乳铁蛋白在治疗过敏原诱发疾病中的应用的制作方法

专利名称：乳铁蛋白在治疗过敏原诱发疾病中的应用的制作方法
背景技术：
本发明涉及用于治疗在对过敏原应答中与不适当或过度免疫反应有关的疾病(包括炎症性皮肤反应、哮喘和关节炎)的药物组合物和方法。
背景技术：
乳铁蛋白是80千道尔吨(kD)的铁结合糖蛋白，在牛奶里的浓度高，在其它分泌物和体液里的浓度较低。它是许多铁结合蛋白中的一种，称为转铁蛋白，涉及哺乳动物的铁结合和输送。Montreuil和Mullet，1960，C.R.Acad.Sci.Paris2501736-1737；Montreuil等，1960，Biochem.Biophys.Acta 45413-421；Johansson，1960，Acta Chem.Scand.14510-512，Blanc和Isliker，1961，Bull.Soc.Chim.Biol.43929-943；Masson和Heremans，1967，Protides Biol.Fluids Proc.Colloq.21115-124；QuerinJenn等，1971，Eur.J.Biochem.20420-425；Leger等，1977，Biol.Anim.Biochim.Biophys.17737-747。
乳铁蛋白最初发现于奶中，在初乳中它可达到7克/升水平。但是，自此以后，在许多其它体液里，包括眼泪、唾液和粘膜分泌物和在多形核白细胞的次级颗粒中也可检测到。Biserte等，1963，Exp.Ann.Biochim.Med.2585-120；Masson，1970，inLa Lactoferrine，93-165页，Arscia，Bruxelles.这样，该蛋白主要由腺体上皮细胞和与局部和中枢免疫防御相关的中性白细胞表达。
乳铁蛋白由于其良好的抗微生物活性，已显示在宿主防御机制上起重要的作用。乳铁蛋白的抗微生物作用看来至少部分是通过没收微生物生长所必须的铁这一乳铁蛋白的铁结合性质的缘故。
业已显示，乳铁蛋白的产生是由脂多糖(LPS)诱导的，脂多糖是细菌细胞壁的组分。Gutteberg等，1990，Scan.J.Clin.Lab.Invest.5042l-427。有成堆的证据显示，除了抗微生物活性外，乳铁蛋白可影响先天性和适应性免疫过程，包括自然杀细胞功能，参与炎症过程，补体激活和影响细胞因子(cytokine)的产生。Lash等，1983，Blood 61885-888；Mansson等，1990，Ann.Rheum.Dis.49594-597；Van Snick等，1974，J.Exp.Med.1401068-1084。对于后者，现已在体外和体内证明，乳铁蛋白会减少全身肿瘤坏死因子α(TNF-α)的产生(Machnicki等，1993，Int.J.Exp.Path.74433-439)，TNF-α是一种在炎症、脓毒血症和内毒素休克中起重要作用的细胞因子(Beutler等，1985，Science229869-871；Tracey等，1987，Curr.Opinion Immunol.1454-461；Waage等，1989，J.Exp.Med.169333-338；Kunkel等，1989，Crit.Rev.Immunol.993-117)。
但是，以前的研究致力于调节LPS激发的TNF-α生成。Machnicki等，1993，Int.J.Exp.Path.74433-439；Gutteberg等，1990，APMIS 981027-1032；和Gutteberg等，1991，APMIS 99602-608。由于已知乳铁蛋白与LPS直接结合，所观察到的TNF-α减少是否归因于该细胞因子本身转录或转录后的调节，或归因于在LPS存在下由于直接与此内毒素结合并使之灭活导致乳铁蛋白减少，这尚未确定。Ellison和Giehl，1991，J.Clin.Invest.881080-1091；Appelmelk等，1994，Infect.Immunity 622628-2632。以前尚未证明过乳铁蛋白的过敏原诱发作用。由于该原因，尚未进行实验来检验同源重组乳铁蛋白影响诱导TNF-α-依赖性生物学反应的能力，此反应中刺激TNF-α的表达不依赖于LPS。
cDNA编码的乳铁蛋白和其重组制备方法如下列专利所述美国专利5,571,896，5,571,697和5,571,691。美国专利申请08/453,703、08/456,106，(1995年5月30日提交)和08/691,123，(1996年8月1日提交)都揭示以融合产物来生产乳铁蛋白的方法。此外，美国专利08/391986(1995年2月21日提交)揭示了用乳铁蛋白来调节或中和肝素活性，还有，美国专利08/866,544(1997年5月30日提交)揭示了乳铁蛋白的突变体和其变异体。前述专利和申请全文纳入本文作参考。
发明综述乳铁蛋白抑制了过敏原依赖性炎症反应的诱发。本发明显示，乳铁蛋白可抑制并非由内毒素(即细菌细胞壁的脂多糖(LPS)组分)诱发的TNF-α依赖的反应。乳铁蛋白是一种活性化合物，用于治疗用过敏原因素引发的局部免疫反应而导致的各种炎症疾病。
本发明一个方面的特征是提供抑制局部炎症反应的组合物。该组合物包括乳铁蛋白和药学上可接受的载体。这些组合物可替换地包括，或另外还可包括对局部诱导的TNF-α-依赖的炎症有所需抑制活性的、乳铁蛋白的功能性类似物或功能性片段。
另一个方面本发明提供了治疗哺乳动物以局部免疫反应为特征的疾病的方法，该方法是给予有效量的包含乳铁蛋白和药学上可接受载体的组合物。用于本发明治疗方法的组合物可替换地包括，或另外包括对局部诱导的TNF-α依赖的炎症有抑制活性的、乳铁蛋白的功能性类似物或功能性片段。
本发明的组合物和方法可用来治疗各种局部免疫反应导致的病症。这类病症包括诸如接触性过敏皮炎、牛皮癣、UV-诱发的炎症、婴儿尿布湿疹、肺炎和痤疮等皮肤发炎疾病。
此外，本发明的组合物和方法可用作抗皱纹美容液中的补充剂，以消除羟基酸的发炎副作用，羟基酸是这类美容产品里最常用的活性组分。
最后，本发明组合物和方法可用来治疗涉及局部免疫反应导致的发炎的其它病症。这类病症包括，但不限于，哮喘和关节炎。
附图简述

图1A显示了导致局部免疫反应和炎症的皮肤中的细胞迁移的级联反应图。
图1B显示了上皮郎格尔汉斯细胞和角质化细胞产生的细胞因子的相互作用，这引发了皮肤的局部免疫反应。
图2显示了新生小鼠皮肤里乳铁蛋白与产生TNF-α的角质化细胞上它的受体的结合。顶部两图显示只用标记乳铁蛋白得到的黑白图像。底部两图显示在过量未标记乳铁蛋白的存在下进行结合试验时的黑白图像。
图3A显示皮内给予乳铁蛋白抑制了由噁唑酮诱发的，而不是由注射TNF-α而刺激诱导的树突细胞在引流淋巴结里的积聚。
图3B显示了皮内给予乳铁蛋白抑制了噁唑酮和IL-1-β诱发的树突细胞在引流淋巴结里的积聚。
图4显示了乳铁蛋白对TNF-α和IL-1β诱导的郎格尔汉斯细胞迁移的影响。
