专利名称：芋螺毒素肽的制作方法
技术领域：
本发明公开了14种芋螺毒素肽，特别涉及从我国海南岛采集的织锦芋螺和线纹芋螺中发现的14种芋螺毒素肽，属于生物领域。
芋螺属于软体动物门，腹足纲，前鳃亚纲，芋螺科，芋螺属。目前公知的芋螺种类约有500种，我国约有70种。芋螺毒素大多属于神经毒素，毒性强，作用迅速，每一种芋螺毒液中的毒性成分复杂多样。目前已从不同芋螺中分离到约40种芋螺毒素，根据其所作用的受体可以分为以下六类Alpha芋螺毒素，作用于n-乙酰胆碱受体Omega芋螺毒素，作用于钙离子通道受体Delta芋螺毒素，作用于钠离子通道受体M/O芋螺毒素，作用于钠、钙离子通道受体Miu芋螺毒素，作用于钠离子通道受体Kappa芋螺毒素，作用于钾离子通道受体上述芋螺毒素在序列上通常由10～30个氨基酸组成，有保守的半胱氨酸排列，通常含2到3对二硫键。芋螺毒素翻译以后通常是由70～80个氨基酸组成的前体肽，经过切除信号肽序列和原肽序列等翻译后加工而得到成熟毒素肽。芋螺毒素虽然都具有相似的空间结构和二硫键框架，但其序列上相差一个氨基酸就可能具备新的受体特异性，意味着在受体研究中提供了一种新的工具，在新药开发上提供了一种新的候选药物和先导药物。芋螺毒素除了在受体研究中作为重要的工具外，还在临床治疗上和疾病诊断上有应用前景，这些应用包括镇痛、缺血性神经保护、增加病理状态下的神经递质释放、小细胞肺癌的治疗和检测、作为植物杀虫剂等。
本发明的目的在于公开从我国海南岛采集的织锦芋螺(Conustextile)和线纹芋螺(Conus striatus)中发现的14种芋螺毒素肽及其应用。
本发明的目的是这样实现的A．序列采用cDNA克隆的方法获取芋螺毒素的cDNA序列(SeqxN)，由cDNA序列推测出芋螺毒素的前体肽序列(Seqxp)，由前体肽序列推测出成熟芋螺毒素肽序列(Seqx)，这些成熟毒素肽可以经化学合成或基因体外表达手段获得；本发明中14种芋螺毒素的毒素序列，毒素的cDNA序列和毒素的前体肽序列分别如下Seq1:PECCSDPRCNSSHPELCG**表示该毒素羧基端被酰胺化Seq1N:ATGGGCATGCGGATGATGTTCATCGTGTTTCTGTTGGTTGTCTTGGCAACCACTGTCGTTTCCTCCACTTCAGGTCGTCGTGCATTTCATGGCAGGAATGCCGCAGCCAAAGCGTCTGGCCTGGTCAGTCTGACTGACAGGAGACCAGAATGCTGTAGTGATCCTCGCTGTAACTCGAGTCATCCAGAACTTTGTGGTGGAAGACGCTGASeq1p:GMRMMFIVFLLVVLATTVVSSTSGRRAFHGRNAAAKASGLVSLTDRRPECCSDPRCNSSHPELCGGRRSeq2 :PECCSHPACNVDHPEICRSeq2N:ATGGGCATGCGGATGATGTTCACCGTGTTTCTCTTGGTTGTCTTGGCAACCACCGTCGTTTCCTTCACTTCAGGTCGTCGTACATTTCATGGCAGGAATGCCGCAGCCAAAGCGTCTGGCCTGGTCAGTCTGACTGACAGGAGACCAGAATGCTGTTCTCATCCTGCCTGTAACGTAGATCATCCAGAAATTTGTCGTTGAAGACGCTGASeq2P:MGMRMMFTVFLLVVLATTVVSFTSGRRTFRGRNAAAKASFLVSLTDRRPECCSHPACNVDHPEICRSeq3 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上述14种芋螺毒素中，Seq1～Seq8来自织锦芋螺，其中Seq1和Seq2属于Alpha芋螺毒素；Seq9～Seq14来自线纹芋螺，其中Seq9～Seq11属于Omega芋螺毒素。
