得自粘膜炎莫拉氏菌的basb027蛋白和basb027基因、抗原、抗体及应用的制作方法

专利名称：得自粘膜炎莫拉氏菌的basb027蛋白和basb027基因、抗原、抗体及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及多核苷酸(本文称为“BASB027多核苷酸”)、由所述多核苷酸编码的多肽(本文称为“BASB027”或“BASB027多肽”)、生产它们的重组材料和方法。在另一方面，本发明涉及使用这样的多肽和多核苷酸的方法，包括对抗细菌感染的疫苗。在再一方面，本发明涉及检测某些病原体感染的诊断测试。
背景技术：
粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)(也称为卡他布兰汉氏菌(Branhamella catarrhalis))是经常从人类上呼吸道分离到的革兰氏阴性细菌。它引起几种病状，主要有婴儿和儿童中的中耳炎以及上了年纪的人中的肺炎。它还引起鼻窦炎、医院感染，并且不经常地引起侵袭性疾病。
从病例数量以及潜在的后遗症来看，中耳炎是一种重要的儿童期疾病。在美国每年记录到超过3.5百万病例，并且估计80％的儿童在达到3岁以前至少经历一次耳炎发作(Klein,JO(1994)Clin.Inf.Dis19:823)。当该疾病未得到治疗或变成慢性时，可能导致暂时的听力损失(在液体在中耳积累的情况下)或永久的听力损失(如果听觉神经受到损伤)。在婴儿中，这样的听力损失可能引起语言学习延迟。
从患中耳炎的儿童的中耳主要分离出三种细菌物种肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，无法定型的(non typeable)流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(NTHi)以及粘膜炎莫拉氏菌。它们存在于60％到90％的病例中。最近研究的综述显示肺炎链球菌和NTHi各自代表了约30％的中耳炎病例，而粘膜炎莫拉氏菌代表了约15％的中耳炎病例(Murphy,TF(1996)Microbiol.Rev.60:267)。从中耳也可以分离到其它细菌(B型流感嗜血杆菌、酿脓链球菌(S.pyogenes)等)，但频率低得多(2％的病例或更少)。
流行病学数据表明对于在中耳中发现的病原体，在上呼吸道中建群(colonization)是发展成耳炎的绝对必要条件；然而也需要其它必要条件以导致疾病(Dickinson,DP等人(1988)J.Infect.Dis.158:205,Faden,HL等(1991)Ann.Otorhinol.Laryngol,100:612)。这些对于触发细菌通过咽鼓管迁移到中耳、随后起始炎症过程是重要的。这些因素是迄今未知的。已经假设，例如，在病毒感染后免疫系统的短暂异常可能导致不能控制在呼吸道建群(Faden,HL等(1994)J.Infect.Dis.169:1312)。另外一种解释是，暴露于环境因子使得一些孩子更大量地建群，这些孩子由于中耳病原体的持续存在而随后变得易于发展中耳炎(Murphy,TF(1996)Microbiol.Rev.60:267)。
针对粘膜炎莫拉氏菌的免疫应答尚未得到很好的特征鉴定。对从0到2岁跟踪的婴儿的鼻咽中顺序分离到的菌株的分析指出他们频繁地获得并除去新菌株。这指出，在已建群的儿童中建立了对抗这种细菌的有效免疫应答(Faden,HL等(1994)J.Infect.Dis.169:1312)。
在大多数测试过的成人中，已经鉴定了杀细菌抗体(Chapman,AJ等(1985)J.Infect Dis.151:878)。粘膜炎莫拉氏菌的菌株在它们抵抗血清杀菌活性的能力上存在变异一般说来，得自患病个体的分离物比得自仅仅已建群的个体的分离物更具有抗性(Hol,C等(1993)Lancet 341:1281,Jordan,KL等(1990)Am.J.Med.88(增刊5A):28S)。因此可以将血清抗性看作是所述细菌的毒力因子。在从中耳炎恢复的儿童的血清中已经观察到调理活性。
除了OMP B1(一种表达由铁调节的84kDa蛋白，它被患有肺炎的患者的血清识别(Sethi,S.等(1995)Infect.Immun.63:1516))和UspA1以及UspA2(Chen D.等(1999),Infect.Immun.67:1310)外，还没有鉴定出在人体中由这些不同的免疫应答所靶向的抗原。
几种其它存在于粘膜炎莫拉氏菌表面的膜蛋白已经使用生化方法进行了特征鉴定，或已经鉴定了它们在诱导保护性免疫中的潜在关联(综述见Murphy,TF(1996)Microbiol Rev.60:267)。在小鼠肺炎模型中，对抗一些所述蛋白(UspA,CopB)而产生的抗体的存在促进更快地清除肺部感染。另一种多肽(OMP CD)在粘膜炎莫拉氏菌菌株中高度保守，并且与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的膜孔蛋白存在同源性，已经显示该膜孔蛋白在动物模型中有效对抗所述细菌。