图5提供了从两个独立实验(图A和B)得到的结果，它表示，用噁唑酮治疗诱导了经0.02％BSA预处理小鼠的树突细胞在引流淋巴结里的积聚(参见图A和B的第2条图与条图1的对比)。在两个实验中局部给予小鼠乳铁蛋白导致强烈抑制了对噁唑酮反应而致的淋巴结中树突细胞的积聚(参见图A和B的条图3)。结果表明，局部给予乳铁蛋白能极有效地抑制因对过敏原反应而致的树突细胞在淋巴结里的积聚，并因此抑制了过敏原诱导的皮肤炎症。
发明详述通过乳铁蛋白调节肿瘤坏死因子α(TNF-α)的产生本发明基于以下出乎意料的发现乳铁蛋白和其类似物和衍生物，包括截短的分子、生物活性片段和含有取代和缺失的突变蛋白质，能抑制内毒素(LPS)独立途径产生TNF-α所引起的各种反应。
炎症疾病常常是局部免疫反应的结果，例如暴露于化学品(包括外源和内源产生的化学品或过敏原)而致，或由自身免疫反应引起。这类炎症反应是由于定居在表皮里的免疫性“郎格尔汉斯”细胞捕获抗原而引起的。一旦捕获抗原，郎格尔汉斯细胞经历成熟或分化过程，使它们离开表皮并如成熟的树突细胞(DC)那样迁移，经皮肤的真皮向下进入淋巴系统。它们然后可通过淋巴系统进入引流的淋巴结，在那儿它们向T-淋巴细胞提呈位于其细胞表面上的加工过的抗原。Kimber和Cumberbatch，1992，毒理学应用药学(Toxicol.Appl.Pharmacol.)117137-146。参见图1A。活化的T-细胞可能通过触发复杂的免疫反应进行应答，这导致炎症性白细胞侵入皮肤而引起局部炎症反应。
因此，局部免疫反应，例如皮肤免疫反应，需要(1)识别和捕获抗原，这通过郎格尔汉斯细胞成熟和树突细胞向淋巴结迁移来完成；(2)通过抗原提呈，树突细胞活化了淋巴结里的T-细胞；和(3)接着刺激炎症性白细胞集结于皮肤。
这些过程的每一个都依赖于一种或多种调节参与免疫酸的细胞功能的细胞因子。
引发炎症反应(如皮肤炎症级联反应)的细胞因子是由表皮的角质化细胞和郎格尔汉斯细胞所产生。如图1B所示，郎格尔汉斯细胞定居于表皮中靠近角质化细胞。
由化学过敏原诱导的郎格尔汉斯细胞迁移和随后的树突细胞在引流淋巴结里的积聚依赖于局部有无TNF-α，TNF-α是一种表皮中由角质化细胞对皮肤致敏或其它形式皮肤创伤起反应时所产生的细胞因子。Cumberbatch和Kimber，1992，免疫学(Immunology)75257-263；Cumberbatch等，1994，免疫学81395-401；Cumberbatch和Kimber，1995，免疫学8431-35。全身给予中和性抗TNF-α抗体几乎可完全抑制由诸如噁唑酮等化学品诱导的郎格尔汉斯细胞迁移的刺激和树突细胞积聚。Cumberbatch和Kimber，1995，同上。皮内给予均质的重组TNF-α本身足以诱导郎格尔汉斯细胞从皮肤迁移并导致树突细胞在引流淋巴结里的数量增加。Cumberbatch和Kimber 1992，同上；Cumberbatch等，1994，同上。
如图3A和实施例2和3所示，皮内给予乳铁蛋白和其功能性类似物和功能性片段抑制了由噁唑酮诱导，但不是由注射TNF-α刺激的树突细胞在引流淋巴结里的积聚。这些数据与乳铁蛋白的负调节角质化细胞产生TNF-α相一致，已知角度质细胞在皮肤致敏后受到刺激而产生TNF-α。
前已证明，刺激郎格尔汉斯细胞迁移和树突细胞积聚也依赖于局部有无另一个表皮细胞因子，白介素1β(IL-1β)。Enk等，1993，免疫学杂志(J.Immunol.)1503698-3704。该细胞因子在鼠表皮里由郎格尔汉斯细胞少量产生，其表达上调是皮肤致敏的进一步结果。Enk和Katz，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.891398；Enk和Katz，1992，皮肤学研究杂志(J.Invest.Dermatol.)99S39-S41。全身给予中和性抗-IL-1β抗体抑制了郎格尔汉斯细胞的迁移和树突细胞的积聚。Enk等，1993，同上。
因此，很显然，郎格尔汉斯细胞的有效迁移依赖于得到IL-1β和角质化细胞的从头合成TNF-α。前述工作提供的进一步证据显示皮内单独给予IL-1β会诱导郎格尔汉斯细胞的迁移。参见图3B和实施例2和3。
乳铁蛋白抑制了噁唑酮诱导的和IL-1β诱导的树突细胞在引流淋巴结里的积聚。这样，乳铁蛋白削弱了IL-1β诱导的，但不是TNF-α诱导的树突细胞的积聚(参见图3A)。这显示，在细胞因子级联反应引起的局部免疫反应里，乳铁蛋白的抑制作用是在IL-1β的下游和在TNF-α的上游。
还有，本文显示了乳铁蛋白能与角质化细胞上的受体结合，这表明乳铁蛋白与角质化细胞结合可防止TNF-α的产生。特别是，图2显示，乳铁蛋白能与新生小鼠皮肤里产生TNF-α的角质化细胞上的受体结合。乳铁蛋白的这种结合主要在表皮层和汗腺里，但不在正常的表皮细胞里。
本文公开的实验结果显示，乳铁蛋白对郎格尔汉斯细胞迁移和树突细胞积聚的抑制作用是由于对TNF-α产生的负调节，而不是通过对郎格尔汉斯细胞功能其它方面的影响。这样，乳铁蛋白能通过与角质化细胞上的受体结合来抑制TNF-α的从头合成。
两叶结构的演变赋予了乳铁蛋白以独特的铁结合性质和分子的其它生物功能。根据这些结构域的鉴定，美国专利申请08/866,544(1997年5月30日提交)描述了乳铁蛋白多肽中赋予该蛋白质铁结合性质的序列和结构，(所揭示的内容纳入本文作参考)。该申请提供了设计和生产新颖的有修饰的铁结合能力的乳铁蛋白变体或它的部分的指导方法。典型的是，乳铁蛋白变体具有改进的性质，包括，但不限于，对铁具有较高亲和力以改善抗微生物活性的乳铁蛋白变体、对铁具有较低亲和力并具有改善的铁释放性能的乳铁蛋白变体，或是具有修饰的pH或温度要求或结合和/或释放铁的范围的乳铁蛋白变体。同样，用于本发明方法的乳铁蛋白典型地具有增加的对白介素活性的抑制，如IL-1β证明的那样。另外，本发明可设计具有其它改进特性，(如治疗耐受性、免疫反应性或生物半衰期)但保留其生物活性的乳铁蛋白变体。
本发明的乳铁蛋白变体可以衍生自各种哺乳动物的野生型乳铁蛋白，包括，但不限于人、小鼠、大鼠、牛和猪的乳铁蛋白。可通过本领域公知的方法使野生型乳铁蛋白突变。参见Sambrook等，1990，分子克隆(Molecular Cloning)；实验室手册(A Laboratory Manual).Cold Spring Harbour实验室出版社出版，美国纽约；Kunkel等，1987，Meth.Enzymol.154367-382；Kunkel，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488-42。
在一个优选的实施方案里，本发明乳铁蛋白变体包括氨基酸序列里的至少一个突变。在另一个优选的实施方案里，本发明的乳铁蛋白包括截短的氨基酸序列。
在适合于真核细胞表达的载体中可以插入本发明的编码乳铁蛋白和其变体的核酸序列，所有的方式是允许乳铁蛋白变体表达。或者，可将本发明乳铁蛋白变体部分的编码核酸插入能让其在真核细胞里表达的载体中。
