专利名称：治疗或预防由nos功能减退诱发的疾病的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及以通式(Ⅰ)表示的化合物及其药学上允许的盐作为有效成分的用于预防和／或治疗由NOS功能减退诱发的疾病的药物，
式中，R1和R2分别表示氢原子，或在一起表示单键，R1和R2表示氢原子时，R3表示-CH(OH)CH(OH)CH3、-CH(OCOCH3)CH(OCOCH3)CH3、-CH3、-CH2OH或苯基，R1和R2在一起表示单键时，R3表示-COCH(OH)CH3。
现已知血管内皮在血管紧张及血栓形成方面起着重要的作用，从1980年开始有报告说存在着一种内皮由来弛缓因子(endothelium-derived relaxing factorEDRF)。之后，在1987年证明了EDRF的本体是一氧化氮(NO)。NO的产生过程是这样的L-精氨酸被氧化，在从NG-羟基-L-精氨酸变成L-瓜氨酸时产生了NO，这一反应受到NO合成酶(NO synthaseNOS)的催化作用。另外，NOS广泛地存在于血管内皮、神经系统、肾脏、血小板、平滑肌等中，因产生的NO具有极其丰富的作用，所以在全身循环的调节方面起着重要的作用。与NO的产生低下有关的疾病例如有高血压、高血脂症、动脉硬化、缺血性心脏病、心功能不全、血栓症等循环系统疾病，哮喘、慢性闭塞性肺疾病、肺高血压、ARDS等呼吸系统疾病，肝障碍、肝硬化、胃肠粘膜障碍、肥厚性幽门狭窄症、胰腺炎等消化器官疾病，脑缺血、脑梗塞、脑循环功能不全、老年性痴呆等脑血管障碍，肾障碍，阳萎等肾和泌尿器官疾病，妊娠中毒症等妇产科疾病，其他的感染症、免疫疾病、糖尿病、烫伤等药剂性的与NO产生低下有关的疾病。另外，进行了有关NOS基因的克隆及结构解析。其结果发现了在NOS基因中除了存在CaM、黄素、NADPH的结合部位之外，还存在着包括在作为本发明的有效成分的式(Ⅰ)化合物中的(6R)-L-赤型-5，6，7，8-四氢生物喋呤(以下称为“BH4”)的结合部位。另外还暗示了BH4实际上与NOS的功能控制有关。
另一方面，如果对实验动物静脉注射NOS阻碍药，则使实验动物的血压上升(Sakuma I．et．al．Circ．Res．70607-611，1992)。另外还有有关在DOCA-食盐高血压大鼠、SHR-SP大鼠、Dahl-S大鼠、Gold blatt高血压大鼠等高血压模型动物中内因性NO的产生低下的报告。
但是，还没弄清楚在这些模型动物体内NO产生低下的原因。另外，还有很多报告说在作为高血压动物模型而频繁采用的高血压自然发病大鼠(SHR)体内NO的产生亢进(Dominizak AF等，Hyper-tension 251202-1211，1995)。对于SHR来说，在高血压状态时NO过量释放，使血压下降，但NO的作用被认为还不够充分(NavaE等，Circulation 92I-347，1995)。也就是说，过去一直认为高血压与NO有关，但NOS活性与高血压之间的关系还不清楚。另外，高血压中的血管舒张反应降低可能与目前还不清楚的内皮由来过分极因子(EDHF)反应的降低或内皮由来血管物质(EDCF)的增加有关。
这样，对于NO的血管舒张作用以及由BH4对NOS进行功能控制已经有了某种程度的认识。但是，对于NO产生低下的原因及NOS活性与高血压之间的关系还不清楚，对于高血压与生物体内的BH4之间的关系当然还有BH4的降压作用还完全不知道。
另外，在许多工业化国家心血管疾病已成为最高的死亡原因。目前在临床上应用的有降压剂、高血脂用剂、利尿剂、血管扩张剂、抗血小板药等，其中的许多药物是以改善血压和胆固醇等的指标为目的，从预防发病、抑制恶化、长期预防等观点来看还有很多问题没有解决。近年对于与以上疾病相关的血管疾病开始从分子水平进行研究，并据此考虑实行对以内皮细胞为代表的血管进行治疗的策略，于是提出了使用能够控制作为EDRF的本体的NO的产生或具有抗氧化作用的物质来进行治疗的方法(Gibbons，G．H．Dzau，V．J．，Sci-ence，Vol．272，689-693，1996年)。但是尚未确立满足该治疗策略的药剂及治疗方法。
