一种基于金纳米粒子的人工抗体构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种全新的基于金纳米粒子通用的人工抗体构建方法。该方法是在金纳米粒子表面重建抗体决定簇互补区的多肽环区，重建天然抗体与抗原的特异性识别，并制备出比天然抗体稳定性更好、结合力更强的人工抗体。通过将选定的本身没有特定构象和功能的多肽与金纳米溶液混合，多肽两端同时固定到金纳米粒子表面，并且通过调节多肽在金纳米粒子表面的密度及金纳米粒子的粒径进而调节多肽两端在纳米粒子表面的跨度实现对多肽环区构象的精确控制，从而赋予合成的功能化纳米粒子与抗原特异性识别的功能。该方法在纳米载药、靶向治疗及抗体药物等领域中具有广阔的应用前景。
【专利说明】
一种基于金纳米粒子的人工抗体构建方法
技术领域
[0001]本发明属于纳米医学领域，具体涉及一种基于金纳米粒子表面重建天然蛋白质抗体的决定簇互补区的方法，从而构建出能够同抗原特异性识别、且比天然抗体结合力更强、稳定性更好的人工抗体。
【背景技术】
[0002]抗体作为机体应答的效应分子，能够识别、中和或清除诱发疾病的抗原。另外针对相应的抗原，抗体具有高特异性和强结合力的特征，使得抗体在疾病治疗和诊断的应用中表现出其他药物无可比拟的优势。但是抗体的结构复杂，价格昂贵，稳定性差的缺点阻碍了抗体在医学领域的广泛应用。针对这些问题，开发人工抗体成为一个重要前沿研究方向。
[0003]由于纳米粒子具有粒径小、比表面积大、分散性良好等优异潜质，纳米粒子的功能化在生物医学方面具有广泛的应用前景。金纳米粒子作为一种特殊的纳米颗粒，不仅具备普通纳米颗粒的性质特征，还具有良好的生物相容性、稳定的化学性质、独特的光学特性等优势，并且易于表面修饰、合成方法简单可控，使其在生物分子的诊断和检测、生物医学成像以及治疗方面得到非常广泛的研究。
[0004]我们开发了一种在金纳米粒子表面重建抗体决定簇互补区的方法，我们通过调节金纳米粒子表面的多肽环区的构象实现对人工抗体活性的精确调控，构建出具有天然抗体功能的人工抗体。本发明方法可用于制备针对不同抗原的人工抗体和抗体药物，在生物医学方面具有广泛的应用价值。
【发明内容】
[0005]当前，基于纳米粒子表面功能化赋予纳米粒子生物功能的研究越来越广泛，但是实现这些功能最常用的方法就是简单地将功能基团通过共价键、吸附等方式修饰到纳米粒子上，如抗体、核酸适配体及叶酸等功能基团。这种方法的局限在于用于修饰纳米粒子的功能基团本身必须也具有功能，修饰到纳米粒子表面后依靠多价性提高功能基团的作用。这些研究都不能对功能基团的构象进行调控，也没有实现对功能化纳米粒子活性的调控。
[0006]本发明的目的是在金纳米粒子表面重构天然抗体决定簇互补区的多肽环区，构建出具有与天然抗体相同的特异性，并具有更强结合能力和更高稳定性的人工抗体。单独的来源于天然抗体决定簇互补区的多肽环区本身并没有结构和功能，我们通过调节多肽环区两端在金纳米粒子表面的跨度，实现了对多肽环区在纳米粒子表面构象的调控，从而实现对人工抗体活性的精确调控。
[0007]该方法的具体思路如下:
首先从天然抗体的决定簇互补区选取多肽环区，然后在多肽环区的两端添加半胱氨酸，然后通过S-Au共价键嫁接到金纳米粒子上，通过调控多肽环区两端在金纳米粒子表面的跨度实现对多肽环区构象的调控，进而实现对人工抗体活性的精确调控，制备出具有同天然抗体相同的特异性，并具有更强结合能力和更高稳定性的人工抗体，原理如图1所示。
[0008]—种的基于金纳米粒子的人工抗体构建方法，该方法是将天然蛋白质抗体的决定簇互补区的CDR多肽环区嫁接到金纳米粒子表面，从而重建天然抗体与抗原的特异性识别，并制备出比天然抗体稳定性更好、结合力更强的人工抗体。该方法的主要特征包括:通过将设计的多肽两端同时固定到金纳米粒子表面，并且利用金纳米粒子表面上金原子的可移动特性，通过调节多肽两端在纳米粒子表面的跨度实现对多肽环区构象的精确控制，从而赋予纳米粒子与抗原之间诱导切合的特异性识别功能。