在另一个优选的实施方案里，乳铁蛋白在重组表达系统里产生。参见，如Ward等，1992，生物技术(Biotechnology)10784-789；Ward等，1995，生物技术13498-503。为了此目的，将所需形式乳铁蛋白的编码核酸(参见，如美国专利5,571,691，全文纳入供参考)表达性掺入一个细胞宿主中，然后在适合表达特定肽或蛋白质的条件下培养。各种基因表达系统适合用于该目的，典型的是由所选宿主自然使用表达控制来驱动所需基因的表达。
因为本发明乳铁蛋白变体如同自然产生的乳铁蛋白，需要翻译后的修饰，如在数个氨基酸残基处的糖基化，所以许多乳铁蛋白变体或其部分需要在真核细胞宿主里生产。在优选的实施方案里，如Ward等，1992，基因(Gene)122219-223；和美国专利5,571,896和5,571,697所述，乳铁蛋白产物可通过曲霉菌(Aspergillus)表达系统产生，本文将其全文纳入作为参考。
但是，若要产生的乳铁蛋白变体或其部分是非糖基化形式，它们的生产可方便地在诸如大肠杆菌等细菌宿主里进行。为了这种生产，可将所选乳铁蛋白变体或其部分的编码核酸置于表达控制(元件)下，如大肠杆菌的lac，trp或PL基因下。
作为乳铁蛋白变体或其部分编码核酸表达的另外方式，可用宿主来表达作为融合蛋白的乳铁蛋白产物，在融合蛋白中乳铁蛋白可释放性地连接于载体蛋白上，这样有利于表达产物的分离和稳定性。
在另一方法中，乳铁蛋白变体或其部分可通过有机合成产生。特别是其中无乳铁蛋白(alactoferrin)变体部分，如长度约20-50个氨基酸的肽。的产生可用已建立的自动肽合成技术，如J.M.Stewart和J.D.Yong，固相肽合成(Solid Phase PeptideSynthesis)，第2版，1984，Pierce Chemical Company，Rockford(美国伊利诺斯)；和M.Bodanszky和A.Bodanszky，肽合成实践(The Practice of PeptideSynthesis)，1984，Springer-Verlag，美国纽约；实用生物系统430A使用手册(AppliedBiosystems 430A Users Manual)，1987。ABI Inc.，Foster Cty(美国加利福尼亚)；和固相肽合成，实用方法(Solid Phase Peptide Synthesis.A practical Approach)，E.Atherton & R.C.Sheppard，IRL出版社，牛津(1989)。在这些技术中，乳铁蛋白变体部分自其C-末端、树脂偶联的残基开始通过依次加入适当保护的氨基酸用Fmox或tBox方案而生长获得。
含乳铁蛋白的药物组合物乳铁蛋白和乳铁蛋白产品。本文的术语“乳铁蛋白”指乳铁蛋白的天然或重组形式，除非特定指出，它们是指哺乳动物的形式。本文的术语“乳铁蛋白产品”指乳铁蛋白和可用于本发明的其功能类似物和功能片段。特别是，该术语涵盖了截短的乳铁蛋白和具有一个或多个氨基酸被取代或缺失的乳铁蛋白。乳铁蛋白的“功能类似物和功能片段”分别指乳铁蛋白的突变体和衍生物，和乳铁蛋白衍生的肽，它们能抑制细胞产生TNF-α。一般来说，本发明涵盖的乳铁蛋白、功能性乳铁蛋白类似物和功能性片段能抑制涉及产生TNF-α的不合适的或过度的局部免疫反应。
乳铁蛋白类似物或乳铁蛋白衍生肽可通过实施例2描述的小鼠模型来测试鉴定是否为功能性的类似物或功能性的片段。参见Cumberbatch和Kimber，1992，免疫学(Immunology)75257-263。简言之，该试验涉及通过给予过敏原，如在剃毛小鼠皮肤上涂以噁唑酮，来诱导局部免疫反应。一小时后，在噁唑酮处理过的部位皮内注射约0.002％-0.5％以盐水配的待测乳铁蛋白类似物或片段。第二组和第三组动物分别注射相同浓度范围和以相同缓冲液配的乳铁蛋白和BSA。约12小时后，处死动物，回收引流淋巴结。比较聚集的树突细胞的数量，可按Cumberbatch和Kimber(同上)所描述的方法来测定，显示乳铁蛋白类似物或片段的效能和它们作为本发明组合物和方法的应用。
一般来说对乳铁蛋白的任何取代、加成或删除不会破坏其受体介导的抑制TNF-α产生的作用，如同不合适或过度的免疫反应可用于本发明。本领域技术人员可不经过多的实验进行这类取代、加成和删除。在优选的实施方案中，功能性乳铁蛋白类似物或功能片段基本上与天然人体乳铁蛋白一样有效。在最佳实施方案里，功能性乳铁蛋白类似物或功能片段与天然人体乳铁蛋白相比具有增加的TNF-α下调活性。例如，这类功能类似物或功能片段显示出增加的血清稳定性、增加的受体结合和增加的信号传导活性。对可用于本发明的乳铁蛋白以及功能性乳铁蛋白类似物和功能性片段的修饰是使该分子更易为炎症部位生物利用的修饰。例如，当局部外用给予乳铁蛋白产品时，功能性乳铁蛋白类似物或功能片段也许会显示增加的经皮吸收。
本发明特定的乳铁蛋白产物可通过各种生产蛋白质产品公知的方法来制备。这些天然形式的乳铁蛋白可通过从天然来源，如哺乳动物奶，最佳的是人奶、用适当联合的蛋白质分离技术提取得到。例如，如Cheron等，1977，C.R.Acd.Sci.法国巴黎284585-588，乳铁蛋白分离可通过顺次提取和用Sephadex G-25、G-50、G-75和G-100纯化得到。
作为提取以外的另一方法，只掺入L-氨基酸的这些形式的乳铁蛋白可通过使用重组DNA技术重现地和以市售数量生产出来。参见，如Ward等，1992，生物技术(Biotechnology)10784-789；Ward等，1995，生物技术13498-503。为了实现此目的，可将所需形式乳铁蛋白的编码核酸(参见美国专利5,571,691，全文纳入本文作参考)可表达性地掺入一细胞宿主中，然后在适合特定肽或蛋白质表达的条件下培养。各种基因表达系统适合于该目的，并且通常由所选定的宿主自然使用的表达控制元件驱动所需基因的表达。
由于乳铁蛋白的天然形式需要翻译后的修饰，例如在数个氨基酸残基处的糖基化，本发明的许多乳铁蛋白、其功能性类似物或功能性片段需要在真核细胞宿主里生产，在优选的实施方案里乳铁蛋白产物可由曲霉菌表达系统产生，如Ward等，1992，基因(Gene)122219-223；和美国专利5,571,896和5,571,697所描述的那样，其全文纳入本文作为参考。
然而，如果使用乳铁蛋白的非糖基化形式其功能性类似物或功能性片段，可在细菌宿主，如大肠杆菌里方便地得到这些产品。对于这类产品，可将编码所选定的乳铁蛋白、其功能性类似物或功能性片段的核酸置于大肠杆菌的lac，trp或PL基因的表达控制之下。
作为表达核酸编码的乳铁蛋白、功能性类似物或其功能性片段本身的另一种方案，可采用能以融合蛋白形式表达乳铁蛋白的宿主，在融合蛋白中乳铁蛋白产物与一载体蛋白可释放地连接在一起，这样有利于表达产物的分离和稳定性。
