专利名称：一种用于早期检测hiv感染的利用非变性hiv抗原的新型酶免疫试验的制作方法
背景技术：
1.发明领域本发明一般地涉及诊断和筛查试验领域。更具体而言，它涉及标本中早期抗HIV抗体检测的改进方法，以及在婴儿中检测人类免疫缺陷病毒接触或感染的早期诊断试验。本发明的另外一个方面涉及在特发性慢性淋巴细胞减少症病人中检测HIV的方法。本发明还涉及重组蛋白质领域，公开了特殊的重组蛋白质以及数种人类免疫缺陷病毒株的重组蛋白质复合制剂。本发明还涉及商品化诊断和预后试验平板与试剂盒领域，描述了设计用来检测早期抗HIV抗体的试验平板，其包括所述重组人类免疫缺陷病毒抗原或人类免疫缺陷病毒感染的细胞分离株制剂。
2.发明背景已知被人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的病人最终会对病毒发动体液免疫反应。抗HIV抗体的产生是用来检测这种反应的一个标志。某些研究报道，对于诊断，抗HIV抗体比HIV培养或病人标本的HIV抗原检测更为可靠1，2。因此，抗HIV抗体检测试验是诊断感染的最常用的方法。EIA和Western印迹试验目前都被用于抗HIV抗体的检测。
遗憾的是，常规抗HIV抗体筛查方法的应用中存在一定程度的不可靠性，如常规EIA。因此，一种进一步的确证试验，如Western印迹(WB)或固定细胞免疫荧光试验，成为推荐的附加试验步骤。
尽管有种种附加的预防性试验措施，但大量研究报道了似乎有一个HIV感染沉默期的存在，该期间内即使进行各种试验，病毒的抗体亦不能检测到。报道称，这一时期从感染开始一直延伸到通过常规血清转变试验可检测到感染的时候。报道称，这一沉默期在常规EIA和Western印迹试验能检测到感染前，持续数月至多达两年半不等。
尽管不能总是成功，但培养外周血淋巴细胞以扩增HIV，确实能在抗HIV抗体不能被常规EIA或WB检测时检测出病毒。然而，最近几项研究应用以PCR为基础的HIV检测方法，继续报道在高危人群中存在PCR(+)阳性、血清(-)阴性病例I10-17。不过，PCR通常确实能在常规血清转换方法之前检测出感染，至少在某些病例使上述沉默感染期缩短约一个月18。
应用常规试验方法测试为阴性的血液，其HIV传染率以相对恒定的速率持续存在25。例如，继续有人报道21-23应用EIA常规方法测得的似乎真实的“血清阴性”血液引起的HIV-1传染。捐献的器官也成为HIV疾病的传染源，器官接受者被诊断有HIV感染，这些器官又是来自被常规试验测试为HIV血清阴性的个体24。
回顾性研究报道，早期供体教育和自我排除措施降低了疾病传染率26。然而，这种排除方法连同抗体测试，尽管有希望降低至少某些假阴性结果的概率27，但只在报道的HIV病例的一小部分中提供了部分且不完善的解决问题的方法。
某些研究报道了在常规EIA、WB和PCR检测技术测试为阴性的高危个体中，HIV特异性T细胞的存在28，29。其它报道发现，在EIA阴性、WB阴性的高危受试者中存在体外产生HIV特异性抗体的B细胞30。尽管这些方法提供了可能的选择，但用于测试，它们相对复杂且比较难于操作，因而在大规模临床筛查中是不可行的。这类测试所需的费用和时间再次使得在当前医学技术中需要一种可靠且可行的HIV筛查和检测方法。
婴儿的早期HIV感染是一个特别棘手的问题。不足18个月的婴儿感染时缺乏明显的临床症状，现代技术难以对其作出诊断。测试抗HIV抗体的常规HIV血清学试验不能够在婴儿中检测出感染，因为检测出的抗体不一定是婴儿的，而是HIV阳性母亲的。这种母体来源的抗体通常在婴儿系统中持续存在达21个月34。
IgA或IgM抗体都不能通过胎盘。因此，在儿童中进行的研究强调IgA和IgM检测作为婴儿HIV感染的指示物。有一项研究在血清阳性母亲生育的达12个月龄的婴儿中，同时发现HIV特异性IgA和IgM，应用常规筛查试验(WB，EIA)发现，产生IgA抗HIV的标本比IgM多两倍(66％对33％)35。
目前，联合应用HIV培养、PCR、IgG抗体测试、和P24抗原测试，大约50％的被感染婴儿可在出生时、大约90％在3月龄时、几乎全部在6月龄时被识别出38。然而，在出生时只有一半被感染婴儿的HIV能被检测出这一事实，再次说明仍然需要改进在婴儿的早期HIV检测。
发明概述从普遍的意义上说来，本发明涉及重组HIV包膜蛋白和肽，及其早期抗HIV抗体免疫反应片段，它能够与早期抗HIV抗体免疫结合。
正如在本发明之描述中所使用的那样，早期抗HIV抗体的定义是，在被HIV病毒感染的人中所诱导产生的最初的人类免疫缺陷病毒抗体，这些抗体能够识别HIV gp160抗原的构象性表位，而且不能被应用无保留构象性表位的HIV gp160靶抗原的现行EIA或Western印迹试验所检测。
通过实现早期抗HIV抗体检测，本发明进一步提供一种改进的HIV检测和筛查方法。这些早期抗HIV抗体在以前应用常规试验是检测不出的，因为这些试验历来使用的靶抗原缺乏足够的、早期抗体识别所必需的保留构象性表位。
本发明的组合物和试验包括改进的HIV靶抗原，其包括一种HIV包膜蛋白，特别是HIV gp160的构象性表位。应用所述抗原可检测的早期抗HIV抗体不识别一级序列表位，因此它们不能被使用至少部分变性HIV靶抗原的常规血清学试验(EIA和Western印迹)所检测。
由于基于PCR的试验在检测HIV方面，与常规EIA和Western印迹血清学试验相比并无多大改进，因此期望，在此描述的EIA也将提供一种比基于PCR的检测和筛查方法更有改进的方法。人类免疫缺陷病毒的重组蛋白和肽在本发明的某些实施方案中，提供了一种重组蛋白质，它包括一种能免疫结合早期抗HIV抗体的重组人类免疫缺陷病毒包膜蛋白。例如，这些重组蛋白质在特定的实施方案中，可被进一步限定为具有的分子量经SDS/PAGE确定为约160,000道尔顿。在这些特定形式中，重组HIV蛋白质是一种HIV包膜蛋白，即HIV gp160。
本发明的重组HIV包膜蛋白可参考其制备工艺进一步描述。例如，在一种实施方案中，工艺包括制备一个核酸序列或人类免疫缺陷病毒核酸序列的一个限制性片段，其编码一种人类免疫缺陷病毒包膜蛋白，如gp160；将限制性片段插入一个能转染真核细胞的载体，以提供一个重组载体；转染能够表达可结合早期抗HIV抗体的人类免疫缺陷病毒包膜蛋白的真核细胞，以提供一个重组真核细胞；在适合重组HIV蛋白质表达的条件下培养重组哺乳动物细胞；以及收集能够结合早期抗HIV抗体的重组HIV包膜蛋白。
在此描述的、能够表达HIV包膜蛋白核酸序列的哺乳动物细胞的一个例子是CEM细胞系。这种CEM细胞系可通过美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。能够转染哺乳动物细胞载体的一个例子是逆转录病毒载体，如pLNSX。其它载体，如腺病毒或质粒，也可用来转移HIV包膜蛋白的编码核酸序列。在工艺的一个特定实施方案中，重组逆转录病毒载体是pLNSX-env。
在重组人类免疫缺陷病毒蛋白质的其它实施方案中，蛋白质被描述为包括一种重组gp160人类免疫缺陷病毒糖蛋白或gp160蛋白质片段，如gp160蛋白质的gp120或gp41片段。
本发明的重组HIV包膜蛋白和肽在某些实施方案中被进一步描述为包括由基本上纯化的和非变性的哺乳动物细胞裂解物制备的重组蛋白质和肽，这种哺乳动物细胞是被表达重组人类免疫缺陷病毒的载体所转染的，以及包括这些转染哺乳动物细胞的、基本上纯化和非变性的表达产物的重组蛋白质/肽。
在其它实施方案中，重组蛋白质/肽制剂包括一种重组人类免疫缺陷病毒gp160蛋白质复合物，该复合物包括来自一种以上人类免疫缺陷病毒株的重组gp160蛋白质。
哺乳动物细胞系是由携带编码gp160的人类免疫缺陷病毒基因的逆转录病毒表达载体转染的，这种细胞系是由编码gp160的核酸片段制备的，这种核酸片段获自HIV感染病人的几种不同的人类免疫缺陷病毒株。例如，重组HIV包膜蛋白是由HIV213病毒株制备的。
