专利名称：重组人肝细胞生成素的生产方法及其治疗严重肝病的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程产品的生产方法及用途领域，更具体地说为一种重组人肝细胞生成素(rHPO)的生产方法及产品在临床上的治疗作用。
肝脏是机体具有强大再生能力的脏器，有关其调控机理的研究国际上已进行百余年，但目前已知的肝再生相关生长因子如肝细胞生长因子(HGF)，转化生长因子-α(TGF-α)等，其作用均缺乏肝特异性，难以解释具有器官特异性的肝再生调控机理，因此，寻找新型肝再生调控因子一直是该领域的热点。1975年，LaBrecque等首先报道大鼠再生肝组织中含有一种具热稳定性的促肝增殖因子。80年代中期，我们在人胎肝组织中也发现同类因子，并对其生物活性、理化性质、蛋白质纯化及临床应用进行了系统研究。由于此类因子应用临床治疗严重肝病取得较好疗效，因而倍受重视，国内外多家实验室一直致力于此类因子的分子克隆。1995年，我们利用功能筛选法从人胎肝cDNA文库中分离到人肝细胞生长素cDNA，完成其核苷酸序列测定并通过构建真核、原核表达质粒，对其生物学活性进行了研究，证实该基因表达产物在体内能刺激肝细胞增殖，并于1996年3月申请中国发明专利，申请号为96103203.0。但至今尚未见国内外有关人肝细胞生成素高效表达及获取重组人肝细胞生成素的系统工艺报道。近年，国内在临床上应用从乳猪肝、新生小牛肝提取的促肝细胞增殖活性因子治疗严重肝病，取得满意疗效，但受材料来源、产品纯度、种族差异等限制，其应用受到较大限制。重组人肝细胞生成素的生产克服了这些限制，有望为临床提供有效的治疗严重肝病的药物。
本发明的目的是通过原核表达、纯化获取具有生物活性的重组人肝细胞生成素及用于临床上治疗严重肝病。
本发明其主要内容是在获取人肝细胞生成素cDNA并成功构建高效表达菌株的基础上，建立了一整套工程菌诱导表达、包涵体的分离和裂解、蛋白质纯化和复性工艺，以获得重组人肝细胞生成素纯品，并对重组人肝细胞生成素的生物学性能进行了描述，表明重组人肝细胞生成素有在临床上治疗严重肝病的用途。
本发明在自行克隆人肝细胞生成素cDNA并成功构建高效表达菌株的基础上；建立并优化了一整套工程菌发酵、包涵体的分离和裂解、蛋白质纯化和复性工艺，其特征为1)对工程菌低密度发酵，其最佳诱导表达时间为细胞密度OD600＝0.3-0.4；2)包涵体变性剂是8M尿素或用0.05mol/L NH4AC缓冲液配制的含1％巯基乙醇的7mol/L盐酸胍；3)采用复性溶液(2mol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mmol/L还原型谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HCl pH8.0)或稀释复性溶液(100mmol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mmol/L还原型谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HCl pH8.0)进行复性；4)柱层析纯化可采用复性蛋白的柱层析纯化或包涵体在变性条件下进行柱层析纯化，其流程如图3；其中sp-FF柱上样后乙酸钠缓冲液洗脱未结合相、用300mmol/LNacl阶段洗脱rHPO在第一峰；DEAE-Sepharose FF(Pharmacia)阴离子交换柱用50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液洗脱未结合相。