专利名称:缓激肽拮抗剂和它们的应用的制作方法
本发明是关于生物学上有效的可作为拮抗缓激肽生物活性的新肽，它们的药学上可以接受的盐以及它们作为治疗剂的应用。
自从Boissonnas等(Experientia 16∶326，1960)叙述和合成了对哺乳动物血管具有很强舒张作用的肽-缓激肽以来25年中合成了数百个有关顺序的肽类似物，并进行了生物系统评价[(Schroeder，in Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.25，(Springer Verlag)pp 324～350，1970)(Stewart，Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.25，(Supplement)，(Springer Verlag)pp 227～272，1979]。上述研究的目的是研究缓激肽的各种生理和药理作用。
缓激肽与在生理学上有关的重要肽-卡里定(Lys缓激肽)和，Met-Lys-缓激肽可以收缩平滑肌(例如引起腹泻、炎性肠疾病和气喘)，降低血压，作为引起变应性炎症、关节炎和气喘的媒介，参与体内凝血反应和间接补体反应，作为引起鼻炎(病毒的，变应性的和非变应性的)的媒介，并且在病理条件下(如脓毒性休克、急性胰腺炎、遗传的血管神经性水肿、胃切除术后综合症、类癌瘤综合症、过敏性休克、精子游动能力降低以及某些其他疾病)会产生过剩。从血浆中产生的缓激肽可引起病理部位的疼痛，并且缓激肽过剩会直接加剧疼痛，或者通过能产生前列腺素和白三烯(leukotrienes)的花生皿烯酸通路激活的缓激肽的刺激而引起疼痛。在Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.25，(Springer-Verlag 1970和25 Supplement，1979可以找到叙述缓激肽及有关肽上述作用的参考文献。
缓激肽产生于肠道的炎症反应，使平滑肌收缩以及肠液和离子分泌。Manning等在Nature(229256～259，1982)中证明，在肠粘膜里和肠平滑肌中存在着特异性的缓激肽受体，并且很低温度的缓激肽就可影响肠液和离子的分泌。
已经研究了在绞痛时产生的缓激肽和伴生的疼痛的关系，并由Kimura等在American Heart Journal(85∶635～647，1973)和由Staszewska-Barczak等在Cardiovasculav Research(10∶314-327，1976)中报道。他们认为，缓激肽和前列腺素的联合作用是感觉受体兴奋的固有刺激，这是心肌缺血性疼痛的予兆。
缓激肽和与缓激肽有关的激肽不仅可由动物产生，而且也可以由于刺伤和叮咬而注入。已经知道，昆虫(如大黄蜂和黄蜂)可注入与缓激肽及与缓激肽有关的肽从而引起疼痛，肿胀和炎症。
由于缺少与缓激肽排列顺序有关的有效的竞争性拮抗剂，所以严重地阻碍了对于认识缓激肽作用机制的探索研究，而机制的探索对研究诊断用的方法和研究减轻由于缓激肽的产生和过剩所引起剧烈疼痛的治疗剂是必需的。
已经报导过能拮抗缓激肽的一种或多种生物活性的拮抗剂，这些拮抗剂为非肽、非特异性和非选择性的物质，如各类止痛剂和抗炎剂类化合物，它们通过前列腺素系统而起作用，并且不直接地作用于缓激肽的生物受体(Rocha I Silva and Leme，Med.Exp.8∶287，1963)。例如抗组织胺剂(Gecse等，J，Pharm.Pharmacol.21∶544，1969);缓激肽抗体(Grez等，Eu.J.Pharmacol.29∶35，1974);苯并二氮类衍生物(Leme and Rocha e Silva，Br，J.Pharmacol.25∶50，1865);高分子量环氧乙烷聚合物(Wilkens and back，Arch.Intl.Pharmacodynam.209，305，1974);没食子酸酯类(Posati等，J.Argi.Food Chem.18∶632，1970)和5-羟色胺抑制剂(Gomazkon and Shimkovich，Bull.Exptl.Biol.Med.80∶6，1975)。上述各个化合物或各类化合物中没有一个是缓激肽特异性抑制剂。
有人报道，含有各种氨基酸的庚酯，如含单个碱基氨基酸(即Arg和Lys)的庚酯(Gecse，Adv.Exptl.Bial.Med.70∶5，1976)，二肽Phe-Gly的庚酯(Geese等，Int.Aech.Allergy 41∶174，1971)和缓激肽C-末端肽碎片类似物(即Pro-Phe-Arg)的庚酯(claessom等，Adv.Exptl.Med.Biol.120 B∶691，1979)可作为抗缓激肽物质。用缓激肽试验系统证实，它们可以是弱的局部激动剂/抗拮剂，其作用性质，取决于剂量的大小，但对缓激肽的抑制作用均没特异性。
已有报道，受损的血管组织标本对缺乏C-末端Arg残基的缓激肽类似物有反应，但对缓激肽本身不起反应，并且已将这些脱-Arg-缓激肽的类似物作为缓激肽的非生理活性的抗拮剂。这些抗拮剂没有缓激肽那样的激动作用，并且对于生理上有显著激肽反应的系统也没有任何缓激作用(Regoli and Barabe，Pharmacol.Revs.32∶1，1980)。
有人报道，在Tyr残基的5和/或8位上含有O-甲基醚的几个缓激肽类似物，对于用半乳糖血(galactosemic)处理的大白鼠离体子宫具有激动/抗拮的混合作用，但对正常大白鼠则无此作用。在上述动物中，抗拮作用不能可靠地重复(Stewavt and Woolley，in Hy Potensiv Peptides，Springer Verlay，p.23～33，1966)。
缓激肽分子中的其他变化是在N-末端加入氨基酸，在体内试验中，它可影响缓激肽的酶降解速率。
在全身循环中，缓激肽的半衰期小于30秒(S.H.Ferreira and J.R.Cane，Br.J.Pharmacol.Chemotherap.30∶417，1967)。在麻醉的大白鼠上，在主动脉内(IA)(肺循环分路)和静脉(Ⅳ)内注射后测定激动剂的降压效果，结果表明，在一次通过肺循环后，缓激肽被完全破坏(破坏98～99%)(J.Roblero，J.M.Ryan和J.M.Skewart，Res，Commun.Pathol.Pharmacol.6∶207，1973)。通过将单个碱基(即DArg-，DLys-，Lys-)和二个碱基DLys-Lys-)的氨基酸残基加到缓激肽顺序的N-末端上，可提高缓激肽激动剂在体内对肺激肽酶破坏作用的耐受性。将二肽Lys-Lys加到缓激肽激动剂的N-末端上，可以完全耐受在体内首次通过肺循环的破坏作用Roblero，Ryan和Stewart，Res.comm.p Pathol.Pharmacol.6∶207，1973)。
本发明是关于哺乳动物肽激素～缓激肽顺序(Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg)的变更，它的药学上可以接受的盐，在第7位取代Pro残基，以独特的方式首次得到相关顺序的类似物，该类似物对于缓激肽的生物活性具有特异的竞争性抑制剂的作用。本发明特别是关于在第7位上用D构型的芳香族氨基酸取代L-Pro，该变更可使缓激肽激动剂转变成拮抗剂，并且本发明还包括在第7位变更了的缓激肽拮抗剂中，在其他位置上进行另外的变更，结果提高了拮抗剂的效力，增强对酶降解作用的耐受性和/或提高了具有缓激肽顺序的D-氨基酸的组织特异性。本发明尤其是关于具有通式Ⅰ的肽，A-Arg-B-C-D-W-X-Y-Z-Arg，(0 1 2 3 4 5 6 7 8 9)(位置)其中，A是氢原子或者是D-，L-构型的单个酸性、碱性、中性或芳香族氨基酸残基，如D-Arg、D-Lys或L-Thi，含有酰基类型保护基、芳香族氨基甲酸乙酯类型保护基、烷基类型保护基的N-末端酶保护基，或者A是含有D-或L-构型氨基酸的二肽或多肽，如Lys-Lys、Met-Lys或Gly-Arg-Met-Lys;
B是L-Pro残基，或者是其他D-或L-环状或非环状脂肪族氨基酸残基，如L-羟基脯氨酸，或者是L-芳香族或取代芳香族氨基酸残基;
C是D-或L-Pro残基，或者是D-或L-构型的其他环状、芳香族或取代芳香族氨基酸残基;
D是Gly残基，或者是L-构型的其他脂肪族、芳香族或取代芳香族氨基酸残基，如Ala;
W是L-构型的Phe残基，或者是取代的Phe或其他脂肪族或芳香族氨基酸残基，如Leu，β-2-噻吩基-丙氨酸(Thi)或2-吡啶基-丙氨酸(Pal);
X是L-构型的Ser残基，Gly残基，或者为其他的D-或L-脂肪族或芳香族或取代芳香族氨基酸残基，如PCl-D-Phe或D-Phe;
Y是D-芳香族氨基酸残基，或者是取代的芳香族氨基酸残基，如D-phe、β(2-噻吩基)-DAla(DThi)、β-(2-吡啶基)-DAla(DPal)、β-2-萘基-DAla(DNal)、DHis、D-同-Phe(Dh Phe)、O-甲基-DTyr(DOMT)、D-α-苯基-Gly(D Phy)、DTrp、DTyr或PCl-DPhe(CDF);
Z是L-构型的Phe残基，或者为取代的Phe或其他脂肪族或芳香族氨基酸残基，如Leu、Thi或Pal。
通式Ⅰ较好的化合物中，取代基有下述特定A＝H，B＝Pro或Hy P，C＝Pro或Hy P，D＝Gly，W＝Z＝Phe或Thi，X＝Ser，并且Y＝D-构型的芳香族氨基酸。
通式Ⅰ的肽的盐包括与HCl、TFA、ACOH形成的盐及其他药学上可以接受的盐。