另一个方案是，乳铁蛋白可通过有机合成产生，特别是当乳铁蛋白是功能性片段，如长度20-50个氨基酸的肽，可使用已建立的自动肽合成技术。肽合成的示范性阐述可参见，如J.M.Stewart和J.D.Yong，固相肽合成(Solid Phase PeptideSynthesis)，第2版，1984，Pierce Chemical Company，Rockford(美国伊利诺斯)；和M.Bodanszky和A.Bodanszky，肽合成实践(The Practice of PeptideSynthesis)，1984，Spriuger-Verlng，美国纽约；实用生物系统430A使用者手册(Applied Biosystems 430A Users Manual)，1987，ABI Inc.，Foster City.美国加利福尼亚；和E.Atherton & R.C.Sheppard固相肽合成-实用方法(Solid Phase PeptideSynthesis-A Practical Approach)，IRL出版社，牛津(1989)。在这些技术中，乳铁蛋白片段可从其C-末端、树脂偶联的残基开始通过依次加入适当保护的氨基酸，用Fmoc或tBoc方案而生长获得。
另一个方法，用于本发明方法和组合物的功能性乳铁蛋白片段可通过肽酶酶消化或纯化的乳铁蛋白或乳铁蛋白产物的水解得到。当然，乳铁蛋白片段也可通过在前述合适的宿主里重组表达来产生。本发明也涵盖化学修饰的乳铁蛋白产物，包括甲基化、羧基化等产物的应用。
药物制剂和给药途径。对于治疗应用，本发明的乳铁蛋白产物可通过任何可得到的常规手段，如单一治疗剂或治疗剂组合来给予。每种可单独给予，但通常与选定的给药途径和标准药学实践中选择的药物载体一起给药。本发明的药物组合物适合于口服、非胃肠道给药、局部外用或直肠给药，或作为吸入剂，可以是单位剂量形式，药学领域技术人员公知的方式给予。非胃肠道给药包括，但不限于，皮下注射、静脉注射、腹腔内注射或肌注。
用此活性组分治疗可在所治病症，如牛皮癣、接触性皮炎、UN-诱发的炎症、婴儿尿布湿疹、哮喘、关节炎等被诊断出来后的任何时间开始。较好的是，治疗为预防性的或在疾病的早期进行以防止在第一地点发生广泛的炎症。典型的是，治疗将持续到炎症被治愈。对于慢性疾病，如牛皮癣、哮喘或关节炎，或对持续暴露于过敏原的情况，治疗可能必须延长到症状治愈之后。由于乳铁蛋白是天然的非毒性蛋白，预计即使长期治疗也不会发生副作用。
给予的剂量当然根据已知的因素而变化，如(1)特定乳铁蛋白产品的药物动力学特征和其给药模式和途径，(2)接受者的年龄、健康、高度和体重，(3)症状的性质和程度，(4)共同治疗的种类，(5)治疗的频度和(6)所需的效果，而定。活性组分的每日剂量预计可为约1毫克/千克体重-1.2克/千克体重，较佳的剂量是50-500毫克/千克体重。当该活性成分局部外用于皮肤或作为吸入剂时，通常是用0.005％到约5％活性成分与载体一起，较佳的是约0.05％到约0.5％活性组分与载体混合使用。
每单位剂型(适合给药的组合物)含大约0.005％到约0.5％活性成分。在这些药物组合物里，活性成分通常占组合物总重量的大约0.5-95％。
典型的是，此活性成分可局部外用给予，作为吸入剂或在发炎的关节或软骨里注射。然而另外，乳铁蛋白产物可口服给药，以固体或半固体剂量形式，如硬胶囊或软明胶胶囊，片剂或粉末剂，或为液体剂型，如酏剂、糖浆剂或悬浮剂。也可非胃肠道给药，以无菌液体剂型。其它剂型可为潜在可能的剂型，如贴膏剂或软膏剂或透皮给药。
本发明的乳铁蛋白也可配制成缓释植入装置以延长和缓慢地给予乳铁蛋白产物。这类缓释制剂的例子包括生物相容聚合物，如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-羟乙酸)、甲基纤维素、透明质酸、胶原蛋白等的复合物。在一些出版刊物里，包括A.Domb等，Polymers for Advanced Technologies 3279-292(1992)揭示了在药物输送运载体中可降解聚合物的结构、选择和使用。在M.Chasin和R.Langer(编辑)”生物可降解的聚合物作为药物输送系统(Biodegradable Polymers as DrugDelivery Systems”)“Drug and the Pharmaceutical Sciences”第45卷，A.Dekker，美国纽约1990，等文献可找到药物配制中聚合物的选择和使用指南。脂质体也可用于乳铁蛋白产物的缓释。如何使用和制备药物的脂质体制剂的详情可参见美国专利4,944,948；美国专利5,008,050；4,921,706；4,927,637；4,452,747；4,016,100；4,311,712；4,370,349；4,372,949；4,529,561；5,009,956；4,725,442；4,737,323；4,920,016。当需要乳铁蛋白高浓度局部给予时，缓释制剂尤为有用。
明胶胶囊或液体填充的软明胶胶囊可含活性组分和粉末化或液体载体，如乳糖、卵磷脂淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。相似的赋形剂可用来制备压制片剂。片剂和胶囊均可制备成缓释产品以在一段时间里持续释放药物。压制片剂可为糖包衣或膜包衣以掩盖令人不愉快的味道并将片剂与大气隔开，或为肠包衣以选择性地在胃肠道里崩解。口服的液体剂型可含有着色剂和/或调味剂以增加病人的接受程度。
Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，美国宾夕法尼亚(1990)-一本该领域标准的参考书，进一步描述了合适的药物载体，其全文纳人本文作为参考。
在优选的实施方案中，包含乳铁蛋白产物的药物组合物可局部外用给药以治疗过敏性皮肤疾病，作为吸入剂治疗诸如哮喘等肺部炎症疾病，以鼻喷雾剂治疗鼻炎和鼻窦炎，或以注射剂型治疗关节炎。除了乳铁蛋白产物外，这些组合物可包含其它活性成分，包括，但不限于，氢化可的松、维生素A酸或用于局部治疗的常规辅剂。下面阐述给予本发明乳铁蛋白的优选的药剂局部外用制剂若需要治疗皮肤炎症，优选的给药途径通常是局部外用给药。由于乳铁蛋白(例如)通过汗腺分泌(Masson等，1966，Clin.Chem.Axta 14735-739)，当局部外用给予时，乳铁蛋白产物通常可望进入皮肤的孔。到达其作用部位的活性物质的利用度会因皮肤表面损伤伴发炎症而进一步减少。或者，制剂中可加入增加皮肤渗透的物质。
一般来说，对于局部外用给药，乳铁蛋白可通过本领域公知的方法以药物上可接受的形式配制成溶液、凝胶、洗剂、软膏剂、霜剂、悬浮剂、糊剂、涂敷药、粉末、酊剂、气溶胶、透皮药物输送系统等。制备局部外用制剂的实际方法是本领域技术人员公知的，在Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，MackPublishing Company，美国宾夕法尼亚(1990)；和Pharmaceutaicl Dosage Forms andDrug Delivery Systems，第6版，Williams & Wilkins(1995)中有详细描述。