另外，过去对于心绞痛或心功能不全采用外因性的NO供给剂进行治疗，其中硝酸剂(硝酸甘油制剂等)很有效，但长期连续使用会产生耐药性的问题。也就是说，从硝酸剂产生NO时，硫醇基(SH基)是不可缺少的，由于长期连用硝酸剂，致使SH基枯竭。产生NO需要有代谢酶，在反应过程中产生亚硝基硫醇等其他的NO关连物质，长期使用会使生物体内物质的平衡被破坏。另外还开发了β阻断剂或具有K+通道开口药性质的新型NO供给剂，但这些药物也超出了上述NO供给剂的范围。因此，从预防发病、抑制恶化、长期预防的观点出发，最理想的治疗法是持续激活内因性NO机能和改善内皮细胞功能。
从上述观点出发，最理想的方法是在生物体内自发地产生NO，也就是使NOS活化，到目前为止对于作为NOS基质的L-精氨酸的效果已经在以下疾病的发病中进行了探讨，例如高血压(Higashi，Y．等，Hypertension 1995，25，898-902)、心绞痛(Egashira，K．等，Circulation 1996，94，130-134)、心功能不全(Rector T．S．等，Circu-lation 1996，93，2135-2141)等。
因乙酰胆碱引起的内皮依赖性血管扩张反应的低下，基础性和由内皮素受体(ETB)刺激引起的肾NO产生低下的动物模型即DO-CA食盐高血压大鼠已广为人知(Hirata Y，Hayakawa H，Omata M等Circulation 1995911229-1235)，对于该动物模型长期给与L-精氨酸会使内皮依赖性血管扩张反应和肾NO的产生恢复，但其效果是部分的(Hayakawa H，Hirata Y，Omata M等Hypertension199423752-756)。对于高血压患者给与L-精氨酸会与正常人一样引起血压降低，但观察不到在正常人身上所发生的肾血流增大、过滤分级分离级分低下、肾血管阻力减弱，高血压患者的血中cGMP明显降低(Higashi Y．Ohshima T，Kajiyama G等Hypertension199625898-902)。这些事实说明在肾循环中的NO产生不全与L-精氨酸这一类基质的多少无关，而且不只是因为NOS的酶活性低的原因。也就是说，L-精氨酸-NO体系与循环调节的关系以及内皮依赖性血管扩张反应低下的机理，单纯以L-精氨酸的利用障碍或不足等为理由是无法充分说明的，因此有必要对NOS的活性或量的变化等进一步探讨。
高血压治疗的目的是预防高血压引起的心血管系统的并发症，延长患者的生命，给患者带来充实的生活。为了在人的一生这样长的一段时间内控制血压，一般是在减盐、减肥、运动疗法等一般疗法的基础上，在长时间内利用降压药进行降压治疗。
目前用于治疗的主要降压药有噻嗪类利尿药、β-阻断剂、Ca拮抗剂、血管紧张素转换酶(ACE)阻碍剂、α1受体阻断剂等。但这些降压药并不能满足如下的作为理想降压药的条件，可以说是即有优点也有缺点。
理想的降压药的条件是指1、作用温和效果稳定；2、使用初期的副作用少；3、对于循环动态、脏器机能的影响朝着希望的方向发展；4、长期连续使用不但不会对心血管系统的危险因子产生坏影响，而且还会改善；5、使接受治疗的患者的伸缩率变好；6、不会因各种并发症或偶发症而有使用禁忌；7、可以期待通过治疗给病人带来更充实的生活。
具体来说，目前使用的降压剂存在着以下一些问题。
噻嗪类利尿药适合于难以控制盐分摄入的场合以及有体液贮留倾向的场合，但对于耐糖能异常、高尿酸血症、肾功能障碍、高血脂症、低K血症的患者要避免给药。
β-阻断剂适合给与年轻患者及有频脉倾向的患者，但对于伴发支气管哮喘或慢性闭塞性肺病的患者、末梢动脉有闭塞性病变的患者、具有雷诺症状的患者要避免给药。另外，由于对胰岛素的分泌有影响，所以很难用于并发糖尿病的高血压患者。
Ca拮抗剂的副作用有，因二氢吡啶衍生物的血管扩张作用引起的颜面潮红、头痛，因强降压作用引起的低血压、头昏，由反射性交感神经紧张引起的频脉、心悸。
ACE阻碍剂的副作用有起立性低血压、空咳、血管性浮肿、高K血症等。因为主要从肾排泄，所以对于肾功能障碍患者必须注意用量和高K血症。还有有关对胎儿造成损害的报告，所以孕妇禁服。
αi阻断剂要注意不引起起立性低血压等副作用。
如上所述，虽然存在许多具有各种各样的作用的高血压治疗药，但从副作用和长期连用的安全性或改善QOL的观点出发，目前还没有令人完全满意的药物。另外，高血压治疗可以预防作为第1目标的高血压脏器障碍的进展，减少因心功能不全或肾功能不全以及脑中风的发病等引起的死亡率，确确实实地利用降压药疗法来改善心功能不全或脑中风的死亡率，但不能阻止因高血压引起的肾功能不全患者的增加。另外，急性或慢性肾小球肾炎患者会因肾小球障碍诱发高血压。现已清楚在具有高血压的慢性肾小球肾炎中预后差，高血压的存在也是独立的慢性肾小球肾炎的预后增恶因子。但是尚未确立治疗伴发慢性肾小球肾炎的高血压的疗法。
