突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶以及使用该酶的非天然氨基酸整合蛋白质的制造方法

专利名称：突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶以及使用该酶的非天然氨基酸整合蛋白质的制造方法
技术领域：
[相关申请的记载]本发明基于日本专利申请日本特愿2007-243574号(2007年9月20日申请)主 张优先权，该申请记载的全部内容作为引用，记载于本说明书中本发明涉及突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶和使用其的非天然氨基酸整合蛋白 质的制造方法。更具体地，涉及使用源自甲烷八叠球菌属的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成 酶和抑制基因tRNA (suppressertRNA)，将Nε -苄氧羰基赖氨酸衍生物位点特异性地导入目 的蛋白质的方法。
背景技术：
将蛋白质中的希望的位置的氨基酸残基用通常的蛋白质合成所涉及的20种类 以外的氨基酸(非天然氨基酸)替换而得到的非天然氨基酸整合蛋白质(全蛋白质， alloprotein)，能够成为用于蛋白质的结构·功能解析的有效手段。使用源自各种生物种 类的氨基酰-tRNA合成酶(aaRS)/tRNA对，已经合成了 30种类以上的全蛋白质。历史最 长并且应用于许多有用非天然氨基酸导入的体系为，酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)突变体 与经琥珀抑制基因化tRNATiT的对。就该方法而言，成为关键的是下述正交(orthogonal) 的关系，即，真细菌、与古细菌和真核生物这两个组中的aaRS在各自的组内将tRNA氨基酰 化，但不能将其它组的tRNA氨基酰化。例如，古细菌詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)的TyrRS/tRNATylr对在大肠杆菌的体系中成为正交的对，相反地，大肠杆菌 TyrRS与脂肪嗜热芽孢杆菌tRNATylr的对在哺乳动物细胞的体系中成为正交的对，因此可以 用于它们体系中的遗传密码的扩增(例如，参考专利文献1和非专利文献1)。另一方面，源自马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)的吡咯赖氨酰-tRNA 合成酶(PylRS)和琥珀抑制基因tRNAPy1，在大肠杆菌细胞内作为具有正交性的aaRS/tRNA 对而发挥功能(例如，参考非专利文献2)。进而，还报道了该对即使在真核细胞内也能够用 于遗传密码的扩增(例如，参考专利文献2)。吡咯赖氨酸(Pyrrolysine)是在侧链上具有 大体积甲基吡咯啉部分的赖氨酸衍生物。野生型PylRS能够在大肠杆菌内使Ne-Boc-L-赖 氨酸与tRNAPyl结合(参考专利文献2)。另外，报道了野生型PylRS与ATP类似物、吡咯赖 氨酸或吡咯赖氨酸类似物的复合物的X射线结晶结构(参考非专利文献3，4和9)。专利文献1 国际公开第2004/070024号小册子专利文献2 日本特开2007-37445号公报非专禾Ij 文献 1 =Sakamoto, K. et al.，Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30， pp.4692-4699.非专利文献2 =Blight S. K. et al.，Nature, (2004) Vol. 431，pp. 333-335.非专利文献 3 =Yanagisawa, Τ. et al.，Acta Cryst. (2006)F62,1031—1033非专利文献4 Kavran, J. M. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. (2007) Vol. 104，pp.11268-11273非专利文献 5 :Tsao,M. -L. ,Tian, F. , Schultz, P. G. ChemBioChemVol. 2005, Issue 6，pp.2147-2149非专利文献6 :0hno, S. et al.，J. Biochem. (Tokyo)Vol. 141，pp. 335-343(2007)# 专禾Ij JC ^ 7 :Mukai, et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 371, pp. 818-822(2008)非专利文献8 :Liu, W. et al.，Nat. Methods. Vol. 4, pp. 239-244 (2007)非专利文献9 =Yanagisawa, Τ. et al.，J. Mol. Biol. (2008) 378，634-65
发明内容
发明要解决的课题以上的专利文献1、2和非专利文献1 9公开的内容，在本说明书中作为引用而 被引入记载。以下，提供本发明涉及的相关技术的分析。使用TyrRS/tRNATiT体系在蛋白质的希望的位置上导入酪氨酸类似物的方法，作为 下述氨基酸的导入方法有用，该氨基酸含有因具有芳香族环的酪氨酸类似物的牢固结构而 用于相位确定的重原子。另一方面，为了将具有交联剂、三键、双键等的反应性氨基酸导入 蛋白质以探寻在细胞内与该蛋白质相互作用的靶物质，被导入的非天然氨基酸的结构柔软 性受到要求。因此认为，与酪氨酸类似物相比，氨基酸侧链的结构更柔软的赖氨酸衍生物更 加优异。通常，为了将赖氨酸衍生物导入蛋白质，存在改变赖氨酰tRNA合成酶(LysRS)的 底物特异性的方法。但是，由于LysRS对赖氨酸的识别严密，因此，至今为止，很难将具有各 种大小、形状的官能团的赖氨酸衍生物位点特异性地导入蛋白质。本发明的目的在于提供 将适宜作为具有重原子、硒、反应性官能团、萤光基、交联剂等有用官能团的非天然氨基酸 的赖氨酸衍生物，特别是N、苄氧羰基赖氨酸(Z-Lys)衍生物位点特异性地导入希望的蛋 白质的方法。解决课题的手段本发明是为了解决上述课题而提出的，发现了 源自甲烷八叠球菌属的吡咯赖氨 酰-tRNA合成酶是特异性的aaRS，其氨基酸底物特异性低，并且不仅能够活化吡咯赖氨酸， 还能够将具有各种疏水性官能团的赖氨酸衍生物活化。进而，发现了能够将具有大体积侧 链结构的Z-Lys衍生物有效地氨基酰化的突变体PylRS，基于这些发现而完成了本发明。S卩，第一方面，本发明提供突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其是序列号2所示的 吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列中，选自构成吡咯赖氨酸结合位点的306位的酪氨 酸、309位的亮氨酸，和348位的半胱氨酸中的至少1个氨基酸残基被替换而得到的突变体 吡咯赖氨酰-tRNA合成酶。其特征在于，该氨基酸替换是，306位的酪氨酸替换为甘氨酸或 丙氨酸，309位的亮氨酸替换为甘氨酸或丙氨酸，和348位的半胱氨酸替换为缬氨酸、丝氨 酸或丙氨酸。优选的实施方式中，所述突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的特征在于，进一步 包括384位的酪氨酸替换为苯基丙氨酸或组氨酸的氨基酸替换。一个实施方式中，本发明的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的特征在于，包含所 述306位、309位、348位和384位以外的1个或多个氨基酸缺失、替换或添加而成的氨基酸 序列，并且能够将N、苄氧羰基赖氨酸氨基酰化。