为了增加活性组分的透皮吸收，许多药剂可加入局部外用制剂中，包括，但不限于二甲亚砜、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、表面活性剂、azone、醇丙酮、丙二醇和聚乙二醇。另外，物理方法，如离子电渗疗法或声波传递法(sonophoresis)，也可用来增加透皮渗透。
药物组合物可直接用于皮肤。或者，它们可通过各种透皮药物输送系统，如贴膏剂来输送。
吸入剂的配制特别用来治疗肺部炎症疾病，如哮喘和支气管炎的含乳铁蛋白的组合物典型的是作为吸入剂给药。
一般来说，乳铁蛋白可用常规吸入剂给药。乳铁蛋白可单独使用，或与其它吸入气溶胶共同给药，包括，但不限于，β-肾上腺素能激动剂，如舒喘宁吸入气溶胶、salmeterol xinafoate吸入气溶胶、硫酸叔丁喘宁吸入气溶胶；肾上腺皮质甾族化合物，如倍他米松二丙酸酯吸入气溶胶；抗哮喘、抗过敏或肥大细胞稳定剂，如色甘酸钠吸入气溶胶；抗炎气溶胶，如去炎松醋酸酯局部气溶胶；抗胆碱能药，如，溴化异丙托品吸入气溶胶；或拟交感物质，如甲磺酸乙基异丙肾上腺素吸入气溶胶和硫酸异丙喘宁吸入气溶胶。Ansel等的药物剂型和药物递送系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，Williams & Wilkins，美国宾夕法尼亚(1995)提供了另外的指导供参考。
喷雾剂的配制特别用于治疗鼻炎、鼻窦炎和晒伤，含乳铁蛋白的组合物典型地以喷雾剂形式给药。
一般来说，可用诸如市售的常规喷雾装置给予乳铁蛋白产物。乳铁蛋白可单独给药，或与其它物质共同给药，包括，但不限于，抗组胺药、拟交感药和抗菌素。此外，乳铁蛋白可以在含药的气雾中，如氯化钠鼻溶液(Salinex溶液(Muro))或盐酸丁苄唑啉鼻溶液(Sine-Off(SmithKline Beecham))或功能性类似物气雾给药。药物剂型和药物递送系统(同上)提供了另外的指导供参考。
注射剂的配制对于特地用于治疗关节炎和蜂窝织炎，包含乳铁蛋白的组合物可通过注射给药，如局部注入患病的关节或软骨，或全身注射。
一般来说，水、油、盐水、右旋糖酐(葡萄糖)水溶液、聚山梨酸酯和有关的糖溶液和诸如丙二醇或聚乙二醇的多元醇适合作为非胃肠道给药溶液的载体。非胃肠道给药的溶液或乳剂宜含大约5-15％聚山梨酸酯80或卵磷脂，合适的稳定剂和需要时的缓冲物质。抗氧化剂，如，但不限于，氢硫化钠、硫化钠或抗坏血酸单独或组合使用，是合适的稳定剂。也可使用柠檬酸和其盐和EDTA钠。另外，非胃肠道给药溶液可含防腐剂，包括，但不限于，氯化苯甲烃铵、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯和氯丁醇。
Remington药物科学(同上)描述了供非胃肠道给药的其它合适的药物载体。
适应症如上所述，TNF-α在各种急性和慢性炎症疾病的发病机理和/或进程里起重要作用。结果，设计可用于治疗的TNF-α产生的合成的抑制剂引起了人们相当的兴趣。本文引用的证据表明，乳铁蛋白产物提供了调节TNF-α产生的手段。从这些资料里衍生得到的乳铁蛋白的潜在治疗用途有很多，包括，但不限于，治疗下列所讨论的需要治疗的哺乳动物，特别是人体的炎症。
接触性皮炎接触性皮炎是由于接触环境里的物质导致的湿疹性皮炎。这些物质是刺激剂或过敏原，可能引起急性、亚急性或慢性湿疹性炎症。刺激性接触性皮炎，即对皮肤的刺激是接触性皮炎最常见的形式。当接触是持续性时，温和的刺激剂会引起干燥、裂缝和红斑。例如，诸如手部、尿布区域等部分连续地暴露于湿气导致的婴儿尿布湿疹或结肠造口周围皮肤会最后导致红斑炎症。强的化学品会产生即刻的反应。参见T.P.Habif，临床皮肤学(Clinical Dermatology)，Mosby，Missouri(1996)和医学手册(The Textbook of Medicine)，编辑J.B.Wyngaarden和L.H.Smith，W.，W.B.Saundres公司，美国费城(1985)。
过敏性接触皮炎与刺激性接触皮炎相反，它是一种迟发型过敏反应，影响到数量有限的个体这些人在一次或数次接触对他们具有抗原活性的物质后发病。
刺激性和过敏性接触皮炎二者据信由局部免疫级联反应所引起，涉及到角质化细胞里TNF-α的从头表达的，其解释同上。
目前的治疗方法和它们的缺点。急性接触性皮炎目前用冷湿敷，同时给予类固醇，如氢可的松、去氢氢化可的松、甲基去氢氢化的可松，严重病例是氟代皮质类固醇，它们在极低浓度下是强效抗炎剂。比氟代类固醇、氢可的松、去氢氢化可的松和甲基去氢氢化可的松的效力更小的药物用于较不严重的病例。根据炎症的严重程度，类固醇局部外用给药或全身给药。
但是，已报道类固醇，特别是强效的氟代类固醇，有许多副作用。例如，上皮和真皮萎缩是一个可预见的副作用，减少胶原蛋白折合成和血管基质支持减少会导致毛细管扩张、紫癜和条纹。也已报道口周皮炎与氟代类固醇有关，还有脸部红斑的加剧，这绝对地限制了这些化合物扩大用于脸部。此外，眼内压的可能上升坚决禁止任何类固醇在眼睛附近的长时间外用。
已认识到局部外用类固醇的全身吸收有另外的危害。皮质醇的血药浓度可达闭合情况下身体的20％。在这些皮肤病中类固醇中断使用后，此类危险反弹的现象是不能忽略的。
总之，显然对于接触性皮炎需要有低毒性治疗方法。
本发明提供的改进的治疗方法。本发明提供了包含乳铁蛋白产物的新颖药用组合物来治疗接触性皮炎。在一个优选的实施方案中，所配制的组合物供局部外用。具体讲，乳铁蛋白产物可以洗剂、霜剂、膏剂等形式应用，浓度为大约0.005％-5％活性物质，在优选的实施方案里，浓度为大约0.01％到大约0.5％活性物质。通常，组合物包括用于局部外用给药的常规使用的辅剂。参见同上。在另一个实施方案中，组合物可配制成皮内注射剂。本发明的组合物可直接干扰角质化细胞产生TNF-α，这样，预防了会导致刺激性和过敏性接触皮炎的过度的局部免疫反应。由于已知乳铁蛋白是无毒的蛋白质，因此该组合物将不会有可检测到的副作用。
牛皮癣牛皮癣是一种慢性皮肤炎症，它会反复发作和缓解，并影响到世界人口的1-3％。在美国，一百万以上的人患有牛皮癣，其中多于11％的人经历了这类严重的残疾，以致危害到工作和效力。该疾病可在任何年龄发病，三十多岁达到峰值。其严重性、病程和缓解是不可预见的。参见，T.P.Habif，临床皮肤学(CliniicalDermatology)，Mosby，Missouri(1996)和医学手册，编辑J.B.Wyngaarden和L.H.Smith，W.，W.B.Saundres公司，美国费城(2985)。
患有牛皮癣的病人可分为两组，有遗传易感性的病人和对后成因素即环境因素。反应的那些病人，最常见的形式是慢性斑块性牛皮癣，其特征是表皮增生，真皮和表皮发炎。这些改变是由于在对未鉴定的抗原刺激反应中T-淋巴细胞活化介导了区域性淋巴结中的真皮免疫反应。活化的T-细胞引起角质化细胞增殖，并呈现牛皮癣表型。在对环境刺激应答中诱发的前炎症细胞因子蛋白引起了炎症反应，结果炎症性白细胞渗入真皮和表皮。