如上所述，目前迫切希望开发一种真正满足各种理想条件的治疗药，特别是兼具肾保护作用的药物。
作为本发明的治疗剂的有效成分的式(Ⅰ)化合物是公知化合物，已知其用途是作为恶性高苯丙氨酸血症、抑郁症、帕金森氏病及其他疾病的治疗药。例如可参照特开昭59-25323号公报、同59-76086号公报、同61-277618号公报、同63-267781号公报。
本发明的目的是提供这样一种安全无副作用的治疗药，该治疗药用于由NOS功能减退诱发的疾病，可以利用内因性NO产生低下抑制作用及内皮细胞功能调节作用来改善循环动态和脏器功能，抑制各并发症的进展，提高患者的日常生活质量。
本发明人等经过各种研究，结果提出了这样一种假说，也就是由NOS的功能减退诱发的疾病发生时BH4的水平也低。于是进行了对DOCA-食盐高血压大鼠和DOCA-食盐SHR给与BH4的试验。结果发现该DOCA-食盐高血压大鼠的实际BH4水平很低，而且NOS表达水平也低，通过给与BH4，利用内因性NO产生低下抑制作用，可以得到生理上极其自然的优良血压上升抑制效果。另外，在DOCA-食盐SHR中实际上也可以观察到BH4水平低下，而且还可以观察到病理组织学方面的坏死性肾小球炎和坏死性血管炎，通过给与BH4，在利用血压上升抑制效果的同时，利用内皮细胞功能调节作用，可以得到上述病理组织学所观察到的显著改善效果，获得了BH4具有NOS功能激活作用这样一种认识，从而完成了本发明。也就是说，本发明涉及利用BH4类制剂对由NOS功能减退诱发的疾病进行有效的治疗。
附图的简单说明
图1表示对照组(-○-)、DOCA组(-△-)和口服BH4的DOCA-食盐高血压大鼠(DOCA+BH4组，-□-)的血压经时变化。图2表示对照组(-○-)、DOCA组(-△-)和口服BH4的DOCA-食盐高血压大鼠(DOCA+BH4组，-□-)的尿中NO2／NO3经时变化。图3表示对照组(-○-)、DOCA组(-△-)和口服BH4的DOCA-食盐高血压大鼠(DOCA+BH4组，-□-)的尿中BP经时变化。图4表示测定在肾组织中E-NOS mRNA的表达的结果。图5表示对照组(-●-)、DOCA组(-○-)和口服BH4的DOCA-食盐SHR(DOCA+BH4组，-□-)的血压经时变化。图6表示对照组(-●-)、DOCA组(-△-)和口服BH4的DOCA-食盐SHR(DOCA+BH4组，-□-)的尿中BP经时变化。图7表示在肾组织标本内所能观察到的病理学所见，从左至右分别表示对照组、DOCA组和DOCA+BH4组中坏死性肾小球炎和坏死性血管炎的出现频率。
本发明是以式(Ⅰ)表示的化合物或其药学上允许的盐作为有效成分的用于治疗或预防由NOS功能减退诱发的疾病的药物，
式中R1和R2分别表示氢原子或在一起表示单键；R1和R2表示氢原子时，R3表示-CH(OH)CH(OH)CH3、-CH(OCOCH3)CH(OCOCH3)CH3、-CH3、-CH2OH或苯基，R1和R2在一起表示单键时，R3表示-COCH(OH)CH3。
本说明书中所说的NOS功能减退是指虽然在血管内皮、神经系统、肾脏、血小板、心肌、平滑肌等处广泛存在着NOS，但因某种原因导致表达减少，或即使表达也因这些细胞的功能减退而不能使NOS的活性充分发挥。NOS功能减退的典型例子是内因性NO水平低下。与NOS功能减退有关的疾病是指因NOS功能减退而发病的疾病，包括因NOS功能减退而使病情恶化的疾病和因NOS功能减退而延迟治愈的疾病等，例如有高血压、高血脂症、动脉硬化、冠状血管挛缩、缺血性心脏疾病、心功能不全、血栓病、肺高血压、脑循环功能不全、脑血管挛缩、肾小球肾炎、慢性肾功能不全、糖尿病、术后再狭窄、弛缓不能、门脉压亢进症、肝障碍、胃肠粘膜障碍、肥厚性幽门狭窄症、肠炎、阳萎、网脉络膜症等，都是与NOS功能减退有关的疾病。
对患有上述疾病的患者给与BH4时，刺激体内的NOS的产生，恢复降低的内皮细胞的功能，使NOS的功能正常化，可以预防或治疗这些疾病。
因此，本发明的治疗或预防对象是能够利用BH4的NOS功能激活作用来处置的疾病。
作为本发明有效成分的式(Ⅰ)化合物中包括以下化合物及其药学上允许的盐(6R)-L-赤型-5，6，7，8-四氢生物喋呤(BH4)
(6R，S)-5，6，7，8-四氢生物喋呤1’，2’-二乙酰基-5，6，7，8-四氢生物喋呤