进而，在不同的实施方式中，提供突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其由野生型吡咯赖氨酰-tRNA合成酶而得，所述野生型吡咯赖氨 酰-tRNA合成酶是序列号2所示的氨基酸序列的同源物，即源自甲烷八叠球菌属的吡咯赖 氨酰-tRNA合成酶，其中，将所述同源物的氨基酸序列与序列号2所示的氨基酸序列进行 序列比对时，序列号2所示的氨基酸序列的306位所对应的酪氨酸被替换为丙氨酸，和/或 384位所对应的酪氨酸被替换为苯基丙氨酸。本发明的其它方面，提供编码所述突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的、经分离得 到的DNA，以及包含该DNA的表达载体和转化体等。进而，在其它方面，本发明提供非天然氨基酸整合蛋白质的制造方法，其特征在 于，使(a)能够将N、苄氧羰基赖氨酸衍生物活化的氨基酰tRNA合成酶、(b)在所述氨 基酰tRNA合成酶的存在下能够与N、苄氧羰基赖氨酸衍生物结合的抑制基因tRNA、以 及(c)编码在希望的位置上接受了无义突变或移码突变的希望的蛋白质的基因，在所述 Ne-苄氧羰基赖氨酸衍生物的存在下，在细胞内或细胞提取液内表达。所述N、苄氧羰基 赖氨酸衍生物优选是N、邻碘-苄氧羰基赖氨酸、苄氧羰基-氨基乙基-硒基半胱氨酸、 Ne-邻乙炔基_苄氧羰基赖氨酸、Ne-邻叠氮基-苄氧羰基赖氨酸Ne-三氟甲基二吖丙因 基(diaziryl)-苄氧羰基赖氨酸。进而，在另一方面，本发明的非天然氨基酸整合蛋白质合成试剂盒的特征在于，包 括(a)细胞提取液、(b)包含Ne-苄氧羰基赖氨酸衍生物的非天然氨基酸、(c)本发明的突 变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶、以及(d)在所述突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的存在下 能够与N、苄氧羰基赖氨酸衍生物结合的抑制基因tRNA。发明的效果本发明的突变体PylRS对于具有大体积侧链结构的Z-Lys及其衍生物的活性增 强。因此，在大肠杆菌、动物细胞等细胞内的蛋白质合成体系中，可以高效地将Z-Lys衍生 物位点特异性地整合在希望的蛋白质中。


[图1]表示L-吡咯赖氨酸的化学结构(A)，源自马氏甲烷八叠球菌的PylRS的功 能域结构(B)，通过PAGE和亚甲蓝染色检测吡咯赖氨酸向tRNAPyl的结合反应而得到的结果 (C)，和 PylRS(c270)的整体结构(D)。[图2]表示基于马氏甲烷八叠球菌PylRS(c270)以及其它PylRS和LysRS的立体 结构的氨基酸序列的序列比对。[图3A]表示PylRS(c270)的活性位点(参照图3C)和LysRS的活性位点(参照 图3D)的比较。[图3B]表示调查导入到PylRS(c270)的活性位点的突变对于吡咯赖氨酸的氨基 酰化反应的影响而得到的结果。[图3C]表示PylRS(c270)的活性位点的放大图。[图3D]表示LysRS的活性位点的放大图。[图3E]表示吡咯赖氨酸为轴向型立体异构体的情况的PylRS(c270)的活性位点 (参照图3F)与LysRS的活性位点(参照图3D)的比较。[图3F]表示吡咯赖氨酸为轴向型立体异构体的情况的PylRS(c270)的活性位点的放大图。[图4]是赖氨酸衍生物的化学结构㈧以及用酸性尿素PAGE对这些衍生物的氨 基酰化反应进行解析得到的结果(B)。[图5]表示 Z-Lys 结合到 PylRS (c270)和 PylRS (c270) (Y306A)活性位点的模式 (A、B)，以及对各种突变体PylRS引起的Z-Lys氨基酰化反应进行解析而得到的结果(C)。[图6]是对使用了PyIRS和tRNAPyl的琥珀抑制系统进行概略说明的图。[图7]表示对大肠杆菌内的Boc-Lys和Aloc-Lys依赖性琥珀抑制的结果合成的 蛋白质利用SDS-PAGE得到的分析结果。[图8]表示对大肠杆菌内的Z-Lys依赖性琥珀抑制的结果合成的蛋白质利用 SDS-PAGE得到的分析结果。[图9]表示对通过大肠杆菌内的琥珀抑制而被合成的GST的纯化蛋白质进行分析 而得到的结果。[图10]是将纯化GST蛋白质进行胶内胰蛋白酶消化，通过MALDI-T0F进行质量分 析而得到的结果。[图11A]表示马氏甲烷八叠球菌tRNAPyl的推测二级结构。[图11B]是调查相对于各种无义密码子的氨基酰化活性而得到的结果。[图12]是表示各种Ne-苄氧羰基赖氨酸衍生物的化学结构和与PylRS(Y306A)的 结合模式的示意图。[图13]是基于GST的SDS-PAGE的分析结果，该GST具有使用Z-Lys特异性高的 突变体酶，而在大肠杆菌内表达的琥珀密码子。[图14]表示用SDS-PAGE对从表达了GST的琥珀基因的大肠杆菌得到的粗提取液 进行分离，将蛋白质染色而得到的图案。[图15]表示FITC-PP3的化学结构。[图16]表示通过SDS-PAGE对用两种方法进行了萤光修饰反应的GST进行分离， 用UV灯检测萤光而得到的结果。[图17]表示用基于LacZ的显色反应的相对强度来表示来自IacZ琥珀基因的 LacZ蛋白质的表达的结果。[图18]表示对由表达了Grb2基因的动物细胞得到的粗提取液进行萤光修饰反应 后，通过SDS-PAGE进行分离，利用萤光检测器检测萤光而得到的结果。
具体实施例方式[吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)]本发明所涉及的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)可以如下制作以从古细菌、 特别是产甲烷古细菌取得的野生型PylRS为基础，通过各种方法导入突变来制作。作为野 生型PylRS，例如可以从作为产甲烷古细菌的马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)、 巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)和噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)等取得，但不限于这些。含有这些古细菌的大多数细菌基因组碱基序列和基 于它们的氨基酸序列是公知的，例如从GenBank等公共数据库进行碱基序列或氨基酸序列 的同源性检索，也能够取得其它同源的PylRS。作为典型的例子，源自马氏甲烷八叠球菌的PylRS以登录号(accession number) No. AAM31141登记，源自巴氏甲烷八叠球菌的PylRS 以登录号No. AAL40867登记，源自噬乙酸甲烷八叠球菌的PylRS以登录号No. AAM03608登 记。特别优选的是，上述源自马氏甲烷八叠球菌的PylRS，其基因的碱基序列示于序列号1， 蛋白质的氨基酸序列示于序列号2。这些甲烷八叠球菌属的PylRS同源物的序列保守良好， 例如，氨基酸序列的同源性为约70 %以上。对这些野生型PyIRS的立体结构进行解析，并按 照以下详细说明的方法制作本发明的突变体PylRS。[突变体PylRS的制作]本发明提供基于PylRS的催化剂活性功能域的立体结构的解析和随机突变导入 法而制作的突变体PylRS。PylRS、底物氨基酸(吡咯赖氨酸或Boc-Lys)与作为ATP类似物 的AMPPNP的复合物的结晶及其X射线结构解析的具体方法，如以下实施例的记载。源自马 氏甲烷八叠球菌的PylRS活性功能域、吡咯赖氨酸以及AMPPNP的复合物结晶的单位晶格参 数为空间组为P64，单位晶格为a = b= 104.88A，C = 70.43A' α = β =90和γ = 120°。这里，所谓单位晶格，意思是结晶的最小的、单纯的体积要素，所谓空间组的意思是 单位晶格的对称性。对于PylRS的催化剂活性功能域的结晶和X射线结构解析方法，已经 由本发明人等报道(参考以上记载的非专利文献3)，其内容通过参考整合至本说明书中。对于PylRS的氨基酸底物识别，与赖氨酸衍生物的ε氨基结合的羰基，及之前被加 成的疏水性官能团的存在是重要的。疏水性官能团只要是具有像吡咯环那样的某种程度的 大小以及大体积(bulkiness)，则野生型PylRS就能够活化其赖氨酸衍生物。