专利名称：熊去氧胆酸的硫酸酯结合物,及其在炎症和其它用途中的有益应用的制作方法
背景技术：
3α,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酸(“熊去氧胆酸”或“UDCA”)在临床上已应用了二十多年，最初证明它可有效地治疗患有胆石病的病人，最近证明它有望用于治疗患有胆汁郁积肝脏疾病的病人。已经确知口服UDCA可明显改善血清肝酶，而且通过长期临床实验，统计结果表明UDCA有益于早期原发性胆汁肝硬变的治疗。此外，临床实验证明UDCA有益于改善患有硬化性胆管炎、囊肿纤维化和慢性肝炎病人的肝功能临床和生化指标。
尽管UDCA对肝病有很好的疗效，但其精确作用机制尚不清楚。早期的推测认为胆汁胆酸池的疏水/亲水平衡的移动是决定其功效的重要结定因素；但近期的实验数据并不完全支持这种观点；而且肝功能的改善几乎可以肯定是UDCA诱导的明显胆汁分泌过多的结果，它易化了潜在较高毒性的胆汁酸或其它内源物质的胆汁排泄。
在对患有多种肝脏疾病病人的UDCA代谢研究中，在尿中总能观测到显著量的UDCA之C-3硫酸酯的存在，并已证明该特异性物质可作为UDCA应变性有用的标志物。此外，动物实验提示胆汁酸的硫酸酯化可能为一重要的防止胆汁郁积和限制肝细胞损害的代谢途径。
胆汁酸的细胞毒性或膜损害作用与其物理化学性质有关。疏水性胆汁酸的膜损害作用要大大高于亲水性胆汁酸，已用胆汁酸在反相高压液相色谱中的保留体积或辛醇/水分配系数作为细胞毒性的相对指标。奇怪的是人肝脏合成疏水的、本身具有肝脏毒性的鹅去氧胆酸，作为其原生胆汁酸的一种；当胆汁郁积时，肝脏累积这种胆汁酸可引发、导致或加剧肝脏损害。与之相反，UDCA，即鹅去氧胆酸的7β-异构体，则为高亲水性的并显示出对疏水性胆汁酸膜损害的对抗作用。这是治疗上应用UDCA治疗多种肝脏疾病的一个理论基础。UDCA经口服或静脉给药后，在肝脏中被有效生物转化，其中主要是被结合。即使在以相对高剂量给药后，也只能在人胆汁中检出可忽略浓度和比例的未结合UDCA。
除治疗多种肝脏疾病外，UDCA还可有其它治疗作用。在这一方面，致结肠癌动物模型的数据提示了UDCA的保护性作用。
然而，事实上要将UDCA转运到结肠上是困难的，按通常治疗剂量口服给药(10-15mg/kg体重/天)，UDCA在肠道被相对好地吸收并在肝脏中主要通过结合被有效生物转化。因此，要将有效量UDCA定向转运到结肠上是十分困难的。
因此，由于这种向结肠上的转运的限制，拥有一种可使UDCA有效地转运到结肠上的化合物、组合物或方法将是十分有益的。拥有一种用于转运UDCA至消化道其它部分的化合物、组合物或方法也是被希望的。此外，拥有一种用于有效抑制或治疗消化道或肝脏炎症的化合物、组合物或方法将是有利的。
发明简述本发明的一个方面是一种药理学可接受的组合物，其包含3 α,7 β-二羟基-5β-胆烷-24-酸(“熊去氧胆酸”或“UDCA”)的硫酸酯和一种药理学可接受的载体。在优选的组合物中，硫酸酯为UDCA-3-硫酸酯、UDCA-7-硫酸酯、UDCA-3,7-二硫酸酯、甘氨-UDCA-3-硫酸酯、甘氨-UDCA-7-硫酸酯、甘氨-UDCA-3,7-二硫酸酯、牛磺-UDCA-3-硫酸酯、牛磺-UDCA-7-硫酸酯、牛磺-UDCA-3,7-二硫酸酯或其混合体。
本发明的另一方面是一种向哺乳动物传输UDCA以抑制或治疗疾病的方法，该方法包括以有效抑制或治疗该疾病的剂量向哺乳动物给药UDCA硫酸酯。例如，可使用UDCA硫酸酯以有利于抑制或治疗消化道的炎症，如结肠癌、直肠癌、结肠瘤、直肠瘤、结肠癌变、直肠癌变、溃疡性结肠炎、息肉状腺瘤、家族性息肉病等等。UDCA的硫酸酯还可用于抑制或治疗肝脏疾病。UDCA的硫酸酯可用于改善肝脏疾病或肝功能的血清生化性质，增加胆汁流量或降低磷脂或胆固醇的胆汁排泄。
本发明的另一方面是涉及一种用UDCA硫酸酯灌注器官以保持隔离器官的方法。
与现有技术相比，本发明具有几种优点和好处。例如，可将治疗有效量的UDCA转运到结肠和消化道其它部分以抑制或治疗炎症，如结肠癌等等。此外，UDCA的硫酸酯可有效地用于抑制或治疗肝脏疾病或改善肝功能。在回顾以下发明详述后，对于本领域的一般技术人员来说这些优点和好处将是显而易见的。
附图简述
图1A和1B显示对照鼠和当口服给药UDCA、UDCA-3S、UDCA-7S和UDCA-DS后，UDCA在整个空肠的总量(图1A)和在肝脏组织中的浓度(图1B)的比较。在GC-MS分析各样品前胆汁酸依据其结合方式用阴离子交换色谱分离。结果以所有动物的平均值表达；图2显示对照鼠和口服给药UDCA、UDCA3-S、UDCA7-S和UDCA-DS鼠的粪便胆汁酸排泄。在GC-MS分析各样品前胆汁酸依据其结合方式用阴离子交换色谱分离。结果以所有动物的平均值表达；图3显示对照鼠和口服给药UDCA、UDCA3-S、UDCA7-S和UDCA-DS鼠的粪便中石胆酸/去氧胆酸的比率。结果以所有动物的平均值表达；图4A-4D显示口服给药UDCA(图4A)、UDCA3-S(图4B)、UDCA7-S(图4C)和UDCA-DS(图4D)鼠肝脏组织中的UDCA浓度。在GC-MS分析各样品前胆汁酸依据其结合方式用阴离子交换色谱分离。结果以所有动物的平均值表达；图5A和5B显示UDCA及其硫酸酯结合物灌注Ⅳ期Sprague-Dawley鼠的平均胆汁流量和胆汁酸排出量；图6A-6D显示UDCA及其硫酸酯结合物灌注后胆汁酸排泄率和胆汁流量的关系；图7A和7B显示UDCA及其硫酸酯结合物灌注IV期Sprague-Dawley鼠的平均胆汁胆固醇和磷脂的排出量；图8A-8E显示鼠胆汁灌注前(图8A)，UDCA灌注期间(图8B)、UDCA3-S灌注期间(图8C)、UDCA7-S灌注期间(图8D)和UDCA-DS灌注期间(图8E)的负离子FAB-MS谱。
发明详述以下出现的其它缩写包括GC(气-液色谱)，GC-MS(气-液色谱质谱联用)，FAB-MS(快原子轰击质谱)，TLC(薄层色谱)，HPLC(高效液相色谱)，UDCA-3S(熊去氧胆酸3-硫酸酯)，UDCA-7S(熊去氧胆酸7-硫酸酯)，UDCA-DS(熊去氧胆酸3,7-二硫酸酯)，tBDMS醚(特丁基二甲基甲硅烷基醚)和tBDMC(特丁基二甲基氯甲硅烷)。
下列数据对比了UDCA的各胆汁酸硫酸酯与未结合胆汁酸的肠道代谢和行为，并与其它因素一起显示C-7硫酸酯基的存在使UDCA免于细菌降解并抑制了肠道对UDCA的吸收。材料与方法UDCA硫酸酯的合成UDCA，纯度99％，来自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)。按本发明详述后面的一步接一步被详细描述的方法制备UDCA的单硫酸酯和二硫酸酯。简而言之，单硫酸酯的合成包括选择性保护UDCA分子中各环上的羟基，接着硫酸化未保护羟基并水解保护基游离出单硫酸酯。将UDCA与氯磺酸反应制备UDCA的二硫酸酯结合物。用气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析经氧化、溶剂解、并转化成甲基/酯-三甲基甲硅烷基醚衍生物的产物确定硫酸酯基的位置。高压液相色谱、薄层色谱和毛细管柱气相色谱分析确定合成胆汁酸盐的色谱纯度为，UDCA7-硫酸酯和UDCA3,7-二硫酸酯＞97％,UDCA3-硫酸酯＞95％。