B．应用毒素Seq11具有镇痛活性，可以作为一种镇痛药物。
具备上述序列的芋螺毒素肽，有以下优点(1)由于毒素序列相差一个氨基酸就可能产生新的受体特异性，因而上述14种新的毒素皆有其独特的受体特异性和亲和力，在受体的研究中具有价值，是新药开发的候选药物和先导药物；(2)毒素Seq11通过阻断钙离子通道发挥作用，具有镇痛活性强，耐受性小的优点。
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。
图1是本发明实施例3中采用的表达载体pTrxFus的质粒图谱。其中pTrxFus-质粒名称pL-人噬菌体pL启动子ATG-起始密码子 Thioredoxin-硫氧还蛋白Ek-肠激酶识别位点 term-转录终止信号序列COIE1-大肠杆菌质粒复制控制序列β-Lactamase-β-内酰胺酶(氨苄青霉素抗性基因)实施例1．织锦芋螺Alpha芋螺毒素cDNA的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)织锦芋螺属食螺性芋螺，对软体动物显示强烈毒性，对人也有致死作用，历史上曾有因织锦芋螺对人的叮咬而中毒死亡的实例。Newcomb R等人曾采用传统的生化分离手段发现织锦芋螺毒液中会有数十种毒素，但他们未能阐明其序列和生物活性。目前从织锦芋螺中发现的毒素有TxⅠA、TxⅠB、TxⅡA、TxⅥA、TxⅦ、TxⅦA、KK-1、KK-2、惊厥肽、瘙痒肽等，这些分别属于Omega、Delta芋螺毒素，尚未从中发现Alpha芋螺毒素。Alpha芋螺毒素由于能区别神经和肌肉型乙酰胆碱受体(nAch-R)，因而在nAch-R的研究中有重要作用。另外Alpha芋螺毒素能结合并阻断小细胞肺癌细胞表面的nAch-R，在小细胞肺癌的诊断和治疗中有潜在应用价值。
研究表明从不同芋螺中分离的Alpha芋螺毒素和Kappa A芋螺毒素cDNA其信号肽编码序列和3’端非翻译区十分保守，因而将这两类芋螺毒素称为A-族芋螺毒素，其cDNA可以采用针对这些保守区域设计的引物来扩增。为了从我国南海产织锦芋螺中分离新的Alpha芋螺毒素序列并研究其应用价值，我们解剖12只采自我国海南三亚并-70℃保存的织锦芋螺(平均大小长7～8cm，宽3～4cm)并分离其毒管，共得到6克毒管用于mRNA的分离。
采用Invitrogen公司的Fast Track 2.0Kit mRNA分离试剂盒提取毒管mRNA，用Pharmacia Biotech公司的TimeSaver cDNA合成试剂盒以T18为引物进行反转录(具体操作照试剂盒说明书进行)。用分别与A-族芋螺毒素的信号肽编码部分配对的引物P1(5’TCTGCGAATGGGCATGCGGATGATGTT3’)和与3’端非翻译部分配对的引物P2(5’TGCTCCAACGTCGTGGTTCAGAGGGTC3’)进行PCR扩增获得织锦芋螺的Alpha芋螺毒素cDNA。
使用Taq DNA聚合酶(华美生物工程公司)和Vent DNA聚合酶(BioLabs公司)以100∶1的比率混合进行PCR扩增以减小突变率。PCR按常规反应条件，反应体积为20μl，循环参数为94℃，变性3min后，94℃ 30s,50℃ 30s,72℃ 30s，共25个循环。获得的PCR产物用Promega公司的Wizard PCR Preps试剂盒纯化，经磷酸化处理以后连接到SmaⅠ处理并去磷酸化的克隆载体pUC18中以供序列分析。序列分析在Applied Biosystem公司的373A型DNA测序仪上进行。