用350mmol/L NaCl阶段洗脱，rHPO在第一峰；5)柱层析纯化可采用包涵体在变性条件下进行柱层析纯化，其流程如图4；其中AcA44凝腔过滤柱层析上样后用2mol/L盐酸胍洗脱，rHPO在第二峰中；MONO Q离子交换层析上样后用0.05mol/L NaCl(0.05mol/L NH4Ac配制)将rHPO洗脱下来，rHPO在主峰中；通过该方法获得人肝细胞生成素纯品，纯度达99％，其N-端氨基酸序列(图2)测定与依据核苷酸序列推导的氨基酸序列(图1)一致；人肝细胞生成素等电点为7.2，分子量为15280道尔顿；在体外能促进原代培养肝细胞及肝癌细胞的增殖，在体内能促进CCL4致损肝细胞DNA合成，并能显著提高CCL4诱导肝功能衰竭大鼠存活率，因而提示重组人肝细胞生成素能应用临床治疗严重肝病。
结合
本发明的具体实施方法如下图1为依据核苷酸序列推导的rHPO氨基酸序列图2为测定的人rHPO N-端氨基酸序列图3为本发明的工艺流程4为本发明实施例二的工艺流程图5为工程菌诱导表达水平的SDS-PAGE检测结果图6为rHPO纯化产物SDS-PAGE结果图中从左至右分别为蛋白标准、全菌裂解液、纯化HPO实施例一一、本实施例的技术要点1.细菌发酵为低密度高表达2.包涵体变性剂为尿素3.包涵体复性后再进行柱层析纯化(两步法)4.包涵体变性条件下进行柱层析纯化(一步法)二、实施例实验操作步骤(图3)1.工程菌种重组pBV-rHPO-1/JM109本室构建。从4℃保存的工程菌平皿中挑取单菌落接种于5ml LB培养液试管中(含氨苄青霉素100ug/ml)，30℃、200转/分振荡培养12小时后，按5％比例接种于摇瓶中(含氨苄青霉素100ug/ml)30℃、200转/分振荡培养12小时后可作为种子液。
2.发酵 以2％浓度将种子液接种于500ml LB培养液中(含氨苄青霉素100ug/ml，pH7.2)，30℃、200转/分振荡培养3-5小时。待其菌密度达到OD600＝0.3-0.4时，迅速升高温度至42℃诱导表达5小时。离心收集细菌、电泳鉴定目的蛋白表达含量。湿菌收获量约5g/L。5升发酵罐发酵条件为通气量2L/min，溶解氧50％(DO调节)，搅拌速度300-600转/分，每次LB培养液(含氨苄青霉素100ug/ml，pH7.2)投料量4升。种子液浓度2％，生长温度30℃，待其菌密度达到OD600＝0.3-0.4时，升高温度至42℃诱导表达5小时。离心收集细菌、电泳鉴定目的蛋白表达含量(图5)。湿菌收获量约5g/L。
3.细菌细胞裂解4℃ 3,000rpm离心30分钟，弃去上清。称量细菌湿重量，按10g菌/100ml的浓度加裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA，1mg/ml)溶菌酶，0℃作用30分钟。然后冰浴超声30-45秒，间歇2分钟，共超声三次。超声完毕，4℃ 8,000rpm离心30分钟，弃去上清，收集包涵体。以100mmol/L Tris-HClpH8.0洗涤一次。
4.包涵体洗涤和纯化(1)以0.5％ Triton X-100(100mmol/L Tris-HCl pH8.0配制)重悬沉淀(20g/100ml)，室温搅拌40分钟。10,000rpm，离心30分钟，弃去上清。沉淀用100mmol/L Tris-HCl pH8.0洗涤一次，称重；(2)以2mol/L NaCl(100mmol/L Tri-HCl pH8.0配制)重悬步骤(1)沉淀(20g/100ml)，室温搅拌120分钟，10,000rpm，离心30分钟，弃去上清。沉淀用100mmol/L Tris-HCl pH8.0洗涤一次，称重；(3)以4mol/L尿素(100mmol/L Tris-HCl pH8.0配制)重悬步骤(2)沉淀(20g/100ml)，室温搅拌40分钟。10,000rpm，离心30分钟，弃去上清。沉淀用100mmol/L Tris-HClpH8.0洗涤一次，称重。