下述表Ⅰ和Ⅱ表明，在缓激肽多肽中的取代基及该取代基的作用。同时也表明，在缓激肽的0，1，2，3，5，7和8位上的氨基酸残基用取代基取代，可以得到更好的缓激肽拮抗剂。
表1缓激肽拮抗剂中的取代基
Thi＝β-(2-噻吩基)丙氨酸Pal＝β-(2-吡啶基)丙氨酸Hyp＝4-羟基脯氨酸Azt＝氮杂环丁烷-2-羧酸Thz＝噻唑烷-2-羧酸Inip＝4-哌啶甲酸OMT＝O-甲基酪氨酸CDF＝对-氯-D-苯基丙氨酸Nal＝β-(2-萘基)丙氨酸CLF＝对-氯-L-苯基丙氨酸PNF＝对-硝基苯基丙氨酸△Pro＝2，3-脱氢脯氨酸表Ⅱ缓激肽拮抗剂中的特征
具有通式Ⅰ的肽及其衍生物的合成，活性及被保护的氨基酸残基的偶合，它们的纯化及测定特性和纯度的分析方法属于肽化学的一般基础知识，如在Houben WeylMethoden der Organische Chemie vol.16，part Ⅰ和Ⅱ(1974)中有关于溶液-相合成的叙述，在Stewart和Yaung(1984)“Solid Phase Peptide Synthesis”中有关于梅里菲尔德(Merrifield)固-相合成方法的论述。熟悉肽合成技术的化学家均能够用标准的溶液方法或者用人工操作的或自动的固相方法合成通式Ⅰ的肽。
用于氨基酸，它们的衍生物和保护基，肽及它们的盐的符号和缩写是在肽化学中普遍使用的(Biochem.T.126∶773，1972)。为方便起见，若干缩写的解释列于表Ⅲ中。除Gly之外，在本说明书中叙述的所有氨基酸残基，除非另有说明，均为L-构型(但在权利要求
书中不是如此)。
下述实例具体说明具有通式Ⅰ的化合物但这些实例并不是对本发明的限制。当涉及固体时，百分比和比例为重量比，涉及液体时，百分比和比例为体积比。
表Ⅲ氨基酸残基的缩写Aib -α-氨基异丁酸Azt -氮杂环丁烷-2-羧酸CDF 对-氯-D-苯基丙氨酸CLF 对-氯-L-苯基丙氨酸hphe -同-苯基丙氨酸Hyp -4-羟基-脯氨酸Inip 4-哌啶甲酸MDy -O-甲基-D-酪氨酸Nal -β-(2-萘基)丙氨酸△Pro -2，3-脱氢脯氨酸Pal -β-(3-吡啶基)-丙氨酸Phg -α-苯基甘氨酸Sar -肌氨酸Thi -β-(2-噻吩基)-丙氨酸Thz -噻唑烷-2-羧酸[所有其它缩写均按国际纯粹化学和应用化学联合会(IUPAC)关于氨基酸残基规定]
实例1制备Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-D Phe-Arg(DPhe-BK)将6.4克叔丁氧基羰基-(g-对甲苯磺酰基)-Arg[BOC-Arg(TOS)](15毫摩尔)和183毫克N，N-二甲氨基吡啶(1.5毫摩尔)的混合物溶于20毫升二甲基甲酰胺(DMF)和125毫升二氯甲烷(DCM)的混合液中，于室温下加入15克羟甲基-聚苯乙烯-联乙烯苯(1%交联度，每克树脂含0.74毫摩尔游离羟基)，再加入60毫升0.25M二环己基碳二亚胺(DCC)在DCM中的溶液。悬浮液于室温搅拌过夜，过滤，树脂用60毫升DCM洗涤三次，再用60毫升甲醇(Me OH)洗涤三次，并在120毫升DCM中再溶胀。在上述树脂上进行另一部分BOC-Arg(TOS)的偶合，树脂经过滤和洗涤后再在120毫升DCM中再溶胀，并加入2.1毫升苯甲酰氯和1.5毫升三乙胺(Et3N)，悬浮液于室温搅拌30分钟后，过滤树脂，依次用DCM和Me OH洗涤三次，每次60毫升，再用Me OH洗涤三次，每次60毫升，最后用DCM洗涤三次，每次60毫升。树脂经空气干燥至恒重，得到18.5克BOC-Arg(TOS)-羟甲基树脂，每克树脂实际氨基酸Arg含量为0.272毫摩尔，它是氨基酸树脂样品在6N盐酸/丙酸中于130℃水解4小时后，经氨基酸定量分析而测定的。
将1.5克含总量为0.4毫摩尔Arg的树脂置于自动固相合成装置(Beckman model 990)的反应容器内，按如下方法进行一轮加成循环，偶合BOC-phe;
程序A.规范的DCC偶合树脂用DCM洗涤三次，每次20毫升，然后用20毫升1∶3三氟乙酸(TFA)在DCM(含0.1%吲哚)中的溶液平衡1.5分钟，平衡再重复30分钟。树脂用DCM洗涤六次，每次20毫升，随后用10%(Et3N)在DCM中的溶液中和11/2分钟，再重复中和一次。树脂用20毫升DCM洗涤六次，然后用1.0毫摩尔BOC-phe在DCM中的溶液平衡11/2分钟。加入4毫升0.25N DCC在DCM中的溶液，混合物搅拌2小时，树脂用DCM洗涤三次，每次20毫升。
按程序B进行第二轮加成循环程序B反相加成重复程序A的方法，直到中和与洗涤。然后，加入1.0毫摩尔DCC在4毫升DCM中的溶液，将树脂与溶液混合11/2分钟。再将1.0毫摩尔BOC-D-Phe在12毫升DCM中的溶液加入，使树脂和溶液混合2小时。树脂用DCM洗涤六次，每次20毫升。
按下述顺序脱去N-末端保护基程序C末端脱去保护重复程序A的方法直到用三乙胺中和。然后，树脂用乙醇洗涤六次，每次20毫升，肽-树脂经空气干燥，得1.66克DPhe-Phe-Arg-树脂的三氟醋酸盐。
用410毫克DPhe-Phe-Arg-树脂TFA盐继续合成，按程序D加成下面的残基。
程序D.去偶合肽-树脂盐首先用DCM洗涤三次，每次20毫升，然后用10%Et NDCM中和1.5分钟。重复中和步骤，肽-树脂-盐用DCM洗涤六次，每次20毫升。肽-树脂用1.0毫摩尔Boc-Ser(OBzl)的DMF溶液平衡1.5分钟。加入4毫升0.25N DCC在DCM中的溶液并与树脂一起混合2小时。产物用DCM洗涤三次。
按列出的程序，可将下述氨基酸衍生物加到不断增长的肽链上BOC-Phe(A)，BOC-Gly(A)，BOC-Pro(A)，BOC-Pro(A)，接着偶合BOC-Pro(D)，BOC-Arg(TOS)(溶于2毫升DMF+9毫升DCM)(A)，再进行程序C，得530毫克保护的九肽树脂，为TFA盐。
在-70℃将510毫克上述肽-树脂悬浮在含1毫升苯甲醚的10毫升液态无水HF中，并于0℃搅拌45分钟。真空除去HF和苯甲醚(1小时水泵，1小时真空泵)，肽与树脂用乙醚(Et2O)洗涤三次，每次20毫升，用冰醋酸萃取三次，每次6毫升，使肽萃取到冰醋酸中。醋酸溶液冷冻干燥，得185毫克脱去保护基的粗制肽。
应用溶剂系统n Bu OH1% TFA(1∶1)，用逆流分配法(CCD)在Post CCD装置中进行上行相转移)将肽纯化。用定量的口(Sakaguchi)试剂进行测定，收集含有主要肽峰的相应管内容物，减压蒸去溶剂，残余物溶于冰醋酸(ACOH)并冷冻干燥，得140毫克肽，逆流分配(CCD)系数K为5.7。在溶剂系统n Bu OH∶ACOH∶H2O(4∶1∶5)中重复进行逆流分配，按上述方法进行测定和检查，得73毫克Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Y-Phe-Arg，为TFA盐(K＝0.2)。在默克(Merck)厂予制涂硅胶的玻璃板上进行涂层层析(TLC)，以n Bu OH∶ACOH∶H2O(8∶3∶4)和Et OAC∶吡啶∶ACOH∶H2O(5∶5∶1∶3)为溶剂系统，以氯-联甲苯胺进行肽鉴别喷雾显影，纯肽的Rf(834)为0.17和Rf(5513)为0.36。在酸水解(在氮气下，于110℃，在含2滴2-巯基乙醇和40微升苯酚的2毫升6N HCl中，于封闭的玻璃小管中水解17小时)后，进行定量的氨基酸分析，氨基酸的比例如下Arg(2.12);Pro(1.93);Gly(1.01);Phe(2.98);Ser(0.96)。
实例2制备Arg-Pyo-Pro-Gly-Phe-Ser-DThi-Phe-Arg(DThi-BK)
按实例1的方法制备该肽，但用BOC-β-2-噻吩基-D-Ala(BOC-DThi)代替BOC-DPhe，K(415)＝0.24;Arg(2.02);Pro(2.18);Gly(1.00);Phe(1.99);Ser(0.89)，Thi(0.99)。
实例3制备Arg-Pyo-Pro-Gly-Phe-Ser-DPal-Phe-Arg(DPal-BK)按实例1的方法制备该肽，但用BOC-2-吡啶基-DAla(BOC-D-Pal)代替BOC-DPhe，K(1∶1)＝0.22;Arg(2.03);Pro(2.01);Gly(1.02);Phe(1.99);Pal(1.02)。
实例4制备Arg-Pyo-Pro-Gly-Phe-DPhe-DPhe-Phe-Arg6.7(DPhe-BK)按实例1的方法制备该肽，但用BOC-DPhe代替BOC-Ser(Bzl)，K(415)＝1.3;Arg(2.12);Pro(1.94);Gly(1.00);Phe(3.94)。
实例5制备Arg-Pyo-Pro-Gly-Phe-DPhe-CDF-Phe-Arg6 7(D Phe CDF-BK)按实例1的方法制备该肽，但用BOC-DPhe代替BOC-Ser(Bzl)，用BOC-PCl-D-Phe(BOC-CDF)代替BOC-DPhe，K(415)＝0.82;Arg(1.98);Pro(1.93);Gly(0.97);Phe(3.10)，CDF(1.02)。
实例6制备Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg5.8 7(Thi DPhi-BK)按实例1的方法制备该肽，但在二轮加成循环中，应用BOC-β-2-噻吩基-Ala(BOC-Thi)，其中BOC-Phe用于实例1，K(415)＝0.21;Arg(1.98);Pro(1.94);Gly(1.04);Phe(1.04)，Ser(0.96)，Thi(2.05)。
