专利名称：标记的谷氨酰胺和赖氨酸类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类用于诊断静脉和动脉血栓形成、栓塞或感染部位的化合物，涉及含有它们的药物制剂，它们在诊断疾病方面的用途及制备它们的方法。
以前，血栓成像放射药物包括放射性标记的纤维蛋白原或纤维蛋白溶酶原；放射性标记的人体纤维蛋白的片断E1；放射性标记的纤维蛋白溶酶原活化剂，如组织纤维蛋白溶酶原活化剂(t-PA)和标记的抗纤维蛋白抗体。已有人论述了基于检测血小板积累部位的方法，如通过施用放射性标记的血小板(例如，使用111In 8-羟基喹啉)或放射性标记的抗血小板抗体。最近，人们经过努力，已经将目光集中在放射性标记的肽或多肽如细胞粘连基元RGD(其中R,G和D分别是氨基酸精氨酸，甘氨酸和天冬氨酸的标准缩写)；血小板因子4或其片断或抗凝剂肽如整合蛋白(disintegrin)上。
因子ⅩⅢ是一种血浆糖蛋白，它以催化失活(或酶原)方式存在于血液和某些组织中。在钙离子存在下通过凝血酶将因子ⅩⅢ转化成其活化形式因子ⅩⅢa。因子ⅩⅢa也被称为血浆转谷氨酰胺酶，纤维蛋白连接酶或纤维蛋白稳定因子。在血块形成的最后一步是纤维蛋白的共价交联，它是因凝血酶使纤维蛋白原蛋白分解而形成的。纤维蛋白分子排列并由酶因子ⅩⅢa催化赖氨酰的NH2和CONH2基团分别与谷氨酰胺基团共价交联，使血块结构上具有刚性。交联作用稳定了纤维蛋白块的结构，并赋予其阻碍纤维蛋白水解的能力。交联的形成是血液正常凝固和伤口愈合以及病理症状如血栓形成的重要方面。由于动脉血栓型脑梗塞是常见的中风类型，因此，因子ⅩⅢa底物可用来诊断中风。其还涉及动脉粥样硬化，发炎过程，肿瘤的生长和转移。WO91/16931公开了放射性标记的因子ⅩⅢ类似物(其中的活动部位已由氨基酸取代作用灭活)可用作血栓成像放射药物。
还已知因子ⅩⅢa能催化低分子量胺结合蛋白的γ-谷氨酰胺部位。类似地，因子ⅩⅢa还能催化低分子量结合赖氨酰基团。因此，这种低分子量胺(或谷氨酰胺类似物)可以用作蛋白的因子ⅩⅢa诱导的赖氨酰/谷氨酰胺交联作用的竞争性抑制剂。已有关于合成这类胺方面的论述，即合成胺是通过猪肝转谷氨酰胺酶催化将标记的腐胺(1,4-丁二胺)摄取到N,N’-二甲基酪蛋白的竞争性抑制剂[L.Lorand等人，《生物化学》(Biochem.),18,1756(1979)]。
WO89/00051(Cytrx Biopool ltd.)要求保护一种方法，即用通过因子ⅩⅢa共价结合到纤维蛋白的标记的化合物靶向纤维蛋白沉积物。与纤维蛋白结合的化合物可以是“用作通常称为因子ⅩⅢa的血酶的底物的任何肽”。优选的肽包括四肽序列-Asn-Gln-Glu-Gln-(或以内酯氨基酸缩写命名法命名的NQEQ)。该文献还公开了从α-2抗纤溶酶的NH2端点排序的12链节肽NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-OH，以及合成的类似物NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Tyr-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-OH，(分别指NQEQVSPLTLTLLK和NQEQVSPYTLTLLK)。后者是用125I标记的，而且表现出在体外可被吸收到凝血酶块中。
现在发现，用适当可检测成分标记的合成的赖氨酸和谷氨酰胺类似物也可以用作酶因子ⅩⅢa的底物。使用适当保护基可以得到对体内代谢，尤其是肽酶代谢物缺乏敏感性的化合物，因此是更有用的靶向剂。
本发明提供了下列化合物Y-(CR2)n-X-NHJ其中X是C=O或CR2；n是1-6整数；Y是L(A)m或R1R2CR-，其中L是金属络合剂；A是-CR2-,-CR-CR-,-C≡C-,-NRCO-,-CONR-,-SO2NR-,-NRSO2-,-CR2OCR2-,-CR2SCR2-,-CR2NRCR2-,C4-8环杂亚烷基，C4-8环亚烷基，C5-12亚芳基，C3-12杂亚芳基或聚亚烷基二醇，聚乳酸或聚乙醇酸部分；m是整数0-10；及R1和R2之一是-NH(B)pZ1，另一个是-CO(B)qZ2，其中p和q是整数0-45；各B分别选自Q或氨基酸，其中
Q是环肽；及Z1和Z2是保护基；J和各R分别选自H,C1-4烷基，C1-4烯基，C1-4炔基，C1-4烷氧基烷基或C1-4羟基烷基；条件是(ⅰ)R1和R2基团中氨基酸残基的总数不得超过45；(ⅱ)如果X是CR2，则Y是-CRR1R2及Z2是金属络合剂；(ⅲ)如果Y是-CRR1R2，则至少R1和R2之一带有至少一种可检测部分。