但是，野生型 PylRS所能够活化的赖氨酸衍生物的大小有限，例如像N、苄氧羰基赖氨酸(Z-Lys)那样 具有大官能团的赖氨酸衍生物就不能导入至蛋白质中。通过本发明的突变体PylRS，即便是 对于采用野生型PylRS时活性低的Z-Lys，也能高效地导入蛋白质。作为这样的突变体PylRS，是在序列号2所示的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸 序列中，选自构成吡咯赖氨酸结合位点的306位的酪氨酸、309位的亮氨酸，和348位的半胱 氨酸中的至少1个氨基酸残基被替换而得到的突变体PylRS。该氨基酸替换优选为，序列号 2的306位的酪氨酸替换为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸等具有较小侧链结构的氨基酸， 更优选的是替换为甘氨酸或丙氨酸，尤其优选的是替换为丙氨酸。关于PylRS的306位的 氨基酸残基，认为其构成底物结合位点，并且特别是在具有Z基那样大体积侧链的底物的 情况下，为了避免结合底物时的空间位阻，优选替换为上述氨基酸残基。另外，309位的亮氨 酸也可以替换为甘氨酸或丙氨酸，优选替换为丙氨酸。此时，优选同时将348位的半胱氨酸 替换为缬氨酸、丝氨酸或丙氨酸。进而，序列号2的384位的酪氨酸也可以替换为苯基丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸或组氨酸等，更优选替换为苯基丙氨酸或组氨酸，尤其优选的是替换为苯基丙氨酸。另 外，131位的甘氨酸也可以替换为谷氨酸。对于这些氨基酸替换带来的活性增强效果，虽然 还不明确，但有可能是384位的氨基酸残基显示出与底物氨基酸、特别是主链部分发生相 互作用(参考非专利文献4)，不依赖于底物氨基酸的种类也增强催化剂活性。优选该384 位的氨基酸替换与上述底物结合位点的氨基酸替换共存，更优选是与306位或309位的氨 基酸替换形成的双重突变体，或与309位和348位的氨基酸替换形成的三重突变体。本发明的优选的实施方式中，提供突变体PylRS，其包含在序列号2所表示的氨 基酸序列中，306位和384位的酪氨酸各自被替换为丙氨酸和苯基丙氨酸的氨基酸序列。该突变体PylRS(Y306A，Y384F)可以高效地将具有Z-Lys那样的大体积侧链结构的赖氨酸 衍生物氨基酰化。本说明书中所说的“能够氨基酰化”或“氨基酰化活性”，是指使赖氨酸 衍生物与抑制基因tRNA结合而合成氨基酰tRNA的活性，例如，纯化突变体酶和抑制基因 tRNA，在体外，在ATP和赖氨酸衍生物的存在下，进行酶反应，从而可以测定生成的吡咯赖 氨酰-tRNA (Pyl-tRNA)的量。作为制作这种突变体的方法，可以采用本领域技术人员公知的各种方法，例如，使 用将编码目的氨基酸的位置的碱基序列替换成编码要改变的氨基酸的碱基序列的引物，通 过PCR使替换成编码要改变的氨基酸的碱基序列的DNA扩增，取得编码全长突变体PylRS 的DNA，使用大肠杆菌等宿主细胞可以使其表达。或者，可以通过Kimkel法或缺口双链 (Gapped duplex)法等公知的位点特异性突变导入方法来进行，可以利用采用了这些方法 的突变导入用试剂盒(例如Mutan-K或Mutan-G(TAKARA)等)。进而，本发明包括包含上述突变体PylRS所具有的氨基酸序列中的306位、309 位、348位和384位以外的1个或多个氨基酸缺失、替换、插入或添加而成的氨基酸序列的蛋 白质，并且该蛋白质能够将Z-Lys氨基酰化。“ 1个或多个氨基酸”，是指全长氨基酸残基数 的最多5 10%左右，例如，1 50个左右，优选1 20个左右，更优选1 10个左右，尤 其优选1 5个左右。同样地，本发明的突变体PylRS，只要是在上述氨基酸序列中的306 位、309位、348位和384位具有规定的突变，维持希望的活性，则也可以包括对于其它氨基 酸残基，具有70%以上的同源性，优选80%以上的同源性，更优选90%以上的同源性的物 质。[非天然氨基酸]作为本发明中使用的非天然氨基酸，例如可以使用Ne-苄氧羰基赖氨酸(Z-Lys) 衍生物。Z-Lys衍生物是非天然的氨基酸，因为赖氨酸侧链的烷基部分作为连接体 (linker)发挥作用，所以适宜作为具有较酪氨酸类似物柔软性高的反应性骨架的氨基酸。 通常已知Z基作为肽合成的保护基团，其不仅可变性比苯甲酰基高，而且侧链含有氧，因此 在水溶性比较高的水溶液条件下也容易操作。另外，因为Z基在催化氢还原的温和条件下 可以脱保护，所以可以将通过交联剂型Z-Lys衍生物而交联的蛋白质彼此在稳定的状态下 分离，还可以根据需要将通过反应性官能团与蛋白质结合的萤光探针等从蛋白质切离。基于Z-Lys结合至野生型和突变体PylRS (Y306A)的活性位点的模型，能够得到几 个优选的化合物。预测Z基的苯环邻位朝向活性位点的外侧不易发生空间位阻，因此能够 用较大官能团替换。例如，可以举出邻位包含交联剂(叠氮基，双吖丙啶(Diazirine))、反 应性官能团(炔烃)的Z-Lys衍生物、烷基侧链上包含结构解析相位确定用原子(硒)的 Z-Lys衍生物等，作为适于突变体PylRS(Y306A)的底物结合位点的Z-Lys衍生物，可以举出 Ne-邻碘-苄氧羰基赖氨酸、苄氧羰基_氨基乙基_硒基半胱氨酸、Νε -邻乙炔基-苄氧羰 基赖氨酸、Ne -邻叠氮基-苄氧羰基赖氨酸，和Ne -三氟甲基二吖丙因基_苄氧羰基赖氨酸 等(参照图12)。[抑制基因tRNA]与上述吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)组合使用的tRNA具备以下要件其被分 配给无义密码子而不是分配给通常的20种氨基酸的密码子，并且，仅被上述突变体PylRS 识别，不被宿主的通常的氨基酰tRNA合成酶识别(orthogonaltRNA，正交tRNA)，并且必须在真细菌内或哺乳动物细胞内表达。作为这样的tRNA，可以举出源自古细菌的抑制基因 tRNAo这里，作为无义密码子，可以举出UAG (琥珀)、UAA (赭石)、UGA(蛋白石)，优选使 用UAG(琥珀)或UGA(蛋白石)密码子。另外，也可以使用包含4碱基以上(优选4或5 碱基)的碱基的密码子(以下称为“移码密码子”)代替无义密码子。这样的tRNA例如可以如下制备从上述古细菌基因组取得对应于tRNAPyl的基因， 使其直接或者导入希望的突变后在体外或体内表达。作为一例，源自马氏甲烷八叠球菌的 野生型tRNA具有以下所示的碱基序列。tRNApyl5' -GGAAACCUGAUCAUGUAGAUCGAAUGGACUCUAAAUCCGUUCAGCCGG⑶UAGAUUCC CGGG⑶UUCCGCCA-3 ‘(序列号 3)[编码本发明的突变体PylRS的DNA，包含该DNA的表达载体和转化细胞]本发明还包括，编码如上所述得到的突变体PylRS的DNA。优选的实施方式中，本 发明的DNA包括编码序列号1所表示的野生型PylRS的DNA中的306位和384位的酪氨 酸所对应密码子(TAC)和(TAT)各自被替换为丙氨酸对应的密码子(GCT、GCC、GCA或GCG) 和苯基丙氨酸对应的密码子(TTT或TTC)的DNA。进而，第306号的氨基酸的密码子也可以 是甘氨酸对应的密码子(GGT、GGC、GGA或GGG)，第384号的氨基酸的密码子也可以是组氨 酸对应的密码子(CAT或CAC)。另外，本发明的DNA还包括包含序列号1所表示的碱基序列的DNA ；使用BLAST 等以默认的条件计算时，具有至少80%以上、优选90%以上、进而优选95%以上的同源性， 并且306位和384位的氨基链的密码子各自包含丙氨酸和苯基丙氨酸对应的密码子的DNA。 进而，还包括上述DNA对应的RNA，例如从上述DNA转录的得到的mRNA，或反义RNA等。另外，和包含上述DNA的互补序列的DNA在严格条件下杂交，并且编码能够将 Ne-苄氧羰基赖氨酸氨基酰化的突变体PylRS的DNA也包括在本发明的DNA的范围内。这 里“在严格条件下杂交“是指本领域技术人员周知的杂交的实验条件。具体地，”严格条件 “，是指在0. 7 IM的NaCl存在下，在60 68°C进行杂交后，使用0. 