5.包涵体裂解采用8mol/L尿素裂解已纯化的包涵体。8mol/L尿素(100mmol/L Tris-HClpH8.0配制)，0.5-1％巯基乙醇重悬纯化的包涵体(20-30g/100ml)，室温搅拌过夜。10,000rpm离心30分钟，上清即为包涵体裂解溶液，溶液应为清亮透明、淡黄色。沉淀可用8mol/L尿素再萃取一次。
6.包涵体复性(1)2mol/L尿素复性步骤5，包涵体裂解液，用100mmol/L Tris，pH8.0，将尿素由8mol/L稀释至2mol/L，同时调节总蛋白量不超过500ug/ml。并在此复性体系中加入终浓度0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽和终浓度1mmol/L还原型谷胱甘肽。4℃复性8-10小时。复性后溶液应清亮透明无沉淀。用100mmol/L Tris-HClpH8.0缓冲液(含氧化还原体系)多次透析除去尿素，每次尿素浓度降低25％。
(2)稀释复性方法 将变性蛋白液逐滴加入复性溶液中(100mol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mmol/L还原型谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HClpH8.0)。总蛋白量不超过1mg/mg充分复性后，离心去除沉淀，经Millipore浓缩仪(分子量截留5000)浓缩，再经100mmol/L Tris-HCl pH8.0缓)中液充分透析，去除残留尿素。
7.复性蛋白的柱层析纯化(1)强阳离子交换层析结合分子筛层析法 选用丙磺基-琼脂糖强阳离子快流速交换柱(SP-FF Pharmacia)。用pH5.5 50mmol/L乙酸钠缓冲液平衡SP-FF柱(2.620cm)。包涵体复性液在乙酸钠缓冲液中充分透析后上样。每次上样10ml(1mg/ml)。乙酸钠缓冲液洗脱未结合相。用300mmol/L NaCl阶段洗脱，280nm检测洗脱蛋白峰，SDS-PAGE鉴定各峰蛋白分布情况，rHPO在第一峰。将以上第一峰样品用50mmol/L Tris-HCl pH8.0充分透析除去NaCl后上样于50mmol/L Tris-HCl pH8.0平衡的Sephacryl S-100快速柱(802.6cm)，280nm检测洗脱蛋白峰，SDS-PAGE鉴定各峰蛋白分布情况。rhHPO在主峰中。
(2)阴离子交换层析结合分子筛层析法 选用DEAE-Sepharose FF(Pharmacia)阴离子交换柱。柱先用50mmol/L Tris-HCl pH8.0流洗平衡。包涵体复性液直接上样，上样浓度1mg/ml，体积15ml。50mmol/L Tris-HClpH8.0缓冲液洗脱未结合相。用350mmol/L NaCl阶段洗脱，280nm检测洗脱蛋白峰，SDS-PAGE鉴定各峰蛋白分布情况，rHPO-I在第一峰。
将以上第一峰样品用50mmol/L Tris-HCl pH8.0充分透析除去NaCl后上样于50mmol/L Tris-HCl pH8.0平衡的Sephacryl S-100快速柱(802.6cm)，280nm检测洗脱蛋白峰，SDS-PAGE鉴定各峰蛋白分布情况。rHPO在最后主峰中。
(3)包涵体裂解液在变性状态下的分子筛层析法Sephacryl S-100快速柱(802.6cm)。8mol/L尿素变性包涵体样品直接上样于经8mol/L尿素(100mM Tris-HCl pH8.0)平衡后的柱。280nm检测洗脱蛋白峰，SDS-PAGE鉴定各峰蛋白分布情况，r HPO在最后峰。
实施例二.