本发明还包括了用可检测成分标记的上述化合物的制备方法，以及这些化合物及相关化合物在诊断或治疗血栓形成，栓塞，动脉粥样硬化，炎症或癌症方面的用途。
术语“环肽”指5-15个氨基酸组成的序列，这个氨基酸序列的两端由共价键相连，该键可以是肽键或二硫键或合成的非肽键，如硫醚，磷酸二酯，二硅氧烷或尿烷键。
术语“氨基酸”指L-或D-氨基酸，氨基酸类似物或氨基酸模拟物，它们可以是天然的或纯合成原物的模拟物，并且可以是光学纯的，即单个对映体，因此也可以是手性的或对映体的混合物。本发明优选的氨基酸是光学纯的。术语“氨基酸模拟物”指天然氨基酸异构体的合成类似物，即被设计成模拟天然化合物空间和电子结构的化合物，这类异构体本领域技术人员已知的，它包括但不限于depsipeptide，逆转录肽类，硫酰胺类，环烷类或1,5-二取代的四唑类[见M.Goodman，《生物多聚物》(Biopolymers),24,137(1985)]。
术语“保护基”指生物上相容的可以抑制或压抑肽或氨基酸的氨基或羧基末端的体内代谢的基团。这类基团是本领域技术人员已知的，对于胺的末端(Z1)选择下列基团较为合适乙酰基，Boc(其中Boc是叔丁氧羰基)，Fmoc(其中Fmoc是芴基甲氧羰基)，苄氧羰基，三氟乙酰基，烯丙氧羰基，Dde[即1-(4,4-二甲基-2,6-二氧亚环己基)乙基]，Npys(即3-硝基-2-吡啶亚氧硫基)或金属络合基团；对于羧基末端(Z2)，则选择下列基团甲酰胺，叔丁酯，苄酯，环己酯，氨基醇或金属络合基团。优选的保护基是金属络合基团，最优选的是结合于金属的金属络合物。肽的羧基末端对羧基肽酶引起的体内裂解特别敏感。因此，金属络合基团或金属络合物优选附着在羧基末端上。当R1是-NH(B)p-1QZ1或R2是-C0(B)q-1QZ2时，保护基可以是闭合环肽(Q)环的共价键。
“可检测成分”是发射信号或适于人体诊断图像的成分，它可以是用于放射性药物成像或治疗的放射性同位素，用于MRI对比成像的顺磁性金属或此类物质，用于X射线对比成像不透X射线的基团或金属，气体微泡超声对比剂或用于利用外光成像进行检测的合适染料。优选地，成像成分是金属离子，最优选的是放射性金属。
当Y是-CRR1R2时，优选R1和R2之一由下列部分的一个或多个肽片段组成α2-抗纤溶酶，纤连蛋白或β-酪蛋白，纤维蛋白原或糖蛋白G。这些肽片段含有至少3个，优选4-20个氨基酸残基。当Y是-CRR1R2及-(CR2)-X-NHJ是-(CH2)4NH2(即赖氨酸的氨基酸侧链)时，优选R1和R2之一由α2-抗纤溶酶，纤连蛋白或β-酪蛋白的这种肽片段组成。α2-抗纤溶酶，纤连蛋白或β-酪蛋白，纤维蛋白原或糖蛋白G的氨基酸序列可以在下列文献中查到α2-抗纤溶酶前体[M.Tone等人，《生物化学杂志》(J.Biochem.),102,1033(1987)]；β-酪蛋白[L.Hansson等人，《基因》(Gene),139,193(1994)]；纤连蛋白[A.Gutman等人，FEBSLett.,207,145(1996)]；糖蛋白G-1前体[V.Dixit等人，《美国科学院大会》(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA),83,5449(1986)]；R.F.Doolittle，《生物化学年鉴》(Ann.Rev.Biochem.),53,195(1984)。
位于不同基团N末端的优选氨基酸序列为(ⅰ)对于α2-抗纤溶酶,NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-OH，或其中一个或多个氨基酸被交换，添加或去除的序列NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-OH,NH2-Asn-Gln-Glu-Ala-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-OH,NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Gly-OH；或(ⅱ)对于酪蛋白Ac-Leu-Gly-Pro-Gly-Ser-Lys-Val-Ile-Gly。
当本发明化合物是肽时，即Y是R1R2CR-时，氨基酸残基数量最好是2-30，最优选3-20，尤其是3-15。