动物实验雄性Sprague-Dawley鼠(Harlan Sprague-Dawley,Inc.Indianapolis,IN)，重210-290 g，置于12小时明-暗循环中，并用相同标准实验室饲料喂养3天。接着将动物置于代谢笼中单独圈养并喂相同的食物。将UDCA、UDCA 3-硫酸酯、UDCA 7-硫酸酯、和UDCA 3,7-二硫酸酯用管饲法以250 mg/天的剂量连续给药四天。每组包含3-6只鼠。每天测量动物的体重。第5天时，在醚麻醉下将动物放血处死。收集血浆并于-20℃下冻藏。切除肝脏，用生理盐水清洗并于液氮中速冻。每24小时收集尿和粪便并于-20℃下冻藏。所有动物均按国立科学院制订的“Guide forthe Care and Use of Laboratory Animals”(National Institutes ofHealth publication no.86-23,revised in 1985)中规定的方法进行人工饲养。胆汁酸的分析肠内容物和粪便中的未结合和硫酸酯胆汁酸将肠内容物称重并剪成小片。将各组动物第4天的粪便(100 mg)合并并碾磨成细糊。所有样品均被声处理，然后在80％甲醇中回流2小时，在氯仿/甲醇(1∶1)中再回流1小时。样品液蒸干，并将干萃取物用80％甲醇(20ml)重新悬浮。取出甲醇提取物样品(1/40肠内容物和1/20粪便样品)，并加入内标降去氧胆酸(10μg)。将该提取液用0.01mol/L醋酸(20ml)稀释，并首先通过Lipidex 1000柱(bed size,4×1cm；PackardInstrument Co.,Groningen,The Netherlands)，接着再通过Bond-ElutC18柱(Analytichem,Harbor City,CA)。用甲醇(分别为20ml和5ml)淋洗Lipidex 1000柱和Bond-Elut柱回收胆汁酸，将合并的萃取液蒸干。在二乙胺基羟基丙基Sephadex LH-20柱(Lipidex-DEAP；PackageInstrument Co.)上进行亲脂阴离子交换色谱分离，将未结合胆汁酸纯化并与中性甾醇和结合胆汁酸分离。用在72％乙醇(7ml)中的0.1mol/L乙酸淋洗接着蒸去溶剂，回收未结合胆汁酸。用9ml在72％乙醇中的0.3mol/L乙酸(pH9.6)淋洗回收总结合胆汁酸。加入降去氧胆酸(10μg)后通过Bond-Elut C18柱除去盐分，然后用5ml甲醇淋洗回收结合胆汁酸。在甲醇(1ml)、蒸馏四氢呋喃(9ml)和1mol/L三氟乙酸之二氧六环(0.1ml)溶液的混合液中于45℃下加热2小时进行溶剂解。溶剂解后，在Lipidex-DEAP柱上色谱分离未结合胆汁酸。将样品溶于甲醇(0.3ml)中并与2.7ml新蒸重氮甲烷乙醚溶液反应，制备甲酯衍生物。蒸去反应试剂后，加入50mlTri-Sil试剂(Pierce Chemicals,Rockford,IL)，将甲酯衍生物转化成三甲基甲硅烷基醚。用Lipidex 5000柱(Packard Insrtument Co.)除去衍生化试剂并纯化样品。
血浆和尿中的未结合和硫酸酯化胆汁酸在每组中，收集每天总动物尿。第1天样品代表基础样品，并收集胆汁酸给药后第2、3和4天的尿样。加入降去氧胆酸(1μg)后，用Bond-Elut C18柱定量萃取尿(3ml)和血浆(1ml)中的胆汁酸。液-固萃取后，在Lipidex-DEAP柱上亲脂阴离子交换色谱纯化和分离未结合和结合胆汁酸。溶剂解结合胆汁酸并用上述方法分离水解产物，然后将胆汁酸转化成挥发性的甲酯-三甲基甲硅烷基醚衍生物。
肝脏和肠内容物中胆汁酸的结合程度将肝脏样品(100mg)磨成细浆，并将肠内容物及粪便中的胆汁酸按上述加热回流并通过Lipidex 1000柱的方法萃取出来。用亲脂阴离子交换色谱按胆汁酸的结合方式将其组分离。合并各动物的萃取液，并用Lipidex-DEAP柱分离胆汁酸及其结合物，用以下缓冲液分步淋洗凝胶床在72％乙醇中的0.1 mol/L乙酸(未结合胆汁酸)；在72％乙醇中的0.3mol/L乙酸，pH 5.0(甘氨酸结合物)；在72％乙醇中的0.15 mol/L乙酸(pH6.5)(牛磺酸结合物)；和在72％乙醇中的0.3mol/L乙酸，pH9.6(硫酸酯结合物)。蒸去缓冲液后，将硫酸化胆汁酸溶剂解，酰胺化结合物用50U的胆酰甘氨酸水解酶(Sigma Chemical Co.)在2.5ml的0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.6)中于37℃下水解过夜。所得未结合胆汁酸用Lipidex-DEAP柱纯化，并按上述方法制成甲酯-三甲基甲硅烷基醚衍生物。
溶剂解后，在Lipidex-DEAP柱上，淋洗液为在72％乙醇中的0.15mol/L乙酸，pH6.5(6ml)，分离鼠肠的空肠部分酰胺化胆汁酸。按上述方法进行酶水解，并按上述方法将所得未结合胆汁酸分离和衍生化。GC-MS按色谱条件30m×0.25mm DB-1熔融石英毛细管柱(J&W Scientific,Folson,CA)，从225℃至295℃程序升温，升温速度为2℃/min，在最终温度上恒温30分钟，分离甲酯-三甲基甲硅烷基醚衍生物。采用Finnigan4635质谱仪(Finnigan Inc.,San Jose,CA)，其上装有上述相同的气相色谱柱并按相同条件操作进行GC-MS分析。连续扫描流出组分记录分子量在50-800 dalton间的电子轰击(70eV)质谱。以参比同系列正构烷烃的气相色谱保留指数，即亚甲基单元值鉴定胆汁酸，并将基质谱与真实标准样品作比较。使用气相色谱对比各胆汁酸的峰高和内标的峰高对胆汁酸作定量。液相二级电离质谱将约1μl甲醇萃取液加到一小滴置于不锈钢探头上的甘油/甲醇基体中后，获得尿样的液相二级电离质谱的负离子谱。将探头置于VG AutospecQ质谱仪的离子源中，用一束由碘化铯(35KeV)产生的铯快原子束轰击样品靶。获得质量范围在50-1000 daltons间的负离子谱。统计分析分析前将萃取液合并时，数据用所有动物的平均±SEM或平均值表达。用配对的或未配对的双尾学生t-检验法对比不同组的结果。P值＜0.05说明统计有显著性。结果沿肠道的管腔内胆汁酸组成对照组和各给药胆汁酸动物组的被剔除肠片断的平均重量是相似的。在对照动物组中，空肠中UDCA的总量(0.03±0.01mg)是微不足道的，仅相当于总胆汁酸的0.3％。当按最终剂量给药UDCA、UDCA 3-硫酸酯、UDCA 7-硫酸酯和UDCA 3,7-双硫酸酯24小时后，所有动物空肠中的UDCA总量(以及占总胆汁酸的百分比)均增加，分别为9.95±0.49mg(35.9％)、3.67±0.45mg(16.4％)、1.09±0.34mg(4.7％)和0.21±0.07mg(2.0％)。结果表明C-7位结合硫酸酯基后仅能保持非常少的UDCA(表1)。