[0009]CDR多肽按如下设计:从天然抗体CDR区选取与抗体特异性结合的关键多肽环区序列，并且在序列两端各添加一个半胱氨酸，以便通过S-Au键将多肽两端固定在金纳米粒子上;为调节环区在金纳米粒子上的构象，在半胱氨酸前添加0-5个中性氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等，如果原环区中间本身含有半胱氨酸，则将其突变为丙氨酸或丝氨酸等，以避免环区中间和金纳米粒子结合;设计的多肽通过固相合成方法合成。
[0010]所述的人工抗体按如下合成:将设计的多肽与粒径范围在2-100nm之间的金纳米粒子溶液混合反应，得到最终人工抗体;基本步骤如下:将按权利要求1设计合成的多肽，根据金纳米粒子的表面积计算，按照I nm2金纳米粒子表面积上嫁接0.1-3个多肽的比例，在常温下混合反应1-180 min，使多肽两端同时固定到金纳米粒子表面形成⑶R，从而制备得到具有特异性识别抗原功能的人工抗体。
【附图说明】
[0011]图1为本发明基于金纳米粒子制备人工抗体的原理示意图。
[0012]图2为实施例一制备的抗溶菌酶人工抗体AuNP-Pepl和AuNP_Pep2的活性比较图。
[0013]图3为实施例一制备的抗溶菌酶人工抗体AuNP-Pepl特异性结合溶菌酶图。
[0014]图4为实施例一通过调整金纳米粒子表面的多肽密度来调控抗溶菌酶人工抗体AuNP-P印I的活性图。
[0015]图5为实施例一通过改变金纳米粒子的粒径来调控抗溶菌酶人工抗体AuNP—Pepl的活性图。
【具体实施方式】
[0016]下面给出实施例，对本发明作进一步说明。有必要在此指出的是以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，如果该领域的技术熟练人员根据上述本
【发明内容】
对本发明做出一些非本质的改进和调整，仍属于本发明保护范围。
[0017]实施例一:基于金纳米粒子表面重建天然抗体CDR多肽环区制备抗溶菌酶人工抗体
1、多肽环区的设计
根据来源于骆驼的抗溶菌酶抗体(cAb-Lys 3)的抗体决定簇互补区的多肽环区(CDR3)，我们首先设计合成了两种多肽，分别为Pepl、Pep2，其中Pepl与Pep2两端均添加了半胱氨酸。两种多肽可以通过S-Au键方便地将两端接到金纳米粒子上，其中Pepl是根据cAb-Lys3的CDR 3的多肽片段稍作修改，而Pep2的序列是将Pepl中间的氨基酸序列随机排列作为对照。
[0018]2、抗溶菌酶人工抗体的制备将金纳米粒子粒径约为3.6nm的纳米金溶液(pH调至7.4)，按金纳米粒子表面积Inm2嫁接1.5个多肽比例在常温下混合反应lh。制备出具有同天然抗溶菌酶抗体相同功能的人工抗体AuNP-Pepl和没有特异性功能对照组AuNP-Pep2。人工抗体AuNP-Pepl可以特异性抑制溶菌酶的活性，而对照组AuNP-Pep2没有此功能。对人工抗体AuNP-Pepl、功能化的AuNP-Pep2及自由的多肽环区Pepl作为对照分别进行溶菌酶活性的测试实验，如附图2所示，曲线斜率越大反映出对溶菌酶活性的抑制越强。从图中可以看出，抗溶菌酶人工抗体AuNP-Pepl几乎完全抑制了溶菌酶的活性；自由的多肽Pepl完全没有抑制活性，功能化的AuNP-Pep2由于纳米粒子的非特异性吸附表现出微弱的抑制活性。为了进一步验证人工抗体AuNP-Pepl与溶菌酶结合的特异性，将各项性质与溶菌酶类似的RNase A(核糖核酸酶)以RNase A与HEWU溶菌酶)5:1的比例按不同加入顺序作为对照。如附图3所示，对于没有功能化的裸露的金纳米粒子AuNPs来说，仅具备非特异性吸附而没有特异性的功能，所以先加入RNase A会影响AuNPs对HEWL的吸附。而对于人工抗体AuNP-Pep I来说，无论加入顺序如何，RNase A不会影响其发挥特异性抑制溶菌酶的功能，所以人工抗体AuNP-PepI始终表现出对溶菌酶的高抑制率。而对于对照组功能化的AuNP-Pep2表现出不具备同HEWL特异性结合的功能。综上所述，我们通过在金纳米粒子表面重建来源于天然抗体cAb-Lys 3的CDR 3多肽环区，制备出一种稳定的具有特异性抑制溶菌酶功能的人工抗体。