实例7制备Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DThi-Thi-Arg5.8 7(Thi DThi-BK)按照实例6的方法制备该肽，但用BOC-DThi代替BOC-DPhe，K(415)＝0.18;Arg(2.07);Pro(2.08);Gly(1.00);Ser(0.93)，Thi(2.88)。
实例8制备Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DPal-Thi-Arg5.8 7(Thi DPal-BK)按照实例6的方法制备该肽，但用BOC-DPal代替BOC-DPhe，K(1∶1)＝0.15;Arg(2.00);Pro(2.20);Gly(1.09);Ser(0.89)，Thi(1.92)，Pal(0.89)。
实例9制备Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DPhe-CDF-Thi-Arg5.8 6 7(Thi DPhe CDF-BK)按实例5的方法制备该肽，但在二轮加成循环中应用BOC-Thi代替BOC-Phe，K(415)＝0.75;Arg(1.89);Pro(2.08);Gly(1.06);Phe(1.02)，Thi(1.88)，CDF(1.07)。
实例10制备Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg0 7(DArg DPhe BK)按实例1的方法制备该肽，但应用BOC-(TOS)-DArg，按程序A进行一次另外的加成循环，接着按程序C进行末端脱保护，K(1∶1)＝3.55;Arg(2.89);Pro(2.07);Gly(1.02);Phe(3.05)，Ser(0.98)。
实例11制备DArg-Arg-Pro-DPro-Gly-Phe-Ser-DPhe-0 3 7Phe-Arg(DArg Pro DPhe-BK)按实例10的方法制备该肽，但在第一次加成BOC-Pro中，应用BOC-DPro代替BOC-Pro，K(415)＝0.15;Arg(3.12);Pro(1.90);Gly(1.05);Phe(3.02)，Ser(0.92)。
实例12制备Arg-Pro-DPro-Gly-Thi-DPhe-CDF-Thi-3 5.8 6 7Arg(DPro Thi DPhe CDF-BK)按实例9的方法制备该肽，但在第一次加成BOC-Pro中，应用BOC-DPro代替BOC-Pro，K(415)＝0.18;Arg(2.00);Pro(1.98);Gly(1.04);Phe(0.99)，Thi(1.89)，PCF(1.11)。
实例13制备Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DPhe-7Phe-Arg(Lys-Lys-DPhe-BK)按实例1的方法制备该肽，但用BOC-(e-Clz)Lys进行二轮另外的加成循环，开始用程序D，然后用程序A，接着用程序C，K(1∶1)＝0.52;Arg(2.04);Pro(1.99);Gly(0.96);Phe(3.00)，Ser(0.96)，Lys(2.01)。
实例14制备Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-5.8 7Thi-Arg(Lys-Lys-Thi DPhe-BK)按实例13的方法制备该肽，但在二轮加成BOC-Phe的循环中，用BOC-Thi代替BOC-Phe，K(1∶1)＝0.33;Arg(1.98);Pro(1.97);Gly(1.01);Phe(1.03)，Ser(0.97)，Thi(1.96)，Lys(2.08)。
实例15制备DArg-Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi0 5.8 7Arg(DArg Thi DPhe-BK)按实例6的方法制备该肽，但首先按程序D，用BOC-(TOS)DArg进行一轮另外的加成循环，然后按程序C进行，K(1∶1)＝2.33;Arg(3.00);Pro(1.99);Gly(0.96);Phe(0.99)，Ser(0.95)，Thi(2.11)。
实例16制备DArg-Arg-Pro-DPro-Gly-Thi-Ser-DPhe-T0 3 5.8 7hi-Arg(DArg DPro Thi DPhe-BK)按实例15的方法制备该肽，但在第一次加成BOC-DPro代替BOC-Pro，＝0.22;Arg(2.10);Pro(1.96);Gly(1.05);Phe(0.98)，Ser(0.94)，Thi(1.96)。
实例17制备Lys-Lys-Arg-Pro-Hy P-Gly-Phe-Ser-DPhe3 7-Phe-Arg(Lys-Lys-Hy P-DPhe-BK)按实例13的方法制备该肽，但在第一次加成BOC-Pro中，用BOC-(4-羟基)-Pro-(BOC-Hy P)代替BOC-Pro，K(1∶1)＝0.35;Arg(2.00);Pro(1.03);Gly(1.00);Phe(3.08)，Ser(0.94)，Lys(1.95)，Hyp(1.01)。
实例18制备Arg-Hyp-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(2 5.8 7Hyp Thi DPhe-BK)按实例6的方法制备该肽，但在第二次加成BOC-Pro中，用BOCHyp代替BOC-Pro，用程序D再次偶合，K(1∶1)＝2.45;Arg(2.03);Pro(0.98);Gly(1.06);Phe(1.05)，Ser(0.95)，Thi(1.97)，Hyp(0.95)。
实例19制备Lys-Lys-Arg-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-2 5.8 7Arg(Lys-Lys-Hyp Thi DPhe-BK)按实例18的方法制备该肽，但用BOC-(e-Clz)Lys进行二轮另外的加成循环，开始用程序D，然后用程序A，接着用程序C，K(1∶1)＝0.27;Arg(2.07);Pro(0.92);Gly(0.99);Phe(1.03)，Ser(0.93)，Thi(1.92)，Lys(2.06)，Hyp(1.10)。
实例20制备Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(3 5.8 7Hyp Thi DPhe-BK)按实例6的方法制备该肽，但在第一次加成BOC-Pro中，应用BOC-Hyp代替BOC-Pro，K(1∶1)＝2.23;Arg(2.08);Pro(0.98);Gly(1.04);Phe(1.01),Ser(0.99),Thi(1.95),Hyp(0.94)。
实例21制备DArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D Phe-Thi0 3 5.8 7Arg(D Arg-Hyp Thi D Phe-BK)按实例20的方法制备该肽，应用BOC－(TOS)D Arg进行一轮另外的加成循环，首先按程序D，接着用程序C,K(11)＝0.18;Arg(3.01);Pro(1.02);Gly(0.98);Phe(1.02),Ser(0.92),Thi(2.07),Hyp(0.97)。
实例22制备Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-Ser-Dphe-Thi-Arg(H2.3 5.8 7yp Thi Dphe-BK)按实施6的方法制备该肽，但在其中应用BOC－Pro,K(1:1)=1.56;Arg(2.04),Gly(1.06),Phe(1.02),Ser(1.01),Thi(1.94),Hyp(1.93)。
实例23制备Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-Dphe-CDF-Thi-Arg2.3 5.8 0 7(Hyp Thi Dphe CDF-BK)按实例9的方法制备该肽，但在应用BOC－Pro的上述循环中，用Boc-Hyp代替Boc-Pro,K(415)=0.89;Arg(2.06),Gly(1.00),Phe(1.03),PCF(1.05),Thi(1.92),Hyp(1.93)。
实例24制备Arg-Pro-Pro-Gly-Leu-Gly-Dphe-Leu-Arg(G6 5.8 7ly leu Dphe-BK)按实例1的方法制备该肽，但在实用Boc-Phe的上述循环中，用Boc-Leu代替Boc-Phe,并且当实例1中应用了BOC-(OBZI)Ser时，则应用Boc-Gly来代替Boc-(OBZI)Ser,K(415)=0.30;Arg(2.04),Pro(2.05)Gly(1.98),Phe(0.98),Leu(1.95)。
对于具有类似取代基的肽，可按上述相同的方法制备，下述实例不是对本发明限制725.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DNal-Phe-Arg(NDal-BK):k(415)=0.37;Arg(2.09);Pro(2.02),Gly(0.98),Phe(2.06),Ser(0.96),Nal(0.95).