墨喋呤
6-甲基-5，6，7，8-四氢喋呤
6-羟甲基-5，6，7，8-四氢喋呤
6-苯基-5，6，7，8-四氢喋呤
以上化合物中优选的化合物是5，6，7，8-四氢生物喋呤类及其盐，最优选的化合物是BH4及其盐。
本发明中作为有效成分使用的式(Ⅰ)化合物为公知化合物。例如可参照特开昭59-25323号公报、同59-76086号公报、同61-277618号公报、同63-267781号公报。也可以使用适当的盐，盐例如可以是与药理学上无毒性的酸如盐酸、磷酸、硫酸、硼酸等无机酸，以及乙酸、甲酸、马来酸、富马酸、甲磺酸等有机酸形成的盐。
本发明的药物对上述疾病有效。例如以高血压病来说，不只对本态性高血压有效，而且对引发肾脏或网膜等的小动脉壁坏死的恶性高血压以及伴发肾障碍的肾性高血压均有效。具体来说，对本态性高血压、肾性高血压、肾血管性高血压、妊娠高血压、老年性高血压、肾上腺性高血压都有效。
式(Ⅰ)表示的化合物与一般常用于医药制剂中的载体利用常法即可制成口服、直肠或非经肠(包括静脉内、髓液中给药)给药制剂。
常用的载体包括赋形剂、粘合剂、崩解剂等。
赋形剂的代表例有淀粉、乳糖、白糖、葡萄糖、甘露糖、纤维素等，粘合剂的代表例有聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、白糖、羟丙基纤维素、阿拉伯胶等。崩解剂例如有淀粉、琼脂、明胶末、纤维素、CMC等，除此之外一般常用的赋形剂、粘合剂、崩解剂等都可以使用。
除上述优选的载体之外，本发明的治疗剂中还可以含有使有效成分稳定化的抗氧化剂。抗氧化剂可以从常用于医药制剂的物质中选择，如抗坏血酸、N-乙酰基半胱氨酸、L-半胱氨酸、dl-α-生育酚、天然生育酚等。相对于活性成分的用量为0．1～2．0(重量，以活性成分为1)，只要能够使活性成分(1种或1种以上)稳定即可。
适合口服的本发明制剂可以是含有规定量的活性成分(1种或1种以上)的片剂、口含片、胶囊剂、粉末、散剂、颗粒剂或细粒剂，或糖浆、乳液或顿服剂等非水性溶液中的悬浮液。
颗粒剂的制法是，将活性成分(1种或1种以上)与1种或1种以上的上述载体、抗氧化剂等辅料一起均匀混合，造粒，过筛整粒后即得。片剂的制法是，将活性成分(1种或1种以上)与1种或1种以上的辅料(根据情况)一起压制成形制得。胶囊剂的制法是，将活性成分(1种或1种以上)与1种或1种以上的辅料(根据情况)混合均匀，将颗粒或粉末利用充填机等充填到适当的胶囊中制得。直肠给药用制剂是使用可可脂等常用载体制成栓剂使用。非经肠给药用制剂是将活性成分(1种或1种以上)作为干燥固体密封在杀菌氮气净化容器中供给使用。该干燥固体制剂在非经肠给药时分散或溶解在规定量的无菌水中对患者给药。
在制造这些制剂时，除有效成分和常用载体之外，优选加入上述的抗氧化剂，根据需要也可以含有选自缓冲剂、矫味剂、表面活性剂、增粘剂、润滑剂等中的1种或1种以上辅助成分。
活性成分也就是式(Ⅰ)表示的化合物的给药量当然可以根据给药途径、症状、接受治疗的患者等而改变，最终要取决于医生的诊断。
例如，治疗高血压所必需的给药量为0．1～50mg／kg(体重)／日，代表性的适合给药量为0．5～10mg／kg(体重)／日。
所希望的给药量可以是上述的活性成分1天1次给药，但也可以在1天中按适当间隔分成2～4次给药。
活性成分可单独给药，可以不与其他成分混合给药，但也可以为了易于调节给药量，与其他活性成分一起给药。
本发明制剂中，作为有效成分除了含有式(Ⅰ)表示的化合物之外，还可以含有NOS基质或辅酶或辅因子作为有效成分，例如从L-精氨酸、黄素类(如FAD、FMN等)和钙中选择的至少1种。与单独使用式(Ⅰ)化合物相比，混合使用有效成分可以得到更优异的治疗效果。本发明制剂中的各成分比例没有特别限制，例如，相对于式(Ⅰ)表示的化合物1重量份，从L-精氨酸、黄素类及钙中选择的至少1种为0．1～10重量份，优选0．5～2重量份。
利用该混合制剂治疗高血压时合适的给药量，按有效成分的总量计在0．1～50mg／kg(体重)／日的范围内，优选为0．5～10mg／kg(体重)／日。
治疗时根据年龄、症状等由医生选择单独含有式(Ⅰ)化合物作为有效成分的制剂还是同时含有其他有效成分的制剂。