在给药UDCA和UDCA 3-硫酸酯的动物空肠内可检测到大比例的作为外源性给药UDCA的特征代谢产物Δ22UDCA。但该代谢产物在对照组中未被检测到，而在给药C-7结合硫酸酯的UDCA的动物中其占总空肠胆汁酸的比例＜3％(表1)。
用亲脂阴离子交换色谱分离胆汁酸后，检查空肠中UDCA的结合方式，发现给药UDCA的动物中主要是甘氨-或牛磺-UDCA，少量的未结合UDCA和可忽略量的硫酸化UDCA。虽然给药C-7硫酸酯后在空肠中发现酰胺化和未结合形式的UDCA，但空肠中的UDCA总量非常少。在给药UDCA 3-硫酸酯的鼠中，肠道中含大比例的酰胺化UDCA，表明明显的生物转化方式为去结合和/或酰胺化。
对于内源性胆汁酸，在对照动物空肠中胆酸为主要胆汁酸，占总胆汁酸的48.5±2.9％(6.82±1010mg)，当给药UDCA后，其量明显降低(P=0.01)至16.8％±1.3％(4.68±0.65mg)。UDCA3-硫酸酯同样造成胆酸比例的下降(P=0.05)，但幅度小于UDCA，而给药UDCA的C-7硫酸酯后反而使胆酸在空肠中的比例上升(P=0.01)(表1)。
在对照动物的结肠中，大多数胆汁酸为次生的，经鉴定主要为脱氧胆酸和ω-鼠胆酸，仅能检测到少量石胆酸(表2)。给药UDCA造成脱氧胆酸的比例下降(P=0.003)，使石胆酸成为主要胆汁酸，占总结肠胆汁酸的32.0％±0.8％(P=0.0004)。与之相反，给药UDCA 7-硫酸酯和UDCA 3,7-二硫酸酯使脱氧胆酸和石胆酸在结肠中的量以及比例均明显下降。胆汁酸的粪便排泄已发现各组动物每天粪便排泄量没有明显差别。给药UDCA、UDCA 3-硫酸酯、UDCA 7-硫酸酯和UDCA 3,7-二硫酸酯的动物的总胆汁酸粪便排泄分别为14.85、10.70、12.65和10.88mg/g粪便。所有动物的粪便中均富含UDCA；但在给药未结合胆汁酸的动物中，UDCA差不多全多部为未结合形式。与之相反，在给药UDCA 7-硫酸酯和UDCA 3,7-二硫酸酯鼠的粪便中仅含可忽略浓度的未结合UDCA；这两种结合物基本上未经转化即排到粪便中(图2)。排到粪便中的主要次级胆汁酸的浓度在各组动物中有差别。在UDCA组中，石胆酸比对照值大大增加，而给药UDCA 7-硫酸酯和UDCA 3,7-二硫酸酯后石胆酸的粪便排泄则下降。去氧胆酸的排泄也具有同样趋势。对比于正常鼠粪，当给药UDCA后石胆酸/去氧胆酸的比例升高20多倍，给药UDCA 3-硫酸酯升高11倍，但给药C-7硫酸酯则不增加(图3)。肝脏组织的胆汁酸组成各胆汁酸在肝脏组织中的浓度和组成概括于表3中。在对照动物中，UDCA的浓度为12.0nmol/g，占总肝脏胆汁酸的2.8％。给药UDCA和C-3硫酸酯后使肝脏组织中UDCA的浓度和比例增加(图1)。此外，发现Δ22UDCA在肝脏中有相对较高的比例。与之相反，当对动物给药C-7硫酸酯胆汁酸后，总UDCA的浓度和百分组成均大大下降。给药UDCA造成肝脏石胆酸浓度增加，而给药硫酸酯结合物时石胆酸浓度下降。在所有给药胆汁酸的动物组中，去氧胆酸的浓度均下降，其中C-7硫酸酯的下降程度较大。当给药UDCA后肝脏组织的胆酸浓度下降约4倍，但给药C-7硫酸酯结合物后则略微上升。
当给药各胆汁酸后，UDCA在肝脏组织中的结合形式为未结合UDCA和其C-3硫酸酯均以结合方式被生物转化，其中主要与牛磺酸结合。不论是否给药胆汁酸，在所有动物的肝脏组织中未结合UDCA和硫酸化UDCA的浓度和比例均可被忽略(图4)。血浆和尿中的胆汁酸组成给药UDCA动物中的未结合血浆UDCA浓度为4.8±2.2μmol/L，该值要明显高于给药3-硫酸酯(0.9±0.4μmol/L)、UDCA 7-硫酸酯(0.7±0.5μmol/L)和UDCA 3,7-二硫酸酯(1.0±0.2μmol/L)的动物。在所有动物中硫酸化UDCA浓度类似并均小于0.3μmol/L。
在未对动物给药胆汁酸前，UDCA的经尿排泄是可忽略不计的(＜0.4nmol/天)。给药UDCA后，尿中未结合UDCA排泄量为642.7nmol/天。该值明显高于给药硫酸酯结合物之动物的尿排泄UDCA浓度(UDCA 3-硫酸酯，5.2nmol/天；UDCA 7-硫酸酯，1.8nmol/天；UDCA 3,7-二硫酸酯，1.3nmol/天)。给药未结合UDCA(4.6nmol/天)、UDCA 3-硫酸酯(2.7nmol/天)、UDCA 7-硫酸酯(317.8nmol/天)、和UDCA 3,7-二硫酸酯(217.1nmol/天)后，UDCA的硫酸酯结合物也可在尿中被观察到。虽然仅占每天给药剂量的＜0.05％，利用液相二级电离质谱分析可检测到这些胆汁酸结合物。讨论口服UDCA使肝脏组织UDCA浓度大大增加，而且该胆汁酸主要通过酰胺化被结合。只有可忽略量的未结合UDCA被检出(图4)，在这方面其代谢方式类似于人类。与之相反，当给药C-7硫酸酯和二硫酸酯结合物时，肝脏UDCA的浓度低于对照动物，表明这些结合物不被肠道所吸收，因此只有可忽略的UDCA保持。当给药C-3硫酸酯后肝脏UDCA浓度增加，其主要被酰胺化的现象表明发生明显的脱硫酸酯基和UDCA 3-硫酸酯的酰胺化。除了在UDCA和UDCA 3-硫酸酯给药组中有较高比例未结合UDCA外，UDCA在空肠中的结合方式平行于肝脏组织(图1)。前期胆汁酸喂养实验证明胆汁酸池的最大富集在4天后达到，继续喂养不使胆汁酸组成发生进一步改变。
从粪便的胆汁酸组成可进一步反应出UDCA的C-7硫酸酯不易被肠道吸收。在给药UDCA 7-硫酸酯和UDCA 3,7-二硫酸酯的动物中，粪便的UDCA总量要大大高于给药UDCA或UDCA 3-硫酸酯动物粪便中的量。此外，UDCA的C-7硫酸酯主要未经转化即排到粪便中。这些发现可被解释为细菌硫酸酯的底物特异性，已发现它仅对C-3胆汁酸底物有活性。给药UDCA对主要次级胆汁酸和石胆酸以及去氧胆酸的粪便排泄有显著影响。当给药未结合UDCA和UDCA 3-硫酸酯时，粪便石胆酸的浓度大大增加，而给药UDCA 7-硫酸酯和UDCA 3,7-二硫酸酯对这些次级胆汁酸的粪便排泄无明显作用。