分别从两批PCR产物形成的重组质粒中随机挑取重组子进行序列分析，从其中一批测定了9个克隆，另一批测定了10个克隆，结果得到了两种不同的cDNA序列，分别为Seq1N和Seq2N。两批克隆中编码Seq1N的各有7个，而编码Seq2N的分别有2个和3个克隆。由Seq1N和Seq2N推测得到的芋螺毒素前体肽的序列Seq1p和Seq2p。根据已知芋螺毒素的翻译后加工规律，推测Seq1p和Seq2p经翻译后加工分别得到成熟Alpha芋螺毒素Seq1和Seq2，其半胱氨酸的排列方式为CCX4CX7C，属4/7亚型Alpha芋螺毒素。
实施例2．从线纹芋螺中获得O-超家族芋螺毒素序列我国南海有约70种芋螺分布，但食鱼芋螺的种类和数量不多。线纹芋螺是我国海南可采到的少数食鱼芋螺种类之一，其毒液对人类也有毒性。目前采用生化分离手段已从中发现两种Omega芋螺毒素(SⅥA和SⅥB)、三种Alpha芋螺毒素(SⅠ,SⅠA,SⅡ)、一种Kappa A芋螺毒素(SⅣA)和一种芋螺加压肽，这些毒素至少在目前尚不能应用于临床。
至今文献已报道了7种芋螺毒素的cDNA序列，它们虽分别属于Omega,Delta、Kappa和M/O芋螺毒素，其信号肽编码部分十分保守，因而有人将这几类芋螺毒素合称为O-超家族芋螺毒素。O-超家族芋螺毒素cDNA信号肽编码部分的保守性和真核mRNA都具有polyA尾的特点为我们利用RACE(Rapid Amplification ofcDNAEnds，快速扩增cDNA末端)方法扩增线纹芋螺的O-超家族芋螺毒素cDNA提供了方便。我们采用RACE方法从线纹芋螺和织锦芋螺中寻找新的O-超家族芋螺毒素序列。
采用实施例1中的方法从25只线纹芋螺毒管中提取毒管mRNA，用同样的方法以P3〔GGCCACGCGTCGACTAGTACT(18)(A/G/C)N〕为引物进行逆转录合成cDNA。取0.5μl逆转录产物为模板，加入20ng5’端PCR弓物P4〔TATGAAA CTGACGTG(C/T)(A/G)TG(A/G)TGATCGT〕和20ng 3’端PCR引物P5〔GGCCACGCGTCGACTAGTAC〕，按常规反应条件用Taq DNA聚合酶(华美生物工程公司)进行PCR扩增，反应体积为20μl，在Perkin Elmer公司的9600型热循环仪上进行反应。循环参数为94℃变性3min后，94℃ 30s,50℃ 30s,72℃ 30s，共25个循环。
PCR扩增产物经Promega公司的Wizard PCR Preps试剂盒纯化后连接到Promega公司的pGEMR-T载体中，转化大肠杆菌DH5α后在含有X-gal的氨苄琼脂平板上挑白色菌落进行PCR鉴定。鉴定为阳性的菌落经扩增后采用QIAGEN公司的QIAprep Spin Miniprep试剂盒纯化克隆质粒以供序列分析。质粒DNA的测序采用AppliedBiosystem公司的373A DNA测序仪进行自动序列分析。通过对获得的约30个重组质粒进行DNA序列分析，从我国海南采集的线纹芋螺中共分离到8种芋螺毒素序列，其中6种为尚未见报道的新的O-超家族芋螺毒素(Seq9～Seq14)。
采用同样的方法从织锦芋螺获得6种新的O-超家族芋螺毒素(Seq3～Seq8)。
实施例3．芋螺毒素Seq3在大肠杆菌中表达体外表达是获得芋螺毒素的方法之一，尤其是当毒素的化学合成比较困难时(例如，本发明中Seq3由于疏水性氨基酸含量过多，合成的小肽不溶于水)。由于芋螺毒素通常只有10～30个氨基酸，因而融合表达是一种方便的选择。融合蛋白分子量适中，容易检测和纯化，而且在融合状态下有利于毒素肽的折叠。纯化后的融合蛋白经序列特异性蛋白酶的切割，即可释放出所需要的芋螺毒素。