在过去几十年中，粘膜炎莫拉氏菌感染的频率已经急剧上升。这已经归因于具有多种抗生素抗性菌株的出现以及免疫系统削弱的人群增加。分离到抵抗一些或所有标准抗生素的粘膜炎莫拉氏菌菌株已经不再是不寻常的事。这种现象已经创造了亟待满足的针对该生物的新型抗微生物剂、疫苗、药物筛选方法以及诊断测试的医疗需要与需求。
发明概述本发明涉及BASB027，尤其是BASB027多肽和BASB027多核苷酸，生产它们的重组材料和方法。在另一方面，本发明涉及使用这样的多肽和多核苷酸的方法，其中包括预防和治疗微生物疾病。在再一方面，本发明涉及用于检测与微生物感染有关的疾病以及与这样的感染有关的病症的诊断测试，例如检测BASB027多核苷酸或多肽的表达或活性的测试。
通过阅读下面的描述并阅读本发明公开内容的其它部分，在所公开的发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域内的技术人员将是非常明显的。
发明详述本发明涉及如下文更详细描述的BASB027多肽和多核苷酸。本发明尤其涉及粘膜炎莫拉氏菌的BASB027的多肽和多核苷酸，所述粘膜炎莫拉氏菌的BASB027与脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)OMP85外膜蛋白在氨基酸序列同源性上相关。本发明特别涉及具有SEQ ID NO:1或3以及SEQ ID NO:2或4分别陈述的核苷酸序列以及氨基酸序列的BASB027。可以理解，在下面序列表中列举为“DNA”的序列代表了本发明的一个实施方案的范例，因为一般技术人员将认识到这样的序列可以有用地普遍使用于多核苷酸，包括核糖多核苷酸(ribopolynucleotide)。多肽在本发明的一方面，提供了本文称为“BASB027”和“BASB027多肽”的粘膜炎莫拉氏菌的多肽及其在生物学上、诊断上、预防上、临床上或治疗上有用的变异体，以及包含上述多肽、其变异体的组合物。
本发明还提供(a)分离的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列有至少85％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、最优选至少97-99％或完全同一性的氨基酸序列；(b)由分离的多核苷酸编码的多肽，所述分离的多核苷酸包含分别在SEQ ID NO:1或3的全长上与SEQ ID NO:1或3有至少85％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、甚至更优选至少97-99％或完全同一性的多核苷酸序列；或(c)由分离的多核苷酸编码的多肽，所述分离的多核苷酸包含编码与SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列有至少85％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、最优选至少97-99％或完全同一性的多肽的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:2或4中提供的BASB027多肽是得自粘膜炎莫拉氏菌菌株Mc2931(ATCC43617)的BASB027多肽。
本发明还提供了BASB027多肽的免疫原性片段，即与包含SEQID NO:2或4的氨基酸序列的多肽具有相同或基本相同免疫原性的BASB027多肽的连续部分；这就是说，所述片段(如果需要，偶联到载体上)能够引起识别所述BASB027多肽的免疫应答。这样一种免疫原性片段可以包括例如缺失N端前导序列和/或跨膜结构域和/或C端锚定结构域的BASB027多肽。在优选的方面，依照本发明的BASB027的免疫原性片段包含多肽的基本全部胞外结构域，其中所述多肽在SEQ ID NO:2的全长上与SEQ ID NO:2或4有至少85％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、最优选至少97-99％同一性。
一种片段是具有这样的氨基酸序列的多肽所述氨基酸序列与本发明任何多肽的任何氨基酸序列部分但不是全部完全相同。就BASB027多肽而言，片段可以是“独立式的”，或包含于更大的多肽中，在其中它们形成一个部分或区域，所述片段最优选是作为单个更大多肽中的单个连续区域。
优选的片段包括例如具有部分SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列或其变异体的截短多肽，例如包括氨基末端氨基酸序列和/或羧基末端氨基酸序列的连续的一系列残基。也优选由宿主细胞产生或在宿主细胞中产生的本发明的所述多肽的降解形式。更优选的是特征在于结构或功能属性的片段，例如包含α-螺旋和形成α-螺旋的区、β-折叠和形成β-折叠的区、转角和形成转角的区、螺旋(coil)和形成螺旋的区、亲水区、疏水区、α两亲性区、β两亲性区、柔性区(flexibleregion)、表面形成区、底物结合区以及高抗原指示区的片段。
