专利名称：干扰素α5在治疗病毒性肝脏疾病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及干扰素α5的制品在用于治疗起源于病毒的肝脏疾病的组合物中的应用。
已知干扰素α5是由健康肝脏产生的干扰素α的唯一亚型，其水平在慢性丙型肝炎中明显降低，这表明该物质可能对该疾病和其它类型的病毒性肝炎具有治疗价值。已知该干扰素的编码基因序列，使用它在不同宿主通过DNA重组技术的制品有可能研制出有效的药物，用于在不同的发展阶段治疗该类肝病。
病毒感染是产生I型干扰素的主要刺激物，尽管还有其它可以增加其合成的因素，如细菌成分，双链RNA，生长因子和其它细胞因子(1)。除了具有抗病毒作用，IFNα可以与某些细胞因子和在免疫系统(3)调控细胞生长和分化的T细胞相互作用。IFNα基因在健康个体人组织中正常表达(4)，然而特殊亚型的表达受到某些细胞类型的限制(5，6)。IFN通过病毒的诱导主要在转录水平上被调控。通过病毒诱导的细胞因子与调控IFNα基因启动子的区域相互作用发生转录的特定激活(7)。
所有的IFNα和IFNβ在细胞表面具有共同的受体。对于不同IFNα亚型在受体部位的竞争性结合表明所有这些亚型在同一受体结合，但具有不同的亲和性(8)。对于IFNα不同亚型的生物学活性所知甚少。IFNα5和IFNβ8干扰素亚型显示具有更强的抗病毒活性。不同亚型间的抗增殖反应也不同(9)。在人类中，未刺激的外周血单核细胞表达不同的IFNα亚型(10)。
病毒感染的持续性的一般机理是IFN系统的缺乏。许多病毒已发展出避免IFN的抗病毒作用的策略。具体地说，在被人免疫缺陷病毒感染的单核细胞中报道了在产生IFNα中的选择性缺陷(11)。
丙型肝炎病毒(HCV)是单链RNA病毒，导致超过三分之二的被感染患者的慢性感染。被HCV感染的发病率占西方人口的大约2-3％。在欧洲的研究表明，33％的慢性HCV感染患者在之后平均小于20年的时间内发展成肝硬化(12)。这些患者中的很大一部分发展成肝癌，每年发病率为1.4％(13)。很难发现HCV感染持续性高发的原因。病毒的高速突变和与Th1相比Th2细胞因子占优势分布的产生，被认为是感染持续性高发的原因。应用IFN治疗在大约30％慢性丙型肝炎的患者中诱导持续的反应。对于应用IFN治疗导致反应或非反应的机理所知甚少。
仅在慢性HCV感染中研究过IFN系统。对于慢性HCV感染没有合适的动物模型，因此，对人进行的研究只能来源于慢性丙型肝炎病理生理学和发病机理的信息。本发明描述了IFNα和IFNβ基因在健康对照和慢性丙型肝炎患者的肝脏和外周血液单核细胞(PBMC)中的表达。另外，我们还分析了IFNα亚型在正常肝组织和慢性丙型肝炎患者肝组织中的表达。在健康对照和慢性丙型肝炎患者的PBMC中还分析了不同IFNα亚型的表达。
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另外，还测定了12名对照患者(男9人，女3人，年龄范围49-70)通过剖腹手术获得的12个正常肝样品的IFNα和IFNβ基因表达。剖腹手术是由于10名患者存在消化道肿瘤(4人结肠直肠癌，5人胃癌，1人胰腺癌)，1名患者患有慢性胰腺炎，另一人患有包虫囊肿。12例中肝组织学正常。这些对照病例在获得肝样品前没有接受治疗。
还测定了25名慢性丙型肝炎患者(男14人，女11人，年龄范围24-69)和23名健康对照(男10人，女13人，年龄范围25-66)PBMC中的IFNα和IFNβRNAm水平。这些患者的病毒基因型，22个患者为1b，2个患者为1a，1个患者为3。
慢性丙型肝炎的诊断基于血清转氨酶增加持续6个月，抗-HCV抗体结果为正(2nd generation ELISA，Ortho Diagnostic System，Raritan，NJ，USA)，血清中存在丙型肝炎病毒RNA(逆转录聚合酶链反应)，和慢性肝炎的组织学证据。肝损伤的严重性应用Knodell指标评价。排除了除丙型肝炎病毒外其它慢性肝炎的原因。在研究前至少6个月患者未接受IFNα治疗。肝，PBMC和血清样品的制备肝样品通过应用Tru-cut活检针进行肝活检获得(Baxter，Deerfield，IL)。三分之一的样品迅速进行液氮冷冻，保持在-30℃直到全部RNA提取完成。其余样品用于组织学研究。