用于本发明的活性成分，最优选(6R)-L-赤型-5，6，7，8-四氢生物喋呤(BH4)及其盐，但也可以使用(6R，S)-5，6，7，8-四氢生物喋呤、1’，2’-二乙酰基-5，6，7，8-四氢生物喋呤、墨喋呤，6-甲基-5，6，7，8-四氢喋呤、6-羟甲基-5，6，7，8-四氢喋呤或6-苯基-5，6，7，8-四氢喋呤和它们的盐等类似化合物。但是，生物体内存在的天然物质BH4当然是最好的。该BH4·2盐酸盐对大鼠口服的急性毒性剂量为2g／kg(体重)以上，几乎没有毒性。另外，不是光学活性体的(6R，S)-5，6，7，8-四氢生物喋呤在用于治疗帕金森氏病时毒性也很弱(特开昭59-25323号公报)，也可以用于本发明的治疗。除此之外的属于式(Ⅰ)的化合物也几乎未见有急性毒性。
用以下实施例详细说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。实施例1(颗粒剂、细粒剂)将1份(重量份，以下同)聚乙烯吡咯烷酮(Kollidon30)溶于灭菌精制水，加入10份抗坏血酸和5份L-半胱氨酸·盐酸盐，成为均匀溶液后加入10份BH4·2盐酸盐。
将上述溶液加入到赋形剂(甘露糖醇或乳糖)59份和崩解剂(玉米淀粉或羟丙基纤维素(LH-22))15份中，混合，造粒，干燥后过筛。实施例2(片剂)在实施例1制备的活性成分的均一溶液中加入乳糖58份、微晶纤维素15份，混合后再加入1份硬脂酸镁，混合后压片。实施例3(胶囊剂)将实施例1制备的颗粒充填在胶囊中。加入0．2％硬脂酸镁作为润滑剂进行制剂。实施例4(注射剂)BH4·2盐酸盐1．5g
抗坏血酸 1．5gL-半胱氨酸·盐酸盐0．5g甘露糖醇 6．5g上述成分溶于灭菌精制水，使总量为100ml，灭菌后取1ml或2ml置于管形瓶或安瓶中，冷冻干燥后密封。实施例5(注射剂)将2．0g BH4·2盐酸盐溶于无氧灭菌精制水，使总量为100ml，灭菌后与实施例4同样密封。实施例6(栓剂)BH4·2盐酸盐 150份抗坏血酸 150份L-半胱氨酸·盐酸盐50份上述成分制成均匀粉末后分散在9950份可可脂中。实施例7(颗粒剂)BH4·2盐酸盐 5份抗坏血酸 5份L-半胱氨酸·盐酸盐2份用上述成分制成均匀溶液。
另一方面，将甘露糖醇55份、聚乙烯吡咯烷酮1份、羟丙基纤维素14份、L-精氨酸或钙5份混合均匀，在其中加入上述溶液，混合，造粒，干燥后过筛。实施例8(颗粒剂)BH4·2盐酸盐 5份抗坏血酸 5份L-半胱氨酸·盐酸盐 5份甘露糖醇 52份聚乙烯吡咯烷酮(Kollidon 30)1份羟丙基纤维素(LH-22)12份L-精氨酸或钙 10份用上述成分与实施例7同样造粒过筛。实施例9(颗粒剂)BH4·2盐酸盐 5份抗坏血酸 5份L-半胱氨酸·盐酸盐2份用上述成分制成均匀溶液。
另一方面，将L-精氨酸或钙10份、甘露糖醇50份、聚乙烯吡咯烷酮(Kollidon30)1份和羟丙基纤维素(LH-22)9份混合均匀，向其中加入上述溶液，造粒，干燥后过筛。实施例10DOCA-食盐高血压大鼠的制成摘出8周龄的Sprague-Dawley大鼠(由Charles River得到)的单肾(对照组除外)。之后分为以下三个实验组进行比较研究。
(1)只给与饮用水的组(对照组)被检验数n=3(2)从摘出单肾后1周开始，每周1次皮下给与去氧皮质甾酮乙酸盐(deoxycorticosterone acetateDOCA)30mg／kg(体重)，给与1％食盐水，制成DOCA-食盐高血压大鼠组(DOCA组)n=6(3)口服BH4(10mg／kg体重／日)的DOCA-食盐高血压大鼠组(DOCA+BH4组)n=5观察各组至实验结束的第5周。在2周后、4周后、5周后(观察结束时)用代谢盒(cage)采集24小时尿。观察结束时，在苯巴比妥的麻醉下从腹部大动脉采血，之后用生理食盐水灌流肾脏，摘出肾脏，进行组织学和免疫组织学研究。血压测定利用tail-cuff法在实验开始时、2周后、4周后、5周后测定血压。尿中NO2／NO3的测定按照Griess法，使用Cyman Chemical Company公司的Nitrate-Nitrite assay kit(kit No．780001)进行测定。尿中NO2／NO3值越大，意味着NOS的活性越高。尿中BP测定根据Fukushima和Nixon的方法(Anal．Biochem．102；176-188，1980)，进行HPLC分析，测定BH4的代谢物生物喋呤(BP)。利用尿中BP值的推移考察给与BH4的影响。肾组织NOS免疫染色冻结摘出的肾组织，分别利用特异性抗体，抗E-NOS抗体和抗B-NOS抗体(由Affinity Bioreagents公司获得)，采用免疫染色法研究在上述肾组织的薄切切片上的肾组织中的内皮型NOS(E-NOS)和脑型NOS(B-NOS)的表达。NOS mRNA表达测定(a)从肾组织中提取总RNA利用胍盐·氯化铯提取法从肾组织提取RNA。