其它优选的片段包括分离的多肽，所述分离的多肽包含具有来自SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的至少15、20、30、40、50或100个连续氨基酸的氨基酸序列，或者所述分离的多肽包括从SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列上截去或缺失了至少15、20、30、40、50或100个连续氨基酸的氨基酸序列。
可以使用本发明多肽的片段通过肽合成来产生对应的全长多肽；因此，可以使用这些片段作为产生本发明的全长多肽的中间体。
尤其优选的是其中以任何组合取代、缺失或添加若干个、5-10个、1-5个、1-3个、1-2个或1个氨基酸的变异体。
本发明的多肽或免疫原性片段可以是“成熟”蛋白的形式，或可以是更大的蛋白(如前体蛋白或融合蛋白)的一部分。包括入添加的氨基酸序列常常是有利的，所述序列包括分泌序列或前导序列、原序列(pro-sequence)、帮助纯化的序列(如多组氨酸残基)或有助于重组生产过程中稳定性的添加序列。此外，也考虑了添加外源多肽或脂质尾部或多核苷酸序列，以增加最终分子的免疫原性潜力。
在一方面，本发明涉及遗传工程化的可溶性融合蛋白，所述融合蛋白包括本发明多肽或其片段，以及不同免疫球蛋白亚类(IgG、IgM、IgA、IgE)的重链或轻链的恒定区的不同部分。作为免疫球蛋白优选的是人类IgG(尤其是IgG1)的重链的恒定部分，其中融合发生在绞链区。在一个具体的实施方案中，可以简单地通过插入一个可以用凝血因子Xa切割的切割序列而除去Fc部分。
此外，本发明涉及通过遗传工程制备这些融合蛋白的方法，以及其用于药物筛选、诊断和治疗的应用。本发明的再一方面还涉及编码这样的融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技术的例子可以在国际专利申请第WO94/29458号和WO94/22914号中找到。
所述蛋白可以化学缀合或作为重组融合蛋白而表达，以使得与非融合蛋白相比，在表达系统中产生的水平增加。融合配偶体(partner)可以有助于提供T辅助细胞表位(免疫融合配偶体)，最好是被人识别的T辅助细胞表位，或者融合配偶体可以帮助以高于天然重组蛋白的产量表达所述蛋白(表达增强物)。所述融合配偶体最好同时是免疫融合配偶体和表达增强配偶体。
融合配偶体包括来自流感嗜血杆菌的蛋白D和来自流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。另一种配偶体是称为LytA的蛋白。最好使用所述分子的C端部分。Lyta得自肺炎链球菌，合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶-酰胺酶LytA(由lytA基因编码{Gene,43(1986)第265-272页})，该酶是特异性降解肽聚糖骨架中某些键的自溶素。LytA蛋白的C端结构域负责对胆碱或一些胆碱类似物(如DEAE)的亲和性。已经利用这种特性研制可用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LytA表达质粒。已经描述了在氨基末端包含C-LytA片段的杂种蛋白的纯化{Biotechnology:10,(1992)第795-798页}。有可能使用在C末端发现的起始于残基178的LytA分子的重复部分，如残基188-305。
本发明还包括前面所述多肽的变异体，即由于保守的氨基酸置换而与前面所述多肽不同的多肽，在保守的氨基酸置换中一个残基被具有相似特征的另一个残基取代。典型的这样的取代发生在Ala、Val、Leu和Ile之间；Ser和Thr之间；酸性残基Asp和Glu之间；Asn和Gln之间；碱性残基Lys和Arg之间；或芳香族残基Phe和Tyr之间。
可以以任何合适方法制备本发明的多肽。这样的多肽包括分离的天然出现的多肽、重组产生的多肽、合成产生的多肽或通过这些方法的组合产生的多肽。制备这样的多肽的方法在本领域内是众所周知的。
最优选本发明的多肽得自粘膜炎莫拉氏菌，然而，所述多肽优选得自同一分类学属的其它生物。例如，本发明的多肽也可以得自同一分类学科或目的生物。多核苷酸本发明的一个目标是提供编码BASB027多肽的多核苷酸，尤其是编码本文称为BASB027的多肽的多核苷酸。
在本发明一个特别优选的实施方案中，所述多核苷酸包括编码BASB027多肽的区，所述区包含SEQ ID NO:1或3中陈述的序列，所述序列包括全长的基因或其变异体。
在SEQ ID NO:1或3中提供的BASB027多核苷酸是得自粘膜炎莫拉氏菌菌株Mc2931(ATCC43617)的BASB027多核苷酸。
作为本发明的再一方面，提供了编码和/或表达BASB027多肽和多核苷酸、尤其是粘膜炎莫拉氏菌BASB027多肽和多核苷酸的分离的核酸分子，包括例如未加工的RNA、核酶RNA、mRNA、cDNA、基因组DNA、B-DNA和Z-DNA。本发明的其他实施方案包括在生物学上、诊断上、预防上、临床上或治疗上有用的多核苷酸和多肽及它们的变异体，以及包含所述多核苷酸和多肽的组合物。