PBMC应用具有Lymphoprep的密度梯度(Nycomed Pharma As，Oslo，Norway)从肝素化血液中分离，600g离心30分钟。离心后收集PBMC，用0.9％NaCl洗涤5次，应用UbtraspecTM蛋白变性溶液(BiotechLaboratories，Houston，USA)进行细胞溶解。细胞溶解物在-80℃下保存，直到应用Chomcznski和Sacchi(17)方法，全部RNA提取完成。
血清样品通过静脉血离心，无菌管收集获得。血清在-40℃下保存，直到应用。IFNα和IFNβ基因在肝和PBMC中表达的分析通过应用热循环仪(PerkinElmer Gene Amp PCR system 2400)，采用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法，测定了IFNα和IFNβRNAm水平。在逆转录前，2μg总RNA(来自肝和PBMC)用1单位脱氧核糖核酸酶(DNAse I扩增级，Gibco-BRL，Gaithersburg，MD，USA)处理，以消除可能的DNA污染。通过包括没有逆转录的对照反应，检查痕量DNA的存在。需要该步是由于不存在IFNα和IFNβ基因中的内含子(18)，这使我们不可能分辨出来自RNA的PCR产物或是可能的DNA污染。所有没有逆转录的对照反应为负，表明没有可能的DNA污染。应用400单位M-MuLV逆转录酶(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD，USA)，最终体积为40μl的5×盐溶液(250mMTris-HCI pH 8.3，375mM KCl，15mM MgCl2)，补充有5mM DTT，0.5mM二氧核糖核苷酸三磷酸盐(Eoehringer Mannheim，Mannheim，Germany)，48单位RNAsas抑制剂(Promeaa Corporation，MD，US)，和400ng随机六聚物(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)，对总RNA进行转录(60分钟，37℃)。逆转录酶变性后(95℃，1分钟)，迅速用冰冷却，10μl等份(0.5μg)cDNA用于扩增IFNα和IFNβ，通过50μl 10×PCR缓冲液中的PCR(160mM(NH4)SO4，670mM Tris-HClpH8.8，0.1％Tween 20)，补充有定向和反定向引物(40ng的每个IFNα和60 ng的IFNβ)，1.2mM MgCl2和2单位BiotaqTMDNA聚合酶(Biobine，London，LTK)。所有实验均进行没有RNA的对照实验。作为每个样品的内部对照，应用事先得到的10μl等份cDNA，扩增cDNAβ-肌动蛋白片段。IFNα扩增通过进行30或33周期(分别对应于PBMC或肝)(94℃，60℃和72℃分别为20，15和30秒)IFNβ扩增通过进行30或35周期(分别对应于PBMC或肝)(94℃，58℃和72℃分别为20，15和30秒)，β-肌动蛋白扩增通过反应18或25周期(分别对应于PBMC或肝)(94℃，55℃和72℃分别为20，15和30秒)，这些方案避免了与PCR反应饱和阶段相关的干扰。寡核苷酸(5’-3’)d(TCCATGAGATGATCCAGCAG)和d(ATTTCTGCTCTGACA ACC TCCC)分别用于定向和反定向引物，扩增位于人IFNα基因中240-514核苷酸间274碱基对的片段(19)。这些寡核苷酸的定向引物被设计成扩增IFNα的所有亚型。寡核苷酸d(TCTAGCACTGGCTGGAATGAG)和d(GTTTCGGAGGTAACCTGTAAG)为用于扩增位于人IFNβ基因中cDNA 349-625核苷酸间的276碱基对的片段的引物(20)。d(TCTACAATGAGCTGCGTGTG)和d(GGTGAGGATCTTCATGAGGT)为用于扩增β-肌动蛋白基因314碱基对(核苷酸1319-2079)片段的引物(21)。