目前的治疗策略和它们的缺点。牛皮癣尚不能治愈，目前的治疗策略是寻求抑制该疾病的严重性和疾病程度的方法。身体受累＜10％病人的第一线疗法是局部给予抗炎药。美国最常用的药物是皮质类固醇(氢化可的松和其类似物)，因为它们短时间里极为有效，费用相对低廉。例如，全身给予皮质类固醇可导致牛皮癣病损的消退，但抑制需要不断加大剂量。当治疗逐渐减少时，就有反弹现象，病损可能扩大到鳞片样脱皮。如果有其它正当理由，对患牛皮癣的病人全身给予类固醇，在决定开始治疗时就应当认识到和权衡牛皮癣恶化的危险。
虽然牛皮癣对治疗的反应可能会引起一段时间的缓解，但重复给予会对治疗的抗炎作用产生耐药性，治疗效果持续不超过数月。此外，当使用的氢化可的松剂量超过标准(1％)时，婴孩会出现涉及脑垂体-肾上腺抑制的严重副作用。James等，1967，柳叶刀(lancet)21059-1061；Turpeinen，1991，Br.J.Dermatol.124358-360。也报告了类固醇另外的副作用，同上。
总之，确实需要有效而严重副作用较少的牛皮癣的治疗方法。
本发明提供的改进的治疗方法。我们对免疫反应在牛皮癣发病机理中所起中心作用理解的最新进展导致了我们应用免疫疗法缓解该疾病的研究。具体讲，业已显示，牛皮癣是由不适当的局部免疫反应引起的，该局部免疫反应涉及角质化细胞从头生成TNF-α。Gilhar等，1996，临床实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)106134-142。因此，本发明的一个实施方案是提供组合物，它直接干扰角质化细胞生成TNF-α，从而防止不适当的局部免疫反应导致牛皮癣。更具体地讲，本发明提供了新颖的药用组合物，包括用于治疗牛皮癣的乳铁蛋白产物。在一个优选的实施方案中，组合物被配制成在约0.5％到约5％载体里局部外用。在另一个实施方案里，组合物被配制成皮内注射的形式。
如上所述，牛皮癣据信是不可治愈的疾病，因此需要长期的治疗。本发明组合物与目前的治疗方法相比的一个重要优点在于，乳铁蛋白产物是低毒的(或无毒的)。
UV-诱发的炎症暴露于UV光是局部皮肤反应和疾病，包括皮肤晒伤性光老化和癌症的另一个重要来源。
目前的预防性治疗方法和它们的缺点。目前，通过使用具有光防护剂，如对-氨基苯甲酸，作为活性组分的防晒剂来减少光活性非离子化辐射向角质素下活的上皮细胞的渗透，即预防UV辐射的不良反应。这些光保护剂通常被设计用来防护较短波长范围290-320纳米的紫外光。防晒剂这样对黑色素的生成产生了不完全的阻断作用，黑色素是应对于穿透的辐射而产生，并能够通过晒黑来部分保护皮肤。
然而，许多炎症性皮肤反应和皮肤老化是由于长期受到320-400纳米范围(UVA)的较长射线引起的，对此通常的光保护剂不能提供保护。若需要对UVA进行保护，则需要诸如二氧化钛或氧化锌等物理防晒剂，它们可作为厚厚的霜剂或糊剂。但是，这些不透明的保护剂要象澄清的奶状洗剂来防护UVA几乎是不可能被接受的，此外，它们也不允许皮肤发生自身防护性晒黑反应，参见T.P.Habif，临床皮肤学(Clinical Dermatology)，Mosby，Missouri(1996)和医学手册(TheTextbook of Medicine)编辑J.B.Wyngaarden和L.H.Smith，W.，W.B.Saundres公司(美国费城)(1985)。
目前的治疗方法和它们的缺点。一旦发生UV-诱发的皮肤炎症，即晒伤，通常用冷敷和空闲来治疗。更严重的病例用强的松龙治疗，它会引起严重的副作用，如上皮和真皮萎缩，进而是如上所述的毛细管扩张、紫癜和条纹。
简言之，需要能预防和/或治愈UV5诱发的皮肤炎症的物质。
本发明提供的改进的预防和治疗方法。本发明提供了治疗和预防UV-诱发的皮肤刺激的改进的组合物和方法。更具体说，本发明的一个实施方案提供了新颖的UV防护组合物，包括常规的防晒基质和作为添加剂的预防发炎的乳铁蛋白。这些新颖的药物组合物易于预防UV-诱导的皮肤炎症，包括UVA诱发的炎症，同时允许皮肤晒黑。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含用于治疗UV-诱发的皮肤炎症的乳铁蛋白产物的药物组合物。
光老化皮肤如上所述，暴露于UV光的副作用之一是皮肤老化，也称为光老化。
目前用全反维生素A酸治疗光老化皮肤的方法和它的缺点。目前，局部外用全反维生素A酸对光损伤皮肤提供了某些逆转作用。Weiss等，1988，J.AMA259527-532。但是，大多数病人经历了全反维生素A酸诱发的皮炎的副作用，可能持续数周到数月。参见T.P.Habif，临床皮肤学(Clinical Dermatology)，Mosby，Missouri(1996)和医学手册(The Textbook of Medicine)，编辑J.B.Wyngaarden和L.H.Smith，W.，W.B.Saundres公司，美国费城(1985)。这样，需要改进的产物来治疗光老化皮肤。
本发明提供的改进的组合物。本发明提供了用来治疗光老化皮肤的改进的组合物和方法。更具体说，在一个实施方案里，本发明提供了常规的全反维生素A酸组合物，它包括乳铁蛋白产品作为对全反维生素A酸诱发的炎性副作用的保护剂。
抗皱产品近几年来许多局部外用的“抗皱”美容产品已进入市场。这些产品通常由想要预防脸部皮肤老化，甚至想逆转已发生的老化过程的个体使用，它们含有羟基酸作为活性组分。虽然这些产品似乎确实具有所需的“去皱”活性，但它们通常会引起皮肤发炎的副作用。因此，需要对目前使用的抗皱产品进行改进以减轻它们的发炎副作用。
本发明提供的改进的组合物。根据本发明，乳铁蛋白可加到常规的抗皱霜剂、洗剂和其它产品里，作为预防羟基酸诱发的发炎副作用的添加剂。
痤疮导致皮肤发炎或与皮肤发炎有关的另一个疾病是痤疮，一种干扰许多人生活质量的皮肤疾病。参见T.P.Habif，临床皮肤学(Clinical Dermatology)，Mosby，Missouri(1996)和医学手册(The Textbook of Medicine)编辑J.B.Wyngaarden和L.H.Smith，W.，W.B.Saundres公司，美国费城(1985)。
目前用全反维生素A酸治疗光老化皮肤的方法和它的缺点。对于较轻的疾病，通常局部外用抗微生物制剂，如苄基过氧化物，或氯林可霉素、四环素或红霉素。
另一种方法是，该疾病可用全身广谱抗微生剂治疗。但是，虽然局部外用疗法更为有效，但这类治疗方法常常不产生所需的效果，此外，它们与严重的副作用有关。例如，虽然四环素是常用的，但具有牙变色、光敏感的危险，甚至通过药物与口服避孕剂的相互作用产生意料之外的怀孕。由于它们可进入生长中的骨架和牙齿，它们不可处方给予4个月的胎儿到12岁的儿童。也有可能在应激时，如怀孕时从骨头流走，结果母亲有患肝炎或胎儿吸收的危险。红霉素是有用的，然而常常导致胃肠道问题。
更严重的痤疮可能需要更广泛的外科手术，较高剂量的抗微生物剂、病损内给予类固醇或甚至全身给予类固醇，雌激素已选用于患有严重的顽固痤疮的妇女，结果良好，但作为环状雌激素孕激素疗法使用它们都停止排卵不能怀孕的附带危险。
总之，目前治疗痤疮的方法常常不能让病人满意地治愈，同时也有相当严重的副作用。因此，需要有效低毒的疗法。