本发明的另一方面涉及包括至少一个全长基因的分离的多核苷酸、与其密切相关的多核苷酸以及所述分离的多核苷酸的变异体，其中所述分离的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:2或4推导的氨基酸序列的BASB027多肽。
在另一个本发明特别优选的实施方案中，有得自粘膜炎莫拉氏菌的BASB027多肽或其变异体，所述BASB027多肽包括SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列组成。
使用本文提供的信息，如在SEQ ID NO:1或3中陈述的多核苷酸序列，可以使用标准的克隆和筛选方法获得编码BASB027多肽的本发明的多核苷酸，所述方法如用粘膜炎莫拉氏菌Catlin细胞作为起始材料，从细菌克隆和染色体DNA片段并对其测序，随后获得全长的克隆的方法。例如，为获得本发明的核苷酸序列，如在SEQ ID NO:1或3中给出的多核苷酸序列，通常用放射标记的寡核苷酸探测粘膜炎莫拉氏菌Caltin染色体DNA在大肠杆菌或一些其它合适宿主中的克隆的文库，其中所述寡核苷酸得自部分序列，最好是17聚体(17-mer)或更长。然后可以使用严格的杂交条件，辨别出带有与探针相同DNA的克隆。通过用根据原始多肽或多核苷酸序列设计得到的测序引物进行杂交鉴定出克隆，对如此鉴定的各个克隆测序，则有可能在两个方向延伸所述多核苷酸序列以确定全长的基因序列。方便的是例如使用由质粒克隆制备的变性双链DNA进行这样的测序。Maniatis,T.,Fritsch,E.F.和Sambrook等，MOLECULAR CLONING,ALABORATORY MANUAL，第二版；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)描述了合适的技术(尤其见“杂交筛选1.90”和“变性双链DNA模板的测序13.70”)。也可以进行直接的基因组DNA测序以获得全长的基因序列。作为本发明的说明，在SEQ ID NO:1或3中陈述的每个多核苷酸都在得自粘膜炎莫拉氏菌的DNA文库中发现。
此外，在SEQ ID NO:1或3中陈述的每个DNA序列都包含一个可读框，所述可读框编码具有大约SEQ ID NO:2或4中陈述数目的所述氨基酸残基的蛋白，所述蛋白推测的分子量可以使用本领域内技术人员所熟知的氨基酸残基分子量值计算出来。
SEQ ID NO:1的多核苷酸，在SEQ ID NO:1的核苷酸号1的起始密码子和开始于核苷酸号2440的终止密码子之间，编码SEQ ID NO:2多肽。
SEQ ID NO:3的多核苷酸，在SEQ ID NO:3的核苷酸号1的起始密码子和开始于核苷酸号2440的终止密码子之间，编码SEQ ID NO:4多肽。
在另一方面，本发明提供了包含以下序列或由下列序列组成的分离的多核苷酸(a)多核苷酸序列，分别在SEQ ID NO:1或3的全长上与SEQ IDNO:1或3有至少85％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、甚至更优选至少97-99％或完全同一性；或(b)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽分别在SEQ ID NO:2或4的全长上与SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列有至少85％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、甚至更优选至少97-99％或100％完全同一性。
可以通过一种方法获得编码本发明多肽的多核苷酸，包括得自除了粘膜炎莫拉氏菌以外的物种的同源物和ortholog，所述方法包括下列步骤在严格条件下(例如，使用45-65℃范围内的温度和从0.1％到1％的SDS浓度)，用包含或由SEQ ID NO:1或3的序列或它们的片段组成的标记或可检测探针筛选合适的文库；并分离包含所述多核苷酸序列的全长基因和/或基因组克隆。
本发明提供了在全长上与SEQ ID NO:1或3中的编码序列(可读框)相同的多核苷酸序列。本发明还提供了成熟多肽或其片段的编码序列本身，以及与另一个编码序列符合读框地共同存在的成熟多肽或其片段的编码序列，所述另一个编码序列如编码前导序列或分泌序列、前蛋白(pre-protein)序列、原蛋白(pro-protein)序列或前原蛋白(prepro-protein)序列的序列。本发明的多核苷酸还可以包括至少一个非编码序列，所述非编码序列包括例如但不限于至少一个非编码5’和3’序列，如转录但不翻译的序列、终止信号(如依赖于rho的终止信号和不依赖于rho的终止信号)、核糖体结合位点、Kozak序列、稳定mRNA的序列、内含子以及聚腺苷酸化信号。所述多核苷酸序列也可以包含编码添加的氨基酸的添加的编码序列。例如，可以编码方便纯化融合蛋白的标记序列。在本发明的某些实施方案中，所述标记序列是在pQE载体(Qiagen,Inc.)中提供并在Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 86:821-824 (1989)中描述的六组氨酸肽，或HA肽标记物(Wilson等，Cell37:767(1984)，这两种标记序列都可以用于纯化与它们融合的多肽序列。本发明的多核苷酸也包括但不限于包括结构基因以及与其天然相连的控制基因表达的序列的多核苷酸。