扩增反应后，20μl产物通过含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶。应用紫外灯显示得到的带，使用能够将得到的图像数字化和分析的商业程序进行分析(Molecular Analyst/PC，Bio-Rad)。最后，对应于IFNα和IFNβ基因表达的值，用其相关的β-肌动蛋白校准。结果表示为IFNα和IFNβ值与相关β-肌动蛋白的比值。之前我们证明了β-肌动蛋白的RNAm在慢性丙型肝炎患者肝和PBMC中恒定表达(22)，这样我们可以应用得到的β-肌动蛋白校准IFNα和IFNβ值。
PCR技术的验证曲线应用已知量的总RNA(从0到1μg)制作。从图3所示，用于IFNα、IFNβ和β-肌动蛋白(0.5μg，在肝和PBMC中)的初始RNA总量，位于PCR扩增曲线的线性范围内。IFNα/β-肌动蛋白的交互实验变异系数为22％，IFNβ/β-肌动蛋白为24％。应用自动测序，对IFNα和IFNβ检查得到的PCR产物的同一性(ABIprismTM310基因分析仪，Perkin Elmer)。IFNα亚型的鉴别总RNA提取，逆转录，和PCR反应如上所述进行，应用上述的IFNα定向引物。获得的PCR产物应用商业的TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Leek，Holland)进行克隆。应用Dye Rhodamine TerminatorCycle Sequencing Kit(Perkin Elmer，Foster，CA)，在自动ABI PRISM310测序仪(Perkin Elmer，Foster，CA)上测定每个插入物的至少6个克隆物。丙型肝炎病毒RNA的检测，量化和基因型确定应用RT-PCR技术(14，22)，使用两对用于丙型肝炎病毒基因组非编码5’区的特异性引物，测定血清中丙型肝炎病毒RNA的存在。应用我们上述的竞争性PCR技术(22)，定量丙型肝炎病毒RNA。应用上述的Viazov’s方法(23)，测定病毒基因型(22，24)。测试5’G(A，G)CCGTCTTGGGGCC(A，C)AAATGAT用于测定基因型4。统计学分析IFNα和IFNβ结果表示为平均值±标准差。应用Shapiro-Wilks试验研究了变量常态。应用非参数实验(Mann-Whitney Utest)或参数实验(Student’s T)，对PBMC或肝脏IFNα和IFNβ值的进行统计学分析。如果适合，应用Pearson或Spearman相关系数研究定量变量间的联系。使用Windows SPSS 6.0程序进行统计学分析。重组蛋白制品大肠杆菌中人干扰素α5的表达和纯化尽管通常来源于大肠杆菌真核细胞有机体的cDNA的表达，可使涉及复杂程序和低产率的所需蛋白质具有高水平的产量、分离和纯化。因此，表达载体的使用有助于获得结合蛋白，其纯化减少至一个亲和色谱步骤，具有高的产量和效率。表达载体的建立和重组细菌的获得将编码干扰素α5的cDNA克隆到pET14b载体(从Novagen通过商业途径获得)中。该载体提供了编码一系列与克隆cDNA同框翻译的组氨酸残基(1kDa)的序列，以产生一种在其氨基末端包括1kDa组氨酸尾巴然后是干扰素α5的融合蛋白，在二者之间具有一个能被凝血酶切开的位点。
一旦获得表达载体，制备BL21(DE3)菌株的感受态细菌，因为该菌株含有可以被T7 RNA聚合酶诱导的基因，其对于之后的蛋白质的产生是必须的。将该感受态细菌用事先得到的载体(具有克隆的干扰素α5cDNA的pET14b)转化。通过在含有氨苄青霉素的LB培养基中的生长，选择转化细胞，因为该载体含有对这种抗生素抗性的基因。干扰素α5的表达和纯化转化细菌在含有氨苄青霉素的LB介质中37℃下生长，直到达到600nm下0.4的光密度。在最终浓度0.5mM下诱导具有IPTG的重组蛋白的表达。以这种方式乳糖启动子被诱导，结果含有该载体的并且调节克隆的cDNA表达的T7 RNA聚合酶启动子被诱导。培养物在同样条件下进一步生长4小时。
为了获得提取物，细菌培养后，在4℃下进行离心。将沉淀细菌再悬浮在10mM Tris/HCl缓冲液，10％蔗糖，2mM 2-巯基乙醇，和蛋白酶抑制剂。在4℃下与溶菌酶培养30分钟，进行超声均化。这可以打碎细菌壁，增加提取过程的产量。通过离心匀浆100,000g 90分钟，得到胞质溶胶提取物。通过SDS-PAGE分析胞质溶胶组份，检查蛋白质产物。