在一个特定的实施方案中，蛋白质/肽gp160复合制剂包括至少三种不同HIV株的重组gp160蛋白质表达产物，这些蛋白质表达产物被发现与具有代表性数量的血清标本中检测到的早期HIV抗体起免疫反应，而这些血清标本由常规EIA和Western印迹技术确定为血清阴性。例如，三种这样的HIV株是HIV213、HIVc和HIVAc-1。这些HIV株已被保藏在美国典型培养物保藏中心(12301 Park Lawn Drive，Rockville，MD20852)。保藏信息如下HIV213-ATCC VR2247HIVc-ATCC VR-HIVAC-1-ATCC VR2246HIVTp-1-ATCC VR2245靶抗原的制备，或源于应用携带这些gp160编码核酸序列或其片段的逆转录病毒或其它载体转染的真核细胞的表达产物，或源于应用这种转染真核细胞的基本上非变性的裂解物。
正如本发明在描述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质/肽制剂和细胞裂解物中所使用的那样，“基本上非变性的”这一术语，被用来限定具有人类免疫缺陷病毒包膜gp160蛋白质保留构型完整性的蛋白质、或具有其中的一部分，足以结合早期抗HIV抗体的蛋白质。作为靶抗原，蛋白质/肽的构象在提供这种早期抗体识别方面十分重要。
本发明者在此提供的方法保留了足够的蛋白质/肽的构象完整性，以使早期抗HIV结合识别。期望通过此处的公开内容，有可能设计出其它相似的蛋白质/肽制备方法，生产出用于早期人类免疫缺陷病毒筛查的有用靶抗原。因此，所有这些改造的方法，在其体现此处描述的方法和特定材料较小或不明显改造的限度内，均已由本发明者将其包括在本发明的范围内。
尽管本发明者检查了许多不同的HIV株，其它未在此特别提到或检查的HIV病毒株，也有可能被用于本发明的多种HIV蛋白质/肽的制剂。预期其它HIV病毒株可能会用于提供能够早期识别抗HIV抗体、限定的基本上保留构象性表位完整的HIV蛋白质。特别提到的、用于制备重组蛋白质/肽靶抗原的HIV株的选择，是根据观察到的结合病人血清或血浆标本中早期抗HIV抗体的活性，这些标本是经常规抗体测试方法确定为血清阴性的。因此，应用在此概括的方法，可能会识别并选择出其它这种代表株，随后再次根据在此详述的方法对其加工，提供重组HIV抗原，其在筛查和诊断病人标本中的早期抗HIV抗体和HIV感染中也是有用的。
在一个特定的实施方案中，本发明的重组蛋白质/肽包括一种能够免疫结合早期抗HIV抗体、构象上充分完整的HIV包膜蛋白，所述抗原作为哺乳动物细胞或其它真核细胞的表达产物是可分离的，这些细胞已用具有编码gp160 HIV包膜蛋白序列的表达载体转染。例如，HIVgp160包膜蛋白可以是感染了一种病毒株HIVc、HIV213或HIVAc-1的真核细胞所表达的。还预期其它能够表达gp160抗原、或gp41或gp120HIV包膜抗原的HIV分离株也可能与本发明一起应用。HIV包膜蛋白的纯化制剂本发明的又一方面，涉及所述重组HIV包膜蛋白制剂的纯化，在特定实施方案中为基本上纯化。在此使用的“纯化的包膜蛋白”这一术语，意指或以HIV感染细胞的溶解群体的形式，或作为一种来自重组表达细胞的蛋白质可从真核细胞分离的蛋白质组合物。这些纯化的包膜蛋白被进一步限定为基本上非变性的，以及能够与早期抗HIV抗体结合。与其天然可获得状态相比，HIV包膜蛋白被纯化至任何程度。在某些实施方案中，纯化抗原状态与重组抗原的纯度相关，正如其在完整哺乳动物细胞裂解物中的存在形式一样。因此，一种纯化的HIV包膜蛋白也指一种重组包膜蛋白，其脱离了其在完整的重组表达哺乳动物细胞内可能天然存在的环境。
“纯化的”一般地指一种HIV包膜蛋白组合物，其中多种不同的非HIV包膜成分，如其它细胞成分被去除，而组合物基本上保留了抗原性和/或与早期抗HIV抗体相互作用的能力。在使用“基本上纯化的”这一术语的地方，它将指一种组合物，其中人类免疫缺陷病毒包膜蛋白构成组合物的主要成分，如大约构成组合物蛋白质的50％、60％、80％、或95％、或更多。
根据本公开内容，本领域熟练的技术人员将熟知确定HIV蛋白质纯化程度的各种不同方法。这些方法包括例如，通过评估SDS/PAPE分析组分中不同多肽的数量，确定制剂检测早期抗HIV抗体的活性。在某些实施方案中，重组HIV蛋白质将被纯化至同质，表示为从粗制细胞裂解物提取至约80％纯度，以便在考马斯蓝染色的SDSPAGE凝胶的识别为单一条带上。蛋白质制剂的SDS PAGE凝胶分析为本领域熟练的技术人员所熟知。
适用于蛋白质纯化的多种不同技术将为本领域熟练的技术人员所熟知。例如，这些技术包括硫酸铵沉淀，PEG、抗体等，或通过热变性，随后进行离心；层析步骤如离子交换、凝胶过滤、反相、羟基磷灰石及亲和层析；等电聚焦；凝胶电泳；以及各种技术的结合。在此描述的一个具体实施例是重组gp160表达哺乳动物细胞的纯化，通过应用与结合在塑料EIA平板加样孔上的抗gp41单克隆抗体的亲和结合，细胞被溶解。
本发明中，来自转染的哺乳动物细胞裂解物的某些重组HIV蛋白质制剂具有80％的纯度。这一数字表示一个比率，例如8个gp160HIV抗原分子与2个非gp160分子的比率。更低或更高纯度的制剂在检测早期抗HIV抗体方面也是有用的。
在下文公开的优选纯化方法包括几个步骤，体现了本发明者目前所知最好的方式，以制备一种基本上纯化的重组HIV包膜蛋白，并依然保持其天然构象。这一方法在当前是优选的，经SDS-PAGE测定该方法使得重组HIV蛋白质基本上纯化且如结合早期抗体的能力评估，能同时包被EIA平板。从HIV转染的哺乳动物细胞纯化重组蛋白质的这一优选方式，包含以下文描述的顺序实施的某些步骤。然而，正如在本领域为人所知的那样，通常认为，进行各种纯化步骤的顺序可以改变，或者某些步骤可以省略，而仍会以一种适当的方法，制备一种基本上纯化的重组HIV包膜蛋白，如重组gp160HIV包膜蛋白。
正如以上所提到的那样，尽管在某些实施方案中的应用是优选的，但没有普遍要求HIV转染的哺乳动物细胞裂解物总是以其最纯化状态提供。事实上构思了，程度较低的基本上纯化的细胞裂解物在某些实施方案中将会有用，这种裂解物与其天然状态相比，仍然富含重组HIV包膜蛋白，如gp160。例如，这些实施方案包括早期抗HIV抗体的检测。用于这些实施方案的、部分纯化的HIV转染哺乳动物细胞裂解物组分之获得可通过，将HIV转染哺乳动物细胞裂解物的提取物经历在此描述的一个或多个步骤。HIV重组包膜制剂也可作为一种分泌产物，从携带HIV包膜抗原(如gp160)编码核酸序列的细胞中获得。重组载体本发明的重组载体可包括任何能够转染真核细胞的载体。例如，这种载体包括逆转录病毒载体和腺病毒载体。质粒也可能被用来转移编码本发明之HIV包膜蛋白的HIV核酸片段。在某些实施方案中，逆转录病毒载体包括一种核酸序列，其编码人类免疫缺陷病毒包膜蛋白，如gp160，或编码一种人类免疫缺陷病毒包膜蛋白的早期抗HIV抗体免疫反应片段。
在特定的实施方案中，编码人类免疫缺陷病毒包膜蛋白的核酸序列包括一种人类免疫缺陷病毒核酸序列的SalI-XhoI限制性片段。例如，本发明者制备了几种人类免疫缺陷病毒，特别是HIV株C、213和AC-1的SalI-XhoI限制性片段，并将片段平端连接到一种逆转录病毒载体上，如pLNSX逆转录病毒载体。哺乳动物细胞系本发明在另一方面提供了表达重组人类免疫缺陷病毒包膜蛋白和肽的重组哺乳动物细胞。任何种类的哺乳动物细胞或细胞系都可应用，只要它们能够表达能免疫检测早期抗HIV抗体的重组HIV蛋白质。例如，可应用的一种细胞系是CEM人细胞系，特地将其描述为CEM人T细胞。制备重组HIV包膜蛋白和肽的方法提供了制备重组HIV包膜蛋白和肽的方法。在一个特定的实施方案中，该方法包括，用一个经基因工程改造以包含编码人类免疫缺陷病毒包膜蛋白序列的逆转录病毒载体转染哺乳动物细胞。然后，这些转染的哺乳动物细胞经过筛选过程，如通过对G418的抗生素抗性，选择出表达最大数量人类免疫缺陷病毒包膜蛋白的克隆。例如，表达最大数量HIV包膜蛋白的克隆可应用抗HIV gp160单克隆抗体(如DZ33，Medarex，Inc.)筛选。
本发明者分离的一个表达HIV包膜蛋白gp160的克隆是克隆7。克隆7是通过用含有HIV213株env基因的LNSX逆转录病毒载体转染CEM细胞系获得的。用流式细胞仪对这种克隆7进行检测，发现它能表达高水平的重组HIV gp160蛋白质(图5)。
其它表达来自一个以上HIV株的gp160融合蛋白的克隆也可获得。达到这个目的可通过例如，构建一个包括来自所需HIV分离株的gp160编码核酸片段的逆转录病毒载体，然后用该构建体转染哺乳动物细胞系。