本实施例中通过与大肠杆菌硫氧还蛋白(TrxA)融合以实现在大肠杆菌中表达毒素Seq3。采用的表达载体为Invitrogen公司的pTrxFus。该质粒图谱如图1，有氨苄青霉素抗性基因、质粒复制控制序列ColE1和用于插入外源目的基因的多克隆位点。多克隆位点在硫氧还蛋白TrxA基因的下游，以合适的框架插入目的基因即可获得融合蛋白。
首先以引物P6(TGCCTTGATGCTGGTGAA)和引物P5从含有Seq3N的克隆质粒中进行PCR扩增，以获得编码Seq3成熟肽毒素的cDNA片段，用SalⅠ酶37℃处理2小时。将表达载体pTrxFus用KpnⅠ酶切处理后用T4 DNA聚合酶削平，再用SalⅠ酶37℃处理2小时。将上述处理的载体和编码Seq3成熟肽毒素的cDNA片段用T4 DNA连接酶在4℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌GI724的感受态细胞，菌落用P5和P6进行PCR鉴定，阳性菌落即含有我们所需要的表达质粒pTrxFus/Seq3。融合蛋白中TrxA和Seq3之间含有一个肠激酶的特异切割位点，用肠激酶作用融合蛋白可以从融合蛋白中获得毒素肽Seq3。
将含有表达质粒pTrxFus/Seq3的大肠杆菌GI724在丰富培养基中进行扩增(含1×M9盐，2％ Casamino Acids,1％甘油，1mmol/L MgCl2,100μg/ml氨苄青霉素)。30℃培养到OD600为0.5时加色氨酸到100μg/ml并转移到42℃进行诱导培养(培养基含1×M9盐，0.2％Casamino Acids,0.5％葡萄糖，1mmol/L MgCl2,100μg/ml氨苄青霉素)，诱导3小时后进行SDS-PAGE分析。结果诱导后的细菌在约15KD的位置出现表达带。表达产物经复性和初步纯化后用肠激酶切割即可得到Seq3毒素肽。
实施例4．芋螺毒素Seq11的化学合成化学合成是获得芋螺毒素的一种方便、快捷的方法。采用固相化学合成方法合成了毒素Seq11。起始Rink树脂0.14g(0.1mmol)，Fmoc-氨基酸0.5mmol，活化剂HOBt-BCC，在433A(PE公司)多肽合成仪上合成，得肽-树脂0.58g。
将上述肽-树脂置于裂解液(含0.75g苯酚，0.25ml 1,2-二巯基乙醇，0.5ml苯硫基甲烷，0.5ml蒸馏水，10ml三氟乙酸)中裂解2小时，过滤，三氟醋酸洗涤，将裂解液减压浓缩至2ml，加入100ml无水乙醚沉淀，过滤，沉淀用20％的乙酸溶解，冻干后得230mg肽。
将冻干肽用10％乙酸溶解，用G-25层析，5％乙酸洗脱除去裂解小分子，收集目标肽冻干。
将上述目标肽溶于0.1mol/L的NH4Ac缓冲液中(pH8.0，含1mmol/L半胱氨酸，1mmol/L EDTA)，肽浓度0.2mg/ml,10℃折叠48小时，冻干，用HPLC纯化。纯化柱为Zorbax 300 SB-C18,9.4×250mm。洗脱梯度为1～30分钟，8～28％B溶液(3ml/min)(A溶液为0.1％TFA,B为100％乙腈，含0.1％TFA)。