具体的作法是，先从摘出的肾脏皮质部分采集少量组织，立即加入到4M硫氰酸胍(Guanidium thiocyanate)溶液中，用玻璃／特氟隆匀浆器粉碎。将该细胞溶液叠层在5．7M氯化铯上，以80000rpm离心2小时，之后将沉淀物溶于0．1％二乙基焦碳酸酯(DEP)溶液中。向其中加入2．5M乙酸铵和乙醇，-20℃下沉淀1小时，以10000rpm在4℃下离心20分钟，得到沉淀。将沉淀溶于0．1％DEP溶液，使浓度为约1μg／μl，-20℃保存至使用时。
(b)逆转录酶(RT)反应由总RNA使用MoMLV逆转录酶合成cDNA。
具体作法是，混合总RNA、引物、缓冲液和水，95℃下加热2分钟后冰浴冷却。然后在37℃下保温30分钟，用RNA使引物退火。向其中加入0．2M二硫苏糖醇(DTT)、5mM脱氧核苷酸(dNTP)混合液、RNasin、MoMLV逆转录酶，90℃加热5分钟后，冰浴使反应停止。
(c)PCR用由RT法得到的cDNA为模板进行PCR。
具体作法是，将分别对应于作为检测目标的E-NOS及作为内部对照使用的苹果酸脱氢酶(MDH)的5’侧引物、3’侧引物、PCR缓冲液、2．5mMdNTP混合液、TaqDNA聚合酶混合，加入RT反应液。用矿物油叠层，离心后用自动PCR装置开始反应。将每1次循环设定为94℃30秒、50℃30秒、72℃30秒，重复30次得到PCR产物。用于检测E-NOS及MDH的引物可以由Ujiie．K．等人的方法得到[参见Am．J．Physiol．267(Renal Fluid Electrolyte physiol．36)F296-F302．1994]。具体的用于检测E-NOS的引物的碱基序列是，5’侧引物TACGGAGCAGCAAATCCAC(序列号1)，3’侧引物CAGGCTGCAGTCCTTTGATC(序列号2)。用于检测MDH的引物的碱基序列是，5’侧引物CAAGAAGCATGGCGTATACAACCC(序列号3)，3’侧引物TTTCAGCTCAGGGATGGCCTCG(序列号4)。
(d)利用聚丙烯酰胺凝胶电泳及DNA杂交测定NOS mRNA表达用5％聚丙烯酰胺凝胶将PCR产物进行电泳，利用DNA杂交测定NOS mRNA表达。
具体的作法是，先将PCR反应液用5％聚丙烯酰胺进行电泳，泳动结束后将凝胶转印到膜过滤器上。为检测E-NOS和MDH，使用5’末端用γ32P-ATP标记的探针，在膜过滤器上进行杂交(上述Ujiie．K．等，1994)。E-NOS检测用的探针碱基序列是CTG-GAACAATTTCCATCCG(序列号5)，MDH检测用探针的碱基序列是TTTGTCTTCTCCCTGGTGGA(序列号6)。之后于-70℃下进行数小时自体放射照相，用光密度计解析感光的自体放射照片。结果示于图4。
基于自体放射照相的结果，利用作为持家基因的MDHPCR产物量将E-NOSPCR产物量标准化，半定量化E-NOS基因的表达。
统计测定值用平均值±标准误差表示，组间的统计用two-wayANOVA进行。以下将P＜0．05作为差别显著的标准。
以下的表1及图1中给出了血压的推移。DOCA组在观察的第4周呈现出高血压。DOCA组的血压上升与其他2组相比很显著。相反在DOCA+BH4组中在观察结束时与对照组同样为正常血压。
表1血压(mmHg)开始时 2周4周 5周对照组101．38102．8591．77111．70(±7．12) (±11．07) (±7．88) (±10．10)DOCA组107．03137．53153．53 150．68(±2．04) (±4．63) (±7．71) (±3．35)DOCA+BH4组105．72120．54111．91 107．78(±5．63) (±6．57) (±7．52) (±7．93)尿中NO2／NO3的推移示于表2和图2。DOCA组中尿中NO2／NO3经时减少，观察结束时降低到测定灵敏度以下。相反在DOCA+BH4组中尿中NO2／NO3增加。DOCA组中的减少与其他2组相比明显，对照组与DOCA+BH4组之间没有明显差别。