通过2ml镍柱中的胞质溶胶提取物层析，纯化组氨-干扰素α5融合蛋白。通过用1M咪唑洗柱，洗脱蛋白。应用凝血酶加工纯蛋白，随后通过分子排阻色谱法再纯化干扰素α5。人干扰素α5在Solanum tuberosum中的的表达和纯化表达载体的建立和转基因植物的获得在根瘤农杆菌表达载体上克隆编码为干扰素α5的cDNA。该载体中含有Solanum tuberosum启动子(在Solanum tuberosum块茎中含有最多的蛋白质)，以及编码一系列组氨酸并且与克隆cDNA同框翻译的序列(1kDa)，以产生一种在其氨基末端包括1Kda组氨酸尾巴然后是干扰素α5的融合蛋白，在二者之间具有一个能被凝血酶切开的位点。
一旦获得表达载体，制备根瘤农杆菌GV2260菌株的感受态细菌。使用事先得到的载体转化该感受态细菌。通过在含有卡那霉素的LB培养基中的生长，选择转化细胞，因为该载体含有对这种抗生素具有抗性的基因。
随后将转化细菌和植物材料(在体外培养的Solanum tuberosum叶)进行共培养，选择对抗卡那霉素的的植物细胞。再生这些细胞，直到获得转基因植物。干扰素α5的获得和纯化从表达干扰素α5的转基因植物块茎中进行全蛋白提取。
通过2ml镍柱中获得的蛋白质提取物层析，纯化组氨-干扰素α5融合蛋白。通过用1M咪唑洗柱，洗脱蛋白。应用凝血酶加工纯蛋白，随后通过分子排阻色谱法再纯化干扰素α5。健康个体中正常肝组织和PBMC的IFNα亚型正常肝组织样品的全RNA提取后，应用对所有IFNα亚型通用的引物扩增IFNα的RNAm。然后将PCR扩增产物进行克隆和测序。对四个不同正常肝脏的41个克隆进行分析，我们观察到41个克隆的IFNα序列是相同的，并且与IFNα5亚型相一致(表1)。该结果表明IFNα5是正常肝脏表达的唯一IFNα亚型。从所有克隆获得的IFNα5部分cDNA序列如SEQ ID NO1所示。
为了比较肝和PBMC中表达的IFN亚型的分布，对5个健康对照PBMC中的全RNA进行提取，应用对所有IFNα亚型通用的引物扩增IFNα的RNAm。在43个分析克隆中，15个与IFNα5亚型相一致，14个与IFNα1/13相一致，6个与IFNα21相一致，8个与其它IFNα亚型相一致(表1)。该结果表明，在PBMC中表达的IFNα亚型分布与正常肝脏中表达的不一致。慢性丙型肝炎患者的肝组织和PBMC中的IFNα亚型上面结果表明正常肝表达IFNα5，而PBMC表达多种IFNα亚型。在慢性丙型肝炎患者肝实质中，含有单核细胞渗入物，一种重要的IFNα源。这表明由慢性丙型肝炎患者肝脏表达的IFNα亚型分布可能不同于正常肝的分布。为了研究IFNα亚型在慢性丙型肝炎中的表达，我们从3个不同患者肝样品和2个PBMC样品中提取了总RNA。在将IFNα RNAm用对所有亚型通用引物扩增后，我们克隆并测序了24个肝组织克隆和18个PBMC克隆。如表1所示，慢性丙型肝炎患者PBMC表达IFNα21、IFNα5和IFNα7(分别为5，12，和1个克隆)。除了IFNα5亚型，在这些患者的肝组织中，我们还发现了IFNα21、IFNα17和IFNα1/13(分别为8，1，和2个克隆)(表1)。
这些数据表明IFNα通过单核细胞渗入物制备，可以引起慢性丙型肝炎患者肝组织中表达的IFNα亚型分布的改变。在慢性丙型肝炎患者和对照的PBMC和肝组织中的IFNαRNAm表达的水平从慢性丙型肝炎患者PBMC和肝组织样品(n分别为25和16)，健康对照的PBMC样品(n＝20)，从剖腹手术获得的肝组织样品(n＝12)中提取了全RNA。应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术(应用对扩增所有IFNα亚型通用的引物)，测定了IFNα亚型的RNAm水平。结果表示为IFNαRNAm与β-肌动蛋白的比。
与健康对照相比，我们发现IFNα在从慢性丙型肝炎患者PBMC中的表达水平明显增加(3.2±0.48对1.14±0.26；p＝0.001)(
图1A)。在病毒感染中如PBMC感染的丙型肝炎中预期得到该结果(14)。另一方面，与正常肝中表达的相比，慢性丙型肝炎患者肝组织中IFNαRNAm的表达水平明显减少。(0.12±0.03对0.43±0.12；p＝0.003)(图1B)。