726.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-MDY-Phe-Arg(MDY-BK):k(1:1)=4.88;Arg(2.10),Pro(1.91),Gly(0.96),Phe(2.08),Ser(0.94),MDY(1.04).
727.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DPhg-Phe-Arg(DPhg-BK):k(1:1)=3.55;Arg(2.01),Pro(1.90),Gly(1.03),Phe(2.07),Ser(0.99),Phg(0.98).
728.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DHis-Phe-Arg(DHis-BK):k(1:1)=0.30;Arg(2.04),Pro(2.09),Gly(0.94),Phe(2.00),Ser(1.00),His(0.93).
729.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DTrp-Phe-Arg(DTrp-BK):k(415)=0.30;Arg(2.04),Pro(1.95),Gly(1.02),Phe(2.05),Ser(0.95),Trp(0.98),730.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DTyr-Phe-Arg(DTyr-BK):k(1:1)=2.70;Arg(1.94),Pro(1.88)Gly(1.04),Phe(2.10),
Ser(0.97)，Tyr(1.08).
731.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DhPhe-Phe-Arg(DhPhe-BK)k(415)＝0.37;Arg(1.99)，Pro(1.94)，Gly(0.97)，Phe(2.02)，Ser(0.88)，hPhe(1.20).
6 732.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-DPhe-DThi-Phe-Arg(DPhe DThi-BK)k(415)＝0.59;Arg(2.14)，Pro(1.87)，Gly(1.00)，Phe(3.01)，Thi(0.98).
6，733.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-DThi-DThi-Phe-Arg(DThi -BK)k(415)＝0.54;Arg(2.04)，Pro(2.00)，Gly(1.01)，Phe(2.04)，Thi(1.91).
6 734.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-DPhe-DNal-Phe-Arg(DPhe DNal-BK)k(415)＝1.04;Arg(2.02)，Pro(2.04)，Gly(1.01)，Phe(2.94)，Nal(0.99).
6 735.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-DPhe-MDY-Phe-Arg(DPhe MDY-BK)k(415)＝0.59;Arg(2.11)，Pro(1.90)，Gly(0.97)，Phe(3.02)，MDY(1.01).
6 736.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-DPhe-DPal-Phe-Arg(DPhe DPal-BK)k(415)＝0.16;Arg(1.86)，Pro(2.12)，Gly(1.07)，Phe(2.90)，Pal(1.05).
6 737.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Gly-DVal-Phe-Arg(Gly DVal-BK)k(415)＝0.20;Arg(2.08)，Pro(2.00)，Gly(1.96)，Phe(1.98)，Val(0.98).
2 738.Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg(Hyp DPhe-BK)k(1∶1)＝3.76;Arg(2.00)，Pro(0.93)，Gly(1.02)，Phe(3.16)，Ser(0.94)，Hyp(0.94).
3 739.Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg(Hyp DPhe-BK)k(1∶1)＝3.35;Arg(1.96)，Pro(0.97)，Gly(1.01)，Phe(3.10)，Ser(0.94)，Hyp(1.02).
2，3 740.Arg-Hyp-Hyp-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg(Hyp DPhe-BK)k(1∶1)＝2.33;Arg(2.03)，Gly(1.02)，Phe(3.10)，Ser(0.94)，Hyp(1.91).
5，8 6，741.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DPhe-DPhe-Thi-Arg(Thi DPhe - BK).
5，8 6，742.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DThi-DThi-Thi-Arg(Thi DThi - BK)k(415)＝0.37;Arg(2.08)，Pro(2.08)，Gly(0.99)，Thi(3.86).
43.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DThi-DPal-Thi-Arg5，8 6 7(Thi DThi DPal-BK)∶k(1∶1)＝0.70;Arg(1.93)，Pro(2.11)，Gly(1.08)，Thi(2.86)，Pal(1.02).
44.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DThi-DNal-Thi-Arg5，8 6 7(Thi DThi DNal-BK)k(415)＝0.59;Arg(2.19)，Pro(2.08)，Gly(1.00)，Nal(0.93)，Thi(2.88).
5，8 6 745.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DThi-CDF-Thi-Arg(Thi DThi CDF-BK)k(415)＝0.54;Arg(2.16)，Pro(1.97)，Gly(1.00)，
PCF(1.06)，Thi(2.81).
46.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DPhe-DAla-Thi-Arg5，8 6 7(Thi DPhe DAla-BK)k(415)＝0.32;Arg(2.06)，Pro(1.89)，Gly(0.97)，Phe(1.02)，Ala(0.96)，Thi(2.12).
5，8 6 747.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-CDF-DAla-Thi-Arg(Thi CDF DAla-BK)∶k(415)＝0.39;Arg(1.96)，Pro(1.93)，Gly(1.00)，Ala(0.99)，Thi(2.05)，PCF(1.08).
0 5，848.Thi-Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Thi-Thi-7DPhe-BK)k(415)＝0.27;Arg(2.16)，Pro(1.89)，Gly(1.03)，Phe(1.04)，Ser(0.93)，Thi(2.95).
0 749.DArg-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DPhg-Phe-Arg(DArg-DPhg-BK)k(1∶1)＝2.03;Arg(3.05)，Pro(2.00)，Gly(0.97)，Phe(2.04)，Ser(0.94)，Phg(1.00).
0 750.DArg-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DTrp-Phe-Arg(DArg-DTrp-BK)∶k(1∶1)＝4.88;Arg(3.07)，Pro(1.99)，Gly(1.00)，Phe(2.04)，Ser(0.89)，Trp(0.97).
0 751.DArg-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DTyr-Phe-Arg(DArg-DTyr-BK)∶k(1∶1)＝1.56;Arg(2.96)，Pro(2.09)，Gly(1.03)，Phe(1.99)，Ser(0.90)，Tyr(1.04).
0 752.DArg-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DHis-Phe-Arg(DArg-DHis-BK)∶k(1∶1)＝0.18;Arg(3.08)，Pro(1.99)，Gly(1.02)，Phe(2.07)，Ser(0.89)，His(0.96).