表2尿中NO2／NO3(mmol／天)开始时2周 4周 5周对照组2．91±0．091．51±0．794．54±0．32DOCA组3．11±1．090．34±0．34测定灵敏度以下DOCA+BH4组2．22±0．702．00±0．555．95±1．90尿中BP的推移示于表3和图3。DOCA组中BP经时减少。相反在DOCA+BH4组中BP经时增加。DOCA组中的减少与其他2组相比明显，对照组与DOCA+BH4组之间没有明显差别。
表3尿中BP(nmol／天)开始时 2周 4周5周对照组26．76±3．0121．71±0．6127．79±2．0334．96±0．96DOCA组23．77±0．7719．49±2．5215．93±3．4619．25±1．96DOCA+BH4组21．87±0．6035．58±3．7452．60±13．13 34．26±4．08体重如表4所示在各组都经时增加，3组间没有明显差别。
表4体重(g)开始时 2周4周 5周对照组390．67±18．49 433．33±21．49 456．00±21．63 458．00±20．43DOCA组376．00±3．69399．67±19．44 430．33±20．08 435．67±23．34DOCA+BH4组383．40±10．83 386．40±12．84 431．20±13．31 446．80±15．81免疫染色的结果是，在DOCA组中小血管中的E-NOS以及利用macula densa的B-NOS的表达都减少，在DOCA+BH4组中观察到这些表达与对照组相等或稍有增加。
(NOS mRNA表达测定结果)测定结果如图4所示，DOCA+BH4组与DOCA组相比，E-NOS的mRNA的表达明显增加。
如上所述，在DOCA-食盐高血压大鼠中可以看到血压上升和尿中NO2／NO3的减少以及肾组织NOS表达的减少，还可以观察到血管内皮细胞的功能障碍。另外在该模型大鼠中还清楚地看到尿中BP减少了。另一方面，通过口服BH4抑制了血压上升，观察到尿中NO2／NO3的增加和肾组织NOS的表达增加，由于BH4对NOS功能的激活作用(NOS量／NOS活性的控制)，所以对伴随内因性NO产生低下的疾病的治疗有效。实施例11DOCA-食盐SHR的制成摘出8周龄的SHR(由Charles River得到)的单肾(除对照组之外)。之后分为以下的3个实验组进行比较研究。
(1)只给与饮用水的组(对照组)被检验数n=8(2)从摘出单肾1周后开始，每周1次皮下给与去氧皮质甾酮乙酸盐(deoxycorticosterone acetateDOCA)30mg／kg(体重)，给与1％食盐水，制成DOCA-食盐SHR组(DOCA组)n=4(3)口服BH4(10mg／kg体重／日)的DOCA-食盐SHR组(DO-CA+BH4组)n=6观察各组至实验结束的第6周。在2周后、3周后、4周后、5周后、6周后(观察结束时)用代谢盒采集24小时尿。观察结束时在苯巴比妥麻醉下从腹部大动脉采血，之后用生理盐水灌流肾脏，然后进行组织学研究。
血压测定利用tail-cuff法在实验开始时、2周后、3周后、4周后、5周后、6周后测定血压。
尿中BP测定根据Fukushima和Nixon的方法进行HPLC分析，测定作为BH4的代谢物的生物喋呤(BP)。根据尿中BP值的推移研究给与BH4的影响。
病理组织学所见6周后采尿、血压测定结束后，麻醉下剖开腹腔，从腹部大动脉脱血，从同一部位注入生理盐水，进行灌流。摘出的肾脏固定在10％甲醛溶液中，用石蜡包埋后，用薄切片装置切成4μm的薄片，制成肾组织标本。进行苏木精·曙红(HE)染色和periodic acid-shiff染色。比较研究在大鼠肾组织标本内观察到的病理学所见，也就是坏死性肾小球炎和坏死性细动脉炎的出现频率。
统计用平均值±标准误差表示测定值，组间的统计利用two-wayANOVA法进行。以下将p＜0．05作为差别明显的标准。
血压的推移示于以下的表5和图5。DOCA组在观察的第3周表现出显著的高血压。DOCA组的血压上升与其他2组相比很明显。相反在DOCA+BH4组中至观察结束时仍停留在与对照组同样的水平上。