编码SEQ ID NO:2或4的BASB027多肽的核苷酸序列可以与分别包含在SEQ ID NO:1或3的核苷酸1-2439中的多肽编码序列相同。或者它可以是这样的序列作为遗传密码的丰余性(简并性)的结果，也编码SEQ ID NO:2或4的多肽。
如本文所用的术语“编码多肽的多核苷酸”包括这样的多核苷酸所述多核苷酸包括编码本发明多肽的序列，其中所述本发明多肽尤其是细菌多肽，更尤其是具有SEQ ID NO:2或4陈述的氨基酸序列的粘膜炎莫拉氏菌BASB027的多肽。该术语也包括包含编码所述多肽的单个连续区或不连续的多个区(例如，被整合的噬菌体、整合的插入序列、整合的载体序列、整合的转座子序列打断的多核苷酸，或由于RNA编辑或基因组DNA再组织而打断的多核苷酸)的多核苷酸以及添加的区，所述添加的区也可以包含编码序列和/或非编码序列。
本发明还涉及本文所述的多核苷酸的变异体，所述变异体编码具有SEQ ID NO:2或4的推导的氨基酸序列的多肽的变异体。本发明的多核苷酸片段可以用于例如合成本发明的全长多核苷酸。
更特别优选的实施方案是编码BASB027变异体的多核苷酸，所述BASB027变异体具有SEQ ID NO:2或4的BASB027多肽的氨基酸序列，在所述氨基酸序列中若干个、几个、5到10个、1到5个、1到3个、2个、1个或0个氨基酸残基以任意组合被取代、修饰、缺失和/或添加。在其中特别优选的是不改变BASB027多肽的性质和活性的沉默取代、添加和缺失。
本发明的其它优选实施方案是这样的多核苷酸以及与这样的多核苷酸互补的多核苷酸所述多核苷酸在全长上与编码具有SEQ IDNO:2或4陈述的氨基酸序列的BASB027多肽的多核苷酸至少85％相同。或者，更高度优选的是包括与编码BASB027多肽的多核苷酸在全长上至少90％相同的区的多核苷酸，以及与其互补的多核苷酸。在这一方面，尤其优选与上述多核苷酸在全长上至少95％相同的多核苷酸。此外，在那些至少95％相同的多核苷酸中至少97％相同的多核苷酸是高度优选的，在其中更高度优选至少98％和至少99％相同的多核苷酸，而至少99％相同的多核苷酸是最优选的。
优选的实施方案是编码这样的多肽的多核苷酸所述多肽基本保留了与SEQ ID NO:1或3的DNA编码的成熟多肽同样的生物功能或活性。
按照本发明的某些优选实施方案，提供了与BASB027多核苷酸序列杂交、尤其是在严格条件下杂交的多核苷酸，如SEQ ID NO:1或3中的那些多核苷酸。
本发明还涉及与本文提供的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。在这一方面，本发明特别涉及在严格条件下与本文所述的多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所用，术语“严格条件”和“严格杂交条件”是指只有在序列间有至少95％、最好97％同一性时才发生杂交。严格杂交条件的一个具体例子是在包含以下物质的溶液中于42℃培育过夜50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl,15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6),5×Denhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸酯以及20微克/ml变性、剪切过的鲑鱼精子DNA随后在0.1×SSC中于约65℃下洗涤杂交支持体。杂交和洗涤的条件是众所周知的，并在Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor,N.Y.,(1989)中，尤其是该书的第11章举例说明。也可使用本发明提供的多核苷酸序列进行溶液杂交。
本发明还提供了包括或由这样的多核苷酸序列组成的多核苷酸，所述多核苷酸序列通过在严格杂交条件下，用探针在包含所述完整基因的合适文库中筛选SEQ ID NO:1或3陈述的多核苷酸序列而获得，其中所述探针具有SEQ ID NO:1或3中陈述的所述多核苷酸序列或其片段的序列；然后分离所述多核苷酸序列。可用于获得这样一种多核苷酸的片段包括例如在本文中别处全面描述的探针和引物。