053.DArg-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DhPhe-Phe-Arg(DArg-7DhPhe-BK)∶k(415)＝0.18;Arg(3.06)，Pro(1.98)，Gly(0.95)，Phe(2.05)，Ser(0.86)，DhPhe(1.11).
54.Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg(Lys-Lys-7DPhe-BK)∶k(1∶1)＝0.52;Arg(2.04)，Pro(2.01)，Gly(0.96，Phe(3.00)，Ser(0.96).
55.Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DTrp-Phe-Arg(Lys-Lys-7DTrp-BK)∶k(1∶1)＝0.67;Arg(2.01)，Pro(2.00)，Gly(1.01)，Phe(2.03)，Ser(0.91)，Trp(0.88)，Lys(2.03).
56.Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DTyr-Phe-Arg(Lys-Lys-7DTyr-BK)∶k(1∶1)＝0.21;Arg(2.01)，Pro(2.11)，Gly(0.99)，Phe(2.02)，Ser(0.97)，Tyr(1.02)，Lys(1.90).
57.Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DHis-Phe-Arg(Lys-Lys-7DHis-BK)∶k(1∶1)＝0.08;Arg(1.91)，Pro(2.06)，Gly(0.94)，Phe(2.08)，Ser(0.93)，His(0.95)，Lys(2.12).
58.Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DhPhe-Phe-Arg(Lys-Lys-7DhPhe-BK)∶k(1∶1)＝1.13;Arg(1.99)，Pro(1.93)，Gly(0.98)，Phe(2.06)，Ser(0.92)，DhPhe(1.11)，Lys(2.01).
3 759.Arg-Pro-DPro-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg(DPro DPhe-BK)k(415)＝0.27;Arg(2.07)，Pro(1.97)，Gly(0.98)，Phe(3.02)，Ser(0.95).
3 6 760.Arg-Pro-DPro-Gly-Phe-CDF-DAla-Phe-Arg(DPro CDF DAla-BK)∶k(415)＝0.59;Arg(1.99)，Pro(2.03)，Gly(0.97)，Phe(2.02)，Ala(0.99)，PCF(1.02).
61.Arg-Pro-DPro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg3 5，8 7(DPro Thi DPhe-BK)∶k(415)＝0.22;Arg(2.10)，Pro(1.96)，Gly(1.05)，Phe(0.98)，Ser(0.94)，Thi(1.96).
062.DArg-Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DPhe-DAla-Thi-Arg(DArg-5，8 6 7Thi DPhe DAla-BK)∶k(1∶1)＝4.00;Arg(2.89)，Pro(1.95)，Gly(1.03)，Phe(0.98)，Ala(1.01)，Thi(2.14).
063.DArg-Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-CDF-DAla-Thi-Arg(DArg-5，8 6 7Thi CDF DAla-BK)∶k(415)＝0.19;Arg(3.00)，Pro(1.99)，Gly(1.00)，Ala(0.96)，Thi(2.03)，PCF(1.02).
64.DArg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg0 2 5，8 7(DArg Hyp Thi DPhe-Bk)∶k(1∶1)＝1.50;Arg(3.11)，Pro(0.97)，Gly(1.03)，Phe(1.04)，Ser(0.95)，Thi(1.88)，Hyp(1.02)65.DArg-Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(DArg-2，3 5，8 7Hyp Thi DPhe-Bk)∶k(1∶1)＝0.96;Arg(3.19)，Gly(0.97)，Phe(0.98)，Ser(1.00)，Thi(1.95)，Hyp(1.90)066.Thi-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Thi-2 5，8 7Hyp Thi DPhe-BK)
067.Thi-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Thi-3 5，8 7Hyp Thi DPhe-Bk)068.Thi-Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Thi-2，3 5，8 7Hyp Thi DPhe-Bk)2 5，869.Arg-Hyp-Pro-Gly-Thi-DPhe-CDF-Thi-Arg(Hyp Thi6 7DPhe CDF-BK)∶k(415)＝1.04;Arg(2.02)，Pro(1.01)，Gly(1.00)，Phe(1.01)，PCF(1.09)，Thi(1.89)，Hyp(0.98)3 5，870.Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-DPhe-CFD-Thi-Arg(Hyp Thi6 7DPhe CDF-BK)∶k(1∶1)＝0.96;Arg(2.01)，Pro(1.11)，Gly(0.97)，Phe(1.06)，Thi(1.86)，PCF(1.06)，Hyp(0.95)2 3 5，871.Arg-Hyp-DPro-Gly-Thi-DPhe-CDF-Thi-Arg(Hyp Pro Thi6 7DPhe CDF-BK)72.Lys-Lys-Arg-Hyp-Pro-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg(Lys-Lys-2 7Hyp DPhe-BK)∶k(1∶1)＝0.37;Arg(1.99)，Pro(0.96)，Gly(0.99)，Phe(3.13)，Ser(0.94)，Hyp(0.98)，Lys(2.00)73.Lys-Lys-Arg-Hyp-Hyp-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg(Lys-Lys-2，3 7Hyp DPhe-Bk)∶k(1∶1)＝0.28;Arg(2.03)，Gly(0.95)，Ser(0.94)，Phe(3.08)，Lys(2.08)，Hyp(1.92)74.Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DThi-Thi-Arg(Lys-Lys-5，8 7Thi DThi-BK)∶k(1∶1)＝0.22;Arg(2.07)，Pro(2.01)，Gly(1.04)，Ser(0.89)，Thi(3.02)，Lys(1.96)75.Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DPal-Thi-Arg(Lys-Lys-