粪便和肝脏石胆酸浓度的增加可被解释为肠道细菌对UDCA的生物转化，并且以一较低程度生物转化其C-3硫酸酯。在鼠和人体中UDCA生物转化成石胆酸的程度是类似的。在给药UDCA动物中脱氧胆酸的增加与己知的竞争性抑制胆酸在末端回肠的吸收一致，它导致增加地溢流入结肠接着7α-去羟基形成脱氧胆酸。有趣的是UDCAC-7硫酸酯似乎具有相反的作用；在肝脏组织中胆酸的浓度比对照动物略微增加，而粪便中胆酸和去氧胆酸的浓度则下降。
由于UDCA发生显著生物转化形成石胆酸并增加了粪便中去氧胆酸的浓度，两者均为高疏水性胆酸，可能是令人吃惊的是在化学诱导结肠癌的动物模型中已发现UDCA的有益的作用。在这些模型中，已有结论表明疏水性胆汁酸促进肿瘤的增长。结肠和口服给药胆汁酸，胆汁分流至盲肠，消胆胺的摄入，食用脂肪和某些纤维，以及所有增加通过结肠的胆汁酸流量的条件均促进肿瘤形成，这与促进生长的作用一致。体外实验表明去氧胆酸和石胆酸为共促有丝分裂的并能增加结肠上皮细胞增生的速度。对鸟氨酸脱羧酶活性和HLAⅠ和Ⅱ型抗原也显示出一些其它的作用。
对于UDCA的化学保护作用可以有几种解释。当在体外共温孵或在体内与有膜损伤作用的疏水性胆汁酸共灌注时，相对高浓度的UDCA以类似于UDCA细胞保护的方式缓冲结肠中石胆酸形成加快的有害作用。或者，保护作用可能是结肠去氧胆酸浓度下降的结果，这暗示去氧胆酸在促结肠癌中的重要作用。尽管给药硫酸化胆汁酸也同样降低结肠脱氧胆酸的量，理论上UDCA的C-7硫酸酯要比UDCA优越，因为这些结合物不被生物转化成更疏水性的胆汁酸。此外，C-7硫酸酯在小肠中的弱吸收使得应用较低剂量而达到相似的化学保护作用。
胆汁酸在人结肠癌发生中的作用还不清楚。早期的研究表明患有结肠癌、息肉状腺瘤、家族性息肉病的病人中，胆汁酸，特别是石胆酸和去氧胆酸的粪便排泄增加，虽然这些发现尚未得到其它一些观察者的证实。与对照相比，已有报道患有结肠癌或息肉状腺瘤的病人粪便中水相石胆酸和去氧胆酸的浓度增加，这些浓度与结肠细胞的增生程度相关。尽管初步实验数据支持UDCA在结肠癌动物模型和体外细胞系中有化学保护和/或细胞保护作用，给药UDCA后造成石胆酸的生成加快可能会限制UDCA在结肠中的所有作用。与对照相比给药UDCA和UDCA 3-硫酸酯后粪便中石胆酸/去氧胆酸的比例大大增加(图3)。这可能不是理想的，因为患有结肠癌和易感此病的人中粪便石胆酸/去氧胆酸的比例上升，而且这已被建议有诊断价值。另一方面，给药UDCA7-硫酸酯和UDCA3,7-二硫酸酯不使石胆酸/去氧胆酸的比例发生变化。虽然统计上无显著性，可观察到该比例有下降的趋势，而这些次级胆汁酸的定量粪便排泄与对照动物类似。
此外，如上述所讨论的那样，UDCA的C-7位引入硫酸酯基大大增加了分子的亲水性，这阻碍肠道吸收，从而易化了UDCA对结肠的定向传输。未结合UDCA转化成石胆酸，因而增加了粪便石胆酸/去氧胆酸的比率，这被认为是结肠病的一个危险性因素，而与之相反C-7硫酸酯是代谢惰性的。因此，这些结合胆汁酸在结肠中的化学保护剂作用比UDCA更有效。在鼠胆汁流量和胆汁脂类分泌中熊去氧胆酸硫酸酯的代谢和作用以下一步接一步地详细讨论UDCA的C-3和C-7硫酸酯以及二硫酸酯结合物的制备。接着检查这些胆汁酸在胆管中的肝脏代谢，将这些胆汁酸与UDCA比较以确立其在胆汁流量和胆汁脂类分泌上的作用。材料与方法熊去氧胆酸3-硫酸酯(UDCA-3S)的合成将咪唑(3.5g)和特丁基二甲基氯甲硅烷(1.6g)加到冰冷却的UDCA(2g)的无水二甲基甲酰胺(1.5ml)-吡啶(0.75ml)溶液中，并将混合液搅拌30分钟。接着将反应液倒入冰水(20ml)中，并用乙酸乙酯(100ml)萃取。有机相用水洗，无水Na2SO1干燥后蒸干。所得油状残留物溶于己烷-乙酸乙酯(体积比为3∶1,250ml)中，并用一40g硅胶(28-200目，AldrichChemical Co.Inc.,Wisconsin)柱过滤。蒸干滤液并将残渣溶于乙醇，结晶得产物UDCA-3-特丁基二甲基甲硅烷基醚(2.15g，产率83％)。用乙酸酐(20ml)和吡啶(20ml)在室温下处理UDCA-3-特丁基二甲基甲硅烷基醚(2.0g)5分钟得油状产物UDCA 7-乙酸酯3-特丁基二甲基甲硅烷基醚。向UDCA 7-乙酸酯3-特丁基二甲基甲硅烷基醚的丙酮(24ml)液中加入18％HCl(2.4ml)，并将混合液于室温下搅拌30分钟。所得产物用乙酸乙酯萃取，水洗，无水Na2SO1干燥，蒸去溶剂得油状产物熊去氧胆酸7-乙酸酯(1.2g)。将在无水吡啶(12ml)中的氯磺酸(1.2ml)加到冰冷的UDCA7-乙酸酯(1.2g)的溶液中，并将溶液加热至50℃。30分钟后，加入水(400ml)终止反应，产物用一大的十八烷基硅烷键合硅胶柱MEGA-BOND-ELUT(Varian,Harbor City,CA)吸附，并用甲醇洗脱回收。接着将甲醇萃取液蒸干，将UDCA 7-乙酸酯3-硫酸酯的吡啶盐溶于0.2M NaOH甲醇溶液中以将其转化成二钠盐，然后过滤。滤液用冷乙醚(400ml)稀释，收集沉淀，用冷乙醚洗涤并干燥。将固体(1.0g)溶于甲醇(10ml)中，加入3.5M NaOH(10ml)，并将溶液在室温下搅拌18小时。产物用MEGA-BOND-ELUT萃取并用水(500ml)淋洗。将该柱的甲醇萃取液蒸干，溶于0.2MNaOH甲醇溶液(30ml)并过滤。滤液用冷乙醚(300ml)稀释，收集所得沉淀并用乙醚洗涤。用甲醇(20ml)和乙醚(200ml)重复该操作三次，制得UDCA-3-硫酸酯二钠盐(0.62g，产率50％)。熊去氧胆酸7-硫酸酯(UDCA-7S)的合成将在无水吡啶(9ml)中的氯磺酸(0.9ml)加到冰冷的UDCA 3-特丁基二甲基甲硅烷基醚(900mg)的溶液中，并将混合液加热至50℃。30分钟后加入水(400ml)终止反应。沉淀出UDCA 3-特丁基二甲基甲硅烷基醚7-硫酸酯的吡啶盐，水洗，真空干燥后按上述方法用HCl水解。产物用MEGA-BOND-ELUT柱萃取并将甲醇萃取液蒸干后溶于0.2M NaOH甲醇溶液(30ml)中。将该甲醇溶液用冷乙醚(300ml)稀释，接着按上述方法分离沉淀的二钠盐得纯UDCA-7-硫酸酯二钠盐(640mg，产率76％)。熊去氧胆酸3,7-二硫酸酯(UDCA-DS)的合成将在无水吡啶(10ml)中的氯磺酸(1ml)加到冰冷的UDCA(1g)无水吡啶(10ml)溶液中，并将混合液加热至50℃。60分钟后加入水(500ml)终止反应。产物用MEGA-BOND-ELUT柱萃取并按上述方法分离得到UDCA-二硫酸酯的二钠盐(1.1g，产率9l％)。