优选的化合物为J代表H，即，有NH2基团的末端。X优选C=O，即优选式Y-(CR2)n-CONH2化合物。最优选的化合物是式Y-(CR2)x-(CH2)2CONH2或化合物式Y-(CR2)y-(CH2)4NH2，其中x是0-4整数，y是0-3整数。特别优选有谷氨酰胺同样侧链的化合物，即Y-(CR2)x-(CH2)2CONH2的谷氨酰胺类似物。
适合用于本发明的非金属放射性同位素包括但不限于放射性碘，如123I,125I,131I，优选123I；正电子发射体，如18F,11C或75Br，以及用于治疗的同位素如211At。
含有金属络合剂的本发明化合物优选只有一种类型的目标分子附着，即-(CR2)n-X-NHJ取代基。该络合剂上也可以有其他取代基，但希望-(CR2)n-X-NHJ取代基是主要负责生物定位性质的。本发明金属络合物可以含有一种或多种相同或不同的金属离子。因此，在一些情况下多核络合物可以具有优越的性质，如某些金属簇合物具有超顺磁性，因此特别适合用作MRI造影剂。本发明优选的金属络合物仅包含单个金属离子。如果金属络合物中的金属是放射性金属，则它既可以是正电子发射体(如68Ga或64Cu)，也可以是γ发射体(如99mTc,111In,113mIn或67Ga)。用于诊断成像的最优选的放射性金属是γ射体，尤其是99mTc。某些放射性核素的金属络合物可以用作对多种疾病如癌症进行放射性治疗的放射性药物，或血栓形成或restenosis的治疗。用于这类放射性治疗应用的放射性同位素包括90Y,89Sr,67Cu,186Re,188Re,169Er,153Sm和198Au。无论选择哪种金属络合物，首选它要能以下方式与因子ⅩⅢa结合它不会轻易从血液中代谢掉，其结果是在标记的因子ⅩⅢa底物到达要成像的体内位置之前金属络合物不会从因子ⅩⅢa底物上裂解开来。因此，优选因子ⅩⅢa底物能够与本发明金属络合物共价结合。
使用金属络合剂，更优选螯合剂将这些金属离子络合。螯合剂由通过非配价主链共价链接在一起的2-10个金属供体原子组成。优选的螯合剂具有4-8个金属供体原子，既可以是开链形式，也可以是大环排列形式，也可以是它们的结合形式。最优选的螯合剂有4-6个金属供体原子，并且并列地相对于金属中心构成5或6员螯合环。这种多卤化合物和/或大环螯合剂形成稳定的金属络合物，它可以战胜内生竞争配体如转铁蛋白和血浆蛋白的对体内金属的竞争。或者，可以用单配位基螯合剂构成带有所要金属离子的稳定络合物，即使它们在金属配位上不能形成螯合剂。已知的这种络合剂的实例，尤其是适用于99mTc的的络合剂是肼，膦，砷和异腈。
合适的螯合剂的实例是双齿体如二胺或二膦，三齿体如单胺二硫醇，或四齿体如二胺二肟(US4615876)，或对应于酰胺供体的配体(WO94/08949)；WO94/22816的四齿配体；N2S2二胺二硫醇，二酰胺二硫醇或酰胺胺二硫醇；N3S硫醇三酰胺；N4配体，如四胺，大环胺或酰胺配体如cyclam,oxocyclam(形成天然锝络合物)或dioxocyclam；或二硫缩氨基脲。上述配体特别适合于锝，但也用于其他金属。其他合适的配体如Sandoz WO91/01144所述，它包括了特别适合于铟，钇和钆的配体，尤其是大环氨基羧酸酯配体和氨基磷酸配体。形成钆非离子(即中性)金属络合物的配体是已知的，并且如US4885363所述。配体也可以由短的氨基酸序列构成，如WO92/13572所述的Cys/氨基酸/Cys三肽，或EP0719790 A2所述的肽配体。
优选的螯合剂具有以下结构式RN[(CR2)aN(CH2)bCR=NOH]2其中各a是2或3；各b是1或2；一个R是氨基亚烷基，螯合剂通过它与其他分子相连；其他R分别是H,C1-C10烃基，烷氧基，烷氧基烷基，胺，酰胺，羟基，羟基烷基或羧酸酯，或两个R与它们相连的原子构成羧基杂环饱和的或不饱和环。
基于非肽的金属螯合剂改进了对附着作用和金属离子的控制，因此是优选的。
本发明还包括α2-抗纤溶酶，纤连蛋白，β-酪蛋白，破伤风，淀粉状蛋白，捕获蛋白(trappin)或聚谷氨酰胺基团的肽片段，所说肽片段含有3-45个氨基酸残基并运载末端金属络合剂。