[0019]3、抗溶菌酶人工抗体活性的调控
因为多肽环区的构象决定人工抗体的活性，所以可以通过改变多肽环区两端在金纳米粒子表面的跨度实现对多肽环区的构象进行调控，进而实现对人工抗体活性的调控。这种构象的调控通过两种方式实现。一种是通过改变多肽在金纳米粒子表面的密度来调节跨度的大小(如附图4所示)，另一种方式是通过调节金纳米粒子粒径的不同来调节跨度的大小(如附图5所示)。在附图4中，每个金纳米粒子表面固定20个多肽Pepl，通过添加不同数目的Pep2来改变金纳米粒子表面多肽环区的密度，斜率反映人工抗体的活性，斜率越小抗体活性越高，斜率的变化反映了抗溶菌酶人工抗体活性的变化，说明通过改变密度可以实现对人工抗体活性的调控。在附图5中，我们制备了粒径分别约为3.6nm、7.0nm、15.0nm的金纳米粒子，按三者的同一表面积计算(保持多肽在金纳米粒子表面密度相同)将Pepl、Pep2以及Pepl和Pep2的混合物嫁接在合成的金纳米粒子表面。由于金纳米粒子尺寸的不同，PepI及Pep2两端接到纳米粒子表面的跨度不同，从而造成多肽环区在纳米粒子表面的构象不同，表现出对溶菌酶抑制率的不同，从而实现对人工抗体活性的调控，可以看出改变粒径的大小可以调控人工抗体的活性。综上所述，我们通过调控多肽环区两端在金纳米粒子表面的跨度，可以精确调控多肽环区的构象，从而得到出比天然抗体结合能力更强稳定性更好的人工抗体。
【主权项】
1.一种基于金纳米粒子的人工抗体构建方法，该方法是将天然蛋白质抗体的决定簇互补区的CDR多肽环区嫁接到金纳米粒子表面，从而重建天然抗体与抗原的特异性识别，并制备出比天然抗体稳定性更好、结合力更强的人工抗体;该方法的主要特征包括:通过将设计的多肽两端同时固定到金纳米粒子表面，并且利用金纳米粒子表面上金原子的可移动特性，通过调节多肽两端在纳米粒子表面的跨度实现对多肽环区构象的精确控制，从而赋予纳米粒子与抗原之间诱导切合的特异性识别功能。2.按权利要求1所述的人工抗体构建方法，其特征在于所述的CDR多肽按如下设计:从天然抗体CDR区选取与抗体特异性结合的关键多肽环区序列，并且在序列两端各添加一个半胱氨酸，以便通过S-Au键将多肽两端固定在金纳米粒子上;为调节环区在金纳米粒子上的构象，在半胱氨酸前添加0-5个中性氨基酸，该氨基酸为甘氨酸或丙氨酸或丝氨酸或苏氨酸或亮氨酸或缬氨酸，如果原环区中间本身含有半胱氨酸，则将其突变为丙氨酸或丝氨酸，以避免环区中间和金纳米粒子结合;设计的多肽通过固相合成方法合成。3.按权利要求1所述的人工抗体构建方法，其特征在于所述的人工抗体按如下合成:将设计的多肽与粒径范围在2 -10 O n m之间的金纳米粒子溶液混合反应，得到最终人工抗体;基本步骤如下:将按权利要求1设计合成的多肽，根据金纳米粒子的表面积计算，按照Inm2金纳米粒子表面积上嫁接0.1-3个多肽的比例，在常温下混合反应1-180 min，使多肽两端同时固定到金纳米粒子表面形成CDR，从而制备得到具有特异性识别抗原功能的人工抗体。
【文档编号】C07K16/00GK105884888SQ201610230732
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月14日
【发明人】曹傲能, 邵珠学, 王海芳
【申请人】上海大学