用气相色谱-质谱(GC-MS)分析所合成化合物经氧化、溶剂解并转化成甲基三甲基甲硅烷基醚(Me-TMS)的衍生物，以确定硫酸酯基的位置。高压液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)和毛细管柱色相气相(GC)分析确定所合成的化合物色谱纯度＞97％。动物实验腹腔注射戊巴比妥(Nembutal,7.5mg/100g体重)将成年雄性Sprauge-Dawley鼠(体重200-230g)麻醉，并用附加剂量保持镇静状态。用PE-50聚乙烯管(Clay-Adams,Parsippany,N.J)插到右颈静脉和总胆管中。实验中用直肠探头和恒温控制的加热板(Harvard ApparatusCo.,Inc.,Millis,Mas)将体温控制为37℃。用Harvard泵(HarvardApparatus Co.,Inc.)以1.0ml/h速率向颈静脉灌注盐水作为对照，时长为2小时。收集2份10分钟胆汁样品作基础值分析后，静脉滴注(i.v.)各胆汁酸30分钟，逐步增加剂量(0.5、1.0、和2.0μmol/min/100g体重)。用含3％人白蛋白的0.45％盐水配制胆汁酸溶液。每次实验采用六只动物并将每10分钟胆汁收集到预先称重的试管中。实验结束时，心脏穿刺取血，并从膀胱中吸取尿样。所有生物样品均在-20℃下贮藏。该动物实验规程(#1810044)已被儿童医院医疗中心的生物伦理学委员会(Cincinnati,Ohio)批准。分析技术采用溶剂系统正丁醇-乙酸-水(10∶1∶1，体积比)在预包被硅胶G板(Merck,0.2mm厚)上进行TLC分析。斑点通过喷10％磷钼酸乙醇溶液，接着在120℃下加热5分钟显色。
使用装有可变波长UV检测器的Varian 5000 HPLC仪(VarianAssociates Inc.,Palo Alto,CA)进行HPLC分析，该仪器装有25×0.46cm Hypersil ODS柱(5μm粒径；Keystone Scientific,Bellefonte,PA)。色谱柱在室温下操作，淋洗液为甲醇-0.01M磷酸盐缓冲液(65∶35，体积比)，调pH为6.8，并按Rossi等人的方法(High pressure liquidchromatographic analysis of eoujugated bile acids in humanbile:simultaneous resolution of sulfated and unsulfatedlithocholyl amidated and the common conjugated bile ducts.J.LipidRes.28∶589(1987))作调整。流量为1.0ml/min，胆汁酸在205nm处检测。
在装有30米DB-1(4mm内径；0.25μm膜厚)的熔融石英毛细管柱(Jand W Scientific Inc.,Rancho Cordova,CA)的Hewlett-Packard 5890气相色相仪上进行GC分析，升温程序为225℃至295℃每分钟2℃，在起始温度时保持2分钟，在最终温度时保持30分钟。氦作为载气，流速为1.8ml/min。
GC-MS在VG Autospec Q磁场式质谱仪或Finnigan 4635四级GC-MS-DS仪上进行，装有相同的色谱柱并在相同色谱条件下进行分析。连续扫描流出组分记录质量范围在50至1000Da/e范围内的电轰击(TOeV)质谱。
将相当于约1μl原始胆汁萃取液、10μl-50μl尿萃取液和μg量合成胆汁酸溶于甲醇中并加到一小滴位于FAB探头铜靶上的甘油基体中，获得胆汁样品、尿和合成化合物的负离子快原子轰击质谱(FAB-MS)。将探头直接引入到质谱仪的离子源中并用一束由鞍形场原子枪(Ion Tech,Teddington,Middlesex,UK)、操作条件为8kV和20μA产生的氙快原子束，或由碘化铯(35kV)产生的铯快原子束轰击含样品的靶。获得质量范围在50-1000Da/e间的负离子谱。胆汁分析假设密度为1g/ml，按重量确定胆汁的体积。在溶剂解前(未硫酸化胆汁酸)和溶剂解后(总胆汁酸)用酶法检测胆汁中总3α-羟基胆酸的浓度(Mashige,F.等人，Direct spectrometry of total bile acids inserum.Clin.Chem.27∶1352-1356(1981))。将胆汁流速乘以胆汁酸浓度计算胆汁酸输出。按胆碱氧化酶法(Nippin Shoji Kaisha,Ltd.,Osaka,Japan)(Grantz,D.等人，Enzymatic measurement of choline-containing phospholipids in bile.J.Lipid Res.22∶273-276(1981))酶法检测胆汁磷脂。也用酶法检测胆固醇(Boehringer Mannehim,Indianapolis,IN)(Fromm,H.等人，Use of simple enzymatic assay forcholesteral analysis in human bile.J.Lipid Res.21∶259-251(1980))。胆汁和尿胆汁酸分析为检测灌注胆汁酸的肝脏转化，将从六只动物上收集的胆汁合并，萃取、溶剂解、水解和衍生化后用GC-MS分析胆汁胆汁酸。采用GC将各胆汁酸峰高与加到最初胆汁样品中的内标降去氧胆酸的峰高作比较，对胆汁酸进行定量分析。以相对于正构烷烃的保留指数，即亚甲基单元值(MU)对胆汁酸进行鉴定，并将其质谱裂解方式与真实标准样品作比较。最近已有超过100个的真实胆汁酸标准样的质谱和保留指数被收集作为参考(Lawson,A.M.等人，MS spectrometry of bile acids,The Bile Acids,Vol.4,Methods and Applications,167-267页(1988))。将来自6只动物的尿样合并并用Bond Elut-C18柱液-固萃取，然后在溶剂解、水解和衍生化后，用GC-MS进行分析。使用亲脂阴离子交换色谱对胆汁酸组分离对于灌注UDCA-3S的动物，在胆汁酸灌注的最终期间(1.0μmol/min/100g体重)收集胆汁。将胆汁酸溶剂解，并按其结合方式用亲脂阴离子交换凝胶、二乙胺基羟基丙基Sephadex LH-20(Packard Instruments,Groningen,The Netherlands)进行组分离。水解并制成Me-TMS醚后用GC-MS对各样品中的胆汁酸组成作分析。统计方法结果以平均±平均值标准误差(SEM)表达。胆汁流量和胆汁脂类输出分别表达为μl/min/g肝脏和nmol/min/g肝脏。使用INSTAT程序(Graphpad Software Inc.,San Diego,CA)进行统计分析。采用学生t-检验法分析组间各参数。用单向方差分析(ANOVA)进行不同组间统计学比较。当发现不同胆汁酸盐灌注组的值有显著性时，用Bonferroni’s t-检验法对比两组数据。进行线性回归分析。从胆汁酸分泌速率和胆汁流量相关的回归线的斜率确定各胆汁酸的利胆作用，并以μl/mol表示。用单向ANOVA进行斜率间的比较。