制备连接有官能团的螯合剂(“双功能螯合”)的方法是已知的。已经被连到螯合剂上的官能团包括胺，羧酸，氰酸盐，硫代氰酸盐，马来酰亚胺和活性酯如N-羟基琥珀酰亚胺。针对二胺二肟配体的螯合-胺共轭物在WO95/19187给出。如果所需的因子ⅩⅢa底物官能团是胺，则本发明配体可以通过双官能团化合物的反应来制备，其中所说双官能团化合物包含一个胺基团(优选用本领域技术人员已知的适当保护基保护)和一个反应性基团如磺酰氯，酰氯，活性酯或烷基/苄基卤化物。然后，既可以将反应性基团偶合成双官能团螯合物的侧胺基团，也可以用来衍生一个或多个含N配体的胺供体原子。或者，可以将单保护的二胺与带有侧活性酯或羧基的双官能团螯合物反应，生成通过酰胺键连到配体系统上的保护的胺基团。在说明概述的两种合成途径中所得配体保护的胺共轭物在适当条件下被脱保护，得到所要的胺功能化的配体。如果所要的因子ⅩⅢa底物官能团是甲酰胺基团，则所要的配体可以，例如，通过适当链长的ω-卤烷基甲酰胺与带有侧胺基团的双官能团螯合物反应，得到甲酰胺类配体。
本发明金属络合物可以通过适当氧化态金属的溶液与配体在适当pH条件下反应制成。该溶液中优选含有与金属弱络合的配体(如氯，葡萄糖酸盐或柠檬酸盐)，即金属络合物是通过配体交换或反螯合作用制成的。这样的条件是用来抑制不需要的副作用，如金属离子的水解。如果金属离子是99mTc，则常用的起始原料是得自99Mo产生器的高锝酸钠。锝存在于Tc(Ⅶ)氧化态的99mTc-高锝酸盐中，它是相对不反应的。因此，从低氧化态锝络合物Tc(Ⅰ)到Tc(Ⅴ)的制备通常需要添加适当的还原剂如亚锡离子以简化络合过程。其他合适的还原剂描述如下。
金属络合物还应该最好表现出低非特定血液本底。
因此，本发明主要涉及用于哺乳动物体内进行成像的诊断剂，其中酶因子ⅩⅢa被活化，而血蛋白如纤维蛋白或胶原沉积。该诊断剂尤其用于人体的诊断成像。该诊断剂含有为酶因子ⅩⅢa而采用的底物，该酶被适于外部成像的金属络合物标记，如放射性金属(用于闪烁图形)或顺磁性金属离子(用于MRI)。本发明金属络合物含有侧氨基或甲酰胺官能团，它们被用来通过酶因子ⅩⅢa分别共价连接到蛋白谷氨酰基甲酰胺或赖氨酰。纤维蛋白与因子ⅩⅢa之间的关系突出了本发明络合剂在诊断病症方面的有效应用，所说病症源自纤维蛋白沉积或堆积和因子ⅩⅢ的活化。已知纤维蛋白沉积的增加将是一些疾病的特征，如血栓形成，动脉粥样硬化，纤维化肝和播散性血管内凝结。纤维蛋白在伴随许多疾病过程的组织发炎部位沉积，如在感染，自身免疫病或癌症过程中。因子ⅩⅢ和组织反谷氨酰胺酶在已知的生理条件下被活化。在编程性细胞死亡和新蛋白阵列结构产生期间可以看到酶水平会升高。因此，本发明络合剂也可以用于检测编程性细胞死亡和病症如关节炎，这时阵列蛋白的沉积增加。由于因子ⅩⅢ在体内敏感部位被活化(即血栓形成，栓塞等)，这使我们获得了本发明金属络合物的定位机理。那么，共价连接的金属络合物可以用放射性核素闪烁图形仪或磁共振成像装置(MRI)外部成像，从而提供诊断患病部位的非侵入性方法。
至于本发明涉及的治疗方面，发明者有体内试验数据(本文没有列出)初步表明在本发明标记的肽(与下面实施例17相符)存在下产生的凝块比没有标记的肽存在时产生的凝块小。在此基础上，例如，通过交联在凝块上的纤维蛋白的有力抑制剂的作用，本文定义的肽(一般含有4-30个，例如，约10个氨基酸残基)可以作为有效的药物增加凝块溶解的速率。因此，本文公开的化合物有可能被用作治疗用的溶解血栓或抗凝结药物。
本发明还涉及制备连接因子ⅩⅢa底物的金属络合物的试剂盒。该试剂盒用来获得适于人体给药，例如，通过注射进入血液的无菌产品。下面讨论可选方案。当可检测成分是99mTc时，该试剂盒中可以有装有游离配体或将金属与可药用还原剂结合的螯合剂的小瓶，还原剂包括连二亚硫酸钠，二亚硫酸钠，抗坏血酸，甲脒亚硫酸，亚锡离子或酒石酸亚锡。或者，该试剂盒中除了有放射性金属或顺磁金属外，还有金属络合物，经过金属转移作用(即配体交换)得到所要的产物。对于99mTc，该试剂盒优选是冻干的，而且设计成用99mTc放射性同位素产生器产生的无菌99mTc-高锝酸盐(TcO4)重构的形式，得到无需进一步手工操作的适于人体给药的溶液。
本发明还可以提供适于给人注射的单位剂量形式，例如，可以制成事先装好的无菌注射器。当可检测成分是放射性同位素如99mTc时，装有单位剂量的注射器也可以注射器架的形式提供(以保护操作者免受强放射性剂量照射)。
上述试剂盒或预装注射器中可以任意装有其他成分如缓冲液；可药用溶解剂(例如环糊精，或表面活性剂如Pluronic,Tween或磷脂)；可药用稳定剂或抗氧化剂(如抗坏血酸，2,5-二羟苯甲酸或对氨基苯甲酸)或用于冻干的填充剂(氯化钠或甘露糖醇)。
下列实施例用以说明本发明化合物的制备方法和它们在成像方面的用途。本发明具体化合物的合成方法在实施例1-9中给出，在实施例10-12中给出用123I或99mTc进行放射性标记的情况。化合物1(现有技术)被包含在比较实施例中。增加血浆在体外的稳定性的事例在实施例13中给出。在体外和体内摄取血块的事例分别由实施例15和17给出，并在实施例18中报告了放射性标记的化合物产生的正常鼠生物分布效应。