表5血压(mmHg)开始时 2周3周4周5周6周对照组129．44119．44143．83151．20158．01161．91(±2．20) (±2．97) (±0．62) (±0．90) (±1．63) (±4．20)DOCA组132．00132．88162．28169．83182．98178．10(±5．18) (±3．88) (±1．87) (±2．57) (±2．04) (±9．85)DOCA+BH4组130．22133．60143．63150．90159．30162．95(±3．75) (±2．05) (±0．85) (±0．94) (±2．84) (±1．52)尿中BP的推移示于表6和图6。在DOCA组中BP经时减少。相反在DOCA+BH4组中BH4经时增加。在DOCA组中的减少与其他2组相比很明显，对照组与DOCA+BH4组之间没有明显差别。
表6尿中BP(nmol／天)开始时4周 6周对照组22．29±1．5325．13±1．2343．07±7．24DOCA组17．87±1．653．18±2．14 16．33±5．77DOCA+BH4组24．26±1．5845．21±10．31 71．78±32．08表7及图7给出在肾组织标本内观察到的病理组织学所见的出现频率。DOCA组中的坏死性肾小球炎的出现率与坏死性血管炎的出现率与其他2组相比明显地高。
表7肾组织的病理所见出现频率百分率(％)坏死性肾小球炎坏死性血管炎对照组0．06±0．06 0．00±0．00DOCA组10．78±0．77 9．03±1．65DOCA+BH4组2．47±1．07 3．34±0．94如上所述，在DOCA-SHR中观察到血压上升和坏死性肾小球炎与坏死性血管炎等病理组织学所见。另外，在该模型大鼠中清楚地观察到尿中BP减少了。另一方面，通过口服BH4抑制了血压上升，因为观察到病理组织学所见的显著改善，所以表现出通过BH4对NOS功能的激活可以有效地治疗伴随内皮细胞功能减退的疾病。
由以上说明可知，本发明可以提供有效地预防和／或改善由NOS功能减退诱发的疾病。另外，因为本发明的治疗剂的有效成分是本来就存在于生物体内的物质，所以即使长期使用也不必担心有副作用等产生。序列表序列号1序列长度19碱基对序列类型核酸链数一条链拓扑型直链状序列种类其他的核酸合成DNA序列TACGGAGCAG CAAATCCAC19序列号2序列长度20碱基对序列类型核酸链数一条链拓扑型直链状序列种类其他的核酸合成DNA序列CAGGCTGCAG TCCTTTGATC 20序列号3序列长度24碱基对序列类型核酸链数一条链拓扑型直链状序列种类其他的核酸合成DNA序列CAAGAAGCAT GGCGTATACA ACCC 24序列号4序列长度22碱基对序列类型核酸链数一条链拓扑型直链状序列种类其他的核酸合成DNA序列TTTCAGCTCA GGGATGGCCT CG 22序列号5序列长度19碱基对序列类型核酸链数一条链拓扑型直链状序列种类其他的核酸合成DNA序列CTGGAACAAT TTCCATCCG19序列号6序列长度20碱基对序列类型核酸链数一条链拓扑型直链状序列种类其他的核酸合成DNA序列TTTGTCTTCT CCCTGGTGGA20
权利要求
1．一种预防或治疗由NOS功能减退诱发的疾病的药物，其中含有以通式(Ⅰ)表示的化合物及其药学上允许的盐作为有效成分，
式中R1和R2分别表示氢原子或在一起表示单键，R1和R2表示氢原子时，R3表示-CH(OH)CH(OH)CH3、-CH(OCOCH3)CH(O-COCH3)CH3、-CH3、-CH2OH或苯基，R1和R2在一起表示单键时，R3表示-COCH(OH)CH3。
2．权利要求1中记载的药物，其中由NOS功能减退诱发的疾病是伴发内因性NO产生低下的疾病。
3．权利要求1中记载的药物，其中由NOS功能减退诱发的疾病是伴发内皮细胞功能减退的疾病。
4．权利要求1中记载的药物，其中由NOS功能减退诱发的疾病是与NOS表达减少有关的疾病。
5．权利要求1～4中任一项记载的药物，其中的R3是L-赤型-CH(OH)CH(OH)CH3。
6．权利要求1～5中任一项记载的药物，是高血压的预防或治疗剂。
7．权利要求1～5中任一项记载的药物，是肾障碍的预防或治疗剂。
全文摘要
本发明的目的是提供1种有效预防或改善由NOS功能减退诱发的疾病的药物。本发明提供的由NOS功能减退诱发的疾病的预防或治疗剂以右式表示的化合物或其药学上允许的盐作为有效成分,式中R
文档编号A61K31/505GK1204963SQ97191338
公开日1999年1月13日 申请日期1997年8月29日 优先权日1996年8月30日
发明者石原高文, 金山良春, 冈村千夫, 吉川纯一, 新宅治夫 申请人:三得利株式会社