一、本实施例的技术要点1.细菌发酵为低密度高表达2.包涵体变性剂为盐酸胍3.包涵体在变性条件下进行柱层析纯化，目的蛋白复性后再进行第二步柱层析纯化二.本实施例实验操作步骤(图4)1.细菌发酵 与实施例1相同2.细菌细胞裂解 与实施例1相同3.包涵体洗涤和纯化 与实施例1相同4.包涵体裂解 洗涤后的包涵体用0.05mol/L NH4Ac缓冲液配制的含1％巯基乙醇的7mol/L盐酸胍裂解，8,000rpm离心10分钟，回收裂解上清，将此上清用于下述纯化。
5.AcA44凝胶过滤柱层析 用2mol/L盐酸胍(0.05mol/L NH4Ac配制)平衡的AcA44凝胶过滤柱(1.6×80cm)。将步骤4裂解上清 上此凝胶柱，每次上样量为3ml。然后用2mol/L盐酸胍洗脱，280nm检测洗脱蛋白峰。SDS-PAGE检查各峰中的蛋白，rHPD在第二峰中。
6.rHPO的复性 将步骤5得到的rHPO样品，用2mol/L盐酸胍调至蛋白浓度低于500ug/ml，然后用0.05mol/L NH4Ac作10倍稀释，并向稀释后的样品溶液中加还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽，使其终浓度分别为1mmol/L和0.2mmol/L。稀释后的样品置4℃的层析柜中过夜。此日，将此稀释样品对0.05mol/L NH4Ac充分透析。然后将透析后的样品离心，上清即为复性后的rHPO样品。
7.MONO Q离子交换层析 将复性后的rHPO样品流经0.05mol/L NH4Ac平衡的Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(1.6×10cm)，用同样的缓冲液洗脱未结合蛋白。再用0.05mol/L NaCl(0.05mol/L NH4Ac配制)将rHPO洗脱下来。经SDS-PAGE鉴定rHPO在主峰中。rHPO纯化产物SDS-PAGE结果见图6。测定的人肝细胞生成素N- 端氨基酸序列见图2。等电点为7.2，分子量为15280道尔顿。实施例三一、本实施例的技术要点1.rHPO促原代培养肝细胞及HTC肝癌细胞DNA合成2.rHPO体内促肝细胞DNA合成二、本实施例实验操作步骤1.体内促肝细胞增殖活性测定 以原代肝细胞及HTC肝癌细胞为体外生物活性检测靶细胞。肝细胞的分离采用Seglaen的方法。Wistar大鼠禁食过夜，自由饮水。早900-1100行手术分离肝细胞。用0.4％戊巴比妥腹腔给药麻醉，75％酒精浸泡全身，通过肝门静脉用无钙PBS罐流5分钟，改用事先预热37℃的0.06％胶原酶液，以10ml/min的速度罐流，同时将肝与周围组织分离，移至平皿继续罐流，剥离肝包膜，轻轻抖落肝实质部分，去除血管、脂肪后，过200目铜网及纱布过滤细胞，用PBS冲洗三次。调整细胞浓度6×106/ml，取100ul接种96孔培养板，以含5％胎牛血清的1640培培养液于37℃、5％CO2条件下培养12h，加入纯化的rHPO(浓度4-10ug/ml)。同时以胰岛素、人胎肝肝脏刺激物为阳性对照，JM109转染PBV220空质粒全菌裂解液(4-10ug/ml)为对照。连续培养24h每孔加入1.85×104Bq3H-TdR。3h后胰蛋白酶消化，收集细胞并进行液闪计数。刺激活性以刺激指数表示。刺激指数＝实验组cpm/至白组cpm。
取HTC细胞悬液(4×105/ml)100ul，接种于96孔细胞培养板，以含5％小牛血清的1640培养液在37℃，5％CO2条件下培养6h后，加入待测样品(每样四孔)，继续培养20h，每孔加1.85×104Bq3H-TdR，3h后，收集细胞于滤纸，并进行液闪计数，活性以cpm值表示。结果表明提纯rHPO在体外能促进原代培养大鼠肝细胞及HTC肝癌细胞DNA合成。