123I-化合物1的体外血浆稳定性较差(见实施例13)，估计是由于蛋白酶活性。对于放射性标记的化合物2-5和7-49在羧基和氨基末端引入保护基使血浆稳定性大大增加。
大多数受试化合物表现出较高的血块吸收能力，即对血块的亲和力。其他化合物的吸收能力较低，而化合物14,16,18,31,34,36,46和48吸收能力显著降低。从化合物14所示的α2-抗纤溶酶衍生系列的2位除去Gln残基将使这种示踪剂的摄入量大幅度下降，因此，我们强烈建议Gln-2是这类序列中的主要氨基酸。
对正常鼠和在新老血块模型中的生物分布的详细描述在实施例16和17中阐述。这些化合物的血液清除率(blood clearance rate)相对较快，生物半寿命在1至2小时之间。99mTc-化合物3的生物分布是有代表性的例子，在此情况下估计t1/2为2小时。从本底组织如血，肺，心和肌肉的迅速间离显示出本发明制剂在成像方面喜人的药物动力，并显示出它们作为放射性诊断剂的能力。虽然由于这些化合物使人们可以看到一些肝胆管分泌物，但分泌的主要途径还是通过尿道。
鼠模型中新老血块吸收许多放射性标记的化合物的效果很好(相对浓度或RC=5-15)，血块与本底组织的比例(＞5)对于成像来说非常喜人。实施例18表明99mTc-化合物5适用于鼠模型中的血块成像。
99mTc-化合物2-49与123I-化合物1(RC=1.5)相比血浆稳定性已经得到改善，它们可以负责改善体内血块吸收这些化合物。
实施例17对新老血块的血块吸收情况的比较结果表明，本发明制剂表现出的吸收情况是常数，而且与血块的新旧程度无关。因此，这些真机制剂对预先存在的血块，例如在肺栓塞中发现的那些，有改善的成像能力。
将1-金刚烷羧酸或3,5-双(三氟甲基)苯甲酸(1.5摩尔当量)，保护的肽Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(tBu)-Gln(Trt)-Val-Ser(tBu)-Pro-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly-Pn216(1摩尔当量)和HBTU(1.2-1.5摩尔当量)溶解于无水DMF(1ml)。加入二异丙基乙胺(11摩尔当量)，将反应混合物在室温下搅拌直到用HPLC判断反应已完成。然后用95％三氟乙酸的CH2Cl2处理此保护的肽片段。将反应混合物在室温下搅拌2-4小时。反应混合物经反相HPLC纯化得到产物。实施例5化合物34的合成例如，除了不用根据合成还原肽键的经典方法得到的Fmoc-Asn(Trt)-ψ(CH2NH)-Gln(Trt)-OH外，通过Gln(Trt)与Fmoc-Asn(Trt)衍生的醛进行还原性胺化反应合成保护的肽(见G.Guichard等人，《肽研究》(Peptide Res.),6(3),121(1993)，该文在此引作参考)。
用实施例2方法制备和纯化所得化合物。实施例6化合物36,38和39的合成如实施例1所示，但却是在Rink树脂上，合成这些保护的肽。除去甘氨酸N保护基后将肽与戊二酸酐仍在所说树脂上反应。用羧酸戊二酸酯的BOP/HOBt进行活化，并与6-氨基甲基-3,3,6,9,9-五甲基-4,8-二氮杂十一烷-2,10-二酮二肟或3,3,11,11-四甲基-7-氨基乙基-4,7,10-三氮杂十三烷-2,12-二酮二肟在树脂上偶合，得到保护的产物。用TFA/水(9/5)裂解，得到粗产物，然后用RP-HPLC(系统A)进一步纯化。实施例7化合物40和41的合成将所需分子量的α-N-(叔丁氧羰基)-聚(乙二醇)氨基-ω-琥珀酰亚氨基碳酸酯和1摩尔当量6-氨基甲基-3,3,6,9,9-五甲基-4,8-二氮杂十一烷-2,10-二酮二肟或3,3,11,11-四甲基-7-氨基乙基-4,7,10-三氮杂十三烷-2,12-二酮二肟的无水四氢呋喃溶液(5ml)在氮气下回流5小时。将反应混合物真空浓缩，得到白色固体。经过快速色谱纯化，用异丙醇/氨/水(10∶1∶1)洗脱，得到标题化合物为白色固体。将37％HCl滴加到于甲醇中的冰冷溶液中以除去Boc保护基，然后将溶液在室温搅拌4小时。加入4M NaOH(4.18ml)使反应混合物碱化至约pH10。用半制备性HPLC(系统D)分离产物。
将所得固体溶解于DMF并在其中加入保护的肽片段。加入二异丙基乙胺和HBTU并将反应混合物在室温搅拌直到反应完成。产物经HPLC(系统E)纯化，得到无色胶体。