如本文别处关于本发明的多核苷酸测定所讨论的，本发明的多核苷酸例如可以用作RNA、cDNA和基因组DNA的杂交探针，以分离编码BASB027的全长cDNA和基因组克隆，以及分离与BASB027基因有高度同一性、尤其是高度序列同一性的其它基因的cDNA和基因组克隆。这样的探针一般将包括至少15个核苷酸残基或碱基对。这样的探针最好具有至少30个核苷酸残基或碱基对，可以具有至少50个核苷酸残基或碱基对。尤其优选的探针将具有至少20个核苷酸残基或碱基对，并将具有少于30个核苷酸残基或碱基对。
使用SEQ ID NO:1或3提供的DNA序列合成寡核苷酸探针，可以通过筛选分离BASB027基因的编码区。然后用标记寡核苷酸筛选cDNA文库、基因组DNA文库或mRNA文库，确定所述探针杂交到文库的哪个成员上，其中所述探针具有与本发明基因的序列互补的序列。
可用几种方法获得全长DNA或延伸短DNA，并且这几种方法是本领域内的技术人员所熟知的，例如基于cDNA末端快速扩增(RACE)的那些方法(见例如Frohman等，PNAS USA 85:8998-9002,1988)的方法。该技术的最新改进，例如以MarathonTM技术(ClonetechLaboratories Inc.)为例，已经显著简化了寻求更长的cDNA。在MarathonTM技术中，由从选定组织提取的mRNA制备cDNA并在每个末端连接“连接物”序列。然后使用基因特异性和接头特异性寡核苷酸引物的组合，进行核酸扩增(PCR)以扩增所述DNA“丢失的”5’端。然后使用“嵌套”引物重复PCR反应，所述“嵌套”引物即是设计在扩增产物内退火的引物(一般是退火结合在连接物序列内3’及其下游的连接物特异性引物和退火结合在所述选定基因内5’及其上游的基因特异性引物)。然后可以通过DNA测序分析该反应的产物，并或者通过将所述产物直接连接到已有DNA上以产生完整序列、或者通过使用新序列的信息设计5’引物以进行另一个全长PCR，构建全长DNA。
如本文关于多核苷酸测定所进一步讨论的，本发明的多核苷酸和多肽可以用作例如发现对疾病、尤其是人类疾病治疗和诊断的研究试剂和材料。
作为从SEQ ID NO:1或3的序列衍生的寡核苷酸的本发明的多核苷酸可以用于如本文所述的方法，但最好用于PCR中，以确定本发明鉴定的多核苷酸是否在感染组织中的细菌中完整地或部分地转录。已经认识到这样的序列也可以用于诊断病原体已经达到的感染阶段以及感染类型。
本发明还提供了编码多肽的多核苷酸，所述多肽是还具有添加的氨基末端氨基酸或羧基末端氨基酸的成熟蛋白，或是在所述成熟多肽内部添加了氨基酸的成熟蛋白(例如，当所述成熟形式具有多于一条的多肽链时)。其中这样的序列可以在蛋白从前体到成熟形式的加工中起作用，可以使得能进行蛋白质转运，可以延长或缩短蛋白的半衰期，或可以便利蛋白测定或生产的操作。由于一般是在体内的情况，因此可以通过细胞酶从所述成熟蛋白上加工除去所述添加的氨基酸。
对于本发明的每一种并且所有的多核苷酸，都提供了与之互补的多核苷酸。优选这些互补多核苷酸与每一个它们与之互补的多核苷酸完全互补。
前体蛋白可能是所述多肽的无活性形式，在所述前体蛋白中所述多肽的成熟形式与一个或多个原序列(prosequence)融合。当除去原序列时，这样的无活性前体通常被激活。在激活前可以除去部分或所有的原序列。这样的前体一般称为原蛋白。
除用标准的A、G、C、T/U代表核苷酸外，还用字母“N”描述本发明的某些多核苷酸。“N”表示四种DNA或RNA核苷酸中的任何一种均可以出现在DNA或RNA序列中的这样一个指定位置上，但优选N不是这样的核酸当与相邻核苷酸位置组合时、当以正确的可读框阅读时，具有在这样的可读框内产生过早的终止密码子的效果。
总之，本发明的多核苷酸可以编码成熟蛋白、编码加上前导序列的成熟蛋白(可以称之为前蛋白)、编码具有并非前蛋白的前导序列的一个或多个原序列的成熟蛋白的前体、或编码前原蛋白，即具有前导序列和一个或多个原序列的原蛋白的前体，其中所述前导序列和原序列一般在产生所述多肽的有活性和成熟的形式的加工步骤中除去。
按照本发明的一个方面，提供了本发明的多核苷酸用于治疗或预防目的、尤其是基因免疫接种的用途。
在基因免疫接种中使用本发明的多核苷酸，将最好使用合适的传送方法，如直接注射质粒DNA进肌肉(Wolff等，Hum Mol Genet(1992)1:363.Manthorpe等，Hum.Gene Ther(1983)4:419)、传送与特异性蛋白载体复合的DNA(Wu等，J Biol Chem.(1989)264:16985)、用磷酸钙共沉淀DNA(Benvenisty和Reshef,PNAS USA,(1986)83:9551)、将DNA包入各种形式的脂质体内(Kaneda等，Science(1989)243:375)、粒子轰击(Tang等，Nature(1992)356:152,Eisenbraun等，DNA Cell Biol (1993)12:791)以及用克隆的逆转录病毒载体进行体内感染(Seeger等，PNAS USA(1984)81:5849)。载体、宿主细胞、表达系统本发明还涉及包含一种或多种本发明多核苷酸的载体、用本发明的载体遗传工程化的宿主细胞以及通过重组技术产生本发明的多肽。也可以使用由本发明的DNA构造物得到的RNA，用无细胞翻译系统产生这样的蛋白。