如上所观察，IFNα5是在正常肝组织中检测到的唯一IFNα亚型，而在慢性丙型肝炎患者肝组织中观察到多种亚型的混合物。结果表明HCV感染明显减少通常在肝组织中表达的IFNα亚型的表达。令人感兴趣的是，慢性丙型肝炎患者肝组织中的IFNαRNAm水平与Knodell指数的直接相关性(r＝0.54；p＜0.05)。该发现，以及在慢性丙型肝炎患者肝组织中检测到的IFNα亚型为在PBMC所观察到的那些，表明大多数在慢性丙型肝炎患者肝组织中发现的IFNαRNAm来自炎性渗入物。这表明IFNα(IFNα5)在肝中表达的减少可能对HCV慢性感染起到部分作用。因此，考虑到其它作者描述的IFNα5的明显抗病毒和抗增生活性(9)，这些观察可以具有治疗性暗示。在慢性丙型肝炎患者和对照的PBMC和肝组织中的IFN RNAm表达的水平IFNβ，1型感染的第二种主要类型，是由单基因产生的糖蛋白。在IFNα和IFNβ基因的病毒感染转录中，可以通过不同的机理激活或抑制(15)。为了分析IFNβ在慢性丙型肝炎中的表达，我们测定了以前用于测定IFNα表达的肝组织和PBMC同样样品中的IFNβRNAm水平。
如图2所示，与健康对照和正常肝组织发现的PBMC相比，我们观察到IFNβ RNAm水平(表示为与β-肌动蛋白的比)在慢性丙型肝炎患者PBMC和肝中明显更高(在PBMC中1.66±0.2对0.88±0.16；p＝0.008，和在肝中1.37±0.23对0.97±0.16；p＝0.011)。这些结果表明当HCV引起IFNα在肝中被抑制，在肝组织和PBMC中IFNβ的表达都增加。这表明VHC以不同方式调控肝中不同的I型IFN基因，阻滞IFNα的生产，以使IFNβ过多表达。具有病毒负荷的IFNα和IFNβ基因表达间的关系，基因型和慢性丙型肝炎的肝损伤为了测定IFNα或IFNβ基因的表达与负荷病毒或基因型的相关性，我们应用竞争性PCR技术量化了所有患者血清中的丙型肝炎病毒RNA，应用与特殊实验材料的杂交方法，测定了VHC基因型。我们发现在IFNα或IFNβ基因的表达(在肝或PBMC中)与血清中的丙型肝炎病毒RNA水平或病毒基因型之间没有相关性。
分析I型IFN基因的表达与慢性丙型肝炎患者肝损伤的严重性之间的关系，我们发现肝中IFNβRNAm水平直接与血清天门冬氨酸氨基转移酶值(r＝0.64，p＝0.008)和Knodell指数(r＝0.66，p＝0.006)相关。同样，肝中IFNαRNAm值表明与如上所述的Knodell指数具有直接的正相关。
表1对照和慢性丙型肝炎患者中IFNα亚型
附图描述图1α干扰素/β-肌动蛋白RNAm(纵坐标)在健康对照和慢性丙型肝炎患者(HCV-RNA+)在外周血液单核细胞(A)和肝(B)中(横坐标)的表达。
图2β干扰素/β-肌动蛋白RNAm(纵坐标)在健康对照和慢性丙型肝炎患者(HCV-RNA+)在外周血液单核细胞(A)和肝(B)中(横坐标)的表达。
图3全RNA起始量(横坐标)与通过扩增PBMC(A)和肝(B)样品中IFNα(·)，IFNβ(▲)和β-肌动蛋白(◆)(纵坐标，以x mm2计算)RNAm获得的PCR产物带强度间的关系。
序列表一般信息申请人名称INSTITUTO CIENTIFICO Y TECNOLOGICO DE NAVARRA，S.A.街道Avenida Pio XII，53城市Pamplona州或省纳瓦拉国家西班牙邮政编码31008电话948-10 56 00传真948-17 52 23题目“干扰素α5在治疗病毒性肝脏疾病的应用”序列编号1联系地址名称INSTITUTO CIENTIFICO Y TECNOLOGICO DE NAVARRA，S.A.街道Avenida Pio XII，53城市Pamplona州或省纳瓦拉国家西班牙邮政编码31008计算机可读型介质类型3.5时盘计算机PC操作系统WINDOWS字处理WORD律师/代理人信息名称ALBERTO DE ELZABURU注册号232/1参考注册号P-99043电话联系信息电话91 7009400传真91 3193810电子信箱号elzaburu@elzaburu.esSEQ ID NO.1信息序列特征274个碱基对类型核苷酸链数1构型线性分子类型cDNA假设否反方向否有机体来源有机体Homo Sapiens组织类型肝基因组位置染色体9特征名称/关键词IFNα5鉴别方法RT-PCR，测序其它信息IFNα5基因序列的核苷酸672-945在Genbank数据库中公开，编号为X02956。