将所得胶体溶解于二氯甲烷(2ml)，溶液用TFA(0.2ml)处理5小时。用1M NaOH(2ml)碱化反应物，抽真空除去挥发性物质。在剩余物中加入MeOH(2.5ml)，用Acrodisc过滤器(LC13 PVDF 0.45m)过滤混合物。经过HPLC(系统E)将产物从甲醇溶液中分离。实施例8化合物43的合成将12-N-Fmoc-氨基十二酸与上述3,3,11,11-四甲基-7-氨基乙基-4,7,10-三氮杂十三烷-2,12-二酮二肟偶合。用20％哌啶的DMF除去Fmoc保护基，用HPLC(系统F)纯化产物。
将所得产物与保护的肽片段偶合，然后按上述方法进行脱保护。产物经HPLC(系统G)纯化。实施例9化合物44的合成根据Fmoc碱化策略并用BOP/HOBt逐步延长，将部分脱保护的肽H-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Val-Ser(tBu)-Pro-Tyr(tBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly-OH装配在2-氯三苯甲基氯树脂上。经过哌啶处理除去N端保护，并用0.5％TFA的二氯甲烷溶液将部分保护的肽从固体托物上剥离。
根据已知方法(例如，见M.Rodriguez等人，《国际肽蛋白研究杂志》(Int.,Pept.Protein Res.),35,441(1990))，在固体碳酸氢钠存在下用BOP作缩合剂在10mM DMF溶液中进行环化反应。
最后，在TFA/水/乙二硫醇(90/5/5)的混合物中进行脱保护，得到粗标题化合物，然后用HPLC(系统A)进行纯化。实施例10用123I标记化合物1-2和化合物44将乙酸铵缓冲液(200μl,0.2M,pH4.0)加到装有配体溶液(20μl,20μg)和Na127I(10μl,1.5μg)的Eppendorf试管中。在溶液被充分混合后，加Na123I(5-50μl,111MBq)。在加入PAA溶液(10μl,0.01M)之前充分混合上述溶液，然后进行搅拌。测量该制剂的活性。在所有情况下通过HPLC将所要产物与反应副产物和未标记的底物分离。实施例11用99mTc标记化合物3,5-43和45-49将0.1ml的一份溶解于H2O的化合物(1mg/ml)与脱氧盐水(0.9％w/v，1ml)和0.035ml NaOH水溶液(0.1M)一起放入一个充有氮气的10ml玻璃小瓶中。在溶液中加入锝产生器洗脱剂(1ml，约0.4GBq)，然后加入氯化亚锡水溶液(0.1ml，约10μg)。标记物的pH值为9.0-10.0。小瓶在实验室温度(15-25℃)下培养30分钟使有效的标记。将所得制剂稀释成所要的放射性浓度，或进行HPLC纯化(系统B)在试验之前除去未标记的起始原料，和放射性杂质。纯化之后抽真空除去有机溶剂，然后将样品重新溶解于约5ml的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，得到试验浓度6-9MBq/ml。使用前用下列薄层色谱法(TLC)测定放射化学浓度，ⅰ)ITLC SG 2cm×20cm，用0.9％w/v盐水洗脱；ⅱ)Whatman No.1 2cm×20cm，用50∶50v/v乙腈H2O。
将标记的底物保留在或紧挨着原来在TLC系统(ⅰ)中的位置，并且移到紧靠系统(ⅱ)前面溶剂的位置。如果用合适的检测仪分析，放射化学纯度一般超过标记化合物的85％。实施例12用99mTc标记化合物4将0.1ml的一份溶解于水的化合物(1mg/ml)与溶解于水的麦黄酮(0.5ml,37.5mg)和溶解于水的苯膦酸三钠盐(0.1ml,10mg)一起放入一个充有氮气的10ml玻璃小瓶中。在溶液中加入锝产生器洗脱剂(1ml，约0.4GBq)，然后加入氯化亚锡的0.1M HCl溶液(0.02ml，约2μg)。标记物的pH值为4.5-5.5。将小瓶在60℃养30分钟使标记物产生效果。按实施例10所述进行纯化和测定放射化学浓度。实施例13体外血浆稳定性在一份化合物(50μl,10MBq/ml)中加入等体积血浆(鼠或人的)或盐水。将混合物在37℃培养，并用HPLC(系统C)在第0,30和120分钟测量其稳定性。盐水稀释液被用作对照物。