2.rHPO体内促肝细胞DNA合成 采用大鼠1/3肝部分切除模型进行。按Higgins和Anderson介绍的方法建立鼠1/3肝叶切除模型。Wistar大白鼠行1/3肝叶切除术，术后立即腹腔注射rHPO(0.1mg/mI)1ml，同时设生理盐水及荷空质粒受体菌裂解液(0.1mg/ml)对照组；20h后按100u ci/kg体重腹腔注射3H-TdR，2h后，处死大鼠于肝固定部位取肝组织，按Morley(6)介绍的方法进行DNA提取及3H-TdR掺入计数，结果以cpm/ug DMA计算.结果表明rHPO在体内能促进肝细胞增殖。实例四一、本实施例的技术要点rHPO抗肝损伤活性二、本实施例实验操作步骤1.体外CCl4肝损伤模型的建立 按Seglaen介绍的原位灌注法分离Balb/c小鼠肝细胞。分离的细胞用含10％小牛血清，10-9mol/L胰岛素及含青霉素，链霉素的1640培养液悬浮，按每孔100ul(细胞数3×104)接种于96孔细胞培养板，37℃，5％CO2条件下培养10小时后，换含5mM CCl4，10％小牛血清及不同浓度rHPO的1640培养液，分别于换液后不同时间进行LDH释放实验及细胞存活状态观察。
2.LDH释放实验 于换液后不同时间收集细胞培养上清，按Cytox96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay操作指南进行测定。
LDH释放率＝实际释放数-自然释放数/最大释放数-自然释放数3.细胞存活状况 采用MTS法评价肝细胞存活状况。每组4孔，共三次实验，用酶联检测仪检测各孔490nm OD值。
4.体内肝损伤模型的建立首先进行预实验，依据病死率、病理改变等确定4ml/kg(1体积CCl4∶1体积豆油)为最佳致死剂量，2ml/kg为最佳致伤剂量。取40只小鼠分别一次性每只腹腔注射CCl4(4ml/kg)，4h后随机分组，每组20只，治疗组每12小时腹腔注射rHPO 40ug，同时设生理盐水对照组，每日记录动物死亡情况，存活超过96h计为存活动物。共进行3批实验，以观察rHPO对CCl4中毒肝衰竭动物的救治作用。
取18只小鼠，按2ml/Kg腹腔注射CCl4，4小时后随机分为3组，1组静脉注射rHPO 10ug；2组静脉注射rHPO 40ug； 3组静脉注射生理盐水；每12小时注射一次，中毒后48小时，进行DNA增殖测定，同时取外周血清测定ALT、LDH水平；取肝组织进行病理学检查。
5.DNA增殖测定 以5-氟尿嘧啶标记法进行肝细胞增殖检测。主要过程最后一次注射rHPO后12小时，按1.0ml/Kg腹腔注射标记液，2小时后活杀动物，于肝固定部位取肝组织于甲醛溶液固定，常规石蜡切片，二甲苯脱蜡，系列酒精脱水后，切片以PBS液洗涤三次，抗5-氟尿嘧啶单克隆抗体室温孵育60分钟，PBS洗涤二次，切片以过氧化物酶标记的鼠抗兔IgG室温孵育30分钟，洗涤三次后，显色10min，脱水、透明、封片，显微镜下随机挑出5个视野，计数阳性细胞。
6.病理学检查 于肝右叶固定部位取肝组织置10％甲醛溶液，常规石蜡切片，病理检查。
7.结果 为观察rHPO在体外是否对CCl4损伤肝细胞有保护作用，我们在原代培养肝细胞体系中加入5mMol/L CCl4模拟体内肝损伤情况，并选择LDH释放及肝细胞存活状况为指标进行了观察。如所示，rHPO对正常肝细胞LDH释放无明显影响，但具有明显抑制CCl4诱导损伤的肝细胞LDH的释放，这种作用在各个时间点均存在且具有剂量效应正相关。为较客观评价CCl4致损后培养肝细胞的存活状况，以MTS法检测之。在含5Mol/L CCl4条件下，培养24h后细胞存活数明显下降，但rHPO组存活数均高于对照组(p＜0.05)。
以4ml/Kg剂量CCl4，成功诱导小鼠发生肝功能衰竭，生理盐水组存活率为10％，rHPO治疗组为30％，两组差别显著(p＜0.01)；以2ml/Kg剂量CCl4诱导小鼠发生实验性肝炎，并以rHPO(10ug、40ug)和生理盐水进行治疗，损伤后48h，两组动物外周血ALT、LDH水平均明显升高，但rHPO治疗组水平较对照组降低，其中40ug组LDH水平降低34％，ALT水平降低38.3％；光镜下病理学检查显示未治疗组肝细胞广泛肿胀、变性，中央静脉周围可见多处坏死，10ug治疗组与未治疗组比较无明显差别，但40ug治疗组变性及坏死均较未治疗组明显减轻；免疫组化检测CCl4诱导肝损伤后肝细胞DNA合成状况。表明rHPO-I具有促进DNA合成的作用，其中10ug组标记细胞较对照增加1.7倍，40ug组增加4.7倍。表明rHPO具有阻止肝细胞坏死，促进肝细胞再生的作用。