1 2倍的SSC溶液 (1 X SSC包含150mM的NaCl、15mM柠檬酸钠)，在65 68°C洗涤，从而可以鉴定的条件。为 了选择严格性，可以将洗涤工序中的盐浓度、温度进行最优化。另外，只要是本领域技术人 员，为了提高严格性而添加甲酰胺或SDS等也是技术常识。本发明还包括通过连结(插入)上述本发明的DNA而可以表达突变体PylRS的 表达载体。用于插入本发明的DNA的载体，只要是能够在宿主中复制的载体就没有特别限 定，例如可以举出质粒DNA、噬菌体DNA等。本发明的表达载体优选被整合到载体中，使得 在导入宿主细胞时，能够在该宿主细胞内产生上述突变体PylRS。因此，本发明的载体上， 除了启动子(例如T7启动子、CMV启动子、trp启动子、Iac启动子、PL启动子、tac启动子 等)以外，根据希望还可以连结含有增强子等顺式元件(cis element)、剪切信号、polyA加 成信号(poly A attachment signal)、选择标记物、核糖体结合序列(SD序列)等的物质。 需要说明的是，作为选择标记物，例如可以举出二氢叶酸还原酶基因、氨苄西林耐性基因， 新霉素耐性基因等。本发明也包括使用本发明的表达载体转化得到的转化细胞、优选真细菌、真核细 胞。这里，所谓真细菌，例如可以举出属于大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌属，枯草杆菌(Bacillus subtilis)等芽孢杆菌属，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等 假单胞菌属，苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)等根瘤菌属的细菌。另外，作为真核细胞， 可以举出酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等酵母，进而可以举出COS细胞，CHO细胞等动物细胞。作为转化方法，例如可以通过 使用钙离子的方法(Cohen, S. N. et al. (1972)Proc. Natl. Acad. Sci. ,USA 69，2110-2114)， DEAE葡聚糖法，电穿孔法等公知的方法来进行。[Z-Lys衍生物整合蛋白质的制造]如此得到的突变体PylRS可以与古细菌或真核生物的抑制基因tRNA组合，用于体 外或体内的Z-Lys衍生物整合蛋白质的制造。即，提供Z-Lys衍生物整合蛋白质的制造方 法，其特征在于，使(a)针对Z-Lys衍生物的氨基酰tRNA合成酶、(b)在所述氨基酰tRNA合 成酶的存在下能够与Z-Lys衍生物结合的抑制基因tRNA以及(c)编码在希望的位置上接 受了无义突变或移码突变的希望的蛋白质的基因，在Z-Lys衍生物的存在下，在细胞内或 细胞提取液内表达。这里，作为PylRS或抑制基因tRNA的合成体系，没有特别限定，可以使 用任意的表达体系。例如，无细胞蛋白质合成体系、真细菌细胞内的蛋白质合成体系，或者， 真核细胞，优选动物细胞，特别优选哺乳动物细胞。所谓无细胞蛋白质合成体系，是指将翻译蛋白质所需要的蛋白质因子作为细胞提 取液取出，在试管内再构成该反应，从而合成目的蛋白质的体系。可以利用来源于各种生物 种类的提取液来构成无细胞体系，可以使用例如大肠杆菌或嗜热性细菌等细菌、小麦胚芽、 兔网状红血球、小鼠L-细胞、艾氏腹水癌细胞、HeLa细胞、CHO细胞和芽殖酵母等、高蛋白 质合成活性状态的真核细胞以及原核细胞的提取液(Clemens，M.J.，Transcription and Translation-Α Practical Approach, (1984), pp. 231-270, Henes, B.D.et al. eds. , IRL Press, Oxford)。作为大肠杆菌的提取液，可以使用通过Zubay等人(Zubay et al. , Ann. Rev. Genet. Vol. 7，pp. 267-287 (1973))或 Pratt 等人(Pratt，J. M. et al.，Transcription and Translation-A Practical Approach, (1984), pp. 179-209, Henes, B.D.et al.eds., IRL Press, Oxford)记载的方法制备的S30提取液。大肠杆菌S30提取液包含转录和翻译所需 要的大肠杆菌的全部酶和因子。进而还可以添加补充的混合液。作为具体的制备方法，最初 培养大肠杆菌，通过离心分离等来回收菌体。被回收的菌体在洗涤后，再悬浊于缓冲液中， 使用法式压滤壶、玻璃微珠、高速组织捣碎机(WARING BLENDER)等来破碎。通过离心分离 除去被破碎的大肠杆菌的不溶物质，与预孵育混合液混合，进行孵育。通过该操作，内源性 的DNA、RNA被分解，进而，添加钙盐或微球菌属的核酸酶等也可以使内源性的核酸分解。接 着，通过透析，除去内源性的氨基酸、核酸、核苷等，每次适量地进行分注，在液氮或-80°C保 存。进行Z-Lys衍生物整合蛋白质的合成反应时，上述细胞提取液中可以包括作为 转录/翻译模板的、编码希望的位置上接受了无义突变或移码突变的希望的蛋白质的DNA 或RNA，包括Z-Lys衍生物的氨基酸，本发明的突变体PylRS，在所述突变体PylRS的存在下 能够与Z-Lys衍生物结合的抑制基因tRNA，能量源，各种离子，缓冲液，ATP再生体系，核酸 分解酶抑制剂，tRNA，还原剂，聚乙二醇，cAMP，叶酸类，抗菌剂，使用DNA作为模板时的RNA 合成的底物，和RNA聚合酶等。这些可以根据目的蛋白质、所使用的蛋白质合成体系的种类
11来适当选择而制备。例如，大肠杆菌的S30提取液的情况，添加Tris-醋酸、DTT、NTPs(ATP、 CTP、GTPdP UTP)、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸激酶、氨基酸(除天然的20种氨基酸外还添 加磷酸丝氨酸)、聚乙二醇(PEG)、叶酸、cAMP、tRNA、醋酸铵、醋酸钾、谷氨酸钾、和最佳浓度 的醋酸镁等的一部分或者全部。为了使突变体PylRS在哺乳动物细胞内表达，对于源自马氏甲烷八叠球菌的野生 型PylRS基因，用PCR法扩增在N末端功能域附加了组氨酸标签等的DNA序列，将其整合到 市售的pcDNA3. 1 (invitrogen公司)等表达载体的NheI-BamHI位点来构建质粒，将该质粒 导入哺乳动物细胞即可。作为向细胞导入载体的方法，例如可以举出电穿孔法、磷酸钙法、 脂质体转染法等。另一方面，作为抑制基因tRNA的表达方法，没有特别限定，可以按照本领域技术 人员公知的方法，使其在大肠杆菌等真细菌内或哺乳动物细胞等真核细胞内表达。例如，在 大肠杆菌内的表达为，在编码抑制基因tRNA的DNA的5’末端连结启动子序列，在3’末端 连结终止子序列。在真核细胞内转录tRNA的II型启动子，是由tRNA编码序列内的2个 区域组成的内部启动子，其共有序列已知是A盒、B盒。A盒的共有序列是，8位 19位的 TRGCNNAGYNGG (序列号7)，B盒的共有序列是，52位 62位的GGTTCGANTCC (序列号8)。因 此，例如，像脂肪嗜热芽孢杆菌的抑制因子酪氨酸tRNA那样，其编码序列内存在A盒和B盒 的情况下，即使不施加任何改变也可以使其在动物细胞内表达。但是，不具有内部启动子的 抑制基因tRNA的情况下，使用外部启动子也可以使其在真核细胞内表达。例如，通过使真 核生物的tRNA核酸序列、Ul或TOsnRNA基因的启动子序列结合在抑制基因tRNA基因的5’ 末端，能够使其在动物细胞内有效地表达。进而，作为不同的实施方式，连结来源于T7噬菌 体的T7启动子，也可以使其在动物细胞内与T7RNA聚合酶同时表达。进而，本发明提供Z-Lys衍生物整合蛋白质合成试剂盒，其包括(a)上述细胞提 取液，(b)包含N、苄氧羰基赖氨酸衍生物的非天然氨基酸，(c)本发明所涉及的突变体 PylRS,以及(d)在所述突变体PylRS的存在下能够与Z-Lys衍生物结合的抑制基因tRNA。 