实施例14HPLC系统流速所有系统均为1ml/min。系统A柱Waters C18 250×4.5mm；粒径4μm。梯度25分钟内10-60％B梯度洗脱。洗脱剂A0.1％TFA水溶液。洗脱剂B0.1％TFA的乙腈溶液。系统B柱Waters C18 150×3.9mm；粒径4μm。梯度22分钟内0-100％B梯度洗脱。洗脱剂A0.1％TFA水溶液。洗脱剂B0.1％TFA的乙腈溶液。系统C柱Waters C18 150×3.9mm；粒径4μm。梯度20分钟内0-100％B梯度洗脱。洗脱剂A50mM NH4OAc缓冲液(pH5.6)。洗脱剂B乙腈。系统D柱Hamilton PRP-1,305mm×7.0mm；梯度10分钟内0-65％B梯度洗脱。洗脱剂A5％氨水溶液。洗脱剂B乙腈。系统E柱Hamilton PRP-1,150mm×4.1mm；梯度15分钟内0-100％B梯度洗脱。洗脱剂A5％氨水溶液。洗脱剂B乙腈。系统F柱聚合物实验室PLRP-S,150mm×2.5mm；梯度15分钟内0-100％B梯度洗脱。洗脱剂A5％氨水溶液。洗脱剂B乙腈。系统G柱Hamilton PRP-1,150mm×4.1mm；梯度15分钟内0-100％B梯度洗脱。洗脱剂A0.1％TFA水溶液。洗脱剂B0.1％TFA的乙腈溶液。实施例15人血浆块的形成采用以下方法诱发体外人血浆块，研究放射标记的底物结合纤维蛋白。在硅化的5ml玻璃小瓶中加入(a)800μl含有氯化钙的Tris(羟甲基)氨基甲烷缓冲的盐水溶液(pH7.5)(50mM Tris,150mM氯化钠，4mM氯化钙)；(b)每ml含有100单位凝血酶的约40μl生理盐水溶液；(c)含有标记底物的约400μl人血浆，标记物浓度一般为10kBq/ml。为了形成血块将一根粗糙的玻璃棒插到小瓶中。用类似方法但不加凝血酶和氯化钙准备对照物小瓶。
将试验溶液在实验室温度(约20℃)培养60分钟，然后加入约400μl33.5mM乙二胺四乙酸二钠盐的冷溶液。通过吸滤到0.45μM硝基纤维素滤纸(事先浸泡在含有0.1％Tween20的1.5％BSA/Tris(羟甲基)氨基乙烷缓冲盐水(pH7.5)中)上，然后用含有最终浓度为0.1％v/v Tween20的约2×10ml Tris(羟甲基)氨基乙烷缓冲盐水(pH7.5)洗涤，从血清中分离出血块。整个放射性(活度)的比例由合适的检测仪器的计数结果计算。
留在滤纸上的馏分的放射性，在减去从对照物测得的非特定结合之后，是与滤出的血块复合测量的结果。
表中“Cmpd”代表化合物。*血浆血块测定(有凝血酶)中残留的％；-血浆血块测定(有凝血酶)中残留的％。实施例16正常鼠生物分布血块图象的分辨率取决于结合的放射药物与血/组织清除率的结合速度。由于这个原因有些化合物的生物分布已经在鼠身上进行了测定。给雄鼠静脉内注射0.1-0.2ml放射性标记的示踪溶液(8MBq/mL)，并在注射后不同时间进行解剖。测量所选各组织的％ID。将一些动物关在代谢笼中以测定尿和粪便中排泄的％ID。针对不同药剂解剖时间定在第15,30,60和120分钟。数据用％ID的平均值(n=3)表示。99mTc-化合物3
实施例17在鼠模型中诱发血块形成鼠下腔静脉型(IVC)用15％尿烷将鼠(雄性Wistar,250-350g)麻醉。剖腹手术后分离出腔静脉和散落的周围脂肪组织。将一根铂导线(1.5cm×0.5mm)插入下腔静脉，并在手术后5分钟通过以前插入的股静脉向静脉内注射0.4ml鞣花酸(1.2×10-4M)，并允许形成血块。这种模型中形成的血块重量约为27mg,n=32,(5-50mg范围)。血块形成后5分钟(新鲜血块)和60分钟(陈旧血块)注射(试验)化合物。60分钟后将动物处死并除去血块，称重和计数。其他组织，例如血液，肺，心脏也被解剖和计数。摄入血块的示踪剂表示成相对浓度(cpm/g血块被dose/g动物)，并且凝结在本底组织中。结果新鲜血块
表中“Cmpd”代表化合物。
表中“Cmpd”代表化合物。实施例18鼠模型中诱发的血块成像如实施例17所述在雄性Wistar鼠(250-350g)诱发血块形成，只是这些实验中的铂导线被放入颈静脉。注射后60分钟注射化合物，在腹膜注射15-180分钟期间要求的平面图象。Park药物异莰烷Iγ相机被用于这些实验，用LEUHR或LEPH准直仪收集胸腔的300K或150K计数。从腹膜注射15分钟后可看到血块。由于化合物被迅速清除，腹膜注射180分钟后血块与本底的比例达到最大值。缩写Ac乙酰基Boc 叔丁氧羰基Cmpd 化合物DMF 甲基甲酰胺ES电子喷雾器FAB 快速原子轰击Fmoc 芴基甲氧羰基HPLC 高效液相色谱仪MALDI-TOF 激光解吸作用离子化-飞行时间构成的矩阵NaI 萘基丙安酸RCP 放射化学纯度RP-HPLC 反相高效液相色谱仪TFA 三氟乙酸TLC 薄层色谱
