少为90％。
61．如权利要求59的分离的核酸分子，该分子编码一种氨基酸序列，该序列与图3所示氨基酸序列的氨基酸1-965的相同性至少为90％。
62．一种检验一种试剂是否是用于治疗体重疾病的候选试剂的方法，包括(a)用所述试剂处理能表达一种编码ObR多肽的基因的真核细胞；和(b)在有所述试剂的条件下测定所述真核细胞对所述基因的表达；其中，如果在有所述试剂的条件下所述基因的表达不同于在没有所述试剂的条件下所述真核细胞对所述基因的表达，则该试剂被确认为是治疗所述体重疾病的候选试剂。
63．如权利要求62的方法，还包括在没有所述试剂的条件下测定所述真核细胞对所述基因的表达。
64．一种检验一种试剂是否是用于治疗体重疾病的候选试剂的方法，包括(a)用所述试剂处理能表达一种编码ObR多肽的基因的真核细胞；和(b)测定所述试剂与所述真核细胞的结合；其中，如果所述试剂与所述真核细胞的结合不同于所述试剂与不能表达所述基因的对照真核细胞的结合，而该对照真核细胞在其它方面相同于该表达所述基因的真核细胞，则该试剂被确认为是治疗体重疾病的候选试剂。
65．如权利要求64的方法，还包括测定所述试剂与所述对照真核细胞的结合。
66．一种检验一种试剂是否是用于治疗体重疾病的候选试剂的方法，包括(a)用所述试剂处理一种ObR多肽；和(b)测定所述试剂与所述ObR多肽的结合；其中，当所述试剂能选择性地结合所述ObR多肽时，则该试剂被确认为是治疗体重疾病的候选试剂。
67．如权利要求62、64、或66的方法，其中，所述ObR多肽包括ObR的胞质域。
68．如权利要求67的方法，其中，所述胞质域包括图3中的氨基酸861-1165。
69．如权利要求67的方法，其中，所述ObR多肽还包括ObR的胞外域。
70．如权利要求66的方法，其中，所述ObR多肽与一种可检测的标记物融合。
71．如权利要求62或64的方法，其中，所述真核细胞是脉络丛细胞。
72．如权利要求62或64的方法，其中，所述基因是一种重组基因。
全文摘要
本发明涉及编码Ob受体(ObR)－一种参与哺乳动物体重调节的受体蛋白－的核苷酸的发现、识别和鉴定。本发明涉及
文档编号A61K38/00GK1211255SQ96199796
公开日1999年3月17日 申请日期1996年11月27日 优先权日1995年11月27日
发明者路易斯·A·塔塔格利亚, 罗伯特·I·泰珀, 贾尼斯·A·卡尔佩珀, 戴维·W·怀特 申请人:米伦纽姆医药公司