任何在此描述的重组HIV抗原可单独或联合应用，作为早期抗HIV抗体检测的靶抗原。这些来自所述病毒株的重组抗原的联合应用，在检测迄今为止最大范围的病人标本中的早期抗HIV抗体方面特别有效。生产重组HIV包膜蛋白/肽的方法/工艺本发明还提供了生产重组HIV抗原的方法/工艺。在一个实施方案中，该方法包括获得一个编码人类免疫缺陷病毒gp160包膜蛋白的核酸片段；将核酸片段连接到载体上以提供一个重组载体；用重组载体转染哺乳动物细胞以提供一个转染的哺乳动物细胞；以及收集重组gp160蛋白质。重组gp160蛋白质的收集可通过，用增溶剂(如毛地黄皂苷)溶解感染的哺乳动物细胞，而不破坏抗原的早期抗HIV抗体检测能力，然后去除溶解于制剂中的细胞成分。另外，重组HIV抗原可作为来自重组真核细胞的分泌产物收集，例如来自一个经基因工程改造以分泌gp160 HIV包膜蛋白的酵母细胞。
一种方法被用于收集作为检测标本中早期抗HIV抗体的靶抗原的重组gp160，这种方法是通过应用1.0％毛地黄皂苷作为感染HIV的CEM细胞的增溶剂。该方法于实施例3中描述。通过将全部重组细胞裂解物倾注到包被鼠抗gp41 mu AB的平板加样孔中，重组HIV gp160抗原被俘获到ELISA平板上。然后冲洗平板以去除细胞成分和其它抗原。以这种方式，所需的HIV gp160抗原被分离到平板上。
在一个特定的实施方案中，制备重组gp160包膜蛋白的方法包括获得一个编码gp160 HIV包膜蛋白的核酸片段；将该片段插入一个能够转染哺乳动物细胞的载体中；以及用该载体转染一个能够表达gp160包膜蛋白的哺乳动物细胞。该方法可能还包括收集重组gp160蛋白质的步骤。试验平板在某些实施方案中，试验平板的加样孔可能首先包被抗gp41或抗gp160抗体。当存在一种温和的增溶缓冲液时，如大约0.1％--10％的毛地黄皂苷(特别是大约1％的毛地黄皂苷)，会将HIV gp160固定到塑料上。在制备具有塑料加样孔的试验平板时，这种方法特别有效。
本发明的其它实施方案中的试验平板包括大量的微量滴定孔，以及在某些实施方案中，为聚苯乙烯微量滴定孔。这些加样孔将包被大约每孔500ng的重组HIV包膜蛋白、或重组HIV抗原、或HIV感染的完整细胞、或其细胞裂解物。早期抗HIV抗体检测试验在另一个实施方案中，本发明提供了改进的抗HIV抗体检测试验，该试验应用上述天然的或重组HIV蛋白质/肽作为靶抗原。这些改进的试验、特别是ELISA夹心式试验，可供在夹心式试验中早期抗HIV抗体的检测，可供在常规EIA和WB技术测试为阴性的标本中检测早期抗HIV抗体。
EIA的样式可被描述为应用直接包被HIV抗原的平板(抗原或是HIV转染的哺乳动物细胞表达的重组HIV包膜蛋白，或是表达HIV包膜蛋白的、基本上非变性、溶解的HIV感染哺乳动物细胞的裂解物)，或为设计成起抗体俘获夹心试验功能的平板。免疫测定正如提到的那样，本发明的重组gp160可用作免疫原，例如，用于疫苗开发，或作为抗原用于抗gp160构象性表位反应性抗体检测的免疫测定。首先谈及免疫测定，就其最简单和直接的意义上来说，本发明优选的免疫测定包括本领域众所周知的多种酶联免疫吸附试验(ELISA)。然而，很容易会认识到，在此所述的gp160制剂的应用，并非限于这种试验，其它有用的实施方案还包括RIA以及其它非酶联抗体结合试验或方法。
在ELISA试验的某些实施方案中，天然gp160或适当的掺入gp160抗原序列的肽被固定到一个所选表面上，优选的表面显示蛋白质亲和性，如聚苯乙烯微量滴定板的加样孔。冲洗去除未完全吸收的物质后，人们便期望将一种非特异性蛋白质(如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、奶粉溶液、明胶、PVP、Superblock、或马白蛋白)，结合或包被到加样孔上，就测试的抗血清而言，这种加样孔已知是抗原中性的。这能够封闭固定表面上的非特异性吸收位点，因此减少抗血清在表面上非特异性结合造成的背景。经适当的包被期(如3小时)后，用一种适当的蛋白质(如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、奶粉溶液、明胶、PVP、Superblock、或马白蛋白)包被加样孔，然后用适当的缓冲液如PBS冲洗数次(如4次或5次)。然后可使平板加样孔干燥，或在其依然潮湿的情况下使用。
抗原物质与加样孔结合、用非反应性物质包被以减少背景、以及冲洗去除未结合的物质后，使固定表面与待测的抗血清、或者临床或生物提取物接触，其方式应有助于免疫复合物(抗原/抗体)形成。这种条件优选包括用稀释剂，如应用BSA、牛丙种球蛋白(BGG)和磷酸缓冲盐液(PBS)/吐温稀释抗血清。这些加入的试剂有助于减少非特异性背景。然后将分层抗血清孵育1～4小时，优选温度为20℃～25℃。孵育后，冲洗接触了抗血清的表面，以去除非免疫复合物质。一种优选的冲洗步骤包括用一种溶液如PBS/吐温或硼酸盐缓冲液冲洗。
待测标本与结合抗原之间形成特异性免疫复合物后进行冲洗，通过将其置于对第一抗体有特异性的第二抗体中，可测定免疫复合物形成的发生，甚至数量。当然，在这种试验中，典型的待测标本是来自人类的，第二抗体优选对人类IgG、IgM或IgA普遍有特异性的抗体。为了提供检测手段，第二抗体优选具有一种偶联酶，后者与适当的显色底物孵育后会产生颜色。例如，人们会期望将偶联了抗血清的表面与脲酶、碱性磷酸酶、或过氧化物酶偶联的抗人IgG接触并孵育一段时间，其反应条件应有助于免疫复合物形成(例如，在含PBS的溶液如PBS/吐温中室温下孵育2小时)。
与第二酶标抗体孵育后随之冲洗去除未结合的物质，通过与显色底物孵育，对标记物的数量进行定量，例如显色底物可为尿素和溴甲酚紫，或在过氧化物酶为酶标物时，2，2-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉6-磺酸)[ABTS]和H2O2。如此，通过测量颜色产生的程度，如应用一种可见光谱分光光度计，就能完成数量测定。
在每个微量滴定孔中，将加入大约10微升待测病人标本和大约90微升反应缓冲液(例如，带有大约1％毛地黄皂苷或其它温和蛋白质增溶剂的PBS)。ELISA平板的对照加样孔将包括正常血清(不含早期抗HIV抗体的人血清)。早期抗HIV抗体取自HIV病人受试者，其经Western印迹评估，尚未出现血清转换；晚期抗HIV抗体获自经常规抗HIV抗体检测技术证实为已出现血清转换的病人。婴儿早期HIV感染检测在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种方法用于在小儿中检测早期IgM或IgA抗HIV抗体。这些方法较现行技术有所改进，因为它们对年龄低于12个月的婴儿HIV感染可进行早期诊测。早期抗HIV抗体检测试剂盒在本发明的另一个方面，构思了一个试剂盒，其用于早期抗HIV抗体检测。在某些实施方案中，本发明设想出一个诊断试剂盒，用来检测早期抗HIV抗体和人类免疫缺陷病毒感染。试剂盒包括能够检测与在此描述的天然或重组HIV抗原起免疫反应的早期抗HIV抗体的试剂。
在某些实施方案中，试剂盒还可能包括一种容器，其包括一种能够检测与重组HIV包膜抗原起免疫反应的早期抗HIV抗体的第二抗体。
试剂盒的HIV抗原试剂可为液体溶液形式、附着于固体支撑物上的形式、或为干燥粉剂。当试剂为一种液体溶液时，该液体溶液优选是水溶液。当试剂是附着于固体支撑物上的形式时，优选的固体支撑物可以是层析介质、塑料珠或平板、或显微镜载玻片。当试剂为一种干燥粉剂时，通过加入适当溶剂可重构粉剂。在其它的实施方案中，试剂盒可进一步包括一种包含适当溶剂的容器。
在某些实施方案中，试剂盒包括一种容器，其中包括一定量的第二抗体，如偶联碱性磷酸酶的羊抗人IgG或IgM或其它抗人IgG第二抗体，以及第二个容器，其中包括一定量的缓冲液，缓冲液包括一种非变性增溶剂，如大约1％的毛地黄皂苷。
在其它实施方案中，试剂盒可进一步包括第三个容器，它包括一种适当的底物，如用于碱性磷酸酶的PNPP，或用于过氧化物酶的9-邻联 二 茴香胺。第四个容器包括一种适当的“终止”缓冲剂，如0.5MNaOH，该容器也可包括在试剂盒的各种不同的实施方案中。