权利要求
1．下式化合物，Y-(CR2)n-X-NHJ其中X是C=O或CR2；n是1-6整数；Y是L(A)m或R1R2CR-，其中L是金属络合剂；A是-CR2-,-CR-CR-,-C≡C-,-NRCO-,-CONR-,-SO2NR-,-NRSO2-,-CR2OCR2-,-CR2SCR2-,-CR2NRCR2-,C4-8环杂亚烷基，C4-8环亚烷基，C5-12亚芳基，C3-12杂亚芳基或聚亚烷基二醇，聚乳酸或聚乙醇酸部分；m是整数0-10；及R1和R2之一是-NH(B)pZ1，另一个是-CO(B)qZ2，其中p和q是整数0-45；各B分别选自Q或氨基酸，其中Q是环肽；及Z1和Z2是保护基；J和各R分别选自H,C1-4烷基，C1-4烯基，C1-4炔基，C1-4烷氧基烷基或C1-4羟基烷基；条件是(ⅰ)R1和R2基团中氨基酸残基的总数不得超过45；(ⅱ)如果X是CR2，则Y是-CRR1R2及Z2是金属络合剂；(ⅲ)如果Y是-CRR1R2，则至少R1和R2之一带有至少一种可检测部分。
2．权利要求1化合物，其中R1或R2包括α2-抗纤溶酶，纤连蛋白，β-酪蛋白，破伤风，淀粉样蛋白，捕获蛋白(trappin)或聚谷氨酰胺残基的一个或多个肽片段，所说肽片段含有至少3个氨基酸残基。
3．权利要求2化合物，其中肽片段来自α2-抗纤溶酶。
4．权利要求3化合物，其中在肽N-末端的2位上的氨基酸是谷氨酰胺。
5．权利要求1-4化合物，其中J是H。
6．下式权利要求5的化合物，其通式为Y-(CR2)x-(CH2)2CONH2或Y-(CR2)y-(CH2)4NH2其中x是0-4整数，y是0-3整数。
7．权利要求1-6任一的化合物，其中Y是-CRR1R2。
8．权利要求1-7任一的化合物，其中至少Z1和Z2之一是金属络合剂。
9．权利要求8化合物，其中Z2是金属络合剂，而Z1不是金属络合剂。
10．权利要求8或9化合物的金属络合物。
11．权利要求10的金属络合物，其中金属是放射性金属。
12．权利要求11的放射性金属络合物，其中放射性金属是99mTc。
13．一种人用制剂，其中含有权利要求1-12任一的化合物。
14．含有权利要求1-9任一化合物的试剂盒，用权利要求10-12任一金属络合物制备。
15．下式化合物在诊断血栓形成或栓塞部位中的用途，Y-(CR2)n-X-NHJ其中X是C=O或CR2；n是1-6整数；Y是L(A)m或R1R2CR-，其中L是金属络合剂；A是-CR2-,-CR-CR-,-C≡C-,-NRCO-,-CONR-,-SO2NR-,-NRSO2-,-CR2OCR2-,-CR2SCR2-,-CR2NRCR2-,C4-8环杂亚烷基，C4-8环亚烷基，C5-12亚芳基，C3-12杂亚芳基或聚亚烷基二醇，聚乳酸或聚乙醇酸部分；m是整数0-10；及R1和R2之一是-NH(B)pZ1，另一个是-CO(B)qZ2，其中p和q是整数0-45；各B分别选自Q或氨基酸，其中Q是环肽；及Z1和Z2是保护基；J和各R分别选自H，C1-4烷基，C1-4烯基，C1-4炔基，C1-4烷氧基烷基或C1-4羟基烷基；条件是(ⅰ)R1和R2基团中氨基酸残基的总数不得超过45；(ⅱ)如果X是CR2，则Y是-CRR1R2及Z2是金属络合剂；(ⅲ)如果Y是-CRR1R2，则至少R1和R2之一带有至少一种可检测部分。
16．权利要求13定义的化合物的放射性金属络合物在诊断血栓形成或栓塞部位中的用途，其中至少Z1和Z2之一是金属络合剂。
17．α2-抗纤溶酶，纤连蛋白，β-酪蛋白，破伤风，淀粉样蛋白，捕获蛋白(trappin)或聚谷氨酰胺的肽片段，所说肽片段含有至少3-45个氨基酸残基，并且带有一个末端金属络合剂。
18．权利要求17的肽片段，其中金属络合剂是在羧基末端。
19．权利要求17或18肽片段的金属络合物。
全文摘要
本发明提供了赖氨酸和谷氨酰胺合成类似物,其功能在于当用可检测成分标记后可作为纤维蛋白稳定酶因子XIIIa的底物。采用适当保护基可使化合物的敏感性降低到体内代谢,尤其是被肽酶代谢的程度,进而使这些化合物成为有用的药剂,用于诊断血栓形成,栓塞,粥样硬化,炎症或癌症。
文档编号A61P7/02GK1309661SQ99808609
公开日2001年8月22日 申请日期1999年5月14日 优先权日1998年5月15日
发明者A·E·斯托雷, M·门迪扎巴尔, S·钱皮安, A·基布森, B·圭尔博特, I·A·威尔逊, P·克诺克斯 申请人:尼科梅德阿默沙姆公开有限公司