序列SEQ ID NO.1的描述TC CAT GAG ATG ATC CAG CAG ACC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAC TCA50His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser1 5 10 15TCT GCT ACT TGG GAT GAG ACA CTT CTA GAC AAA TTC TAC ACT GAA CTT TAC 101Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr20 25 30CAG CAG CTG AAT GAC CTG GAA GCC TGT ATG ATG CAG GAG GTT GGA GTG GAA 152Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Val Gly Val Glu35 40 45 50GAC ACT CCT CTG ATG AAT GTG GAC TCT ATC CTG ACT GTG AGA AAA TAC TTT 203Asp Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Thr Val Arg Lys Tyr Phe55 60 65CAA AGA ATC ACC CTC TAT CTG ACA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCA TGG 254Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp70 75 80GAG GTT GTC AGA GCA GAA AT274Glu Val Val Arg Ala Glu85 90
权利要求
1.IFNα5或编码它的基因序列和/或基本上来源于它的基因序列在制备用于治疗肝病的组合物中的应用。
2.按照权利要求1的应用，用于制备用于治疗慢性丙型肝炎的组合物。
3.按照权利要求1的应用，用于制备用于治疗病毒引起的肝硬化的组合物。
4.按照权利要求1的应用，用于制备用于治疗肝细胞肿瘤的组合物。
5.按照权利要求1-4任何一个的应用，其中制备的组合物用于遗传诱导干扰素α5在细胞核水平的生理合成，在患病的肝细胞中缺乏这种合成。
6.按照权利要求1-4任何一个的应用，其中这种组合物的制备包括通过在一种适当的宿主中克隆一种表达载体产生施用于人类的重组蛋白质。
7.按照权利要求6的应用，其中克隆的宿主为真核细胞有机体，优选大肠杆菌。
8.按照权利要求6的应用，其中克隆的宿主为原核生物有机体，优选Solanum tuberosum。
9.按照前述权利要求任何一个的应用，其中制备的组合物为可以与食物一起摄取的组合物。
10.按照权利要求1-4任何一个的应用，其特征在于制备的组合物为用于体细胞基因治疗的组合物。
全文摘要
本发明涉及干扰素α5在治疗病毒性肝脏疾病的应用。本发明描述了IFNα5在丙型肝炎患者肝中与健康肝中(作为对照)的还原合成。与在患病肝中表达的不同亚型相比,在所述健康肝中表达的IFN亚型只有亚型α5相一致。序列SEQID NO:1显示了与IFNα5一致的cDNA序列。这些肝中表达型间明显区别说明了这些干扰素亚型在制备用于治疗病毒性肝脏疾病组合物的应用。本发明详细公开了不同类型和加工中的应用,包括从SEQ ID NO:1序列制备重组蛋白的应用。
文档编号A61K48/00GK1307482SQ9980786
公开日2001年8月8日 申请日期1999年5月13日 优先权日1998年5月13日
发明者赫苏斯·普列托·巴尔图埃纳, M·皮拉尔·西韦拉·穆里略, 埃斯特·拉雷亚·莱奥斯 申请人:纳瓦拉公司科学与技术研究所