5，8 7Thi DPal-BK)∶k(1∶1)＝0.06;Arg(2.12)，Pro(1.94)，Gly(1.01)，Ser(0.87)，Thi(1.81)，Pal(0.98)，Lys(2.22)76.Lys-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-DPhe-CDF-Thi-Arg(Lys-Lys-5，8 6 7Thi DPhe CDF-Bk)∶k(415)＝0.11;Arg(2.02)，Pro(2.00)，Gly(1.02)，Phe(1.00)，PCF(1.06)，Thi(1.85)，Lys(2.06)77.Lys-Lys-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Lys-Lys-3 5，8 7Hyp Thi DPhe-BK)∶k(1∶1)＝0.22;Arg(2.05)，Pro(0.96)，Gly(1.04)，Phe(1.03)，Ser(0.94)，Hyp(1.10)，Thi(1.84)，Lys(2.04)78.Lys-Lys-Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Lys-Lys-2，3 5，8 7Hyp Thi DPhe-BK)∶k(1∶1)＝0.15;Arg(2.00)，Pro(2.06)，Gly(1.01)，Phe(1.03)，Ser(0.94)，Thi(1.92)，Hyp(2.04)79.Lys-Lys-Arg-Hyp-Pro-Gly-Thi-DPhe-CDF-Thi-Arg(Lys-Lys-2 5，8 6 7Hyp Thi DPhe CDF-Bk)∶k(1∶1)＝6.69;Arg(1.96)，Pro(1.14)，Gly(0.96)，Phe(1.03)，Thi(1.77)，PCF(1.06)，Lys(1.93)，Hyp(1.14)80.Lys-Lys-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-DPhe-CDF-Thi-Arg(Lys-Lys-3 5，8 6 7Hyp Thi DPhe CDF-BK)∶k(1∶1)＝6.14;Arg(2.04)，Pro(0.97)，Gly(1.01)，Phe(0.98)，PCF(1.06)，Thi(1.89)，Hyp(1.01)，Lys(2.05)81.Lys-Lys-Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-DPhe-CDF-Thi-Arg(Lys-Lys-
2，3 5，8 6 7Hyp Thi DPhe CDF-Bk)∶k(1∶1)＝4.88;Arg(2.02)，Gly(0.99)，Phe(0.96)，PCF(1.10)，Thi(1.84)，Hyp(2.01)，Lys(2.06)2 5，8 782.Arg-Thz-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Thz Thi DPhe-BK)∶k(415)＝0.24;Arg(1.97)，Pro(1.04)，Gly(1.02)，Phe(1.06)，Thi(1.91)3 5，8 783.Arg-Pro-Thz-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Thz Thi DPhe-BK)∶k(1∶1)＝5.2584.Arg-Thz-Thz-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg2，3 5，8 7(Thz Thi DPhe-BK)∶K(1∶1)＝6.692 5，8 785.Arg-Aib-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Aib Thi DPhe-BK)∶k(415)＝0.183 5，8 786.Arg-Pro-Aib-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Aib Thi DPhe-BK)k(415)＝0.24;Arg(2.09)，Pro(0.99)，Gly(1.05)，Ser(0.95)，Phe(1.07)，Thi(1.94)，Aib(0.91)87.Arg-Aib-Aib-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg2，3 5，8 7(Aib Thi DPhe-BK)∶k(415)＝4.002 5，8 788.Arg-Azt-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Azt Thi DPhe-BK)∶k(415)＝0.18;Arg(2.07)，Pro(0.99)，Gly(1.02)，Phe(1.04)，Ser(0.95)，Thi(1.97)，Azt(0.99)3 5，8 789.Arg-Pro-Azt-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg(Azt Thi DPhe-BK)
90.Arg-Azt-Azt-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg2，3 5，8 7(Azt Thi DPhe-BK)91.Arg-Inip-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg2 5，8 7(Inip Thi DPhe-BK)∶k(415)＝0.2192.Arg-Pro-Inip-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg3 5，8 7(Inip Thi DPhe-BK)∶k(415)＝0.18;Arg(2.10)，Pro(0.95)，Gly(1.04)，Phe(1.03)，Ser(0.93)，Thi(1.95)93.Arg-Inip-Inip-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg2，3 5，8 7(Inip Thi DPhe-BK)∶k(415)＝0.185，8 794.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DNal-Thi-Arg(Thi DNal-BK)∶k(415)＝0.325，8 795.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-CDF-Thi-Arg(Thi CDF-BK)∶k(415)＝0.285，8 796.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DTyr-Thi-Arg(Thi DTyr-BK)∶k(415)＝0.125，8 797.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DVal-Thi-Arg(Thi DVal-BK)∶k(415)＝0.115，8 798.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DIle-Thi-Arg(Thi DIle-BK)∶k(415)＝0.165，8 799.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DLeu-Thi-Arg(Thi DLeu-BK)5，8 7100.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DTrp-Thi-Arg(Thi DTrp-BK)5，8 7101.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhg-Thi-Arg(Thi DPhg-BK)
5，8 7102.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DHis-Thi-Arg(Thi DHis-BK)5，8 7103.Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DOMT-Thi-Arg(Thi DOMT-BK)∶k(415)＝0.18缓激肽拮抗剂活性的实例在自发或诱发动情期的离体大白鼠子宫和豚鼠回肠上，按通常可接受的Trautschold(Handbook of EXPt，pharmacol.Vol25，Springer Verlag，pp53-55，1970)所论述的试验缓激肽和有关激肽的方法，测定缓激肽拮抗剂对缓激肽亲肌活性的抑制作用。按通常测定生物活性化合物拮抗剂的方法(SchildBr.J.Pharmacol.2189 1947)，在离体大白鼠子宫(RUT)和离体豚鼠回肠(GPT)上，测定抑制强度。通过上述试验，测定了参照物质缓激肽的剂量-反应曲线。缓激肽的ED50为使组织产生最大收缩幅度的一半所需的剂量。将一定剂量的拮抗剂与组织一起孵育30秒钟，然后将缓激肽ED50的2倍量加入组织，不断增加予先同组织孵育的拮抗剂的剂量，直到组织对缓激肽2倍ED50剂量的反应降低到相当于缓激肽1倍ED50剂量所引起的反应。PA2值表示将组织缓激肽的反应，由2倍ED50剂量降低到相当于1倍ED50剂量时所需拮抗剂克分子浓度的负对数。一个单位的PA2值代表效力值变化的一个数量级。为了便于比较，缓激肽剂量的负对数(使组织产生最大收缩的一半所需的剂量)通常称作PD2值。用大白鼠子宫试验时，缓激肽的PD2值是7.9，用豚鼠回肠试验时，PD2值为7.4。