本发明提供的改进的组合物。本发明提供了包含乳铁蛋白产物的有效的组合物供治疗痤疮相关的炎病。通常，此组合物按治疗接触性皮炎所用组合物相似折方法来配制。
关节炎关节炎，即关节软骨的发炎，与许多原因有关，已知有各种表现。如，关节炎可为自身免疫性疾病，或由过敏原诱发。参见医学手册(Textbook of Medicine)，编辑J.B.Wyngaarden和L.H.Smith，W.，W.B.Saundres公司，美国费城(1985)。
目前的治疗方法和它们的缺点。目前，关节炎通常用皮质类固醇或其它类固醇进行全身性给药治疗。有关类固醇治疗的问题如上所述。此外，目前治疗关节炎的方法没有一种能停止疾病的进程，还可能导致骨骼变形。这样，需要改进的组合物和方法治疗关节炎。
本发明提供的改进组合物。本发明提供了包含乳铁蛋白产品的新颖的组合物，它可抑制过敏原介导的炎症，用来治疗许多形式的关节炎。此外，由于自身免疫反应的介导看来像过敏原涉及的免疫反应那样有赖于相似的机理，即二者均是由TNF-α介导的，可以推测提供的本组合物也具有治疗与自身免疫病有关关节炎的价值。在本发明的一个实施方案中，含乳铁蛋白产物作为活性组分的组合物被直接注入患病的关节中。其它抗炎剂，如水杨酸酯可用作辅剂。在本发明的另一个实施方案里，乳铁蛋白产物可通过注射全身给药，或以缓释产品的形式给药。本发明组合物与治疗关节炎已知产品相比的一个优点是(1)有效性，直接妨碍疾病的推动力，即关节发炎，从而防止疾病加重，(2)无毒，即如上所述，已证明乳铁蛋白产品对人体和其它哺乳动物没有毒性。
肺部炎症性疾病肺部炎症疾病，如过敏性哮喘和支气管炎是特征为气管和支气管对各种刺激，如过敏原的反应性增加，导致大范围气道狭窄的疾病。例如，哮喘是呼吸系统应答外部刺激的炎症反应。在严重的病例中，哮喘会因缺乏氧气供给而引起死亡，美国多达5％的人可能受此病折磨。在2到17岁年龄之间的过半病例被诊断为哮喘，在该年龄组它导致了疾病和残疾。参见医学手册，编辑J.B.Wyngaarden和L.H.Smith，W.，W.B.Saundres公司，美国费城(1985)。
目前的治疗方法和它们的缺点。目前的治疗方法包括给予拟交感药物，甲基黄嘌呤和皮质类固醇。拟交感药物包括肾上腺素和异丙肾上腺素，具有β-肾上腺素能作用。它们的使用仅限于对心脏的作用，此外，重复使用后会产生耐药性。甲基黄嘌呤据信会通过它们对细胞质酶磷酸二酯酶的作用引起平滑肌松弛，在许多病例中引起厌食、恶心、胃肠道失调和中枢神经系统兴奋。皮质类固醇在治疗哮喘中极为有效，但它们有上述严重的副作用。因此，需要有效同时低毒性的新颖组合物和方法治疗哮喘。
本发明提供的改进的组合物。本发明提供了包含乳铁蛋白产物的新颖的组合物和方法来治疗哮喘。通常此组合物可作为吸入剂给予。另外，含乳铁蛋白产物的组合物可通过注射或片剂、胶囊剂或缓释剂型进行全身给药。即使在高剂量下，本发明组合物也没有明显的副作用，因为乳铁蛋白是天然、无毒的蛋白质。
下列实施例更详尽地解释了本发明。下列制剂和实施例使本领域技术人员能更清楚地理解和实施本发明。但本发明的范围不为所例举的实施方案所限定，它们只是本发明阐述的一个方面，方法是本发明范围里的功能等价物。确实，除了本文所描述外，本领域技术人员显然还可从前述说明和附图里作出各种修改。这类修改也落在所附的权利要求书范围里。
优选的实施方案实施例1乳铁蛋白与产生TNF-α的角质化细胞上的受体的结合下列实施例是一种原位配体-结合试验，它显示125I-乳铁蛋白与新生小鼠皮肤上皮层里角质化细胞的结合。
实验过程。从新生野生型小鼠得到大约2毫米2背部皮肤样品，37℃用PBS简单淋洗两次，37℃，在0.5mlPBS/0.1％牛血清白蛋白里一式两份培养，所述的PBS含有(A)1.0×108125I-乳铁蛋白；和
(B)1.0×108125I-乳铁蛋白加上50倍过量未标记的铁饱和重组乳铁蛋白。
样品用冷的PBS/0.1％牛血清白蛋白洗涤6次，每次10分钟，固定在4％多聚甲醛里3小时而不振摇，然后以冷的PBS淋洗两次10分钟。马上冷冻样品。样品用于制备10μm切片，然后用浓度增加的乙醇使切片脱水。将该切片放在NTB-2乳剂里，4℃暴光7天和14天。展开后，用苏木精染色显影切片并用Permount固定。
乳铁蛋白与角质化细胞结合。原位杂交实验显示，乳铁蛋白在角质化细胞膜上积聚。参见，如图2。特别是，图2显示了乳铁蛋白与其在新生小鼠皮肤上产生TNF-α的角质化细胞上的受体原位结合。顶部两图显示只用标记乳铁蛋白(1.0×108125I-乳铁蛋白)得到的黑白视野图像。底部两图显示当有过量(50倍过量)未标记乳铁蛋白存在时进行结合试验的黑的视野图像。乳铁蛋白的结合集中在上皮和毛囊里，但在正常的真皮层没有观察到。这些结果表明，乳铁蛋白与其在上皮里角质化细胞表面上的受体结合。角质化细胞已知能产生TNF-α。
实施例2乳铁蛋白对DC积聚在引流淋巴结中的影响下列实施例显示乳铁蛋白抑制由噁唑酮和IL-1β诱发的树突细胞在引流淋巴结里的积聚，同时乳铁蛋白不影响通过给予TNF-α诱发的树突细胞的积聚。
实验过程。各组小鼠(n＝10)在两耳的耳郭里皮内注射30微升各悬浮在磷酸缓冲盐水里(PBS；pH7.2)的0.02％鼠乳铁蛋白(LF)或0.02％牛血清白蛋白(BSA)，2小时后，小鼠在同样的位点分别接受第二次皮内注射50ng(30微升)细胞因子，即TNF-α或IL-1β(悬浮在0.1％BSA/PBS中)，或两耳背面局部接触25微升溶于丙酮∶橄榄油(4∶1)中的0.5％噁唑酮(Ox)。对照小鼠不作处理。引流(耳)淋巴结在不同时间取出，然后根据每次处理所诱导的DC积聚的动力学将淋巴结分别接触TNF-α4小时，IL-1β17小时，噁唑酮18小时。随后，如前所述对每个淋巴结的树突细胞数进行评估。Cumberbatch和Kimber，1992，免疫学75257-263。
结果。如表1和图3A所示，用噁唑酮处理诱导了树突细胞在引流淋巴结里的积聚(条图4，与条图1对照组相比)。对噁唑酮-诱导的动物皮内给予乳铁蛋白结果抑制了树突细胞在引流淋巴结里的积聚达75％(噁唑酮/乳铁蛋白13,774树突细胞/每个淋巴结(基础水平以上)，噁唑酮/+乳铁蛋白3,394树突细胞/每个淋巴结(基底水平上)，参见表I)，这表明这些动物的局部免疫反应被乳铁蛋白所抑制。
如表I和图3A进一步显示，给予TNF-α诱导了引流淋巴结里树突细胞的积聚(参见图3A，条图2)。图3A，条图3反映的结果表明，乳铁蛋白对TNF-α诱发的局部免疫反应没有任何影响，即给予TNF-α/-乳铁蛋白导致4,753树突细胞/每个淋巴结(基础水平以上)，而给予TNF-α/+乳铁蛋白导致4,802树突细胞/每个淋巴结(基础水平以上)。这些结果表明，乳铁蛋白作用于免疫应答级联反应中TNF-α的上游。
如表I(B)和图3B所示，皮内给予IL-1β刺激了郎格尔汉斯细胞的迁移和树突细胞在引流淋巴结里的积聚(图3B，条图1)。给予乳铁蛋白导致免疫反应的抑制，如图3B，条图2所示，皮内注射乳铁蛋白导致抑制了树突然细胞的积聚达56％(IL-1β/-乳铁蛋白7,569树突细胞/每个淋巴结(基础水平以上)，噁唑酮/+乳铁蛋白3,342树突细胞/每个淋巴结(基础水平以上)，参见表I)。