试剂盒可进一步包括一份说明书，简述试验步骤，而且与本领域熟练的技术人员所熟知的典型EIA样式基本相同。特发性慢性淋巴细胞减少症的筛查在本发明的另一个方面，提供了在特发性慢性淋巴细胞减少症标本中筛查HIV证据的方法。在某些实施方案中，该方法包括从病人身上获取一种生物液体标本；使该标本接触天然的或重组人类免疫缺陷病毒包膜蛋白，后者能够结合早期抗HIV抗体，其条件应充分允许标记的重组蛋白质与病人标本中任何抗体之间形成免疫复合物，以便提供一种孵育混合物；以及通过某些标记物，鉴定孵育混合物中存在形成的免疫复合物，其中标记免疫复合物形成之存在，提供了在特发性慢性淋巴细胞减少症中筛查HIV的方法。
附图简述下列附图构成本说明书的一部分，将其包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图，并结合在此描述的特定实施方案的详述，可更好地理解本发明。
图1.常规EIA试验测试为“血清阴性”的个体是被HIV感染的，而且具有可检测到的早期抗HIV抗体，抗HIV抗体与来自病人的病毒分离株感染的活细胞起免疫反应。来自“血清阴性”HIV感染受试者R6和R23的血清，是在活的非感染H9细胞或感染了其自身HIV分离株(HIVR6或HIVR23)的H9细胞中滴定的，并用FITC偶联的羊抗人Ig(多价)染色。在UV显微镜下计数膜荧光细胞的百分比，表示标本中早期抗HIV抗体的存在。
图2.来自“血清阴性”但为HIV感染受试者的抗体，与HIV感染细胞裂解物的HIV gp160起反应。NP-40溶解的[S]甲硫氨酸标记H9细胞(未感染或由HIVpm213感染)的免疫沉淀物SDS-PAGE分析。泳道1-3和8是感染HIVpm213的H9裂解物，泳道4-7是未感染的H9裂解物。泳道1和4，R23血清；泳道2和5，R6血清；泳道3和6，R78血清；泳道7和8，R58血清(R23、R6、snfR78在常规RIA和Western印迹中是阴性的，作为HIV抗原，R58是EIA和WBt)。
图3.毛地黄皂苷溶解的感染HIV213的H9细胞的RIP。NS＝正常人血清；R6和R23＝“早期”血清；*＝用抗gp160单克隆抗体(F105)预清除的裂解物。
图4.[35S]甲硫氨酸标记、感染HIV的H9细胞之SDS/PAGE，细胞用不同的去污剂裂解，并用正常人血清(NS)、或用含早期抗HIV抗体(NIA-0145，8363)的病人血清免疫沉淀。
图5.用流式细胞仪测定抗gp41和抗gp120单克隆抗体的水平，单克隆抗体结合在三种独立的、HIV213gp160转染的细胞克隆上(CEM-HIV env-1，env-4，env-7)，并与非表达对照作比较。细胞用20μg/ml对照(无关IgG，阴影曲线)、或抗g41 mAB(5F3人mAB，虚线)、或抗gp120(gpIII2，3鼠mAB，实线)染色。应用第二个种属特异性、结合藻红蛋白的抗体进行检测。
图6.HIV213 SalI-BamI序列(核酸序列)。
优选实施方案详述本发明的天然或重组HIV包膜抗原基本上是非变性的，并且大部分保留天然构象。在此对某些典型重组HIV靶抗原的描述中，鉴定并应用了特定的HIV株，但这并非意在限制权利要求中包含的诊断/筛查试验或产品的范围。
已开发了一种应用重组HIV抗原的EIA，其用HIV感染的活细胞免疫荧光检测早期抗HIV抗体。本发明的EIA包括一种靶抗原，其中哺乳动物细胞中载体表达的gp160 HIV蛋白质通过一种不会使其变性的方法溶解(例如通过应用增溶剂，毛地黄皂苷)，并被用来包被EIA试验平板的加样孔。病人血清中与这些构象得以保留的、天然抗原模拟表位起反应的早期抗HIV抗体，可利用一种适当的标记抗人免疫球蛋白(如碱性磷酸酶标记抗人IgG)来检测，或者在婴儿中则用抗人IgM或IgA。
下列实施例被包括在内，以证实Western印迹或现行EIA定为阴性的HIV感染受试者中，存在与gp160构象性表位起反应的抗HIV抗体。本领域熟练的技术人员应意识到，以下实施例中公开的技术代表了发明者发现的、能在本发明的实施的效果良好的技术，因此可被认为构成其实施的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域熟练的技术人员应意识到，公开的特定实施方案中可能经过许多变化，但依然会获得相同或相似的结果，这均不背离本发明的精神和范围。
下列实施例中应用的几种方法描述如下方法活细胞膜免疫荧光试验1.靶细胞是产生HIV的、急性感染的H9或CEM T细胞。
2.将靶细胞移至离心管中，室温下离心10分钟，吸出液体，用相当于沉淀物5倍体积的培养基悬浮沉淀物。
3.将50微升的1°抗体加入96孔圆底平板的加样孔中。
4.将10微升的靶细胞加入每个加样孔中。
5.密封，室温下孵育1小时。
6.平板离心，吸出液体，用培养基冲洗2遍，吸出液体。
7.将50μl适当稀释的2°FITC抗体加入每个加样孔中，室温下孵育1小时。
8.平板离心(5′×2，000转/分)，吸出液体，用培养基冲洗2遍。
9.将1滴含2％福尔马林的甘油/PBS(1∶1)加入每个加样孔中，混合。
10.将细胞混悬液固定在显微镜载玻片的盖玻片下。放射免疫沉淀和SDS/PAGE方案细胞的放射标记1.对悬浮培养物，将细胞培养至晚期对数生长期。去除生长培养基，用不含甲硫氨酸的培养基洗涤细胞一次。在37℃孵育细胞20-30分钟，以助耗尽细胞甲硫氨酸积存。
2.去除洗涤培养基，加入最小体积的无甲硫氨酸的培养基，其中含50微居里/ml的S-甲硫氨酸。孵育3-4小时，或按要求。
3.为收集细胞，离心收集悬浮培养物，用冷PBS洗涤一次。加入1.0ml裂解缓冲液(0.5％NP40，或1％毛地黄皂苷，等)。移至微量离心管中，涡流振荡，将标本贮存在-70℃。
D.应用TCA沉淀法测定放射标记蛋白质的量。就在蛋白质分析之前，在微量离心管中离心标本15分钟，以沉淀核酸及未溶解的残渣。细胞裂解物的免疫沉淀和SDS/PAGE1.根据放射标记蛋白质的量，将适当体积的裂解物等分物加入螺口带盖微量离心管中。一个典型的RIP可含有10cpm。如果需预清除，则加入1∶100(V)的抗体(正常血清)，涡流振荡，在冰上孵育30分钟。标本中加入100微升蛋白A-琼脂糖或福尔马林固定的金黄色葡萄球菌(Cowan株)，混匀，冰上放置30分钟。离心5分钟，回收上清液，移至新的螺口试管中。
2.用3-5微升血清或100微升组织培养单克隆抗体上清液免疫沉淀预清除裂解物标本(相当于1-2×106个细胞)，4℃过夜。用金黄色葡萄球菌回收沉淀物，在还原条件下(5％2-巯基乙醇)用SDS(10％)-PAGE对其进行分析。实施例1-早期抗HIV抗体以活细胞免疫荧光作为靶抗原该实施例显示了曾被常规抗HIV抗体检测技术诊断为血清阴性的病人血清中早期抗HIV抗体的存在。
该实施例应用一种非变性试验(活细胞膜免疫荧光)，显示4例高危感染的EIA、WB个体中，4例病人有早期抗HIV抗体的存在。这些抗HIV抗体为IgG同种型，而且发现与其同种HIV、以及许多其它的HIV-1分离株起反应(表1)。
表1“血清阴性”病人具有与许多HIV-1分离株起反应的抗体针对HIV感染细胞的血清抗体滴度一览使50％H9感染细胞染色的血清稀释度的倒数未感染血清H9HIVR6HIVR23HIV58HIVpm213HIVG1HIVAC-1HIV-IIIBR6 ＜1060 6010 40 20 50＜10R23＜10160 160 20 160 640 320 20R78＜1030 7060 15 50 ＜10 40R82*＜1070 1530 80 ND 15NDR58＜10320 ＜10 100 1000200 1000 640注ND，未测定*该血清用未感染的H9细胞预吸收，以去除与H9细胞起反应的抗体。R58是一例EIA+、WB+的HIV感染受试者，用作比较。
这些血清与作为对照未感染HIV的细胞不起反应。实施例2-临床筛查中HIV株的免疫反应性该实施例描述了对不同HIV株的调查，因为本发明者的早期研究显示，来自HIV感染个体的EIA+、WB+血清，对天然HIV包膜抗原具有大量的类型专一性，当应用活细胞免疫荧光时，对不同的HIV株有活性。表2提供的资料说明，某些HIV株与其它HIV分离株相比，看来能被来自更多感染个体的抗体所识别。