缓激肽拮抗剂的效力pA2/RUT pA2/GPI例号 结构71 DPhe-BK 5.072 DThi-BK 4.6
73 DPal-BK 5.0 4.86，74 DPhe-BK 5.26 75 DPhe CDF-BK 4.9 5.85，8 76 Thi DPhe-BK 6.5 6.35，8 77 Thi DThi-BK 4.2 5.85，8 78 Thi DPal-BK 4.20 710 DArg-DPhe-BK 5.60 3 711 DArg-DPro DPhe-BK 4.0713 Lys-Lys-DPhe-BK 5.15，8 714 Lys-Lys-Thi DPhe-BK 6.0 5.30 5，8 715 DArg-Thi DPhe-BK 5.5 6.10 3 5，8 716 DArg-DPro Thi DPhe-BK 5.22 5，8 718 Hyp Thi DPhe-BK 5.62 5，8 719 Lys-Lys-Hyp Thi DPhe-BK 5.83 5，8 720 Hyp Thi DPhe-BK 7.0 4.70 3 5，8 721 DArg -Hyp Thi DPhe-BK 7.22，3 5，8 722 Hyp Thi DPhe-BK 6.72，3 5，8 6 723 Hyp Thi DPhe CDF-BK 6.50 2 5，8 764 DArg-Hyp Thi DPhe-BK 5.70 2，3 5，8 765 DArg -Hyp Thi DPhe-BK 7.12 772 Lys-Lys-Hyp DPhe-BK 5.63 5，8 777 Lys-Lys-Hyp Thi DPhe-BK 6.7在平滑肌试验中，激肽拮抗剂的特异性本发明缓激肽拮抗剂的特异性作用，是通过观察其抑制缓激肽(BK)和两种在生理上有重要作用的缓激肽类物质-卡里定(KAL，Lys-BK)和甲硫氨酰赖氨酰-BK(MK-BK)的亲肌活性的能力来证实的，但对非激肽的肽物质，如血管紧张肽-Ⅱ(ANG)或P物质(SP)的亲肌活性则无抑制作用。结果表明，所试验的缓激肽拮抗剂仅抑制缓激肽类激动剂所产生的收缩效应，而对非激肽的亲肌性物质则没有作用。所列出的抑制效力，同上述一样，用PA2值表示。
在豚鼠回肠试验中，激肽拮抗剂的特异性豚鼠回肠例号 结构 BK KAL MK-BK ANG SP71 DPhe-BK 5.0 5.6 6.0 NO NO5，86 Thi DPhe-BK 6.3 6.4 5.2 NO NO0 7DArg -DPhe -BK 5.6 6.0 6.3 NO NO0 5，8 7DArg -Thi DPhe-BK 6.1 6.7 6.4 NO NO缓激肽拮抗剂拮抗作用的实例(大鼠血压试验)按照Roblero，Ryan和Stewart(Res.Commun Pathol.Pharmacol.6207，1973)所描述的方法，用整体动物观察缓激肽拮抗剂对麻醉大白鼠血压的影响，当6＃、10＃、15＃化合物以25微克/分的速度静脉输入时，对缓激肽25毫米降压剂量(ED25毫米)的反应，由25毫米降到10毫米。拮抗剂输入结束后，5分钟内，缓激肽的降压作用可回到正常水平。将缓激肽和拮抗剂做成混合剂，用动脉内注射或静脉内注射给予试验动物时，拮抗剂也可产生对缓激肽效应的抑制作用。
延伸缓激肽同类物的N-末端对酶降解作用的耐受性在体内缓激肽同类物耐受酶(如激肽酶)降解作用的能力容易测定。例如，在麻醉大白鼠肺循环中做一单通道后，主动脉内和静脉给药，测定特定同类物残余的血管抑制剂的溶性(J.Roblero，J.W.Ryan，and J.M.Stewart，Res.Commun.Pathol.Pharmacol.6207 1973)，试验中，用N-末端取代的缓激肽同类物(激动剂)进行试验，获得如下的结果。
改变N-末端的缓激肽同类物对大白鼠肺的破坏作用肽结构 破坏百分率(%)Bradykinin(BK) 98Lys-BK 95DArg-BK 92DLys-BK 89Lys-Lys-BK 05，8Thi -BK 955，8Lys-Lys-Thi -BK 0缓激肽延伸的N-末端同类物，特别是用Lys-Lys-延伸的同类物，能耐受激肽酶的降解作用，这意味着作用时间长的缓激肽拮抗剂，可用Lys-Lys-延伸的方法改变[D-Ph
]-BK抑制剂而获得。另外，D-Arg残基加到缓激肽激动剂的N-末端，有使子宫收缩效能增加的倾向，而对回肠的作用不影响，上述观察促进了D-Arg-的D-ph
-BK同类物的合成，该同类物可作为组织的特异性抑制剂。
用Lys-Lys-或D-Arg残基延伸D-Ph
-BK的N-末端，可降低对子宫激动剂的效力，但不影响对回肠的拮抗作用，同样，将Lys-Lys-或D-Arg加到N-末端，
Dph
BK对子宫的抑制作用降低，在回肠试验中将D-Arg加到作用很强的
Dph
BK拮抗剂上，对抑制效力仅有很小的影响。
在2，3位上改变缓激肽拮抗剂得到的组织选择性作用改变缓激肽的九肽顺序所产生的缓激肽激动剂，在经典的大白鼠子宫(RUT)和豚鼠回肠(GPI)试验中，均显示出类似的效能。近来，有人报告，在7位上带有氨基异丁酸(Aib)(R.J.Vavrek and J.M.Stewart，Peptides 1∶231，1980)和6，7位上带多元D-氨基酸取代物(R.J.Vavrek and J.M.Stewart，在kinins 1984 L.M.Greenbaum ed.Plenum Press，NY，1985)的缓激肽同类物，对平滑肌的活性产生分离的现象，即对子宫的活性明显高于对回肠的活性。D-氨基酸残基(DArg)加到对回肠具有选择性的缓激肽拮抗剂Dph
-BK的N-末端(DAr
-Dph
-BK)，在回肠上未改变抑制缓激肽活性的选择性。在DPh
-BK的3位上，用DPro残基取代(即DP-r
Dph
-BK)，用回肠试验，可消除拮抗剂的活性，但用子宫试验，则使激动剂的活性受到破坏。置换DArg-Dph
-BK3位上的Pro残基，逆转了平滑肌的活性谱，对子宫平滑肌具有选择性的拮抗作用，而在回肠平滑肌上完全丧失。对缓激肽的拮抗作用。同样，用DPro残基代替非特异性拮抗剂DAr
-
-Dph
-BK3位上的Pro残基，消除了对缓激肽回肠作用的拮抗效应，但却完全保持了在子宫上的拮抗活性。
3位结构的改变得到的拮抗剂的特异性(平滑肌试验)
例号 结构 RUT CPI71 DPhe-BK (1%AG) pA＝5.00 7 210 DArg-DPhe-BK (0.1%AG) pA＝5.03 7 259 DPro-DPhe-BK 0 00 3 711 DArg-DPro-DPhe-BK pA＝4.6 00 5，8 7 215 DArg-Thi DPhe-BK pA＝5.2 pA＝6.12 20 3 5，8 7DArg-DPro Thi DPhe-BK pA＝5.2 02相对于BK的激动剂效力＝100;PA是由Schild(Br.J.pharm acol.2189，194))定义的抑制效力。
2位上Pro的变化也可改变缓激肽同类物对组织的选择性。有人发现，在2位上，用Val、Sar、Pro、Ala、Hyp和Aib(α-氨基异丁酸取代，在豚鼠回肠与大白鼠子宫比较试验中测定的亲肌活性表明，缓激肽的多种同类物对组织具有不同的选择性(R.J.Vavrek and J.M.Stewart，Peptides，231-235，1980)。通过2位上的取代，可得到各种缓激肽同类物对组织的选择性作用，这表明，任一缓激肽同类物，包括具有拮抗作用的缓激肽同类肽同类物，进行类似的取代，也会获得对组织的选择性作用。
新型缓激肽拮抗剂的应用于治疗的范围，不仅包括治疗动物本身所产生的缓激肽或有关的激肽，而且也包括治疗由于叮咬或蜂刺时注入动物的与缓激肽有关的多肽物质。单独局部应用或与皮下注射联合应用本发明缓激肽拮抗剂，可以治疗与缓激肽有关的肽所致的痛疼，炎症和肿胀。
本发明的缓激肽拮抗剂也可治疗其它外伤，炎症或由于缓激肽的中介作用而产生的病理状况，或者因缓激肽产生过量所引起的病情加剧。上述这些情况，包括局部外伤如创伤、烧伤、疹子、绞痛、关节炎、哮喘、变态反应、鼻炎、休克、炎性肠道疾病、低血压、全身性疼痛及炎症、精子活动弱所致男性不育。本发明的缓激肽拮抗剂，可通过不同方法给药，包括象硝酸甘油那样舌下给药，或用助吸收剂制成膏药，通过皮肤给药治疗绞痛。根据本发明所显示的PA2和ED50资料及先有技术中有关激动剂的效力，对于熟悉本项技术的人员决定本发明新型缓激肽拮抗剂的应用剂量是可能的。
因此，象疼痛、外伤炎症、烧伤、疹子等，一般应用的剂量范围估测是0.1～0.5毫克/毫升;用于治疗鼻炎、变态反应和哮喘的鼻喷雾剂型、其剂量范围为0.1～0.5毫克/毫升;静注剂型，用于治疗全身性炎症、休克、关节炎、变态反应、气喘和增加精子活力，其剂量范围是0.1～10毫克/公斤;治疗炎症性肠道疾病或一般疼痛、炎症，适用的剂量范围是10～100毫克/公斤缓激肽拮抗剂也可通过阴道、直肠、口腔或任何其它可接受的体内途径给药。