上述(b)的非天然氨基酸也可以是与20种天然氨基酸的混合物。这些构成要素，为了使用 方便，可以每份分注一定量，制成Z-Lys衍生物整合蛋白质合成试剂盒来配送。这些产品可 以在冷冻或干燥状态下保存，收纳在适于保存和运输的容器中作为试剂盒来出售。试剂盒 中可以附带操作说明书、载体DNA等。实施例1[试样的制备和结晶]L-吡咯赖氨酸N6- [ (2R，3R) _3_甲基-3，4_ 二氢_2H_吡咯_2_基羰基]-L-赖氨酸 (参照图1A)化学地合成，通过1H-NMR确认了其化学结构。各种L-赖氨酸衍生物从Bachem AG(瑞士)购入。源自马氏甲烷八叠球菌的tRNAPyl通过体外转录而合成，经RES0URCEQ柱 色谱(Amersham Biosciences 公司)纯化。完整长度的源自马氏甲烷八叠球菌的PylRS是包含454个氨基酸残基、分子量 5IkDa的蛋白质。将编码该完整长度的PylRS的基因，由马氏甲烷八叠球菌、JCM9314株 的基因组DNA(理研生物资源研究中心)使用以下的引物通过PCR进行扩增，在载体质粒 pET28c(N0VAGEN公司)的NdeI-SacI位点克隆。将其导入大肠杆菌而表达的蛋白质，在N 末端被添加有源自PET28的His标签编码区域(MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH)(序列号4)。
12
N 末端引物5 ‘ -AGGGGTAACCATATGGATAAAAAACCACTAAACAC-3 ‘(序列号 5)C 末端引物5 ‘ -ACATGGTCCAGAGCTCTTACAGGTTGGTAGAAATCCCGTT-3 ‘(序列号 6)另一方面，虽然使完整长度的PylRS在大肠杆菌内表达而制备了结晶，但由于没 能得到适于X射线结构解析的结晶，因此制作了 N末端起第184个氨基酸缺失的PylRS (以 下称之为“PylRS(c270)”。参照图IB。)。PylRS(c270)蛋白质，作为与添加在N末端的6 个组氨酸标签融合的蛋白质，用大肠杆菌BL21(DE3)CodonPlus-RIL株(Stratagene公司) 使其表达。天然的PylRS(c270)和以硒基蛋氨酸标记的PylRS(c270)蛋白质用前述的非专 利文献3记载的方法纯化和结晶。需要说明的是，为了获得更好的结晶，如下所述，使用稍 微改变的结晶条件。在5mM的吡咯赖氨酸(或3. 45mM的Boc-Lys)和5mM的AMPPNP的存 在下，在包含5 % PEG4000 (或PEG3350)和5mM的MgCl2的50mM 二甲胂酸钠(ρΗ7· 0)中，于 20°C在3分钟以内取得PylRS (c270)的共结晶。[数据采集]X射线晶体结构解析用数据按照上述非专利文献3记载的方法进行，用SPring-8 的光束线(beamline)BL41XU收集来自PylRS(c270)/吡咯赖氨酸/AMPPNP复合物结晶的 1.8 A数据集，和来自PylRS (c270)/Boc-LyS/AMPPNP复合物结晶的1.79 A数据集。[结构解析]采用MAD法确定了相位。7个硒替换位点中的5个利用SnB进行了局部化，初期相 位通过SOLVE计算。初期相位接着通过利用了 RESOLVE的密度修饰进行了改善。部分模型 通过RESOLVE被自动构建，其余主要由程序0构建，以CNS精密化。立体结构模型的质量用 PR0CHECK 解析。[氨基酰化分析]向野生型PylRS的突变导入是使用Quikchange突变导入试剂盒(Stratagene公 司)进行的。用大肠杆菌使完整长度的突变体PylRS过表达后，用HisTrap柱(Amersham Biosciences公司)纯化。氨基酰化反应在37°C进行1小时。氨基酰化反应溶液是溶解在 2. 83 μ M的源自马氏甲烷八叠球菌的纯化PylRS (或9 μ M的PylRS (c270))、IOmM的MgCl2、 2mM的ATP、4mM的DTT、2. 11 μ M的源自马氏甲烷八叠球菌的tRNAPyl转录物和IOOmM的HEPES 缓冲液(PH7. 2)中的各种氨基酸浓缩溶液的适当量。tRNA的氨基酰化的有无是通过酸-尿 素聚丙烯酰胺凝胶电泳来解析的。[整体结构]马氏甲烷八叠球菌的PylRS包含454个氨基酸残基，与巴氏甲烷八叠球菌的PylRS 的同源性高(74%的同源性)。PylRS主要包含2个功能域。约250氨基酸残基的C末端侧 功能域具有与ClassII氨基酰-tRNA合成酶的序列的同源性，但约140氨基酸残基的N末 端侧功能域是独特的(参照图1B)。氨基酰-tRNA合成酶样功能域所对应的PylRS(c270) 能够用吡咯赖氨酸将tRNAPyl酯化(参照图1C)。为了该PylRS(c270)的结晶生长，需要添 加ATP类似物，认为ATP牢固地与PylRS (c270)结合而将其结构稳定化。最初，通过使用了硒基蛋氨酸替换体的多波长异常散射法(MAD法)，确定了与 AMPPNP结合的PylRS(c270)的结构。其立体结构的特征在于，含赖氨酰-tRNA合成酶 (LysRS)的ClassIIaaRS。PylRS(c270)的结构中，N末端起的第195 237个残基形成2 个α-螺旋(α 1和α 2)，第241 432个残基构成催化剂功能域(参照图1D)。催化剂功能域具有伸长的7个反式平行β-折叠(β 1，β5，β6，β7，β8，β9和β 10)和包围它们 的α -螺旋，在ClassIIaaRS显示出了特征性的拓扑结构。图2是表示基于马氏甲烷八叠球菌PylRS (C270)与其它PylRS和LysRS的立体结 构的氨基酸序列的序列比对的图。对于序列，用程序CLUSTAL W比对，部分以手动进行优 化。将PylRS和LysRS中高度保守的氨基酸残基用框围住。比对序列的上部示意性地表示 二级结构。本发明所涉及的306位的酪氨酸和384位的酪氨酸的氨基酸替换位点用箭头表 示。比对序列上部的数字表示马氏甲烷八叠球菌PylRS (c270)的氨基酸残基的位置，它们 的下部的数字表示大肠杆菌LysRS的氨基酸残基的位置。MmPylRSc表示马氏甲烷八叠球菌 PylRS (c270) ；MbPylRS表示巴氏甲烷八叠球菌PylRS (AAL40867) ；MaPylRS表示噬乙酸甲烷 八叠球菌PylRS(AAM03608) ；MtPylRS表示嗜热甲烷八叠球菌PylRS ；DhPylRSc表示脱卤呼 吸细菌(哈夫尼脱亚硫酸菌)PylRS (AAU93507) ；EcLysU表示大肠杆菌LysRS (AAA97029)； MmLysRS表示马氏甲烷八叠球菌的ClassIILysRS(AAK29404) ；HsLysRS表示人的细胞质 LysRS(AAH04132)。[吡咯赖氨酸和ATP的识别]接着，由与吡咯赖氨酸和AMPPNP形成了复合物的PylRS(c270)的结晶结构得知， PylRS的氨基酸结合位点远远大于常规的氨基酰-tRNA合成酶的氨基酸结合位点。吡咯赖 氨酸分子结合于ClassII氨基酰-tRNA合成酶上特征性的7个反式平行β -折叠的表面。 大体积的4-甲基-吡咯啉环被收纳在包含Ala-302、Leu-305、Tyr-306、Leu-309、Cys-348、 Val-401、Leu-407、Ile-413和Trp-417的主要由疏水性残基形成的孔道内(参照图3A和 图3C)。Asn-346侧链的酰胺部分朝着底物氨基酸，以2.82 A的距离与吡咯赖氨酸的侧链 羰基形成氢键，将其位置固定。需要说明的是，吡咯赖氨酸为轴向型立体异构体的情况下， Asn-346侧链的酰胺部分与吡咯赖氨酸的侧链羰基之间的距离为2.81 A (参照图3E和图 3F)。另外，Asn346的侧链的羰基通过水而与吡咯赖氨酸的α-氨基间接地形成氢键。高度 保守的Arg-330的胍基与吡咯赖氨酸的α -羰基形成氢键。除了通过Asn-346和Arg-330 形成的这3个氢键以外，不存在其它氢键，PylRS这样的氨基酸识别模式是极有特征性的 (参照图3C)。