这些结果表明(1)树突细胞的积聚依赖于IL-1β水平的增加，和(2)IL-1β作用于TNF-α的上游，因为TNF-α诱发的免疫反应不受乳铁蛋白影响。
这样，IL-1β刺激了角质化细胞从头合成TNF-α。此外，这些资料显示乳铁蛋白对郎格尔汉斯细胞迁移和树突细胞积聚的抑制作用是由于负调节了TNF-α的产生，而不是通过影响郎格尔汉斯细胞的功能。因此，乳铁蛋白能抑制TNF-α的从头合成。
表1乳铁蛋白对DC在引流淋巴结里积聚的影响<
<p>实施例3乳铁蛋白对TNF-α-和IL-1β-诱导的郎格尔汉斯细胞迁移的影响下列实施例显示，乳铁蛋白抑制了IL-1β-诱导的郎格尔汉斯细胞的迁移，但它不影响TNF-α诱导的郎格尔汉斯细胞的迁移。
实验过程。各组小鼠(n＝3)在两耳的耳郭里皮内注射30微升各悬浮在磷酸盐缓冲的盐水里(PBS；pH7.2)的。0.005％鼠乳铁蛋白(LF)或0.005％牛血清白蛋白(BSA)，2小时后，小鼠在同样的位点分别接受第二次皮内注射50ng(30微升)细胞因子，即TNF-α或IL-1β(悬浮在0.1％BSA/PBS中)，或两耳背面局部接触25微升溶于丙酮∶橄榄油(4∶1)中的0.5％噁唑酮(Ox)。对照小鼠不作处理。在TNF-α处理后30分钟或IL-1β处理后17小时取下耳朵，如前所述制备上皮片。Cumberbatch等，1994，Immunology 81395-401。用间接免疫荧光法测量郎格尔汉斯细胞(LC)的频率。结果以4个样品，每个样品检查10个视野的平均细胞数/毫米3(±SE)表示。实验组之间差异的统计学意义用Student’s t-检验进行计算，p＜0.005。
结果。如表II和图4所示，皮内给予IL-1β导致刺激郎格尔汉斯细胞的迁移被乳铁蛋白所抑制。给予TNF-α也导致郎格尔汉斯细胞的迁移但不被乳铁蛋白所抑制。
这些结果证实，在局部免疫应答级联反应中，IL-1β作用于TNF-α的上游，乳铁蛋白作用于IL-1β的下游，但作用于TNF-α的上游。
表 II乳铁蛋白对TNF-α和IL-1β-诱发的郎格尔汉斯细胞迁移的影响
实施例4乳铁蛋白对树突细胞在引流淋巴结里积聚的影响下列实施例显示，当局部给予乳铁蛋白时，它能抑制由噁唑酮诱发的树突细胞在引流淋巴结里的积聚。
实验过程。各组小鼠(n＝6)在两耳背部局部外用溶液溶于lubriderm洗剂的0.02％乳铁蛋白或0.02％牛血清白蛋白(BSA)溶液。稍后，小鼠的相同位点处局部接触25微升溶于丙酮∶橄榄油(4∶1)里的0.5％噁唑酮(Ox)溶液。对照小鼠不作经处理。在局部接触后18小时取出引流淋巴结，如上所述评估每个淋巴结里树突细胞的数量。Cumberbatch等，1992，Immunology 75257-263。
结果。如图5所示，两个独立实验的结果(图A和B)表明，用噁唑酮处理诱发了树突细胞在0.02％BSA预处理小鼠引流淋巴结里的积聚(参见图A和B的条图2对条图1对照)。在两个实验中局部给予鼠乳铁蛋白导致强烈抑制噁唑酮引起的树突细胞在淋巴结里的积聚(参见图A和B的条图3)。
结果表明局部外用给予乳铁蛋白能极有效地抑制对过敏原反应中树突细胞在淋巴结里的积聚，并因此抑制了过敏原诱发的皮肤炎症。
图5显示当乳铁蛋白局部外用于皮肤表面时，乳铁蛋白对噁唑酮引起的树突细胞在引流淋巴结里的积聚的抑制作用。
所有说明书里引用的参考文献都全文纳入作为参考。
本文提供的实施例仅供例举。本发明仅受所附的权利要求书的限定。
权利要求
1.一种抑制IL-1β的炎症活性的方法，它包括给予药学上有效量的乳铁蛋白产品的步骤。
2.一种组合物，它包括(a)产生局部炎症反应的治疗或美容化合物，和(b)乳铁蛋白产物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中化合物(a)选自全反维生素A酸、光防护剂和羟基酸。
4.根据权利要求2或3所述的组合物，它还包括药学上可接受的载体或美容载体。
5.一种治疗哺乳动物的过敏原诱发的炎症疾病的方法，它包括对哺乳动物给予治疗有效量的乳铁蛋白产品。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的哺乳动物是人。
7.根据权利要求1、5或6任一所述的方法，其中过敏原诱发的炎症疾病特征是TNF-α产生增加引起的局部免疫反应。
8.根据权利要求1和5-7任一所述的方法，其中乳铁蛋白产品是天然的乳铁蛋白。
9.根据权利要求1和5-7任一所述的方法，其中乳铁蛋白产品是重组产生的乳铁蛋白或其生物活性类似物。
10.根据权利要求1和5-7任一所述的方法，其中乳铁蛋白产品是乳铁蛋白的生物活性片段。
11.根据权利要求1、5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中炎症疾病选自关节炎和肺部炎症疾病。
12.根据权利要求1、5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中炎症疾病是皮肤炎症疾病。
13.根据权利要求1、5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中炎症疾病选自接触性皮炎、牛皮癣、UV-诱发的炎症、婴孩尿布湿疹和痤疮。
14.根据权利要求1、5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中乳铁蛋白产品以组合物形式给予，所述的组合物还包含抗皱剂，炎症疾病是脸部皮肤衰老。
15.根据权利要求1、5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中炎症疾病是哮喘。
16.根据权利要求1、5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中炎症疾病是鼻窦炎。
17.根据权利要求1、5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中炎症疾病是鼻炎。
18.根据权利要求5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中炎症疾病是支气管炎。
19.根据权利要求5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中炎症疾病是支气管炎。
全文摘要
本发明涉及治疗过敏性疾病的药物组合物和方法,所述的过敏性疾病的特征在于包括炎症性皮肤反应、哮喘和关节炎的局部免疫反应。
文档编号A61K31/203GK1262625SQ98805584
公开日2000年8月9日 申请日期1998年4月10日 优先权日1997年4月10日
发明者I·金伯, M·坎伯巴奇, R·J·迪尔曼, O·M·康萘利, P·沃德 申请人:阿吉尼克斯股份有限公司