可以通过本领域内技术人员所熟知的方法，从包含表达系统的遗传工程化的宿主细胞制备本发明的重组多肽。因此，在另一方面，本发明涉及包含一种或多种本发明多核苷酸的表达系统，涉及用这样的表达系统遗传工程化的宿主细胞，以及涉及通过重组技术产生本发明的多肽。
为重组产生本发明的多肽，可以遗传工程化宿主细胞以引入本发明的表达系统或其部分或多核苷酸。可以采用在许多标准实验室手册中描述的方法将多核苷酸引入所述宿主细胞，所述实验室手册如Davis等，BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,(1986)和Sambrook等，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)，所述方法如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转位、显微注射、阳离子型脂质介导的转染、电穿孔、转导、scrape loading、弹道引入(ballistic introduction)及感染。
合适宿主的有代表性的例子包括细菌细胞，如链球菌(streptococci)、葡萄球菌(staphylococci)、肠球菌(enterococci)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌属(streptomyces)、蓝细菌(cyanobacteria)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、脑膜炎奈瑟氏球菌和粘膜炎莫拉氏菌的细胞；真菌细胞，如酵母、克鲁维酵母菌属(Kluveromyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、担子菌(basidiomycete)、白假丝酵母(Candida albicans)和曲霉属(Aspergillus)的细胞；昆虫细胞，如果蝇属S2(Drosophila S2)和贪夜蛾属Sf9(Spodoptera)Sf9的细胞；动物细胞，如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞，如裸子植物或被子植物的细胞。
可以使用非常多种的表达系统产生本发明的多肽。这样的载体其中包括，染色体衍生的载体、附加体衍生的载体和病毒衍生的载体，例如，从细菌质粒衍生的载体、从噬菌体衍生的载体、从转座子衍生的载体、从酵母附加体衍生的载体、从插入元件衍生的载体、从酵母染色体元件衍生的载体、从病毒衍生的载体以及从它们的组合衍生的载体，如那些从质粒和噬菌体遗传元件衍生的载体(如粘粒和噬菌粒)，其中所述病毒如杆状病毒、乳多空病毒(如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒、细小核糖核酸病毒、逆转录病毒和甲病毒属(alphavirus)。所述表达系统构造物可以包含调节以及引发表达的控制区。一般地说，在这一方面，可以使用任何适于在宿主中维持、繁殖或表达多核苷酸和/或表达多肽的系统或载体以用于表达。可以通过多种众所周知的常规技术中的任何一种将合适的DNA序列插入所述表达系统中，所述常规技术如那些在Sambrook等，MOLECULAR CLONING,ALABORATORY MANUAL，(见上文)中所陈述的技术。
在真核细胞中的重组表达系统中，为将翻译后的蛋白分泌进内质网的腔、分泌进壁膜间隙或分泌进胞外环境，可以将合适的分泌信号引入所表达的多肽。这些信号对于所述多肽可以是内源的，或者它们可以是异源信号。
可以通过众所周知的方法，从重组细胞培养物回收和纯化本发明的多肽，所述方法包括硫酸铵沉淀或乙醇沉淀、酸提取、阴离子交换层析或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝集素层析。最优选使用离子金属亲和层析(IMAC)进行纯化。当所述多肽在细胞内合成、分离或纯化的过程中变性时，可以使用众所周知的重折叠蛋白的技术再生活性构象。
所述表达系统也可以是重组的活微生物，如病毒或细菌。可以将目标基因插入活的重组病毒或细菌的基因组中。用该活载体接种和体内感染将导致抗原的体内表达并诱导免疫应答。用于此目的的病毒和细菌有，例如痘病毒(如痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒)、甲病毒属(新培斯病毒(Sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(SemlikiForest Virus)、委瑞内拉马脑脊髓炎病毒(Venezuelian EquineEncephalitis Virus))、腺病毒、腺伴随病毒、细小核糖核酸病毒(脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)、疱疹病毒(水痘-带状疱疹病毒等)、利斯特菌氏属(Listeria)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、卡介苗(BCG)。