结果胆汁流量和胆汁酸分泌静脉灌注UDCA、UDCA-3S、SUDCA-7S和UDCA-DS对胆汁流量和胆汁酸分泌速度的影响在图5A和图5B中描绘并概括于表4中。所有胆汁酸均有明显利胆作用，最大胆汁流速顺序为UDCA-3S＜UDCA＜UDCA-7S=UDCA-DS。灌注UDCA-3S、UDCA、UDCA-DS和UDCA-7S期间所有动物胆汁酸分泌速度均增加，其最大值分别为138.9±11.8、145.1±17.3、222.4±24.3和255.4±18.2nmol/min/g肝脏。作为对比，基础胆汁酸分泌平均为40±4.2nmol/min/g肝脏。各胆汁酸灌注后胆汁酸分泌速度与胆汁流速的关系在图6中显示。从各回归线的斜率计算出的UDCA、UDCA-3S、UDCA-7S和UDCA-DS的表观利胆作用分别为16±2、15±1、13±1和16±1μl/μmol。各线的截距表明对于所有动物组胆汁酸与胆汁流量的依赖程度相当(1.7μl/min/g肝脏)。胆汁脂类分泌灌注UDCA及其硫酸酯结合物对胆固醇和磷酯的胆汁输出的作用在图7A和7B中显示。在灌注UDCA和UDCA-7S的头40分钟，胆汁胆固醇增加，最大分泌速度分别达到1.88±0.19和1.76±0.21nmol/min/g肝脏，采用UDCA-7S时胆固醇的分泌被维持，而灌注UDCA，甚至是逐步增加剂量时，胆固醇的分泌也明显下降。在预灌注期间，相应的胆固醇分泌速度平均分别为1.46±0.1和1.42±0.16nmol/min/g肝脏。与之相反，灌注UDCA-3S和UDCA-DS时都明显降低胆汁胆固醇的输出，如基础值相比分别降到0.40±0.05和0.37±0.12nmol/min/g肝脏。灌注UDCA和UDCA-7S明显增加胆汁磷酯分泌，而与之相反，灌注UDCA-3S和UDCA-DS造成胆汁磷脂分泌明显减少(表4)。负离子FAB-MS分析胆汁和尿胆汁酸灌注未结合UDCA前(基础期)和灌注期间时合并的鼠胆汁的负离子FAB-MS谱在图8A和8B中显示。在基础胆汁样品中离子m/z 514和m/z 498分别代表三羟基和二羟基胆酸的牛磺酸酯结合物，并代表作为鼠胆汁中主要成份的原生胆汁酸。在灌注UDCA期间，质谱中主要离子变为m/z.498和m/z 448，说明灌注的UDCA差不多全与牛磺酸和甘氨酸结合。离子m/z471表示二羟基胆酸(UDCA)的硫酸酯，而m/z 567和m/z 589(钠加合物)代表UDCA的flucuronide结合物。
灌注UDCA-7S期间，质谱中(图8D)主要离子为m/z 471和其钠加合物m/z 493，这些离子代表未变化的UDCA-7S。没有别的明显离子出现表明有UDCA-7S的进一步代谢转化。
灌注UDCA-3S期间，离子为m/z 471和m/z 493(钠加合物)证明胆汁分泌未变化的胆汁酸，离子m/z 550和m/z 600表明与甘氨酸和牛磺酸酰胺化(图8C)。
灌注UDCA-DS期间，主要离子为m/z 471和m/z 493(钠加合物)和m/z573。离子m/z 573代表UDCA-DS,m/z 471和m/z 493为碎片离子。没有其它离子出现支持UDCA-DS的进一步代谢转化(图8E)。GC-MS分析胆汁胆汁酸表5概括了灌注UDCA及其多种硫酸酯结合物后胆汁中各胆汁酸的相对百分组成。在基础状态下，胆酸、α-鼠胆酸和β-鼠胆酸为鼠胆汁中主要胆汁酸。在灌注所有化合物期间，UDCA成为主要胆汁酸并且所有组间百分组成均类似，表明所有硫酸化胆汁酸被肝脏吸收并有效分泌到胆汁中。
虽然未结合UDCA和UDCA-3S均被进一步羟基化而代谢，其中最有可能发生在侧链上，但羟基化代谢物的精确结构尚未被确定，没有证据表明UDCA的C-7硫酸酯和二硫酸酯会发生包括酰胺化的任何生物转化。
对灌注UDCA-3S时分泌入胆汁的胆汁酸结合物的分离表明，等比例(25％)的灌注胆汁酸以牛磺酸和甘氨酸结合物形式被回收，而UDCA则几乎全部被牛磺酸和甘氨酸结合。由于FAB-MS证明UDCA-7S和UDCA-DS难以被生物转化，进一步结合物的分离被认为是没有必要的。尿胆汁酸的分析所有尿样的FAB-MS分析表明UDCA的硫酸酯均可被排泄至尿中，GC-MS分析也证明了这一点。但是从定量角度与主要消除途径胆汁排泄相比，UDCA硫酸酯被排泄至尿中的相对比例小。当灌注UDCA时只有占总给药剂量可忽略比例(0.0l％)的UDCA出现在尿中。对于UDCA-3-硫酸酯、UDCA-7-硫酸酯和UDCA-二硫酸酯来说，其在尿中的相对于总给药剂量的比例分别为2.8％、0.9％和2.2％。讨论上述结果证明，与UDCA相似，所有硫酸酯结合物均有显著利胆作用并增加了胆汁酸的分泌。各胆汁酸的最大胆汁流量顺序为UDCA-DS=UDCA-7S＞UDCA＞UDCA-3S，不与HPLC保留指数所确定的其相对疏水/亲水性质直接相关。
胆汁酸母核C-7位上硫酸酯基的存在使其具有比UDCA诱导的更高胆汁流量，而C-3硫酸酯，虽然也具有利尿作用，其刺激胆汁流量的效率尚不如未结合UDCA。这些不同点可被解释为肝脏首过消除时发生了C-3明显的硫酸酯酰胺化，而C-7硫酸酯基则阻碍了生物转化。酰胺化的硫酸酯可能具有较弱的利尿性质。有趣的是即使所有被考察胆汁酸造成明显的胆汁流量不同，这些化合物的胆汁中UDCA的相对比例均类似。
对于到胆固醇和磷脂排泄，趋势是明显的。极性(由HPLC保留指数证明)最大的胆汁酸使胆汁胆固醇和磷脂输出明显下降。胆汁酸的疏水/亲水性与胆固醇和磷脂排泄间的关系最可能与分子的净化能力有关，即净化能力较弱而极性高的胆汁酸硫酸酯对细胞膜的损伤要比疏水性较强的胆汁酸弱。
与未结合UDCA相比，较低的胆固醇和磷酯排泄和由高亲水性UDCA的3-硫酸酯和3,7-二硫酸酯结合物诱导的较大的胆汁分泌过多的综合效应提示出，这些特殊的胆汁酸硫酸酯有可能是更有效的胆汁郁积肝脏疾病的治疗剂。
各UDCA硫酸酯的明显不同的肝脏生物转化己被观察到。例如，母核C-7位上硫酸酯基的取代阻碍了肝脏的生物转化，故UDCA-7-硫酸酯和UDCA-二硫酸酯均未经转化即被排泄。而对于UDCA的C-3硫酸酯情况则不同，它以有限程度未经转化被排泄，而且还明显地与牛磺酸和甘氨酸酰胺化并进一步羟基化，其中羟基化最有可能发生在侧链上。而在胆汁分泌前未结合UDCA则主要与牛磺酸结合，并有较少部分转化成甘氨酸、硫酸酯和Flucuronide结合物。
甚至以相对高浓度进行灌注后，也仅有可忽略量的UDCA硫酸酯排泄至尿中。考虑到主要尿胆汁酸为硫酸酯结合物后，该发现是特别令人吃惊的。因此，在患有胆汁郁积肝脏疾病的病人体中胆汁胆汁酸硫酸酯的缺乏以及高比例和高浓度硫酸化尿胆汁酸的出现仅能解释为胆汁酸肾的硫酸化作用，而不是肝脏的硫酸化作用。这些观察结果清楚地表明硫酸化的胆汁酸易于被肝脏吸收并被转运到胆汁中，因此不支持常见的肝脏硫酸化作用为胆汁郁积中主要代谢途径的观点。据此，在胆汁郁积期间肾脏可能是保护肝免受毒性的重要代谢器官。