表2 来自HIV EIA/WB(+)的血清针对在用不同HIV分离株感染的H9细胞上表达的ENV之反应性血清H9AC-1CP-1MCK0214III205 HTLV TP-1AK-1SK-1213G1-IIIB对照- - - - 10- - - - -- - - -Pt.11 - 20*- - - - 80 20- -- - 20 -l - 512080 40- - 40 802560 2560 32020 2560 1280K - 40 - - 160 160- 5120 1601280 - 20 2560 -8 - 512020 - 20- 20 405120 2560 160- 5120 4012 - 160 - - 40- - - - 320 - - - -5 - 160 80 8040- 160160 5120 640 320- 5120 1602 - 512080 320 160 - 40 1280 1601280 2560 20 64064010 - 2560- 80160 10 40 405120 320 5120 1605120 806 - 2560- - 20- 320801280 320 - - 1280 -13 - 5120- - - 10 80 160 5120 2560 160- 5120 8015 - 160 - - - - 160 -6402560 40 - 5120 4020 - 512020 - - - - -2560 160 2160 1605120 2017 - 512040 20802560 20 320 1605120 1280 3201280 64018 - 2560- 20160 5120 - 160 1601280 3203202560 16021 - 1280- 1280 640 1280 - -2560 2560 1603201280-9 - 1280- - - 5120 40 5120 640-1280 10 2560-14 - 256010 202016020 1280 6405120 5120 1280 2560256016 - 1280- 40402560 1602560 5120 1280 1280 80 ＞640 80*数据表示为在活细胞免疫荧光试验中染色50％细胞的血清稀释度的倒数。
个体(EIA阴性，WB阴性)。这些资料概括在表3中，表中显示HIV株213、AC-1和C对大多数血清起反应。
表3“早期”抗体对不同HIV-1株的活细胞免疫荧光反应性对这些靶细胞的阳性*数目测试病H9H9+ H9+ H9+ H9+ H9+ H9+人总数 MNRF IIIB 213 AC-1 C13 00 22 1110 12(40，80) (40，80) (40-160) (40-80) (40-160)阳性＝≥40()＝滴度范围。滴度为使50％细胞染色的血清稀释度的倒数。
累积起来，晚期感染以及“早期”感染受试者的全部资料表明，三种HIV株的一种或多种将会与来自几乎所有感染者的抗体起反应。
还对更大一组高危EIA阴性、WB阴性个体进行了测试。发现其中约25％具有在活细胞膜免疫荧光中起反应的抗体，表4中的资料显示了单个高危病人的抗HIV免疫荧光滴度，该病人构成了Clerici等人报道的研究。表4从同一病人序贯获取的血清标本的膜免疫荧光滴度靶细胞血清 H9 H9-HIV就诊#8 -30*就诊#10-50就诊#15-70*使50％细胞染色的血清稀释度的倒数。
膜荧光试验显示，该个体具有低的、但却明显的抗HIV抗体滴度，但在FDA批准的血清学试验中他是“血清阴性”的，而且是HIV的PCR阴性的28。相应地说，他具有HIV反应性T细胞，这为他们的报道提供了根据。
表5显示了另一组个体的膜荧光滴度。编码标本包括许多正常对照，以及常规试验定为血清阳性的感染个体。表5血清的膜免疫荧光反应性总览这些靶细胞的阳性数目危险组 病例数 H9 H9-HIV213H9-HIVAC-1异性恋低危险 10 0 00HIV感染的 10 0 10 10EIA/WB阳性同性恋高危险 50 13(EIA-，WB-)阳性＝滴度≥1∶40膜荧光滴度与那些试验完全一致。该组也包括5例高危个体，在8-10个月的期间内，序贯抽取他们的血液。这些个体中有一例(20664)在第一次就诊时，有低HIV213免疫荧光滴度，那时他经FDA批准的试验测定仍然是血清阴性的。大约4个月后，该个体的EIA和Western印迹是阳性的，而且HIV213的膜免疫荧光滴度为1∶160，HIVAC-1的滴度也是这样。第二例(40301)在第二次就诊时，出现了对HIVAC-1的膜免疫荧光滴度，下次就诊时又有升高。第三例受试者(41593)在最后一次就诊时，膜免疫荧光试验变为血清阳性，但EIA和Western印迹是阴性的。该组中的其他两例是高危个体，常规试验一直没有出现血清转换，而且经膜免疫荧光试验测试，也从未出现血清转换。
表6概括了65例个体的膜免疫荧光反应性。各组包括正常对照、阳性对照(EIA/Western印迹阳性)，以及36例EIA和WB为血清阴性的高危个体。后者中有12例膜免疫荧光为阳性，而且已被发现也具有对HIV肽起反应的T细胞。
表6血清膜免疫荧光滴度这些靶细胞的膜免疫荧光阳性数目危险组别病例数 NO.w/HIV反 H9 H9-213 H9-AC-1应性T细胞低危险对照180 000HIV感染的 11ND 010 11EIA+，WB+高危险3611 010 12EIA-，WR-ND＝未测定阳性＝滴度≥40来自所有高危“血清阴性”受试者的资料概括在表7中。这些血清中的大多数只取过一次，并且包括另外50例病人血清。
表7高危受试者血清中HIV抗体的活细胞免疫荧光测试一览受试者组别 受试者例数 阳性例数滴度范围高危、WB/EIA 10929 20-130血清阴性低危对照 50 0 -AIDS病人 83 83 100-5000109例受试者中有29例，具有对三种HIV株中至少一种的活细胞荧光起反应的抗体，随机对其中8例检查了感染细胞中毛地黄皂苷溶解的病毒蛋白质的免疫沉淀，发现他们都对HIV gp160起反应。在活细胞荧光中，低危HIV阴性个体没有被发现是阳性的(即滴度≤1∶10)，而且感染受试者的滴度大致与疾病病期相符。活细胞荧光中的高滴度，通常见于那些EIA和Western印迹也计为阳性的个体，而较低滴度的个体，EIA和Western印迹通常不计分。活细胞免疫荧光试验的相对敏感性活细胞免疫荧光并不一定在所有情况下都是比EIA和WB更敏感的试验。对照(阴性)血清在稀释度大于1∶10时不能使细胞染色，但在如此低的稀释度时，EIA和WB却产生阳性反应。在EIA和WB，对照血清通常需稀释至大约1∶100才不起反应，这些试验的高度敏感性，有可能使得人血清中与大多数抗原起反应的抗体在很低量时即得出阳性计分。大约44-95％的HIV感染个体具有显著的自身抗体水平。活细胞荧光的敏感性太低，在血清稀释超过1∶10时，不能检测到这些抗体。此外，抗HIV抗体阳性血清稀释至1∶10,000-1∶30,000时，在EIA和WB中仍保持反应性，而这些同样的血清当稀释超过1∶5000时，在活细胞荧光中却无反应性。应用活的感染细胞可检测天然构象性表位的抗体，但其敏感性不高，不能在摩尔水平上检测抗体。实施例3-溶解研究-非活细胞靶抗原用于检测早期抗HIV抗体该实施例显示了非活细胞靶抗原在检测病人标本中早期抗HIV抗体的实用性。这些资料还显示了人类免疫缺陷病毒包膜蛋白之基本上保留的构象性表位在检测早期抗HIV抗体方面的重要性。
通过用若干不同的去污剂制备HIV靶抗原，调查了不同增溶剂对HIV蛋白质与早期抗HIV抗体免疫反应性的影响。这项研究显示，应用感染HIV的非活细胞作为靶抗原，可检测出人血清标本中的早期抗HIV抗体，而应用变性的HIV蛋白质作为靶抗原(Western印迹和常规EIA)，曾将这些标本确定为抗体血清阴性。
应用表8中所列试剂之一可将HIV感染的人CEM细胞溶解。每一抗原制剂都测试了被6例病人血清中所含早期抗HIV抗体免疫沉淀的能力。这些病人血清被活细胞免疫荧光试验测定为早期抗HIV抗体阳性，而应用变性HIV靶抗原的常规Western印迹，却将其测定为抗HIV抗体阴性。每一抗原制剂还与对照血清标本一起测试，这些对照血清标本经活细胞免疫荧光试验测定，不含早期抗HIV抗体(“NS”＝正常血清)。
表8概括了所有资料，显示毛地黄皂苷是一种具有代表性的增溶剂，与本项研究中的其它去污剂相比，它对用作靶抗原的蛋白质/肽的变性作用最小。这些资料提供证据说明，这些“早期”抗体识别HIVgp160的构象性表位。估计大约0.1％-5％浓度的毛地黄皂苷可用于制备本发明的靶HIV抗原，而不会有早期抗HIV抗体检测反应性的丧失。