对于将用于形成收纳上述吡咯赖氨酸的孔道的各氨基酸残基替换为丙氨酸 的突变体PylRS的氨基酰化活性进行测定，305位的亮氨酸、306位的酪氨酸、346位的天冬 酰胺、401位的缬氨酸和417位的色氨酸分别替换为丙氨酸的5个突变体的活性显著降低 (参照图3B)。[PylRS活性位点与LysRS活性位点的比较]对于PylRS的结构和底物结合模式，与大肠杆菌的LysRS的结构和底物结合模式 进行了比较。大肠杆菌LysRS的活性位点中，高度保守的残基(Glu-240，Arg-262，Glu-278， Tyr-280, Asn-424，Phe-426和Glu-428)参与L-Lys的识别(参照图3D)。向这些残基导 入突变，则对于作为LysRS的底物的L-Lys的Km值显著增大。与此相对，马氏甲烷八叠球 菌PylRS(c270)中，仅Arg-262保守，其它位点被更小的非带电氨基酸残基占据(分别是 Ala-302、Asn-346、Cys-348、Ser-399、Val-401 和 Gly-403)。通过这些氨基酸替换，PylRS 的氨基酸结合位点(孔道)比LysRS中的L-Lys结合袋(pocket)深8 9 A (参照图3A)。 如上所述，吡咯赖氨酸与PylRS (c270)之间仅形成3个氢键，与此相对，L-Lys与LysRS之 间形成至少7个氢键。与赖氨酸部分相互作用的氢键少，则PylRS难以以L-Lys为底物进行活化。实际上，PylRS以ImM浓度的吡咯赖氨酸就会活化tRNAPy1，但即使0. 5M的浓度也 无法活化包括赖氨酸的20种常规的氨基酸。有趣地是，就利用PylRS进行的吡咯赖氨酸的 识别而言，赖氨酸的侧链对应的部分作为主链和甲基吡咯啉羰基部分之间的隔离子而发挥 作用。疏水性的深孔道和对赖氨酸部分的弱识别是PylRS和LysRS的底物识别中很大的差 别。[通过PylRS进行的非天然氨基酸的活化]由PylRS的底物结合位点的立体结构推测出，PylRS能够将吡咯赖氨酸以外的非 天然氨基酸活化。基于该假设，调查了 PylRS能否活化图4A所示的6种Ne-赖氨酸衍生 物。其结果示于图4B。各泳道是在PylRS的存在下，从左开始顺次在如下条件下进行氨 基酰化反应的结果。未添加氨基酸；0. 5M的Lys ；IOOmM的Ac-Lys ；ImM的Boc-Lys ；ImM 的 Aloc-Lys ；IOmM 的 Nic-Lys ；7mM 的 Nma-Lys ；3. 5mM 的 Z-Lys ；ImM 吡咯赖氨酸；和空白 tRNAPy1。如图4B所示，对于叔丁氧基羰基-赖氨酸(Boc-Lys)和烯丙氧基羰基-赖氨酸 (Aloc-Lys)，在ImM的浓度下以与吡咯赖氨酸同等程度的效率进行了活化。进而，虽然效率 多少有些降低，但得知了 野生型PylRS以…-乙酰基-L-赖氨酸(Ac-Lys)、Νε-烟酰-L-赖 氨酸(Nic-Lys)、Ne-苄氧羰基L-赖氨酸(Z-Lys)和作为萤光氨基酸的Ne -(N-甲基-氨 茴酰)-L-赖氨酸(Nma-Lys)等Ne -修饰赖氨酸衍生物将tRNAPyl酯化。另一方面，野生型 PylRS没能将以甲基、二甲基、三甲基、异丙基、丹酰基、邻，对-二硝基苯基、对叠氮基苯甲 酰基、生物素基、9-芴基甲氧基羰基和对甲苯磺酰基进行了 N、连结的赖氨酸衍生物活化。 由此得知，PylRS会识别具有某种程度的大体积N、替换体。对于先前制作的突变体PylRS，以Boc-Lys作为底物测定了氨基酰化活性，结果 是，与作为天然底物的吡咯赖氨酸同样地，305位的亮氨酸、306位的酪氨酸、346位的天冬 酰胺、401位的缬氨酸和417位的色氨酸各自替换为丙氨酸的5种突变体的活性显著降低。 有趣的是，得知了 1种突变体PylRS (Y306A)，与野生型PylRS相比，极高效地用Z-Lys将 tRNAPyl酯化(参照图5C)。该306位的酪氨酸替换为丙氨酸的突变被认为是，在PylRS的 底物结合位点生成用于收纳苄氧羰基(Z)基的合适空洞(参照图5A和B)。[Boc-Lys-tRNA 合成酶的选择]体外的氨基酰化分析的结果是，无论野生型PylRS是否将Boc-Lys等赖氨酸衍生 物氨基酰化，在大肠杆菌细胞内都没能将这些衍生物有效地整合到蛋白质中。于是，在体内 能够将Boc-Lys有效地向蛋白质中整合的突变体PylRS(Y384F)按照以下的方法筛选。完整长度的PylRS基因，在质粒PTK2-1中，在大肠杆菌TyrRS启动子和终止子的 控制下表达。该质粒PTK2-1是质粒pACYC 184的衍生物，卡那霉素耐性基因和大肠杆菌 Ipp启动子的控制下，表达1个拷贝的tRNAPyl基因。PylRS基因，使用GeneMorph PCR突 变导入试剂盒(Stratagene公司)随机地以每Ikb 3 7个的比例导入突变，与原来的质 粒PTK2-1连结，制作出PylRS文库。连结的载体转化大肠杆菌DHlOB感受态细胞，取得了 6 X IO7个菌落形成单位的文库。tRNAPyl基因还在质粒pTK2-l中的Ipp启动子和rrnC终止 子的控制下在大肠杆菌DHlOB中表达。突变体PylRS文库，最初，基于设置在氯霉素乙酰基 转移酶(CAT)基因的非必须位置上的琥珀中止密码子的抑制(抑制)进行了阳性选择。使 通过突变体PylRS文库和野生型tRNAPyl基因转化的细胞在含ImM的Boc-Lys的培养基中生 长，在各种浓度的氯霉素的存在下筛选生存的细胞。接着，使生存细胞在氯霉素的存在下并且在Boc-Lys的非存在下生长。在Boc-Lys的非存在下，表达被选择的突变体PylRS (Y384F) 的细胞仅在低于25 μ g/ml的氯霉素浓度下生存，但在Boc-Lys存在下，即使在150 μ g/ml 的氯霉素浓度下也生存。与PylRS非存在下的大肠杆菌的耐CAT性能(< 13 μ g/ml)比 较，结果是，被选择的突变体PylRS (Y384F)不仅接受Boc-Lys，而且对任一天然型氨基酸都 进行一定程度的氨基酰化。[大肠杆菌内的赖氨酸衍生物依赖性琥珀抑制]为了确认大肠杆菌内是否发生琥珀抑制(琥珀突变抑制)，将N末端起第25个酪 氨酸密码子突变为琥珀密码子(TAG)的谷胱甘肽转移酶(GST)基因克隆到pET系质粒中。 另一方面，将野生型和各种突变体PylRS基因、以及tRNAPyl基因克隆到pACYX系质粒中(参 照图6)。将这两种表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)，用含卡那霉素和氨苄西林的LB琼 脂培养基静置培养一夜。将生长出来的菌落在赖氨酸衍生物存在或非存在下，接种在含卡 那霉素和氨苄西林的LB液体培养基中，在37°C培养，在培养基的吸光度达到0. 6时，添加 IPTG使得终浓度为ImM。培养一夜诱导表达后，回收大肠杆菌，用SDS-PAGE确认表达的GST。 其结果是发现了，在各自4mM的Boc-Lys和Aloc-Lys的存在下，使突变体PylRS (Y384F)和 tRNAPyl表达时，表达28kDa的GST蛋白质(参照图7)。发现了在5mM的Z-Lys存在下，使双重 突变体PylRS (Y384F/Y306A)和tRNAPyl表达时，也产生完整长度的GST蛋白质(参照图8)。 在从培养液IOml中回收的大肠杆菌中加入缓冲液A (磷酸钾(pH7. 4)、0. 15M的NaClUOmM 的β-巯基乙醇)lml，超声破碎，离心分离，向得到的上清中加入谷胱甘肽亲和柱(GSTrap， Amersham Biosciences公司)200 μ 1，在4°C搅拌1小时后，用缓冲液A洗涤3次，用含20mM 谷胱甘肽的缓冲液A将GST蛋白质溶出。如此纯化得到的GST的收率为每IL培养液1 2mg的蛋白质(参照图9)。将纯化的GST蛋白质用胰蛋白酶分解后，通过MALDI-T0F质量分 析法进行了解析。胰蛋白酶消化而产生的肽NSXSPIGYWK(X分别表示Boc-Lys，Aloc-Lys和 Z-Lys)所对应的检测峰为m/z = 1392. 74，1376. 79和1426. 70Da，均与理论值很一致，与野 生型胰蛋白酶肽 NSYSPILGYWK(m/z = 1327. 72Da)相比，分别大 65. 02,49. 07 和 98. 98 (参 照图10)。