鼠是明显产生6β-羟基化胆汁酸、CDCA和UDCA 6β-羟基化的种属。在本研究中，明显量的UDCA的羟基化产物，如鼠胆酸异构体不能被检出。已有报道在鼠胆管中牛磺鹅去氧胆酸二硫酸酯和甘氨鹅去氧胆酸二硫酸酯90％被代谢成3α,7α-二硫酸酯、6β-羟基5β-胆烷酸(α-鼠胆酸的3α,7α-二硫酸酯)。在本发明所进行的实验中，UDCA-7S和UDCA-二硫酸酯均不被羟基化。这些实验强烈支持硫酸酯基的存在阻碍了母核的肝脏生物转化。当然也可能是由于羟基化酶优先作用于酰胺化胆汁酸底物的缘故。
胆汁酸与牛磺酸的结合被认为依赖于底物与酶的亲合力(胆汁酸辅酶A甘氨酸/牛磺酸-N-酰基-转移酶)以及肝脏中牛磺酸的供应。我们的FAB-MS和GC-MS结果表明UDCA-3S部分地与牛磺酸和甘氨酸酰胺化，提示与未硫酸化胆汁胆汁酸相比硫酸酯与酶的亲合较弱。UDCA-7S和UDCA-DS不与牛磺酸或甘氨酸酰胺化的观察结果提示7β-硫酸酯基的存在阻碍了酶的活性。
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注结果用平均±SEM表示ND未检出表4.UDCA及其硫酸酯结合物灌注的生理学效应UDCA UDCA-7S UDCA-3S UDCA-DS胆汁流量(μl/min/g肝脏)基础值 1.97±0.05 1.95±0.081.85±0.062.06±0.08最大值 4.88±0.16 5.83±0.313.34±0.135.92±0.21胆汁盐输出(nmol/min/g 肝脏)基础值 47.30±4.30 34.60±4.40 39.60±3.80 40.20±5.50最大值 145.10±17.30 255.40±18.20138.90±11.80 222.40±24.30胆固醇输出(nmol/min/g肝脏)基础值 1.46±0.10 1.42±0.16 1.28±0.05 1.52±0.12最大值 1.88±0.19 1.76±0.23 0.40±0.02 0.37±0.07磷酯输出(nmol/min/g 肝脏)基础值 10.30±0.70 9.00±1.00 9.60±0.80 9.80±0.70最大值 17.20±1.90 15.00±1.70 4.00±0.50 2.50±0.30数值以每组中6个动物的平均±SEM表示。
表5.静脉灌注UDCA和UDCA的硫酸酯结合物期间分泌入胆汁中的各胆汁酸的相对百分组成时间(min) DCACDCA a-MCACAUDCA β-MCA MCA其它UDCA 灌注基础值2.05.48.976.5 3.226.9 1.5nd20-30mins 1.03.04.349.0 51.9 17.2 1.014.650-60mins 0.52.53.921.4 65.9 12.6 0.513.780-90mins 0.71.56.49.879.5 9.9nd 11.9UDCA-7S灌注基础值5.75.37.258.3 1.418.5 3.6nd20-30mins 2.31.72.520.2 61.3 10.7 1.3nd50-60mins 0.70.60.97.783.6 5.90.6nd80-90mins 1.20.71.39.978.8 7.40.8ndUDCA 3S灌注基础值2.24.010.8 57.4 2.020.6 3.0nd20-30mins 2.54.66.236.0 33.3 12.4 4.95.250-60mins 1.01.92.714.9 70.6 7.41.511.580-90mins 1.32.53.018.2 67.7 5.22.011.2UDCA-DS灌注基础值4.26.39.156.7 1.418.0 4.3nd20-30mins 2.12.53.424.5 54.6 9.73.2nd50-60mins 1.20.72.215.3 70.7 6.72.2nd80-90mins nd 0.91.610.6 79.1 6.51.4nd
以上虽然对本发明的几个特殊方面进行了详细讨论，但本发明的范围并不仅局限于这些方面，而是以以下权利要求来确定本发明的范围。
权利要求
1.一种药理学可接受的组合物，其包含一种3α,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酸(UDCA)的硫酸酯；和一种药理学可接受的载体。
2.如权利要求1所述的药理学可接受的组合物，其中，所述硫酸酯选自UDCA-3-硫酸酯、UDCA-7-硫酸酯、UDCA-3,7-二硫酸酯、甘氨-UDCA-3-硫酸酯、甘氨-UDCA-7-硫酸酯、甘氨-UDCA-3,7-二硫酸酯、牛磺-UDCA-3-硫酸酯、牛磺-UDCA-7-硫酸酯、牛磺-UDCA-3,7-二硫酸酯及其混合体。
3.如权利要求1所述的药理学可接受的组合物，其中，所述硫酸酯选自UDCA-3-硫酸酯、UDCA-7-硫酸酯、UDCA-3,7-二硫酸酯及其混合体。
4.如权利要求1所述的药理学可接受的组合物，其中，所述硫酸酯选自UDCA-7-硫酸酯、UDCA-3,7-二硫酸酯及其混合体。
5.如权利要求1所述的药理学可接受的组合物，其中，所述硫酸酯以有效抑制或治疗消化道炎症的量存在。
6.如权利要求5所述的药理学可接受的组合物，其中，所述炎症选自小肠的炎症、大肠的炎症及其混合炎症。
7.如权利要求5所述的药理学可接受的组合物，其中，所述炎症选自结肠癌、直肠癌、结肠瘤、结肠瘤、结肠癌变、直肠癌变、溃疡性结肠炎、息肉状腺瘤、家族性息肉病及其混合炎症。
8.如权利要求1所述的药理学可接受的组合物，其中，所述硫酸酯以有效抑制或治疗肝脏炎症的量存在。
9.如权利要求1所述的药理学可接受的组合物，其中，所述硫酸酯以有效地转UDCA运量至哺乳动物大肠的量存在。
10.如权利要求9所述的药理学可接受的组合物，其中，所述硫酸酯包括C-7碳上有一硫酸酯基，与UDCA或一种C-7碳上无硫酸酯基的UDCA硫酸酯将UDCA转运至大肠相比，所述硫酸酯以更有效地将UDCA转运至哺乳动物大肠的量存在。
11.如权利要求1所述的药理学可接受的组合物，其用于抑制UDCA的肠道吸收。
12.如权利要求1所述的药理学可接受的组合物，其用于抑制UDCA及其代谢物的肠道生物转化。
13.如权利要求12所述的药理学可接受的组合物，其用于抑制UDCA及其代谢物的肠道细菌降解生物转化。
14.如权利要求13所述的药理学可接受的组合物，其用于抑制UDCA及其代谢物的肠道7α-羟基化生物转化。
15.如权利要求1所述的药理学可接受的组合物，其中，所述硫酸酯包括C-7碳上有一硫酸酯基，所述组合物降低结肠中石胆酸及其盐和去氧胆酸及其盐的量。
16.如权利要求1所述的药理学可接受的组合物，其中，所述硫酸酯包括C-7碳上有一硫酸酯基，所述组合物将UDCA转运至结肠但不明显增加结肠中石胆酸及其盐与去氧胆酸及其盐的比例。