表8RIP/SDS-PAGE检测“早期”抗体对不同去污剂溶解的HIV gp160的反应性一览去污剂“早期”抗体*免疫沉淀0.5％SDS -0.5％NP40 3份血清阳性；3份血清阴性10mM CHAPS -0.5％去氧胆酸盐-1.0％辛基糖苷 -1.0％毛地黄皂苷+(全部6份)1M K2PO4-0.5mM十二烷基麦芽糖苷 -0.3mM Theirst -*测试了6份不同的血清。全部为WB阴性，但HIV感染细胞的活细胞免疫荧光为阳性。
图4显示了这项研究的典型实施例，证实“早期”抗体免疫沉淀的gp160溶解在大约1％毛地黄皂苷和0.5％NP40中。当溶解于毛地黄皂苷的gp160作为靶抗原时，在所有的血清标本中都检测出了早期抗HIV抗体。应用NP40溶解的HIV靶抗原，6份病人血清标本中有3份也检测出了早期抗HIV抗体。然而，应用10mM CHAPS、0.5％SDS、0.5％去氧胆酸盐、1.0％辛基糖苷、1mM K2PO4、0.5mM十二烷基麦芽糖苷、或0.3mM Theirst处理的HIV靶抗原，所有血清中均没有检测出早期抗HIV抗体。
在一个实施方案中，HIV感染细胞将在1％毛地黄皂苷中溶解，并作为靶抗原用于包被EIA平板。
这些放射免疫沉淀(RIP)和SDS/PAGE研究还显示，抗体是与病毒抗原，而不是病毒诱导的细胞抗原起反应。用CHAPS溶解的HIV抗原与含早期抗HIV抗体的血清不产生一种可检测到的免疫沉淀物(图2，泳道1和2)。应用0.5％NP40溶解的、S-甲硫氨酸标记的感染细胞，4份血清中有1份出现了免疫沉淀物(图2，泳道4和5)。这一百分比的NP40-增溶剂所引起的轻度变性，破坏了其它3份血清中的抗体所要识别的抗原表位。
一份反应性血清免疫沉淀一种分子量约160,000的蛋白质(图2)。用抗gp160单克隆抗体预清除NP-40细胞裂解物，能消除这种RIP反应性，这种现象证实这种被免疫沉淀的蛋白质是HIV gp160(图3)。
以下实施例概述了(a)表达来自HIV AC-1和C株gp160的CEM细胞系的制备；(b)EIA的样式(即用抗原直接包被加样孔或抗体俘获夹心试验)，包括EIA中合适封闭剂的确定以减少背景结合；有关EIA平板干燥或潮湿应用样式的确定研究，以及在本发明的商品化实施方案中，如何保留试验平板上的HIV蛋白质的抗原构象。实施例4-重组GP160 HIV蛋白质/肽该实施例显示了本发明在提供能够与早期抗HIV抗体起反应的构象完整的重组靶抗原方面的实用性。早期抗HIV抗体的存在类似于用活性细胞免疫荧光试验观察的抗HIV抗体检测。
逆转录病毒载体(pLNSX)上的HIC株213的SalI-Xhol限制性片段已在CEM人类T细胞中获得稳定表达(图5)。这一片段被平端连接到载体上，经电穿孔转染后，细胞用G418选择，然后通过有限稀释获得单个克隆，并应用Medarex公司的针对HIV gp160的F105单克隆抗体测试包膜的高表达。产生的克隆(克隆7)经流式细胞仪(图5)研究显示高水平表达gp160。
克隆7可用于活细胞荧光试验中，而且已观察到，它与应用H9HIV感染细胞检测到的早期抗HIV抗体起反应。应用上述表达载体系统，其它两个HIV株，HIVC和HIVAC-1的包膜基因克隆也获得成功。
本发明者应用重组gp160 HIV抗原进行的研究，进一步提供证据表明，HIV靶抗原的保留构象完整性在早期抗HIV抗体结合与检测中的重要性。HIV213的包膜在大肠杆菌中表达。然后，该抗原被用于测试病人血清中早期抗HIV抗体的免疫沉淀，病人血清已由活细胞免疫荧光鉴定，含有早期抗HIV抗体。
大肠杆菌表达的重组gp160包膜抗原不能被病人标本中的早期抗HIV抗体沉淀，而毛地黄皂苷溶解的HIV213感染细胞抗原却能。这些结果表明，早期抗HIV抗体不能免疫结合只有保留一级结构的gp160HIV表面抗原，因为大肠杆菌不能产生具有早期抗HIV抗体识别所必需的足够构象特征的重组蛋白质。Gp160在细菌中的过度表达，使蛋白质得不到适当的折叠和糖基化。实施例5-婴儿抗HIV抗体的检测该实施例显示了婴儿中早期抗HIV抗体的存在，以及天然重组HIV抗原试验在检测婴儿HIV感染中的实用性。
在这些研究中检查的标本，来自一个由48名婴儿(年龄1天～6个月)标本组成的儿科HIV人群，他们的母亲经常规抗体检测技术确定为HIV血清阳性。此外，还培养了PBMC，以便应用P24抗原俘获EIA和PCR进行HIV检测。这些婴儿中有6例发现了HIV。
表9概括了针对未感染细胞和感染细胞之活细胞膜免疫荧光中婴儿血清的滴定结果。
表9活细胞免疫荧光测试婴儿血清中与HIV起反应的IgM受试者组别 病例 PCR检测 IgM例数，对非感数HIV阳性例 对HIV染细胞数 (滴度)HIV+母亲生育的 486 6(10-80) 0婴儿(年龄1天-6个月)对照组婴儿(年龄1130 00天-5个月)*培养的PBMC的LTR-gag序列之PCR扩增6例被感染的婴儿中，每一例都具有与HIV感染细胞起反应的早期IgM抗体。这些血清与非感染细胞不起反应，而且这些血清用琼脂糖蛋白G吸附去除IgG以排除类风湿因子被检测的可能性后，仍具有反应性。非感染婴儿不具有抗HIV IgM，因此活细胞荧光测定HIV IgM的存在与病毒的存在之间有100％的一致。值得注意的是，一例被发现受感染的1天龄婴儿的血浆中，存在中等滴度的抗HIV IgM。这些资料明确提示，该婴儿显然是在子宫内被感染的。
这些资料显示，被感染婴儿具有HIV特异性IgM，应用活的感染细胞作为抗原能对其进行检测。因此，为了这一特殊应用，提供了一种儿科HIV检测试剂盒，其能检测与HIV蛋白质的构象性表位起反应的IgM和IgA抗体。
这些资料支持这一论点，即HIV特异性T细胞、B细胞、以及识别构象性表位的抗HIV抗体，是在其它免疫学上表现为沉默感染的早期产生的，最终被感染的个体产生了与变性蛋白质起反应的抗体(现行EIA/WB试验中的常规“血清转换”)。
对HIV血清阳性母亲生育的婴儿进行的其它观察中，有一项前瞻性研究显示，12例HIV培养阳性的婴儿中，10例具有针对HIV重组蛋白质的IgA抗体，从出生到27周龄期间均能检测到36。在大多数病例，测试的第一份血清是在两月龄后采集的。在大于1岁的婴儿中，全部标本的HIV特异性IgA阳性，而只有50％含有可测到的IgM。值得注意的是，应用他们改进的Western印迹方法进行检测，13例3月龄以下的被感染婴儿中只有2例检测出IgA。不管测试方法是什么(Western印迹或斑点印迹)，含有可测到的HIV抗体的第一份血清标本均与包膜糖蛋白gp160起反应。
以上结果显示了本发明在婴儿中作为一种新的HIV诊断试验的实用性，它比现行方法更有改进，因为它比标准筛查方法能更早地检测HIV，而且对婴儿感染、而不是母体感染更具特异性。
在特定实施方案中，本发明包括一种测试体系，依靠这种测试体系，通过针对HIV gp160构象性表位的特异性IgM或IgA的存在，进行早期抗HIV抗体测试，可在儿科受试者筛查HIV感染，这成为改进的儿科HIV感染早期诊断的一部分。实施例6-血库中血液筛查方法HIV感染的现行测试不能查出最近被感染的个体，而且甚至会漏掉一小部前AIDS期后期的个体。因为在这些EIA阴性、WB阴性病人中可检测到病毒，他们很有可能在这一时期将病毒传播给其他人。此外，如果他们以为自已未被感染而献血，那么接受他们的血液的输血者就受到威胁。因此，对目前各类试验最大的需要之一就是，将其应用扩展到血库对捐献血液的监测。此外，由于这些受试者中许多人很可能是性活跃者，在此公开的试验在治疗性传播疾病诊所，其它测试场所等中，对检测早期HIV-1感染个体是有实用性的。
本方法提供了检测早期抗HIV抗体的重组的非活细胞HIV靶抗原的应用。在某些实施方案中，该方法包括EIA，其中由哺乳动物细胞中载体表达的gp160被溶解在如毛地黄皂苷中，并被用于包被标准EIA平板的加样孔。然后，应用一种标记物来检测病人血清中与这些天然抗原起反应的早期抗HIV抗体，如结合抗人Ig抗体的碱性磷酸酶。实施例7-应用非变性重组GP160 HIV抗原的EIA试验该实施例显示了本发明提供一种EIA，应用一种非变性、非活细胞HIV靶抗原检测早期抗HIV抗体的实用性。这些非变性的HIV抗原，与HIV感染细胞作为靶抗原相比，是一种减毒的生物危害品，但仍具有基本上相同的抗HIV早期抗体检测活性。该实施例中特定的非变性、非活细胞HIV靶抗原是一种重组gp160 HIV抗原。