由图10所示的质谱得到的序列信息显示出，这些非天然氨基酸被位点特异性地 导入了 GST蛋白质。[PylRS (c270)和 tRNA 的结合模式]PylRS(c270)维持tRNA的氨基酰化活性的情况是值得关注的(参照图1C)。其表 示tRNAPyl能够与N末端功能域缺失了的PylRS结合。使PylRS(c270)的催化剂活性位点与 和tRNAAsp形成了复合物的大肠杆菌天冬氨酸-tRNA合成酶的立体结构重合，制成将tRNAAsp 替换为酵母tRNApte的对接模式。由此，PylRS (c270)与tRNA的接纳茎和D-臂接触。α 和α 2螺旋与1个tRNA原聚体的D-臂邻接，PylRS (c270)与T-臂和反密码子臂之间没有 发现相互作用。tRNAPyl的结构表现出与常规tRNAphe相比显著不同的特征，例如图IlA所 示，具有仅由5碱基形成的小D-环。因为PylRS(c270)的N末端螺旋朝着T-臂的方向突 出，所以，马氏甲烷八叠球菌的完整长度PylRS可能会与tRNAPyl的T-臂接触。进而，制作 出改变为与tRNAPyl的反密码子的序列不同的序列的突变体时，它们均不影响PylRS的酶活 性，因而得知PylRS与tRNA的反密码子环没有相互作用，几乎不需要识别反密码子(参照 图 11B)。实施例2
[Z-Lys特异性的突变体PylRS的筛选]基于与Boc-Lys和AMPPNP形成复合物得到的PylRS (c270)的立体结构，通过以下 方法筛选Z-Lys特异性的突变体PylRS。从该复合物的立体结构，选择位于接近Boc-Lys侧 链的位置上的PylRS的氨基酸残基，进行饱和诱变(saturation mutagenesis)。为了识别 大的Z-Lys基，PylRS的氨基酸识别袋的末端部必须进行伸长和扩增。在PylRS与Boc-Lys 复合物的结构中，Tyr306、Leu309、Cys348和Trp417构成袋的末端部。但是，PylRS的Trp417 替换为其它氨基酸时酶失活，所以制作了将其余3个氨基酸残基的密码子用NNK (N表示4 种任意的碱基，K表示G或T。)替换而得到的突变体酶的文库(包括2. 3X106个独立转 化体)。具体地，将对Boc-Lys的氨基酰化活性提高了的R61K、G131E和Y384F突变体 PylRS基因，在含pBR322复制起点和卡那霉素耐性基因的质粒pBRQl的glnS启动子的控制 下克隆。合成该PylRS基因的306位、309位和348位的密码子序列用NNK(N表示4种任 意的碱基，K表示G或T)随机替换而得到的DNA片段，通过PCR进行了扩增。将它们用重 叠PCR(Overlap PCR)法组装，插入到质粒pBRQl的glnS启动子的下游。将这些质粒在具 有琥珀突变的CAT基因(Amll2)和Ipp启动子的控制下，导入到保持有含tRNApyl基因的 质粒的大肠杆菌DHlOB中。作为阳性选择，将得到的转化体用含有50μ g/ml氯霉素和ImM Z-Lys的LB板进行选择，提取质粒DNA并用琼脂糖凝胶电泳进行纯化。接着，将得到的质 粒DNA导入保持有源自pACYC184的质粒的大肠杆菌DHlOB中，所述源自pACYC184的质粒 在作为细菌毒素的芽孢杆菌RNA酶(barnase)基因翻译区域的2位、44位和65位含有琥珀 密码子，并含有被araC启动子控制的DNA。作为阴性选择，将这些细胞在含0. 02%阿拉伯 糖的LB板上孵育。阳性选择重复进行3次，并且阴性选择重复进行2次。其结果是，通过利用75yg/ml的氯霉素进行的阳性选择，最终得到了 5个不同 的突变体。这5个突变体中，带有含L309A和C348V的双重氨基酸替换的酶(以下称为 Z-LysRS)的细胞，表达最大量琥珀抑制GST(在含ImM的Z-Lys的M9GMML培养基中为 6. 9mg/L培养基)，另一方面，未添加Z-Lys的条件下，几乎没有发现表达(参照图13)。图 13是使用实施例1中得到的突变体PylRS(Y306A)和本实施例中得到的Z-LysRS，对添加2 种非天然氨基酸Z-Lys或2-氯-Z-Lys而被琥珀抑制的完整长度GST的表达进行调查而 得到的结果。图的上部是针对大肠杆菌粗提取液，下部是针对纯化后的GST溶液，各自用 12% SDS-PAGE分离，进行CBB染色而得到的结果。按照考马斯亮兰法(Bradford法)(使 用Bio-Rad公司的蛋白质分析试剂盒)，测定各条件下的收率(每M9GMML培养基IL的GST 表达量mg)，其结果示于上下2个凝胶之间。图中，N.D.表示不能检测出。将纯化后的GST蛋白质进行胰蛋白酶分解后，用MALDI-T0F质量分析法进行解析 的结果是，仅检测出NSXSPIGYWK(X是Z-Lys残基，m/z = 1426. 75Da)所对应的肽峰，没有检 测出整合有其它氨基酸的肽的峰。由此得知，本实施例中得到的突变体酶Z-LysRS(L309A， C348V)对Z-Lys是特异性的。另外，如图13所示，Z-LysRS与Y306A相比，Z-Lys的导入效 率更高，而且作为底物的2-氯衍生物的引入量反而少，因此认为对Z-Lys的特异性更高。实施例3[大肠杆菌中的N、邻叠氮基-苄氧羰基赖氨酸(AzZLys)向GST蛋白质的导入 和萤光修饰反应]
为了使具有Y306A和Y384F的双重氨基酸替换的PylRS突变体和tRNAPyl在大肠杆 菌中表达，使用了与实施例1相同的质粒PTK2-1。按照与实施例1相同的方法，将赖氨酸衍 生物导入到使用了该质粒的从N末端起第25位具有琥珀密码子的GST中。进而，AzZLys [从 新成化学(大阪)购得]向使用了相同质粒的GST的琥珀位点的特异性导入，也是通过与 实施例1相同的方法进行的。接着，将从表达GST的琥珀基因的大肠杆菌得到的粗提取液 用SDS-PAGE分离，染色。其结果是，只有在ImM的AzZLys存在下(+)的情况下，检测出完 整长度GST的表达(其条带的位置在图14用箭头GST表示)。应予说明，GST的纯化也按 照与实施例1相同的方法进行。萤光团与三芳基膦的共轭物，与纯化后的完整长度GST，通过 Staudinger-Bertozzi反应而连结。作为共轭物，使用了与FITC的共轭物(以下称为 FITC-PP3)(从新成化学购得)。图15中表示FITC-PP3的化学结构。连结反应是以2种反 应条件，即，在37°C 1小时(Ihr)和在4°C一夜(0/N)进行的。接着，将这些GST用SDS-PAGE 分离，用UV等检测萤光。其结果是，只在37。C反应1小时的反应条件的情况下，发现了被 萤光修饰了的GST (其条带的位置在图16用箭头GST表示)。对于Staudinger-Bertozzi 反应，参照上述非专利文献5、6等。该结果是，通过使用PylRS (Y306A，Y384F)突变体，能够 将AzZLys特异性地导入大肠杆菌内的希望的位点，而且，由被导入的AzZLys与膦的反应， 能够将含萤光团的任意修饰基团导入(任意的)蛋白质[GST蛋白质]。[动物细胞中的AzZLys向Grb2蛋白质的导入和萤光修饰反应]为了使PylRS (Y306A，Y384F)突变体和tRNAPyl在HEK c_18细胞中表达，使用了上 述非专利文献7记载的系统。同样地，使用了该非专利文献7记载的在IacZ基因和GRB2 基因的编码区域导入有琥珀密码子的突变基因及其表达系统。首先，为了在动物细胞将AzLys位点特异性地导入蛋白质，确定了最佳的AzLys浓 度。在含有0、0. 01、0. 025、0. 05、0. 1、0. 25和0. 5mM的AzZLys的培养基中，进行来自IacZ 琥珀基因的LacZ蛋白质的表达，通过LacZ引起的显色反应求出LacZ的表达量(相对值)。 结果得知，添加到培养基中的AzZLys的浓度为0. 05mM的情况下，AzZLys被最有效地引入 到IacZ的琥珀位点(图17)。图17中的WT表示在编码区域中不具有琥珀密码子的野生型 (WT)的IacZ的表达量(相对值)。通过与WT结果的比较得知，AzZLys的浓度为0. 05mM时 的抑制效率是30%左右。向表达了 GRB2的琥珀基因的动物细胞的粗提取液中添加萤光膦共轭物 (FITC-PP3)，进行Grb2蛋白质的萤光标记。接着，用SDS-PAGE进行分离，利用萤光检测器 检测了萤光(图18的泳道1 3)。图18中，aaRS表示ZLysRS表达的有无(+为有表达)， Grb2表示GRB2的琥珀基因表达的有无(Am为有表达)，tRNA表示tRNAPyl表达的有无(+为 有表达),a. a.表示AzZLys的添加的有无(+为添加)。由图18明确可知，只有在aaRS (+)、 Grb2(Am)、tRNA⑴且a. a.⑴的情况(泳道3)，能够检测出用萤光标记的Grb2蛋白质(其 条带的位置用箭头Grb2表示)。应予说明，泳道1表示使用了 WT的GRB2基因的情况的结 果，由图18明确可知，没有显现出萤光标记的条带。作为对照，将对叠氮基苯基丙氨酸(以 下称为AzF)导入Grb2蛋白质的相同位置。为了使用AzF特异性酶(AzFRS)在动物细胞 中将AzF导入琥珀位置，使用了上述非专利文献8记载的系统。由图18明确可知，即使使 用AzFRS，Grb2也被萤光修饰(泳道5 ；其条带的位置用箭头Grb2表示)，同时，AzFRS也被萤光修饰(泳道5和6;其条带的位置用箭头AzFRS)。由此可知，仅用萤光检测，无法区别 Grb2和AzFRS，便利性差。上述的结果表示通过使用PylRS (Y306A，Y384F)突变体，能够将AzZLys特异性地 导入动物细胞内希望的位点，并且，通过使被导入的AzZLys和膦反应，能够将含萤光团的 任意修饰基团导入(任意的)蛋白质[GST蛋白质]中。上述的结果还表示该实施例中使 用的本发明的系统，与以往的使用AzFRS将AzF导入蛋白质的系统相比，修饰的选择性更优
已 升。产业实用性本发明的突变体PylRS能够实现以往不可能实现的将Z-Lys衍生物那样的非天然 氨基酸位点特异性地导入蛋白质，对于合成新的全蛋白质有用。本发明通过提供这样的方 法，通过蛋白质的结构和功能的解析，促进了复杂生命现象的理解，对于医药、生命科学领 域的产业有用。在本发明公开的全部内容(包括权利要求)的范围内，进一步基于其基本技术思 想，可以对实施方式乃至实施例进行改变、调整。另外，在本发明的权利要求的范围内，能够 将各种公开的要素进行多种组合或选择。
权利要求
突变体吡咯赖氨酰 tRNA合成酶，其为序列号2所示的吡咯赖氨酰 tRNA合成酶的氨基酸序列中，选自构成吡咯赖氨酸结合位点的306位的酪氨酸、309位的亮氨酸和348位的半胱氨酸中的至少1个氨基酸残基被替换而得到的突变体酶，该氨基酸替换是306位的酪氨酸替换为甘氨酸或丙氨酸，309位的亮氨酸替换为甘氨酸或丙氨酸，和348位的半胱氨酸替换为缬氨酸、丝氨酸或丙氨酸。
2.根据权利要求1记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其中，还包括384位的酪氨 酸替换为苯基丙氨酸或组氨酸的氨基酸替换。
3.根据权利要求2记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其中，所述氨基酸替换包括 306位的酪氨酸替换为丙氨酸，和384位的酪氨酸替换为苯基丙氨酸的双重替换。
4.根据权利要求2记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其中，所述氨基酸替换包括 309位的亮氨酸替换为丙氨酸，和384位的酪氨酸替换为苯基丙氨酸的双重替换。
5.根据权利要求2记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其中，所述氨基酸替换包 括309位的亮氨酸替换为丙氨酸，348位的半胱氨酸替换为缬氨酸，和384位的酪氨酸替换 为苯基丙氨酸的三重替换。
6.根据权利要求1 5任一项记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其特征在于，包 含306位，309位，348位和384位以外的1个或多个氨基酸缺失、替换或添加而成的氨基酸 序列，并且能够将N e -苄氧羰基赖氨酸氨基酰化。
7.突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其由野生型吡咯赖氨酰-tRNA合成酶而得，所述野 生型吡咯赖氨酰-tRNA合成酶为序列号2所示的氨基酸序列的同源物，即源自甲烷八叠球 菌属的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其中，将所述同源物的氨基酸序列与序列号2所示的氨基 酸序列进行序列比对时，序列号2所示的氨基酸序列的306位所对应的酪氨酸被替换为丙 氨酸，和/或384位所对应的酪氨酸被替换为苯基丙氨酸。
8.编码权利要求1 7任一项记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的、经分离得到 的 DNA。
9.表达载体，其为在导入宿主细胞时，在该宿主细胞内能够产生权利要求1 7任一项 记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的表达载体，该表达载体被功能性地结合于所述宿 主细胞内的表达控制序列，并且包含权利要求8记载的DNA。
10.真细菌，其特征在于，经权利要求9记载的表达载体转化而成。
11.大肠杆菌，其特征在于，经权利要求9记载的表达载体转化而成。
12.哺乳动物培养细胞，其特征在于，经权利要求9记载的表达载体转化而成。
13.非天然氨基酸整合蛋白质的制造方法，其特征在于，使(a)能够将NE-苄氧羰基赖氨酸衍生物活化的氨基酰tRNA合成酶，(b)在所述氨基酰tRNA合成酶的存在下能够与NE-苄氧羰基赖氨酸衍生物结合的抑 制基因tRNA以及，(c)编码希望的蛋白质的基因，所述蛋白质在希望的位置上接受了无义突变或移码突变，在所述NE -苄氧羰基赖氨酸衍生物的存在下，在细胞内或细胞提取液内表达。
14.根据权利要求13记载的方法，其中，所述氨基酰tRNA合成酶是权利要求1 5任一项记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶。
15.根据权利要求13或14记载的方法，其中所述…-苄氧羰基赖氨酸衍生物是NE-邻 碘_苄氧羰基赖氨酸、苄氧羰基_氨基乙基_硒基半胱氨酸、NE -邻乙炔基-苄氧羰基赖氨 酸、NE -邻叠氮基-苄氧羰基赖氨酸或NE -三氟甲基二吖丙因基_苄氧羰基赖氨酸。
16.非天然氨基酸整合蛋白质合成试剂盒，其包括(a)细胞提取液，(b)包含NE_苄氧羰基赖氨酸衍生物的非天然氨基酸，(c)权利要求1 7任一项记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，以及(d)在所述突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的存在下能够与NE-苄氧羰基赖氨酸衍生 物结合的抑制基因tRNA。
全文摘要
本发明提供将适宜作为具有重原子、硒、反应性官能团、萤光基、交联剂等有用官能团的非天然氨基酸的赖氨酸衍生物，特别是Nε-苄氧羰基赖氨酸(Z-Lys)衍生物位点特异性地导入希望的蛋白质中的方法。本发明还提供突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其为序列号2所示的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列中，选自构成吡咯赖氨酸结合位点的306位的酪氨酸、309位的亮氨酸和348位的半胱氨酸中的至少1个氨基酸残基被替换而得到的突变体酶，该氨基酸替换是306位的酪氨酸替换为甘氨酸或丙氨酸，309位的亮氨酸替换为甘氨酸或丙氨酸，和348位的半胱氨酸替换为缬氨酸、丝氨酸或丙氨酸。
文档编号C12N5/10GK101952428SQ20088010789
公开日2011年1月19日 申请日期2008年9月19日 优先权日2007年9月20日
发明者坂本健作, 小林隆嗣, 柳泽达男, 横山茂之 申请人:独立行政法人理化学研究所