17.如权利要求1所述的药理学可接受的组合物，其用于改善肝脏疾病和肝功能的血清生化性质。
18.如权利要求17所述的药理学可接受的组合物，其中，所述血清生化性质包括选自丙氨酸转氨酶、天门冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酯酶、γ-谷氨酰转肽酸及其混合体的酶的血清浓度。
19.如权利要求1所述的药理学可接受的组合物，其用于增加胆汁流量。
20.如权利要求1所述的药理学可接受的组合物，其用于降低选自磷脂、胆固醇及其混合体的脂类的胆汁分泌。
21.如权利要求1所述的药理学可接受的组合物，其中，所述组合物被制成灌注隔离器官的制剂。
22.权利要求21所述的药理学可接受的组合物，其中，所述隔离器官选自肝脏、肺、肾和肠。
23.权利要求1所述的药理学可接受的组合物，其为口服、局部或静脉给药的剂型。
24.如权利要求8所述的药理学可接受的组合物，其为静脉给药的剂型。
25.一种向哺乳动物传输3α,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酸(UDCA)以抑制或治疗疾病的方法，其包括以下步骤以有效抑制或治疗所述疾病的剂量向哺乳动物给药UDCA硫酸酯。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯选自UDCA-3-硫酸酯、UDCA-7-硫酸酯、UDCA-3,7-二硫酸酯、甘氨-UDCA-3-硫酸酯、甘氨-UDCA-7-硫酸酯、甘氨-UDCA-3,7-二硫酸酯、牛磺-UDCA-3-硫酸酯、牛磺-UDCA-7-硫酸酯、牛磺-UDCA-3,7-二硫酸酯及其混合体。
27.如权利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯选自UDCA-3-硫酸酯、UDCA-7-硫酸酯、UDCA-3,7-二硫酸酯及其混合体。
28.如权利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯选自UDCA-7-硫酸酯、UDCA-3,7-二硫酸酯及其混合体。
29.如权利要求25所述的方法，其中，所述疾病为消化道的炎症。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述炎症选自小肠的炎症、大肠的炎症及其混合炎症。
31.如权利要求29所述的方法，其中，所述炎症选自结肠癌、直肠癌、结肠瘤、结肠瘤、结肠癌变、直肠癌变、溃疡性结肠炎、息肉状腺瘤、家族性息肉病及其混合炎症。
32.如权利要求25所述的方法，其中，所述疾病为肝脏的炎症。
33.如权利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯以有效地将UDCA转运至所述哺乳动物大肠的量给药。
34.如权利要求33所述的方法，其中，所述硫酸酯包括C-7碳上有一硫酸酯基，与UDCA或一种C-7碳上无硫酸酯基的UDCA硫酸酯将UDCA转运至大肠相比，所述硫酸酯以更有效地将UDCA转运至所述哺乳动物大肠的量给药。
35.如权利要求25所述的方法，其中，所述方法抑制UDCA的肠道吸收。
36.如权利要求25所述的方法，其中，所述方法抑制UDCA及其代谢物的肠道生物转化。
37.如权利要求36所述的方法，其中，所述方法抑制UDCA及其代谢物的肠道细菌降解生物转化。
38.如权利要求37所述的方法，其中，所述方法抑制UDCA及其代谢物的肠道7α-羟基化生物转化。
39.如权利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯包括C-7碳上有一硫酸酯基，所述硫酸酯以足够降低结肠中石胆酸及其盐和去氧胆酸及其盐的量给药。
40.如权利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯包括C-7碳上有一硫酸酯基，所述硫酸酯以足够将UDCA转运至结肠但不明显增加结肠中石胆酸及其盐与去氧胆酸及其盐的比例的量给药。
41.如权利要求25所述的方法，其中，所述疾病为肝脏疾病，所述硫酸酯以足够改善肝脏疾病和肝功能的血清生化性质的量给药。
42.如权利要求41所述的方法，其中，所述血清生化性质包括选自丙氨酸转氨酶、天门冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酯酶、γ-谷氨酰转肽酸及其混合体的酶的血清浓度。
43.如权利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯以足够增加胆汁流量的量给药。
44.如权利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯以足够降低选自磷脂、胆固醇及其混合体的脂类的胆汁分泌的量给药。
45.如权利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯以选自口服、局部或静脉给药及其混合方式给药。
46.如权利要求32所述的方法，其中，所述硫酸酯以静脉注射给药。
47.一种维持隔离器官的方法，其包括以下步骤向所述隔离器官灌注3α,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酸(UDCA)的硫酸酯。
48.如权利要求47所述的方法，其中，所述隔离器官选自肝脏、肺、肾和肠。
全文摘要
本发明的一个方面涉及一种药理学可接受的组合物,其包含:一种3α,7β－二羟基－5β－胆烷－24－酸(UDCA)的硫酸酯和一种药理学可接受的载体。在优选组合物中,所述硫酸酯为UDCA－3－硫酸酯、UDCA－7－硫酸酯、UDCA－3,7－二硫酸酯、甘氨－UDCA－3－硫酸酯、甘氨－UDCA－7－硫酸酯、甘氨－UDCA－3,7－二硫酸酯、牛磺－UDCA－3－硫酸酯、牛磺－UDCA－7－硫酸酯、牛磺－UDCA－3,7－二硫酸酯及其混合体。本发明另一方面涉及一种向哺乳动物传输UDCA以抑制或治疗疾病的方法,其包括以有效抑制或治疗所述疾病的剂量向哺乳动物给药UDCA硫酸酯。例如,UDCA硫酸酯可用于抑制或治疗消化道的炎症如结肠癌、直肠癌、结肠瘤、结肠瘤、结肠癌变、直肠癌变、溃疡性结肠炎、息肉状腺瘤、家族性息肉病等。还可给药UDCA来抑制或治疗肝脏的炎症。UDCA硫酸酯可用于改善肝脏疾病或肝脏功能的血清生化性质,增加胆汁流量,或降低磷脂或胆固醇的胆汁分泌。另一方面,本发明还涉及通过用UDCA硫酸酯灌注器官来维持隔离器官的方法。
文档编号A61K47/24GK1211185SQ96199708
公开日1999年3月17日 申请日期1996年11月19日 优先权日1995年11月21日
发明者肯尼斯·D·R·塞彻尔 申请人:儿童医院医疗中心