总之，本发明公开了一种生产rHPO的方法，包括工程菌诱导表达、包涵体的分离和裂解、蛋白质纯化和复性等系列工艺，并提供了生产产物的理化性质、生物活性检测方法。
本发明的纯化产物可做为一种抗原，用于免疫动物以制备相应抗体，也可作为一种试剂，用于固体组织、液体标本的检测；该产品还可望应用临床治疗严重肝病(如急性肝功能衰竭)。
权利要求
1.一种生产重组人肝细胞生成素(rHPO，原名肝增殖素)的生产方法及其治疗严重肝病的用途，包括工程菌发酵、包涵体的分离裂解、蛋白质纯化和复性工艺及表达产物的生物活性；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征为对工程菌低密度发酵，其最佳诱导表达时间为细胞密度OD600＝0.3-0.4时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征为包涵体变性剂可以是用0.1MTris，pH8.0缓冲液配制的8M尿素或用0.05mol/L NH4AC缓冲液配制的含1％巯基乙醇的7mol/L盐酸胍。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征为采用复性溶液，其组份可以为2mol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mmol/L还原型谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HCl pH8.0或稀释复性溶液，其组份可以为100mmol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mol/L还原型谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征为柱层析纯化可采用复性蛋白的柱层析纯化，其流程如图3，其中SP-FF阳离子交换柱上样后乙酸钠缓冲液洗脱未结合相，用300mmol/L NaCl阶段洗脱，rHPO在第一峰；DEAE-Sepharose FF(Pharmacia)阴离子交换柱用50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液洗脱未结合相，用350mmol/L NaCl阶段洗脱，rHPO在第一峰。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征为柱层析纯化可采用包涵体在变性条件下进行柱层析纯化，其流程如图4；其中AcA44凝胶过滤柱层析上样后用2mol/L盐酸胍洗脱，rHPO在第二峰中；MONO Q离子交换层析上样后用0.05mol/LNaCl(0.05mol/L NH4Ac配制)将rHPO洗脱下来，rHPO在主峰中。
7.根据权利要求1所述的方法，生产的rHPO具有以下生物学特性具有附图1氨基酸序列；等电点为7.2，分子量为15280道尔顿；在体外能促进原代培养肝细胞及肝癌细胞的增殖，在体内能促进1/3肝部分切除后及CCl4致损后大鼠肝细胞DNA合成，并能显著提高CCCL4诱导肝功能衰竭大鼠存活率。
全文摘要
本发明为重组人肝细胞生成素(rHPO)的生产方法及其治疗严重肝病的用途;属生物产品生产方法及用途领域。在获取hHPOcDNA并成功构建高效表达菌株的基础上,建立了一整套工程菌诱导表达、包涵体的分离和裂解、蛋白质纯化和复性工艺,以获得重组人肝细胞生成素纯品;其生物特征为等电点7.2,分子量15280道尔顿;在体外能促进原代培养肝细胞及肝癌细胞的增殖,在体内能促进1/3肝部分切除后及CCl
文档编号A61K38/16GK1194308SQ9710193
公开日1998年9月30日 申请日期1997年3月21日 优先权日1997年3月21日
发明者贺福初, 杨晓明, 何浩, 王清明, 魏汉东, 李志红, 陈惠鹏, 吴祖泽 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所