实施例5．毒素Seq11的镇痛活性测定用小鼠热板法测定化学合成的毒素肽Seq11的镇痛活性。小鼠选择体重为20g左右的雌性小鼠，随机分组，每组5只。脑内注射Seq11、MⅦA或生理盐水对照，分别于给药后不同时间测定小鼠在55℃热板上的痛阈值，以小鼠舔后足或后足抖动为疼痛反应的指示。为避免小鼠因过长时间的热刺激而受到伤害，超过60秒仍无疼痛反应的立即停止热刺激。当一组中只有个别小鼠痛阈值超过60秒时，计算平均痛阈时以60秒计。结果表明(表1)，在高剂量时(60ng/小鼠)给药后4小时仍有显著的镇痛活性。20ng/小鼠时，给药后30分钟有镇痛活性。Seq11的镇痛活性与国外正在进行临床试验研究的MⅦA的镇痛活性相当。
表1．热板法测定毒素seq11的镇痛活性
注＞60(n),x…y表示该组中有n只小鼠痛阈值大于60秒，其余几只痛阈值分别为x…y秒。
表权利要求
1．本发明公开了从我国海南岛采集的织锦芋螺和线纹芋螺中发现的14种芋螺毒素肽，是采用cDNA克隆的方法获取芋螺毒素的cDNA序列(SeqxN)，由cDNA序列推测出芋螺毒素的前体肽序列(Seqxp)，由前体肽序列推测出成熟芋螺毒素肽序列(Seqx)，这些成熟毒素肽可以经化学合成或基因体外表达手段获得；其特征在于A．序列本发明中14种芋螺毒素的毒素序列，毒素的cDNA序列和毒素的前体肽序列分别如下Seq1:PECCSDPRCNSSHPELCG**表示该毒素羧基端被酰胺化Seq1N:ATGGGCATGCGGATGATGTTCATCGTGTTTCTGTTGGTTGTCTTGGCAACCACTGTCGTTTCCTCCACTTCAGGTCGTCGTGCATTTCATGGCAGGAATGCCGCAGCCAAAGCGTCTGGCCTGGTCAGTCTGACTGACAGGAGACCAGAATGCTGTAGTGATCCTCGCTGTAACTCGAGTCATCCAGAACTTTGTGGTGGAAGACGCTGASeq1p:GMRMMFIVFLLVVLATTVVSSTSGRRAFHGRNAAAKASGLVSLTDRRPECCSDPRCNSSHPELCGGRRSeq2 :PECCSHPACNVDHPEICRSeq2N:ATGGGCATGCGGATGATGTTCACCGTGTTTCTCTTGGTTGTCTTGGCAACCACCGTCGTTTCCTTCACTTCAGGTCGTCGTACATTTCATGGCAGGAATGCCGCAGCCAAAGCGTCTGGCCTGGTCAGTCTGACTGACAGGAGACCAGAATGCTGTTCTCATCCTGCCTGTAACGTAGATCATCCAGAAATTTGTCGTTGAAGACGCTGASeq2P:MGMRMMFTVFLLVVLATTVVSFTSGRRTFRGRNAAAKASFLVSLTDRRPECCSHPACNVDHPEICRSeq3 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全文摘要
本发明公开了从我国海南岛采集的织锦芋螺和线纹芋螺中发现的14种芋螺毒素肽，属于生物领域。是采用cDNA克隆的方法获取芋螺毒素的cDNA序列(SeqxN)，由cDNA序列推测出芋螺毒素的前体肽序列(Seqxp)，由前体肽序列推测出成熟芋螺毒素肽序列(Seqx)，这些成熟毒素肽可以经化学合成或基因体外表达手段获得。具备上述序列的芋螺毒素肽，由于毒素序列相差一个氧基酸就可能产生新的受体特异性，因而上述14种新的毒素皆有其独特的受体特异性和亲和力，在受体的研究中具有价值，是新药开发的候选药物和先导药物；毒素Seq11通过阻断钙离子通道发挥作用，具有镇痛活性强，耐受性小的优点。
文档编号A61P29/00GK1237584SQ99106070
公开日1999年12月8日 申请日期1999年4月30日 优先权日1999年4月30日
发明者卢柏松, 黄培堂 申请人:解放军军事医学科学院生物工程研究所