在该试验提供早期抗HIV抗体检测的同时，它还显示与常规抗HIV抗体检测方法检测出的晚期抗体起阳性反应。
gp160 HIV靶抗原将按实施例4中的描述制备(HIV213)。不过任何作为编码核酸序列的一部分被分离并重组产生的HIV包膜蛋白都可与本发明结合使用，该抗原具有促进早期抗HIV抗体识别与结合所必需的保留构象完整性。在一个实施例中，由哺乳动物细胞中的载体表达的gp160将用大约1％的毛地黄皂苷溶解，并用于包被例如标准96孔微量滴定板的加样孔。
存在于一种标本、优选是一种生物标本(实体组织或液体)中的任何早期抗HIV抗体会与抗原起免疫反应，而且早期抗体的检测是应用碱性磷酸酶标记的抗人IgG，或者对于婴儿为抗人IgM和IgA。
有了本公开内容的资料，例如用抗原直接包被试验加样孔或抗体俘获夹心试验，EIA试验可按照本领域熟练的技术人员熟知的任何类型的试验样式进行。期望含有抗原或用抗原处理的试验平板能是干燥的，而不会造成早期抗HIV抗体结合能力或吸引结合能力的明显丧失。EIA样式的确定与所有“早期”以及“晚期”抗体起反应的HIV gp160表达细胞，可在一种温和的增溶剂，如毛地黄皂苷中溶解。这种裂解物在低温下用葡聚糖凝胶G2000柱进行大小分级分离，含HIV gp160的峰(用RIP测定)将被用于包被聚苯乙烯微量滴定孔，用量为500ng/孔。包被3小时后，加样孔将用BSA“封闭”，并用缓冲液冲洗5次。加样孔或晾干，或在PBS中保持潮湿。将10微升“早期”抗体加入含90微升反应缓冲液(约含1％毛地黄皂苷的PBS)的每个加样孔中。随后的步骤将是典型EIA样式，包括室温下孵育约1小时，用大约1％毛地黄皂苷-缓冲液冲洗3次，以及室温下(20℃)用结合碱性磷酸酶的羊抗人IgG或IgM孵育大约1小时。然后将加样孔冲洗2次，并加入于底物缓冲液中的底物。加入终止缓冲液后，将平板置于ELISA平板读数器上读数。对照包括不加抗体的、加入正常血清的、以及加入来自EIA/WB阳性血清的HIV抗体的加样孔。
如果在该试验中早期抗体的读数显著高于正常对照血清(例如，在4倍或4倍以上稀释度)，那么这一特定样式将被用于商品化实施方案。预想对这一试验可进行更细致的改进。此外，更为纯的gp160制剂将应用本领域熟练的技术人员熟知的亲和纯化技术制备，并作为靶抗原用于根据本发明的早期抗HIV抗体的检测中。
如果毛地黄皂苷溶解的材料没有充分附着在塑料平板上，那么可以应用其它几种方法。一种方法是，首先用一种抗gp41或抗gp160抗体包被平板，该抗体在毛地黄皂苷存在时会将gp160固定到平板上。这种夹心EIA在包被过程中也会纯化抗原。其它几种单克隆抗体也可用于将抗体首次包被到平板上，例如gp160的单克隆抗体F105，或者gp41的单克隆抗体chessie8。
该实施例描述了用于减少本发明的EIA中背景结合的技术和制剂。EIA在人类抗体检测中的一个常见问题是，与正常对照血清较高程度的背景结合。一般来说，在此描述的HIV抗体测试中，为了正常血清结果阴性，需稀释至1∶100以上。以下制剂将作为封闭剂进行测试，或单独使用或联合使用牛血清白蛋白PVPSuperblock如果仍然观察到与对照血清的高度结合，那么将应用不可能被人类免疫系统识别的其它蛋白质，如马白蛋白。在本方法的不同实施方案中，将选择和应用背景结合最少的封闭剂。Superblock是一种用于封闭EIA平板的商品化封闭剂(Pierce Chemical)。干燥平板需首先干燥以评估是否保持了与早期抗体的反应性。平板在干燥前也可用蔗糖溶液处理，以进一步促进抗原构象完整性的保持。这一技术已被应用于其它EIA，以保持蛋白质的部分水化。此外还可应用甘油或明胶，在部分干燥时它们可保留抗原，然后经重新水化，作为进行试验的第一步它们能被溶解以进行试验。作为另外一个选择，平板加样孔可保持潮湿，密封平板以防止渗漏，作为可方便应用的EIA工具。
EIA将用于检测一批冻存血清，这些血清是在许多年中从HIV感染个体采集的，他们或是经现行试验测定为血清阳性的，或是现行试验中没有阳性结果的早期感染个体。对未感染对照血清也进行检测以作为对照。所有这些将在未稀释的状态下测试，或者在新的EIA中以不同的稀释度测试，以便确定测试血清的最佳条件。实施例8-其它GP160表达细胞系的建立该实施例概述的方法将用于表达重组HIV抗原的细胞系如GEM细胞系的建立。这些细胞系具有早期抗HIV抗体反应性。典型的重组HIV抗原包括HIV213株、AC-1株和C株的重组HIV抗原。被这些重组抗原感染的细胞系将表达一种具有早期抗HIV抗体检测活性的抗原，与在此建立并描述的HIV感染细胞系相似。
通过应用位于编码病毒包膜蛋白或编码其中的抗原活性片段之核酸序列侧翼的已知限制位点，可获得人类免疫缺陷病毒的限制性片段。例如，来自特定的HIV分离株(如在此描述的HIVAC-1和HIVC)的SalI-XhoI片段，可在适当的质粒如pUC19质粒中克隆。根据本领域熟练的技术人员所熟知的技术，限制酶切作图也可用来证实该片段编码一种HIV包膜蛋白。然后，可将获得的片段连接到一种合适载体如pLNSX逆转录病毒载体的克隆位点上(见图5)。然后，逆转录病毒载体将被用于转染合适的哺乳动物细胞系，如水貂MiIu细胞(ATCC CCL64)或任何其它被认为合适的细胞系。然后可应用一种期望的选择机制，如抗生素抗性，来选择细胞，(例如，每ml 400-800微克G418K，1-2周)。然后可在Terasaki平板中通过限制稀释克隆筛选过程中的存活细胞。然后，可通过应用单克隆抗体F105(Medarex，Anandale，NewJersey)的活细胞免疫荧光(见实施例1)，筛选表达重组HIV gp160的单个克隆。根据流式细胞仪的荧光强度测量，表达最大数量重组抗原的克隆可进一步扩增，细胞库存活冷冻。
在此描述的重组HIV抗原在早期抗HIV抗体的检测中是有用的，这种抗原具有HIV抗原的构象性表位，特别是HIV包膜抗原如gp160，其构象性表位得以保持，并且与早期抗HIV抗体起反应。应用感染了携带gp160基因片段的重组逆转录病毒穿梭载体、被毛地黄皂苷溶解的完整活细胞，显示HIV gp160抗原的非活细胞制剂保持了与早期抗HIV抗体的免疫反应性。在某些实施方案中，感染了携带编码gp160核酸片段的逆转录病毒的完整细胞可在1％的毛地黄皂苷中溶解，并用于包被EIA平板。来自HIV感染细胞分离株，如HIV213的gp160表达产物也可用于所述方法和试验中。实施例9-重组HIV蛋白质表达细胞作为抗原与以活HIV感染细胞为基础的抗体测试之比较试验在该研究中，采集了41例纵向研究的高危个体的血清。对每份血清进行了测试，测试方法为活细胞免疫荧光中应用表达重组HIV抗原的CEM细胞，以及三种商品化测试HIV抗体的EIAAbbottLaboratories，Electronucleonics，以及Organon-Technica。试验步骤按照生产商的推荐进行。识别出应用CEM细胞系发现为阳性、但三种商品化试验为阴性的个体。
在采集血清的同时，从每例病人获取PBL标本，用PCR分析其中HIV的DNA，并对标本进行培养以及与正常供者的纯化CD4淋巴细胞共同培养。后者是一种非常敏感的分离HIV的方法，因为它使HIV扩增。因此，在我们的试验中仅为阳性的受试者将接受一种确证试验，在采集血清的同时直接检测淋巴细胞中的HIV。
来自这组41例受试者的资料表明，重组抗原表达细胞用于检测早期抗HIV抗体，其作用与HIV感染细胞相似。
表10利用表达重组gp160的CEM细胞通过活细胞免疫荧光评估早期抗HIV抗体的存在血清 CEM CEM-213env CEM-AClenv CEM-Cenv对照(1)A-*- - -B- - - -C- - - -D- - - -E- - - -F- - - -HIV-感染的ElA+/WB+HR-39 - 1200,6401280,2500 640,640HR-49 - 1280,1280 1280,2400 640,1000HR-51 - 320,320 640,640 100,120HR-53 - 320,320 640,640 160,320R-410 - 640,10001280,1280 640,640HIV-感染的高危人群EIA-/WB(2)TL-1 - 60,80 100,80 40,40HR-2 - 40,50 20,40 30,20HR-9 - 60,80 20,20 20,20HR-22 - 40,40 60,80 10,20HR-48 - 50,40 -,- 10,10HR-55 - 100,120 20,40 20,20HR-56 - 80,100 40,50 40,40