熟悉本项技术的人员可以认识到，本发明应用范围广泛，对那些由于疾病、损伤、休克所产生的缓激肽，提供了竟争性抑制剂。本发明的优点是7位上L-pro用D-构型氨基酸取代，可把缓激肽激动剂变为拮抗剂，从而提供多种具有特异性和竞争性的拮抗剂，以减轻缓激肽的作用。本发明的另一个优点是改变7位上的L-Pro及改变新的缓激肽拮抗剂的其它位置，可提供多种有用的化合物。只要不超过下述权利要求
的范围，在本发明所提供的参数以内，对于上述改变和其它的改变，本发明均是可行的。
权利要求
1.制备具有下式缓激肽拮抗剂类型的肽及其药学上可以接受的盐的方法，H-Arg-pro-pro-Gly-phe-ser-y-phe-Arg该方法包括用各种方法取代7位脯氨酸(pro)残基，通过合成缓激肽类型的肽，赋予缓激肽拮抗剂活性，式中7位y可选自以下一组氨基酸D-芳香族氨基酸，取代的D-芳香族氨基酸、D-脂肪族氨基酸或D-杂环氨基酸残基。
2.权利要求
1的方法还包括通过各种方法用选自下述一组氨基酸取代2位脯氨酸(pro)，合成缓激肽类型的肽，以提高组织选择性，ⅰ)氨杂环丁烷-2-羧酸(Azt)ⅱ)噻唑烷-2-羧酸(THz)ⅲ)4-
啶甲酸(Inip)ⅳ)2，3-脱氢脯氨酸(△pro)ⅴ)4-羟基脯氨酸(Hyp)ⅵ)羟基脯氨酸ⅶ)α-氨基异丁酸(Aib)ⅷ)脱氢脯氨酸ⅸ)丙氨酸(Ala)ⅹ)缬氨酸(Val)ⅹⅰ)肌氨酸(sar)ⅹⅱ)甘氨酸(Gly)。
3.权利要求
1和2的方法还包括通过各种方法用选自下述一组氨基酸取代3位脯氨酸(pro)，合成缓激肽类型的肽，以提高组织选择性，ⅰ)氮杂环丁烷-2-羧酸(Azt)ⅱ)噻唑烷-2-羧酸(THz)ⅲ)4-
啶甲酸(Inip)ⅳ)2，3脱氢脯氨酸(△pro)ⅴ)4-羟基脯氨酸(Hyp)ⅵ)α-氨基异丁酸(Aib)ⅶ)缬氨酸(Val)ⅷ)丙氨酸(Ala)ⅸ)肌氨酸(Sar)ⅹ)甘氨酸(Gly)。
4.权利要求
1、2和/或3的方法还包括通过各种方法用选自下述一组氨基酸取代零位H，合成缓激肽类型的肽，以提高对酶的耐受性，ⅰ)精氨酸(Arg)ⅱ赖氨酸-赖氨酸(Lys-Lys)ⅲ)苯基丙氨酸(phe)ⅳ)β-(2-噻吩基)丙氨酸(Thi)ⅴ)赖氨酸(Lys)ⅵ)甲硫氨酸-赖氨酸(Met-Lys)ⅶ)甘氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-赖氨酸(Gly-Arg-Met-Lys)。
5.权利要求
1、2、3和/或4的方法还包括通过各种方法用选自以下一组氨基酸取代5位苯基丙氨酸(phe)，合成缓激肽类型的肽，以提高其效力，ⅰ)苯丙氨酸(phe)ⅱ)β-(2-噻吩基)丙氨酸(Thi)ⅲ)O-甲基酪氨酸(OMT)ⅳ)β-(2-吡啶基)丙氨酸(Pal)ⅴ)对-氯-L-苯基丙氨酸(CLF)ⅵ)对-硝基苯基丙氨酸(PNF)ⅶ)β-(2-萘基)丙氨酸(Nal)ⅷ)亮氨酸(Leu)ⅸ)赖氨酸-赖氨酸-β-(2-噻吩基)丙氨酸(Lys-Lys-Thi)ⅹ)丝氨酸(Ser)ⅹⅰ)酪氨酸(Tyr)。
6.权利要求
1、2、3、4和/或5的方法还包括通过各种方法用选自以下一组氨基酸取代8位苯基丙氨酸(Phe)，合成缓激肽类型的肽，以提高其效力，ⅰ)苯基丙氨酸(Phe)ⅱ)β-(2-噻吩基)丙氨酸(Thi)ⅲ)O-甲基酪氨酸(OMT)ⅳ)β-(2-吡啶基)丙氨酸(Pal)ⅴ)对-氯-L-苯基丙氨酸(CLF)ⅵ)对-硝基苯基丙氨酸(PNF)ⅶ)β-(2-萘基)丙氨酸(Nal)ⅷ)亮氨酸(Leu)ⅸ)酪氨酸(Tyr)。
7.权利要求
1、2、3、4、5和/或6的方法还包括通过各种方法用选自以下一组氨基酸取代6位丝氨酸(Ser)，合成缓激肽类型的肽，以提高其效力，ⅰ)丝氨酸(Ser)ⅱ)甘氨酸(Gly)ⅲ)苯基丙氨酸(Phe)ⅳ)对-氯-D-苯基丙氨酸(CDF)ⅴ)β-(2-萘基)丙氨酸(Nal)ⅵ)β-(2-吡啶基)丙氨酸(Pal)ⅶ)β-(2-噻吩基)丙氨酸(Thi)ⅷ)对-氯-苯基丙氨酸(Pcl-Phe)。
8.制备具有下述缓激肽拮抗剂类型的肽及其药学上可以接受的盐的方法，A-Arg-B-C-D-W-X-Y-Z-Arg该方法包括通过各种方法取代7位氨基酸，以获得拮抗剂活性，7位氨基酸以y表示，其中y可选自以下一组氨基酸，ⅰ)D-芳香族氨基酸，ⅱ)取代的D-芳香族氨基酸，ⅲ)D-脂肪族氨基酸，ⅳ)D-杂环氨基酸残基;并且其中B、C、D、W、X和Z均为氨基酸，A为氨基酸或氢。
9.权利要求
8的方法还包括通过各种方法取代零位氨基酸，以赋予酶活性，零位氨基酸以A表示，其中A可选自以下一组氨基酸，ⅰ)精氨酸(Arg)ⅱ)赖氨酸-赖氨酸(Lys-Lys)ⅲ)苯基丙氨酸(Phe)ⅳ)β-(2-噻吩基)丙氨酸(Thi)ⅴ)懒氨酸(Lys)ⅵ)甲硫氨酸-赖氨酸(Met-Lys)ⅶ)甘氨酸-精氨酸-甲酰氨酸-赖氨酸(Gly-Ary-Met-Lys)。
10.权利要求
8和/或9的方法还包括通过各种方法取代2位氨基酸，以赋予组织选择性，2位氨基酸以B表示，其中B可选自以下一组氨基酸，ⅰ)氮杂环丁烷-2-羧酸(Azt)ⅱ)噻唑烷-2-羧酸(THz)ⅲ)4-
啶甲酸(Inip)ⅳ)脯氨酸(Pro)ⅴ)2，3-脱氢脯氨酸(△Pro)ⅵ)4-羟基脯氨酸(Hyp)ⅶ)羟基脯氨酸ⅷ)α-氨基异丁酸(Aib)ⅸ)脱氢脯氨酸ⅹ)缬氨酸(Val)ⅹⅰ)丙氨酸(Ala)ⅹⅱ)肌氨酸(Sar)ⅹⅲ)甘氨酸(Gly)。
11.权利要求
8、9和/或10的方法还包括通过各种方法取代3位氨基酸，以赋予组织选择性，3位氨基酸以C表示，其中C可选自以下一组氨基酸，ⅰ)氮杂环丁烷-2-羧酸(Azt)ⅱ)噻唑烷-2-羧酸(THz)ⅲ)4-
啶甲酸(Inip)ⅳ)脯氨酸(Pro)ⅴ)2，3-脱氢脯氨酸(△pro)ⅵ)4-羟基脯氨酸(Hyp)ⅶ)α-氨基异丁酸(Aib)ⅷ)缬氨酸(Val)ⅸ)丙氨酸(Ala)ⅹ)肌氨酸(Sar)ⅹⅰ)甘氨酸(Gly)。
12.权利要求
8、9、10和/或11的方法还包括通过各种方法取代4位氨基酸，4位氨基酸以D表示，其中D可选自以下一组氨基酸，ⅰ)甘氨酸(Gly)ⅱ)丙氨酸(Ala)ⅲ)肌氨酸(Sar)。
13.权利要求
8、9、10、11和/或12的方法还包括通过各种方法取代5位氨基酸，以提高其效力，5位氨基酸以W表示，其中W可选自以下一组氨基酸，ⅰ)苯基丙氨酸(Phe)ⅱ)β-(2-噻吩基)丙氨酸(Thi)ⅲ)0-甲基酪氨酸(OMT)ⅳ)β-(2-吡啶基)丙氨酸(Pal)ⅴ)对-氯-L-苯基丙氨酸(CLF)ⅵ)对-硝基苯基丙氨酸(PNF)ⅶ)β-(2-萘基)-丙氨酸(Nal)ⅷ)亮氨酸(Leu)ⅸ)丝氨酸(Ser)ⅹ)酪氨酸(Tyr)。
14.权利要求
8、9、10、11、12和/或13的方法还包括通过各种方法取代6位氨基酸，以提高效力，6位氨基酸以x表示，其中x可选自以下一组氨基酸，ⅰ)丝氨酸(Ser)ⅱ)甘氨酸(Gly)ⅲ)苯基丙氨酸(Phe)ⅳ)对-氯-D-苯基丙氨酸(CDF)ⅴ)β-(2-萘基)-丙氨酸(Nal)ⅵ)β-(2-吡啶基)-丙氨酸(Pal)ⅶ)β-(2-噻吩基)-丙氨酸(Thi)ⅷ)对-氯-苯基丙氨酸(Pcl-Phe)。
15.权利要求
8、9、10、11、12、13和/或14的方法还包括通过各种方法取代8位氨基酸，以提高其效力，8位氨基酸以Z表示，Z可选自以下一组氨基酸，ⅰ)苯基丙氨酸(Phe)ⅱ)β-(2-噻吩基)丙氨酸(Thi)ⅲ)0-甲基酪氨酸(OMT)ⅳ)β-(2-吡啶基)丙氨酸(Pal)ⅴ)对-氯-L-苯基丙氨酸(CLF)ⅵ)对-硝基苯基丙氨酸(PNF)ⅶ)β-(2-萘基)丙氨酸(Nal)ⅷ)亮氨酸ⅸ)β-(2-噻吩基)丙氨酸(Thi)。
16.权利要求
8的方法，其中通过叔丁氧基羰基-(g-对-甲苯磺酰基)-Y与下述肽链a或b反应进行耦合，a.A-Arg-B-C-D-W-X;或b.Z-Arg。
17.权利要求
8或16的方法还包括下述步骤(a)使Arg结合到不溶的聚合母体上，(b)使至少一个氨基酸残基耦合到步骤(a)的Arg上;(c)使缓激肽拮抗剂类型的肽从上述不溶的聚合母体上去耦合。
18.权利要求
17的方法，其中耦合是在溶液中用结合到上述步骤(b)氨基酸残基上的叔丁氧基羰基-(g-对甲苯磺酰基)进行的。
专利摘要
在肽激素缓激肽或缓激肽其他取代类似物的第7位用芳香氨基酸或D-构型芳香氨基酸取代，可以使激动剂缓激肽转变成缓激肽拮抗剂。本发明还包括在7位已改变的新型缓激肽拮抗剂中其他位置的变化，它们可提高对酶的耐受性、拮抗剂效力和/或新的缓激肽拮抗剂的特异性。制备的类似物可用于治疗由于缓激肽过量生成，或由于叮咬而进入体内所引起的哺乳动物和人体的病痛和疾病。
文档编号C07K5/00GK87101721SQ87101721
公开日1988年9月14日 申请日期1987年3月6日
发明者约翰·M·斯蒂沃特, 雷蒙德·J·瓦夫里克 申请人:约翰·M·斯蒂沃特, 雷蒙德·J·瓦夫里克导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan