抗凝剂和人源化抗冯·维勒布兰德氏因子的单克隆抗体的制作方法

专利名称：抗凝剂和人源化抗冯·维勒布兰德氏因子的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明的领域抗人源von Willebrand因子的人源化单克隆抗体，是一种能产生抗体细胞和含有上述抗体作为活性成分的抗凝剂。
已开发许多抗凝剂用以治疗血栓疾病。但是，许多现有的抗凝剂在临床应用方面效率低、血栓特异性低，引起出血副作用。
在血栓形成的初级阶段起作用的一种重要的蛋白质是血浆中的vonWillebran因子(“vWF”)。随着vWF内量变和质变的出现而发生的出血区表明是yon Willebrand病(“vMD”)。已知几种抗vWF的抗体Fujimura等在J.Nara Med.Assoc.,vol.36,662(1985)公开的NMC-4；Tuddenham等在Blood,vol.177,no.1,113(1992)公开的RFF-VIIIRAG:1；Nagano等,在PCT/JP95/02435公开的由杂交瘤AJvW-1,AJvW-2,AJvW-3,和AJvW-4制备的单克隆抗体(在此引入作为参考)。
本发明提供以由杂交瘤AJvW-2制备的抗体为基础的人源化抗体。此种鼠源单克隆抗体可有效地抑制vWF的生理活性，而且可用于治疗血栓病。不幸的是，将使用如来自AJvW-2的鼠源单克隆抗体用于治疗人类疾病有些特定的缺点，尤其是用于反复治疗区。而且，鼠源单克隆抗体用于人类时，其寿命缩短一半并缺乏其它重要的免疫球蛋白的功能特性。更重要的是，将鼠源单克隆抗体注射到病人体内后，含有免疫原性的大量氨基酸序列。大量的研究已表明，注射外来抗体后，病人体内引发的抵抗注射抗体的免疫反映很强烈，消除了最初治疗后抗体的治疗有效性。而且，如果鼠源或其它抗原(对人)单克隆抗体用于治疗人类疾病，那么，在随后的治疗中如用不相关的鼠源抗体可能是无效的，甚至由于交叉反应是危险的。
虽然已证明生产所谓的嵌合抗体(如与人源不变区连接的鼠源可变区)取得成功，但还存在有效免疫原性问题(见LoBuglio A.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,4220-4224(1989)；M.N.Saleh等，HumanAntibod.Hybridomas e:19(1992))。
通常，用常用的人源单克隆抗体生产技术生产可与vWF高亲和性的人源免疫球蛋白是非常困难的。因此，需要改善专用于von Willebrand因子的人源化免疫球蛋白的形态，实质上，vWF在人体内是非免疫原性的，且可用适合于治疗制剂和其它用途的方式，即容易又经济地生产。本发明可实现这些和其它需求。


图1(b)是AJvW-2,SEQ ID NO:2的轻链可变区序列图2(a)是人源化AJvW-2,SEQ ID NO:3的重链可变区序列。
图2(b)是人源化AJvW-2,SEQ ID NO:4的轻链可变区序列。
图3是鼠源和人源化AJvW-2抗体(IgG4和IgG2m3)与vonWillebrand factor竞争粘合特性的图。
本发明的详细描述根据本发明，提供了专与人源von Willebrand因子反应的人源化免疫球蛋白。在瑞斯托菌素(ristocein)或botrocetin的存在下，这些免疫球蛋白能够抑制vWF与GPIb蛋白质粘合，其与vWF的粘合亲和性至少约为107M-1-1010M-1，优选为108M-1-1010M-1，或更强。
本发明提供了一种含有专与人源vWF粘合、抑制人源血小板的RIPA(瑞斯托菌素诱导的血小板凝集)，BIPA(botrocetin诱导的血小板凝集)和SIPA(剪切应力诱导的血小板凝集)反应的人源化免疫球蛋白的新型抗凝组合物。
免疫球蛋白有两对轻链/重链复合物，至少一条由一个或多个功能上与人源构架区部分结合的鼠源互补性决定区组成的链。例如，鼠源互补性决定区，带有或没有其它的自然附带的鼠源氨基酸残留物，可被引入人源构架区，能以亲合值高于约107M-1与抗原粘合来生产人源免疫球蛋白。这些人源化免疫球蛋白能嵌在给予CDR的鼠源单克隆抗体与vWF(例如AJvW-2)的粘合体中。
通过各种各样的重组DNA技术，如用转染细胞的最终表示式，优选无限增殖的真核细胞，如骨髓瘤或杂交瘤细胞，易于制备本发明的免疫球蛋白，包括粘合片段和它的其它的衍生物。由编码为人源化免疫球蛋白构架区的第一序列和编码为所需的免疫球蛋白互补性决定区的第二序列组成的多核苷酸可经合成法或通过将合适的cDNA与基因组DNA片段组合制备。
实质上，人源化免疫球蛋白可以纯态用于溶栓治疗，即移去生成的细胞内纤维蛋白聚集物。人源化免疫球蛋白也可用于预防和治疗血管受干扰后造成的粥样硬化(athelosclerosis)和restenosis病。也可用于治疗具有或处于血栓疾病危险状态的病人，如梗塞、瞬间局部缺血、不稳定绞痛、急性心绞痛、胸绞痛、外血管疾病、由溶血贫血组成的深静脉血栓形成和溶血尿毒综合症，急性肾衰竭和血栓血小板减少性紫癜。也可用于预防由血管内受干扰后引起的急性和非急性血栓形成或restenosis的局部缺血并发症和作为附属治疗法预防治疗急性心绞痛溶栓后的再阻塞引起的局部缺血并发症。
可用药物上可接受的剂量形式制备人源化免疫球蛋白或它们的复合物，其形式随着给药方式的变化而变化。
人源化免疫球蛋白有一个人源构架和一个或多个来自免疫球蛋白AJvW-2的互补性决定区(CDR’s)。但是也可用来自其它抗体与AJvW-2竞争、在瑞斯托菌素(ristocetin)或botrocetin的存在下，嵌在vWF与GPIb蛋白质的粘合体内，和/或与vWF上与AJvW-2同样的表位粘合的CDRs。本发明的免疫球蛋白可大量而经济地生产，具有许多用途，例如，通过各种各样的技术治疗病人的血栓疾病。
已知抗体的基本结构单元由四聚体组成。每一个四聚体由两对同样的多肽链组成，每一对具有一个“轻“链(约25kD)和一个”重“链(约50-70kD)。每一个链的氨基的端部包括主要负责抗原识别的约100-110或更多氨基酸的变化区。每一个链的羧基的端部构成了一个主要负责效应子功能的不变区。
轻链可分为卡巴(kappa)或lamboda型。重链可分为γ(gamma)、mu、a(alpha)、δ(delta)或E(epsilon)和分别定义抗体的异构形为IgG、IgM、IgA、IgD、和IgE。在轻链和重链内，由约12或更多氨基酸的“J“区连接可变区和不变区，重链还包括约多于10个的氨基酸的”D“区。(见基础免疫学，1984年在纽约Raven Press,Paul,W.,Ed.，写的第7章131-166页，在此引入作为参考。)每一个轻链/重链对的可变区配对形成抗体的粘合位点。这些链都展示了由三个超变区连接的相同的一般结构的相对保守的构架区，即所谓的互补性决定区或CDR’s(见“Sequences of Proteins of ImmunoligicalInterest,”Kabat,E.，等，U.S.Department of Health and HumanServices,(1987)and Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196,901-917(1987)在此引入作为参考。)来自每一对的两个链的CDR’s通过构架区排列，能够与专有的表位粘合。
在此所用的术语“免疫球蛋白“是指由一个或多个实质上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。识别的免疫球蛋白基因包括卡巴(kappa)、lambda、α、γ、δ、epsilon和mu不变区基因以及多免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白除抗体形式外，可以多样形式存在；包括，例如Fv,Fab,和F(ab’)2及双功能杂交抗体(例如，Lanzavecchia等，Eur.J.Immunol.17,105(1987))和单链(如，Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85,5879-5883(1988)和Bird等，Science 242,423-426(1988)在此引入作为参考)。(见，Hood等，免疫学，Benjamin,N.Y.,2nd ed.(1984),Harlow和Lane，抗体，A实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)和Hunkapiller和Hood,Nature,323,15-16(1986)，在此引入作为参考)嵌合抗体是它的轻链和重链基因通常由属于不同种类的免疫球蛋白基因片段经遗传学工程构建的抗体。例如，来自鼠源单克隆抗体的基因的可变片段(V)可与人源不变片段(C)如γ1和γ3连接。常用的治疗嵌合抗体是由V或来自鼠源抗体和C或来自人源抗体的效应子区组成，虽然也可用其它哺乳动物类的抗体。
在此所用的术语“构架区“是指在由Kabat,et al.,op.cit定义的单种类的不同的免疫球蛋白中相对保守(除CDRs外)的免疫球蛋白轻链和重链可变区的部分。本发明所用的”人源构架区“是实质上与天然形成的人源抗体的构架区相同(约85％或更多)。
本发明所用的术语“人源化免疫球蛋白”是指由人源构架、至少一个来自非人源抗体的CDR组成的免疫球蛋白，在免疫球蛋白内，任何现存的不变区实质上与人免疫球蛋白不变区相同，如至少约85-90％，优选至少95％相同。因此，除了CDR′s外，人源化免疫球蛋白的所有部分实质上与一个或多个天然的人体免疫球蛋白序列相同。例如，人源化免疫球蛋白不包括嵌合鼠源可变区/人源不变区抗体。
与鼠源抗体和在某些情况下用于人类治疗的嵌合抗体相比，人源化抗体有至少三个潜在的优势1．因为效应子部分是人源，所以与人类免疫系统的其它部分可更好地反应(如，通过依赖于补体的细胞毒性(CDC)或依赖于抗体细胞的细胞毒性(ADCC)更有效地破坏靶细胞。)2．人类免疫系统不能识别作为外来抗体的人源化抗体的构架区或C区，因此对注射抗体的抗体反应应小于对完全外来鼠源抗体或部分外来嵌合抗体的反应。
3．据报道，注射鼠源抗体在人体循环内的寿命比正常抗体(Shaw,D.et al.,J.Immunol,138,4534-4538(1987)的半寿期短一半。可认为注射的人源化抗体基本上有与天然形成的人抗体相同的半寿期，允许注入较少量和较低频率的剂量。
本发明涉及编码为以单克隆抗体AJvW-2方式与vWF粘合的来自重链和/或轻链CDR’S的重组多核苷酸。编码为上述区的多核苷酸通常与编码为合适的人源构架区结合。关于人源构架区，构架或提供CDR的非人源免疫球蛋白的可变区氨基酸序列与人源免疫球蛋白序列集合体内的相应序列比较，选择具有同源性的序列。实例的多核苷酸包括在图1和图2中，其表示编码为由单克隆抗体AJvW-2组成的重链和轻链CDR′s组成的多肽链。由于简并密码子和非临界氨基酸的取代物，下述的图1和图2中的序列可容易地取代其它多核苷酸序列。
人源化免疫球蛋白的设计按如下方式进行。如果氨基酸在下面种类中的一个种类内，所用的人源免疫球蛋白的氨基酸构架(免疫球蛋白接受体)被来自提供CDR的非人源免疫球蛋白的氨基酸构架(免疫球蛋白给予体)取代(a)免疫球蛋白接受体的人源构架区内的氨基酸的位置对人源免疫球蛋白是非同寻常的，其中，免疫球蛋白给予体内的相应氨基酸的位置对人源免疫球蛋白来说是正常的。
(b)氨基酸的位置与CDR′s中的一个紧密相邻；或(c)氨基酸可与三级结构免疫球蛋白模型中的CDRs相互作用(见Queen et al.,op.ciit.，和Co et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88,2869(1991)，此处分别引入二者作参考)关于人源化免疫球蛋白的生产方法的详细描述见Queen etal.,op.cit.，和Co et al.,op.cit。
多核苷酸通常进一步包括可与人源化免疫性编码序列连接的表达控制多核苷酸序列、自然附带或异源启动子区。优选表达控制序列为载体内能转换或转染真核宿主细胞的真核启动子系统，但也可用原核宿主细胞的控制序列。一旦载体被引入合适的宿主，在适合于高级表达核苷酸序列的条件下保持宿主，而且，按照需要，随后收集和纯化轻链、重链、轻链/重链二聚体或完整抗体，粘合片段或其它免疫球蛋白形态。
可由各种不同的多核苷酸(基因的或cDNA,RNA，合成多核苷酸等)和组分(如V,J,D和C区)以及各种不同的技术形成最终表达为所需要的人源化抗体的本发明的核酸序列。将合适的基因和合成序列连接是目前最普通的生产方法，但还可使用cDNA序列(见欧洲专利公开号0239400和Riechmann,L.et al.,Nature,332.323-327(1988)，此处引入二者作为参考)根据众所周知的方法，人源不变区DNA序列可与种种不同的人源细胞分离，但优选无限增殖B细胞(见Kabat op.cit.和WP 87/02671)。用于生产本发明的免疫球蛋白的CDR′s类似地来源于能以AJvW-2方式与vFW粘合的单克隆抗体且用任何方便的脯乳动物源如田鼠、老鼠、兔子或其它能生产上述抗体的脊椎动物，并经公知的方法制备。可从许多来源如美国型培养物(Catalogue of Cell Lines and Hybridomas,Fitthedition(1985)Rockville,Maryland,U.S.A.，此处引入作为参考)收集获得用于多核苷酸序列的合适源细胞和用于免疫球蛋白表达和分泌的宿主细胞。
除了上述精确描述的人源化免疫球蛋白外，本领域的技术人员利用众所周知的各种各样的重组DNA技术也可容易地设计和生产实质上一样的改性免疫球蛋白。例如，构架区在一级结构处，通过几个氨基酸取代物、终端和中间加成物和缺失物等，可改变天然序列的值。而且，各种不同的人源构架区可单独使用或结合使用作为本发明的人源化免疫球蛋白的基础。通常，可通过各种不同的众所周知的技术容易地实现基因改性，如定向位点诱变(见Gillman and Smith,Gene 8,81-97(1979)and RobertsS.et al.,Natrur 328,731-734(1987)，此处引入二者作为参考)另外，可生产仅由一部分的主抗体结构组成的多肽片段，此片段具有一个或多个免疫球蛋白活性(如互补固定活性)。应用本领域内众所周知的方法如完整的抗体蛋白水解分裂生产上述的多肽片段，或通过使用定向位点诱变将终止密码子插入载体内的所需位置，如在CH1后生产Fab片段或在绞链区后生产F(ab′2片段。通过将VL和VH与一个DNA连接物连接法生产单链抗体(见Huston et al.,op cit.,and Bird et al.,opcit.)而且，因为许多相似的基因，相关的免疫球蛋白基因含有独立的功能区，每一个功能区具有一个或多个不同的生物活性，基因可与来自其它基因的功能区融合，以生产具有新型特性的融合蛋白质。
如前所述，在序列与表达控制序列可操作性地连接(如固定位置确保其功能)后，多核苷酸表达为宿主。这些表达载体通常在宿主有机生物中以异构体或宿主染色体DNA的整体部分复制。通常，表达载体含有选择标记物如四环素或新霉素，以便形成具有所需DNA序列的细胞(见美国专利4,704,362，此处引入作为参考)E.COli是一种特别适用于克隆本发明的多核苷酸原核宿主。适合于此用途的其它微生物宿主包括杆菌如枯草杆菌和其它的肠细菌如沙门氏菌，沙雷氏菌和多样的假单胞菌。这些原核宿主中，可制备表达载体，这些载体通常含有与宿主细胞兼容的表达控制序列(如复制源)。此外，将存在任何种种众所周知的启动子，如乳糖启动子系统，色氨酸启动子系统，β-内酰胺酶启动子系统，或γ啮菌体启动子系统。启动子通常控制表达，任意带有操作序列，而且具有核糖体粘合位点序列等，以便引发和完成转录和翻译。其它的微生物，如酵母菌也可用于上述表达。酵母菌是优选的宿主，带有表达控制序列的合适载体，如启动子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它的糖酵解酶和复制源，末端序列和所需的等等。
除微生物体外，哺乳动物组织细胞的培养物也可用来表达和生产本发明的多肽(见Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)，此处引入作为参考)实际上，优选真核细胞，因为现有技术已开发许多能分泌完整免疫球蛋白的合适的宿主细胞，其中包括CHO细胞系、多样的COS细胞系、HeLa细胞，优选骨髓瘤细胞系等或杂交瘤的转化B-细胞。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制源、启动子、和促进剂(Queen et al.,Immunol.Rev.89,46-68(1986)，此处引入作参考)和必要的处理信息位点，如核糖体粘合位点、RNA分裂位点、聚腺苷酸化位点，和转录终止序列。优选的表达控制序列是源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等病毒。
可用已知的方法将含有多核苷酸有意义的序列(如编码为序列和表达控制序列的重链和轻链)的载体转化为宿主细胞，其方法随着细胞的宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于真核细胞，但磷酸钙处理或电穿孔可用于其它的细胞宿主。(见generally,Maniatis et a1.,Molecular cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1982)，此处引入作参考。)一旦表达后，根据现有技术的标准方法纯化本发明的整个抗体、它们的二聚体、单个的轻链和重链或其它的免疫球蛋白，标准方法包括硫酸胺沉淀法、亲和柱法、层析法、凝胶电泳法等(见generlly,Scopes,R.,Protein Purificatin,Springer-Verlag,N.Y.(1982)此处引入作参考)实质上优选至少约90-95％同源基因的纯免疫球蛋白，为药物目的，更优选98-99％或更多同源基因。一旦按所需将多肽纯化、部分或同源化基因，多肽可用于治疗(包括体外地)或开发和实施检验程序，免疫荧光染色等。(见generally,Immunological Methods,Vols.Ⅰand Ⅱ,Lefkovits and Pernis,eds.,Academic Press,New York,N.Y.(1979 and1981)。
本发明的免疫球蛋白个体通常可用于治疗病人的血栓疾病。本发明的人源化免疫球蛋白和它的药物组合物特别适用于肠胃外给药，如皮下、肌肉内、静脉内、或眼内。适合于肠胃外给药的组合物通常包括免疫球蛋白的溶液或溶解在可接受的载体内的合剂，可接受的载体优选为水溶性载体。可用许多水溶性载体如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、5％葡萄糖、人类白蛋白溶液等载体。这些溶液是无菌并通常不含有粒状物。利用传统的、众所周知的无菌技术使这些组合物洁净无菌。在近似的生理条件下如PH调节和缓冲剂、张力剂、张力调节剂等，这些组合物可含有药物上可接受的辅助物质例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠、柠檬酸钠等。这些配方中的免疫球蛋白的浓度可广泛变化如从小于0.5％。通常至少约1％至多达15或20重量％而且根据所选择的具体给药模式，主要依据流体容积、黏度等来选择其浓度。
因此，用于注射的常用药物组合物最多含有1毫升无菌缓冲水，和1-100毫克的免疫球蛋白。用于静脉注入的常用组合物可多含有250毫升的无菌Ringer’s溶液，和150毫克的免疫球蛋白。用于制备肠胃外给药的组合物的实际方法对本领域技术人员来说是已知的并且是显而易见的，并在Remington’a Pharmaceutical Science,15thed.,MackPublishing Company,Easton,Pennsylvania(1980)，中有更详细地描述，此处引入作参考。
在使用前，为贮存目的，可将本发明的免疫球蛋白冷冻或冻干并在合适的载体内重新构成。此技术已表明对现有的免疫球蛋白来说是有效的，且可使用公知的冻干和重组技术。本领域的技术人员能够理解的是冻干和重组可导致改变免疫球蛋白活性不同程度损失(如对现有免疫球蛋白来说IgM抗体比IgG抗体具有较大的活性损失)必须用调整量来补偿。
用于治疗或预防治疗可给药含有本发明的人源化免疫球蛋白或它的合剂的组合物。在治疗应用时，以足够治疗或至少部分抑制疾病和它的并发症而没有引起出血的用量的组合物给药于遭受血栓疾病的病人。足以实现上述目的的用量定义为“治疗有效剂量”。用于上述用途的有效量取决于疾病的严重性和病人自身的免疫系统的一般状态，但每位病人一般通常所用的剂量范围为0.1-200mg/kg的免疫球蛋白。每天，每周2或3天、一周、两周、一月等给药的精确剂量可以为1mg/kg,5mg/kg,10mg/kg,20mg/kg，但随着疾病的严重性和其它的因素由技术精湛的医生来选定。
必须记住的是，本发明的材料一般可用于严重的疾病，即威胁生命或潜在威胁生命的情况。在上述情况下，考虑到缩小外部物质和降低外部物质排斥的可能性的情况，本发明的免疫球蛋白排斥外部物质，可以按治疗需要给病人过量的免疫球蛋白。
为治疗病人，可按照医生选定的剂量和方式实施组合物的单一或多次给药。在任何情况下，药物配方应提供一定量的免疫球蛋白足以有效治疗病人。
在具体的实施方案中，包括本发明的人源化的免疫球蛋白的组合物可用于检测vWF。与由AJvW-2抗体识别的抗原决定子粘合的人源化免疫球蛋白可作标记并用于识别含有有效浓度的vWF的吻合位点。举例但并不是限制，一个或多个标记部分可附在人源化免疫球蛋白上。示例的标记少部分包括但不是限制，不透射线的染料、辐射对照剂(radiocontrastagents)、荧光分子、旋转标记分子、酶或其它的标记部分的诊断值，尤其使用辐射线或磁成象技术(radiologic or matnetic resonace imagingtechniques)。
本发明的人源化免疫球蛋白在在活体外具有广泛的用途。例如，免疫球蛋白可用于检测vWF。
为诊断目的，免疫球蛋白可作标记或不作标记。不作标记的免疫球蛋白可与其它作标记抗体(第二抗体)结合使用，作标记的抗体与人源化免疫球蛋白反应，如专用于人类免疫球蛋白不变区的抗体。另一方面，免疫球蛋白可直接作标记。可使用多样的标记，如放射性核素、荧光、酶、酶基质、酶辅助子、酶抑制剂、配基(特别是半抗原)等。可获得大量类型的免疫检测，且这些检测为本领域的技术人员所知。
提供试剂盒，用于本发明的免疫球蛋白的预防或检测细胞活性或选择的抗原的存在。因此，可提供本发明的免疫球蛋白组合物，通常在容器内以冻干形式存在，或单独或与专用于所需细胞类型的额外抗体结合。与标记或毒素结合或不结合的免疫球蛋白包括在带有缓冲剂的试剂盒内，所述的缓冲剂如N-三(乙羟基)N-苯汞基乳酸铵、磷酸盐、碳酸盐等，稳定剂、防腐剂、杀生物剂、惰性蛋白质，如血清蛋白或类似的物质和一套应用指南。通常，这些材料依据活性的免疫球蛋白的量，以小于约5重量％存在，而且通常根据免疫球蛋白浓度以总量至少约0.001重量％存在。通常，希望包括惰性延展剂或赋形剂以稀释活性成分，其中赋形剂可以为总的组合物的约1-99重量％存在。能与免疫球蛋白粘合的第二抗体可用于检测，通常存在于独立的小瓶中。第二抗体通常与标记结合并以类似的模式形成上述的免疫球蛋白制剂。
下面的实施例是说明并不是限制。应理解的是虽然与人源化的AJvW-2抗体相关的实施例，生产具有与vWF抗原高度粘合亲和性的人源化抗体，但还需要使用与vWF的同样的表位粘合的其它单克隆抗体来补充。
计算机程序ABMOD和ENCAD(Zilber et al.,Biochemistry,Vol.29,10032(1990)；Levitt et al.,J.Mol.Biol.168:595(1983))可构造AJvW-2可变域的分子模型，该分子模型可用来寻找AJvW-2构架内的与CDRs足够靠近从而与其潜在相互作用的氨基酸。为设计人源化AJvW-2重链和轻链可变区，将来自鼠源AJvW-2抗体的CDRs与人源13R抗体的构架区接枝。在计算机模型表明与CDRs有效接触的构架位置处，最初人构架氨基酸取代了来自鼠源抗体的氨基酸。对人源化AJvW-2来说，在重链的残基28、48、49和67及轻链的残基48、70和71处完成上述相互作用。而且，几乎很少在人抗体数据库内的上述位置发生上述反应的构架残基被在那些位置的人共有氨基酸取代。对人源化AJvW-2来说，在重链的1、78、118残基和轻链的62、73、和83残基处完成上述相互作用。
图2示出了人源化AJvW-2抗体重链和轻链可变区的序列。但是，许多潜在的CDR接触残基易于被其它氨基酸取代而且保证抗体保持与抗原的高亲和性。下列表格列出了构架内的许多位置，在构架出的合适的取代氨基酸(LC=轻链，HC=重链)表1
同样，不与人源化AJvW-2重链和轻链内的CDRs接触的许多构架残基可接受来自人源13R抗体、其它人源抗体、人共有氨基酸、鼠源AJVW-2抗体或其它鼠源抗体相应位置的氨基酸取代物，没有有效损失亲和性或人源化抗体的非免疫原性。下列表列出了构架内可变氨基酸适合的的许其它位置。
表2
选择多样的取代氨基酸可用以生产具有亲和性、专一性、非免疫原性、容易生产和其它所需的特性的变化组合的人源化AJvW-2变体。因此，上述实施例仅是说明，而不是限制。实施例3人源化AJvW-2的构建一旦按上述设计人源化可变区氨基酸序列，对其编码构建基因，包括信号肽、叠接给予信号和合适的限制位点(图2)。使用长度范围约为65-80bases(见He et al.J.Immunol.160:1029(1998))的八次重叠合成低核构建和放大轻链和重链可变区基因。低核苷酸成对退火并用DNA聚合酶的克列诺片段延伸，产生四个双链片段。用克列诺法将获得片段变性、成对(PAIRWISE)退火、和延伸，产生两个片段。再次将上述片段变性、成对退火、和延伸，产生全长基因。用Taq聚合酶的聚合酶链反应(PCR)放大获得产品，凝胶纯化，用XbaⅠ消化，再凝胶纯化，然后亚克隆入pVK、pVg4或pVg2.M3表达载体的XbaⅠ位点。前面已描述了轻链表达的pVK载体。用约2000bp片段的人源g4不变区基因(Ellison andHood Proc.Natl.Acad,Sci.USA 79:1984(1982))取代含有g1不变区基因的pVg1的Xbal-BamHⅠ段来构建重链表达pVg4载体(见Co etal.J.Immunol.148:1149(1992))，上述人源g4不变区基因从g4基因的CH1外显子之前的HindⅢ位点延伸到基因的CH4外显子之后的NsiⅠ位点后的270bp。已描述了γ2链表达的pVg2.M3载体。(见Cole,etal.,J.Immunol.159:3613(1997))。pVg2.M3是人源野生型IgG2的变种，由Ala在234和237处取代氨基酸Val和Gly。变种减少了与Fc接受体的相互作用，因此具有最小的抗体效应活性。
核苷酸序列和限制酶作图确认最终质粒的结构。使用本领域的技术人员众所周知的标准方法实施进行全部DNA操作。
为对比研究，产生两种人源化AJvW-2,IgG4和IgG2.M3。为构建生产人源AJvW-2的细胞系，各个的重链和轻链质粒转染到鼠源骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag14(ATCC CRL1581)。在转染前，使用限制内切核酸酶使含有重链和轻链的质粒线形化。使用Fspi使kappa链和γ2重链线形化；使用BstZ171使γ4链线形化。每一个质粒的大约20ug转染到PBS内的1×107细胞中。根据厂家指令，在360v和25uFD电容下，使用Gene Pulser仪(BioRad)，通过电穿孔法转染。来自每次转染的细胞放在四个96孔组织培养板中，两天后，使用选择介质(DMEM,10％FCS,1×HT补充物(希格玛，0.25mg/ml黄嘌呤，1ug/ml霉酚酸)。
大约两周后，由ELISA筛选出出现的克隆体用以生产抗体。通过在节介质(DMEM带有10％FCS)内生长细胞汇集制备高生产性克隆物的抗体，然后用无血清介质(杂交瘤SMF；Gibco)代替上述介质，然后培育直到在培养物中获得最大抗体值。培养物上清液通过蛋白A-琼脂糖柱；用0.1M甘氨酸、100mML氯化钠、PH3洗脱并中和抗体，然后与磷酸盐缓冲盐溶液交换(PBS)。通过在丙烯酰胺凝胶上分析所述抗体并确认抗体的纯度，由OD280读数测定上述抗体的浓度，假设1.0毫克的抗体蛋白质的OD280读数为1.4。实施例4人源化AJvW-2的性质鼠源和人源化AJvW-2抗体的vWF的亲和性，通过与生物素酰化的鼠源AJvW-2抗体的竞争粘合性测定。实施例步骤如下1．用TBS(20mM Tris PH7.4+0.15M NACL)将vWF稀释到8ug/ml。50ul分散到96-孔NUNC MAXISORP培养板的每一个孔内(VWR科学产品)，然后在4℃孵化过夜。
2．用TBS将培养板洗涤一次，加200ul/孔的阻断溶液(TBS+5％BSA)阻断，然后在室温下孵化3小时。
3．用TBS将培养板洗涤三次。
4．根据厂家指令，先用磺琥珀酰化-6-(生物素氨基)己酸酯(Pierce,Rockford,IL，产品号21335)将鼠源AJvW-2生物素酰化。用TBS+0.1％BSA将生物素酰化抗体稀释到0.5ug/ml。
5．用起始浓度为25ug/ml的TBS+0.1％BSA，制备鼠源和人源化抗体的8个4倍系列稀释物。
6．将下列溶液加到涂有vWF培养板的每一个孔中25ulTBS+1％BSA+10％DMSO,100ul冷竞争抗体(鼠源，人源IgG2m3或人源化IgG4)和25ul生物素酰化抗体，l然后在室温下轻微摇动孵化1小时。
7．根据厂家指令，用洗涤溶液将平板洗涤三次，然后用Immuno PureABC磷酸酶染色试剂盒(Pierce,Rockford,IL)染色。精确地说，将2滴反应剂A(avidin)和2滴反应剂B(生物素酰化碱式磷酸酶)添加到50ml的TBS+0.1％BSA中制备溶液。将50UL的制备溶液添加到96孔培养板的每一个孔中，然后在室温下孵化1小时。
8．用洗涤溶液将培养板洗涤三次并用碱式磷酸酶基质展开。
9．在405nm处，测定吸光度为，然后以竞争体抗体的浓度绘图。
如图3所示，结果表明，与没有作标记的鼠源抗体比较，人源化AJvW-2IgG4和IgG2m3与生物素酰化鼠源抗体同等竞争，表明两人源化抗体具有相似的粘合亲和性而且在人源化抗体和鼠源抗体与抗原的亲和性方面没有显著差别。
图1示例了cDNA和鼠源AJvW-2抗体的重链(A)和轻链(B)可变区的翻译的氨基酸序列。强调了互补性决定区(CDRs)和双重强调了成熟链的第一氨基酸。
图2示出了DNA和人源化AJvW-2抗体的重链(A)和轻链可变区的翻译氨酸序列。强调了互补性决定区(CDRS)并双重强调了成熟链的第一氨酸。
图3是鼠源和人源化AJvW-2抗体(IgG4和IgG2m3)与von Willebrandfactor竞争粘合特性图。在生物素酰化示踪剂鼠源AJvW-2的存在下，提高了冷竞争剂抗体的浓度。测量吸光度并以没有标记竞争抗体的浓度绘图。
根据上述，显然可对本发明作大量的改变。因此，在所附的权利要求范围内，除了上述具体描述的方法外，可用其它方法实施本发明。
权利要求
1．一种与人源von Willebrand因子粘合的人源化免疫球蛋白。
2．如权利要求1的免疫球蛋白，其中该免疫球蛋白与鼠源抗体AJvW-2竞争，以便专一地粘合von Willebrand因子。
3．如权利要求1的免疫球蛋白，其中该免疫球蛋白是包括图2a(SEQ.ID.NO.3)示出的重链可变区和图2b(SEQ.ID.N0.4)示出的轻链可变区的抗体。
4．一种人源化免疫球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白是鼠源抗体AJvW-2的一种人源化形态。
5．如权利要求1的人源化免疫球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白包括来自鼠源AJvW-2抗体的互补决定区和来自人源13R抗体重链和轻链构架的重链和轻链可变区构架，条件是选自由LC-48、LC-70、LC-71、HC-28、HC-48、HC-49和HC-67组成组的至少一个位置被存在于鼠源AJvW-2抗体重链或轻链可变区构架的同等位置的氨基酸占有，人源化抗体以107M-1和十倍于鼠源AJvW-2抗体的亲和性的亲和常数与vWF专一地粘合。
6．如权利要求5的人源化免疫球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白是一种选自由LC-48、LC-70、LC-71、HC-28、HC-48、HC-49和HC-67组成组的每一个位置被存在于鼠源AJvW-2抗体重链或轻链可变区构架的同等位置的氨基酸占有。
7．如权利要求6的人源化抗体，其中至少一个选自LC-62、LC-73、LC-83、HC-1、HC-78和HC-118的位置被存在于人抗体重链或轻链共有序列的相同位置的氨基酸占有。
8．如权利要求5的人源化免疫球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白包括由图2a(SEQ.ID.NO.3)示出的重链可变区和图2b(SEQ.ID.NO.4)示出的轻链可变区，其中一个或多个氨基酸位置可由表1和2示出的取代物取代。
9．如权利要求1的人源化免疫球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白包括由至少85％与图2a(SEQ.ID.NO.3)示出的人源化重链相同的人源化重链和至少85％与图2b(SEQ.ID.NO.4)示出的人源化轻链相同的人源化轻链，条件是至少一个选自由LC-48、LC-70、LC-71、HC-28、HC-48、HC-49和HC-67组成组的位置被存在于鼠源AJVW-2抗体重链或轻链可变区构架的等同位置的氨基酸占有。
10．如权利要求1的免疫球蛋白，其中该免疫球蛋白包括两对轻链/重链二聚体，其中每一条链包括可变区和不变区。
11．如权利要求1的人体化免疫球蛋白，其中该免疫球蛋白是一Fab片段或F(ab′)2。
12．如权利要求1的人源化免疫球蛋白，该人源化免疫球蛋白具有来自AJvW-2的互补决定区和轻链可变区构架，其中重链可变区构架的序列是人源免疫球蛋白重链可变区构架的共有序列。
13．如权利要求1的人源化免疫球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白具有IgG2或IgG4免疫球蛋白亚型。
14．如权利要求1的人源化免疫球蛋白，其中不变区是Cγ2和Cγ4区。
15．一种生产免疫球蛋白的方法，其中该方法包括下列步骤培养编码为人源化免疫球蛋白的重和轻链的细胞系，其中表达与鼠源抗体AJvW-2竞争的人源化抗体；和恢复所述的人源化抗体。
16．如权利要求15的方法，其中该方法进一步包括用药物上可接受的载体配制人源化抗体以生产药物组合物。
17．一种药物组合物，其中该药物组合物包括与鼠源抗体AJvW-2竞争，以便专一粘合yon Willebrand因子的人源化免疫球蛋白和药物接受载体。
18．一种治疗具有或处于血栓疾病或粥样硬化危险的病人的方法，其中该方法包括给有效剂量的与鼠源抗体AJvW-2竞争以便专一粘合VONWILLEBRAND因子的人源化免疫球蛋白。
19．如权利要求18的方法，其中免疫球蛋白是鼠源抗体AJvW-2的人源化形态。
20．如权利要求18的方法，其中免疫球蛋白包括图2a(SEQ.ID.NO.3)示出的重链可变区和图2b(SEQ.ID.NO.4)示出的轻链可变区。
21．如权利要求18-20的方法，其中该方法可治疗梗塞、瞬间局部缺血、不稳定绞痛、急性心绞痛、胸绞痛、外血管疾病、深静脉血栓形成、溶血尿毒综合症、溶血贫血、急性肾衰竭、血栓血小板减少性紫癜、急性和非急性血栓形成或restenosis引起的局部缺血并发症或预防作为附属治疗法预防治疗急性心绞痛溶栓后的再阻塞引起的局部缺血并发症。
22．一种细胞系，该细胞系产生人免疫球蛋白，该人免疫球蛋白和鼠源抗体AjvW-2竞争，以便专一粘合yon Willebrand因子。
全文摘要
含有与von Willebrand因子粘合的人源化抗体的抗凝剂。
文档编号A61P9/04GK1311691SQ99809222
公开日2001年9月5日 申请日期1999年8月19日 优先权日1998年8月19日
发明者曼·桑·柯, 马克西米利安诺·瓦斯克斯 申请人:味之素株式会社