*(-)＝血清稀释度为1∶10或更高时无反应性。资料以使50％细胞染色的血清稀释度的倒数表示。
(1)未感染低危受试者，应用急性HIV感染细胞的活细胞免疫荧光测定其血清为“早期”抗HIV抗体阴性(2)应用急性HIV感染细胞的活细胞免疫荧光测定血清为“早期”抗HIV抗体阳性。实施例10-活细胞或固定细胞的EIA该实施例显示了本发明中试验平板的一种特别设想的实施方案，即应用表达所需HIV包膜抗原的活重组细胞为靶抗原。这些重组活细胞可通过各种不同的机制附着到平板加样孔上，例如通过应用必须附着在基质上才能生长的细胞系。
这些平板的特定实施方案包括活细胞-或固定细胞EIA，其中在加样孔中加入表达HIV株213、AC-1和C包膜蛋白的活细胞。这些活细胞会附着到塑料平板上。附着在基质上生长的细胞系包括水貂肺成纤维细胞(MiLu)，以及其它来自人或不同动物种的成纤维细胞或上皮细胞系。这些细胞将感染兼嗜性MuLV包装逆转录病毒，其中含有上述一种或多种病毒株之结合的包膜基因。然后选择细胞的G418抗性。然后所选细胞将被单个克隆，经活细胞免疫荧光评估，表达最高水平包膜蛋白的克隆将被用于EIA。为了进行EIA，将细胞加入96孔平底微量滴定板中，使细胞附着和连片生长。
平板可与活细胞一起应用，或者细胞可用温和的固定剂(如0.5％戊二醛)固定，这些固定剂不会破坏检测早期抗HIV抗体所必需的gp160构象性表位。不同稀释度的测试血清以及已知阳性和阴性的对照血清将被加入每个加样孔中，使之孵育1-2小时，然后将其去除。然后用PBS将加样孔冲洗3-5次。然后将结合了一种酶(如碱性磷酸酶)的第二种抗血清在每个孔中孵育1-2小时，随后用PBS冲洗3次。然后将底物加入加样孔中，直至检测到可见的颜色。然后应用本领域熟练的技术人员熟知的技术在EIA平板读数器上对平板进行读数。
****根据本公开内容，无需过多实验即可对在此公开和申请专利的所有组合物与方法进行制备和实施。尽管按照优选的实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，但显然，对本领域熟练的技术人员来说，对在此描述的组合物、方法以及方法的步骤或步骤的顺序可进行变动，而不会背离本发明的思想、精神和范围。更具体而言，某些在化学上和生理上相关的制剂可代替在此描述的制剂，而会取得相同或相似的结果，这对其是显而易见的。所有本领域这些熟练的技术人员显而易见的相似替代物和改造，均被认为不超出本发明的精神、范围和思想，正如所附权利要求书所限定的那样。
参考文献以下参考文献提供的典型的方法或其它细节对在此陈述的细节有所补充，特在引入作为参考。
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权利要求
1.一种重组蛋白质，它包括一种能够免疫结合早期抗HIV抗体的重组人类免疫缺陷病毒包膜蛋白，该蛋白质被进一步限定为，经SDS/PAGE测定其分子量大约为160,000道尔顿。
2.权利要求1的重组蛋白质被进一步限定为通过如下方法制备制备一种限制性片段，该限制性片段包括编码一种包膜蛋白gp160的人类免疫缺陷病毒核酸；将该限制性片段插入能够在真核细胞中表达的一种载体上；用该重组载体转染真核细胞；以及收集能够免疫结合早期抗HIV抗体的重组蛋白质。
3.权利要求2的重组蛋白质，其中真核细胞在哺乳动物细胞系，如CEM或Mu-l-Lu。
4.权利要求3的重组蛋白质，其中真核哺乳动物细胞是CEM或Mu-l-Lu。
5.权利要求2的重组蛋白质，其中重组载体是pLNSX-env。
6.一种包括一个核酸分子的重组载体，该核酸分子具有编码能够结合早期抗人类免疫缺陷病毒抗体的人类免疫缺陷病毒gp160蛋白质的序列。
7.一种哺乳动物细胞，其包括权利要求6的重组载体，该重组载体包括一个编码一种gp160 HIV蛋白质的序列。
8.权利要求7的哺乳动物细胞，其中编码gp160 HIV蛋白质的序列是一个来自HIV213、HIVAC-1、HIVc或其组合的SalI-XhoI限制性片段。
9.权利要求7的哺乳动物细胞被进一步限定为CEM或Mu-l-Lu。
10.权利要求87的哺乳动物细胞，其中编码gp160 HIV蛋白质的序列是一个来自HIV213(ATCC VR2247)的SalI-XhoI限制性片段。
11.一个检测早期婴儿人类免疫缺陷病毒感染的筛查方法，其包括使一种取自婴儿的生物标本接触一种非变性的人类免疫缺陷病毒抗原，以形成孵育混合物；监测孵育混合物中与人类免疫缺陷病毒形成的免疫复合物的存在；以及鉴定与重组抗体免疫结合的IgA或IgM抗HIV抗体的存在，其中，非变性人类免疫缺陷病毒抗原-IgM或IgA抗体免疫复合物形成的存在，表明婴儿被人类免疫缺陷病毒感染。
12.权利要求11的方法，其中人类免疫缺陷病毒抗原是一种获自HIV213(ATCC VR2247)的重组人类免疫缺陷病毒gp160包膜蛋白。
13.一种筛查取自特发性慢性淋巴细胞减少症病人的生物标本中HIV的方法，它包括从患有或被怀疑患有特发性慢性淋巴细胞减少症的病人身上获取一种生物标本；使该标本接触一种非变性的人类免疫缺陷病毒抗原，其条件应使得标本中的任何抗体与重组蛋白质之间形成免疫复合物，以提供一种孵育混合物；以及用标记的人类免疫缺陷病毒抗原，通过抗-抗体第二反应物，鉴别孵育混合物中形成的免疫复合物的存在，其中，标本中与抗体形成的免疫复合物的存在，提供了对特发性慢性淋巴细胞减少症中HIV的筛查。
14.一种试验平板，它包括大量的微量滴定孔，微量滴定孔包括一种基本上非变性的和纯化的、能够结合早期抗人类免疫缺陷病毒抗体的人类免疫缺陷病毒包膜蛋白。
15.权利要求14的试验平板，其中微量滴定孔由基本上非变性的和纯化的重组人类免疫缺陷病毒包膜蛋白包被。
16.权利要求14的试验平板，其中基本上非变性的和纯化的重组人类免疫缺陷病毒包膜蛋白被进一步限定为一种重组gp160包膜蛋白。
17.一种筛查标本中早期抗人类免疫缺陷病毒的试剂盒，它包括一种如权利要求14所限定的试验平板；一种容器，它包括对抗HIV早期抗体有结合亲和力的标记第二抗体。
18.一种能够免疫结合早期抗HIV抗体的靶抗原制剂，它包括一种获自纯化真核细胞裂解物的重组HIV包膜蛋白gp160，该真核细胞裂解物包括一种来自HIV感染的哺乳动物细胞的裂解物，该细胞是被HIVAC-1感染的，一种被HIVc感染的哺乳动物细胞以及一种被HIV213感染的哺乳动物细胞。
19.权利要求18的靶抗原，其中哺乳动物细胞裂解物的制备方法是，用大约0.1％至大约10％的毛地黄皂苷溶解表达HIV的哺乳动物细胞。
20.权利要求18靶抗原，其中哺乳动物细胞是CEM细胞。
21.权利要求18的靶抗原，其中哺乳动物细胞是Mu-l-Lu细胞。
22.一种用于检测早期抗HIV抗体的试验平板，它包括附着于试验平板的细胞，其表达来自一个选自HIV213、HIVAC-1和HIVc的病毒分离株的重组gp160。
23.权利要求22的试验平板，其中细胞是Mu-l-Lu细胞。
全文摘要
能够免疫识别早期抗HIV抗体之存在的重组人类免疫缺陷病毒抗原在许多细胞系中稳定表达。作为一种非危害性工具在人类免疫缺陷病毒接触/感染的检测,以及在特发性慢性淋巴细胞减少症(ICL)的筛查方法中,这些抗原具有数种重要的临床应用。这些技术较现行的基于免疫学和基于PCR的检测方法有改进,因为它们可在这些常规试验确定为阴性的标本中检测出感染/接触,这些常规试验不能检测与HIV构象性表位起反应的抗HIV gp160抗体。该发明特别适用于在婴儿中人类免疫缺陷病毒接触/感染的检测。所述方法的早期检测是通过所述重组构象完整的人类免疫缺陷病毒保留的免疫反应性而实现的,这种人类免疫缺陷病毒能够检测一类“早期”抗人类免疫缺陷病毒抗体,后者在以往用标准的Western印迹或ELISA方法是检测不出的。人类免疫缺陷病毒gpl60包膜抗原包括这些改进的筛查方法中用人类临床标本检测的特异性重组抗原中的一种。
文档编号A61P31/18GK1251614SQ97199745
公开日2000年4月26日 申请日期1997年10月9日 优先权日1996年10月9日
发明者M·W·克洛德, K·M·拉姆赛 申请人:德克萨斯州立大学董事会