为获得活体疫苗，这些病毒和细菌可以是有毒力的、或以各种方式减毒的。这样的活体疫苗也构成本发明的一部分。诊断测定、预后测定、血清分型测定以及突变测定本发明还涉及使用本发明的BASB027多核苷酸及多肽作为诊断试剂的用途。在真核细胞、尤其是哺乳动物、特别是人类中检测BASB027多核苷酸和/或多肽将提供对于疾病诊断、疾病分期或传染性生物对药物的反应的诊断方法。可以通过多种众所周知的技术，以及通过本文提供的方法，在核酸或氨基酸水平上检测真核生物、尤其是哺乳动物、特别是人类、其中尤其是受到或怀疑受到包含BASB027基因或蛋白的生物感染的人。
可以从推测受到感染和/或已经受到感染的个体的身体材料中获得用于预后、诊断或其它分析的多肽和多核苷酸。来自这些来源中任何一种的多核苷酸，尤其是DNA或RNA，可直接用于检测或在分析前通过使用PCR或任何其它扩增技术酶促扩增。也可以按同样方法使用RNA (尤其是mRNA)、cDNA和基因组DNA。使用扩增，对个体中存在的传染性生物或居留生物(resident organism)的物种和株系的特征鉴定，可以通过分析该生物选定多核苷酸的基因型而完成。与由相关生物选出的参考序列的基因型作比较，通过扩增产物大小上的变化可以检测缺失或插入，其中所述相关生物最好是同一属的不同物种或同一物种的不同株系。通过将扩增的DNA与标记的BASB027多核苷酸序列杂交，可以鉴定点突变。可以通过DNA酶或RNA酶消化(分别对于DNA或RNA而言)、或通过检测解链温度或复性动力学的差异，将完全配对序列或显著配对序列与不完全错配或更显著错配双链体区分开来。也可以通过与参考序列相比，以多核苷酸片段在凝胶上的电泳迁移率的变化检测多核苷酸序列的差异。这可以使用或不使用变性试剂进行。也可以通过直接的DNA测序或RNA测序检测多核苷酸差异。见例如Myers等，Science,230:1242(1985)。也可以通过核酸酶保护分析(如RNA酶、V1和S1保护分析)或化学切割方法揭示在特定位点的序列改变。见例如Cotton等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-4401(1985)。
在另一实施方案中，可以构建包含BASB027核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探针的阵列，以进行例如遗传突变的有效筛选、血清分型、分类学分类或鉴定。阵列技术方法是众所周知的并具有普遍应用性，并可以用于解决分子遗传学中的多种问题，包括基因表达、遗传连锁、以及遗传变异性(见例如Chee等，Science,274:61O(1996))。
因此在另一方面，本发明涉及诊断试剂盒，其中包括(a)本发明的多核苷酸，最好是SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列或其片段；(b)与(a)的核苷酸序列互补的核苷酸序列；(c)本发明的多肽，最好是SEQ ID NO:2或4的多肽或其片段；或(d)针对本发明的多肽的抗体，最好是针对SEQ ID NO:2或4的多肽的抗体。
人们会认识到，在任何这样的试剂盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可以包含实质性的成分。这样的试剂盒将尤其在诊断疾病或诊断对疾病的易感性方面有用。
本发明还涉及使用本发明的多核苷酸作为诊断试剂。检测与疾病或致病性有关的本发明多核苷酸(最好是SEQ ID NO:1或3)的突变形式，将提供可以帮助或确定疾病诊断、预测疾病病程、确定疾病阶段、或对疾病的易感性的诊断工具，所述疾病源于所述多核苷酸的表达不足、过量表达或表达变化。可以在多核苷酸水平上通过多种技术，如那些本文别处描述的技术，检测在这样的多核苷酸上带有突变的生物、尤其是传染性生物。
也可以通过多种技术，在多核苷酸或多肽水平上检测来自在本发明的多核苷酸和/或多肽上带有突变或多态性(等位变异)的生物的细胞，以进行例如血清分型。例如，可以使用RT-PCR检测RNA中的突变。尤其优选使用RT-PCR结合自动化检测系统，例如GeneScan。RNA、cDNA或基因组DNA也可以经PCR用于同样目的。例如，可以使用与编码BASB027多肽的多核苷酸互补的PCR引物鉴定和分析突变。
本发明还提供从5’和/或3’端除去1、2、3或4个核苷酸的引物。这些引物可以用于，尤其是，扩增由个体得到的样品(如身体材料)分离出的BASB027 DNA和/或RNA。所述引物可以用于扩增从感染个体分离的多核苷酸，以便随后可以通过各种技术研究所述多核苷酸以阐明所述多核苷酸序列。这样，可以检测到所述多核苷酸序列中的突变，并用于诊断和/或预测感染或其阶段或病程，或者用于对所述传染性病原体进行血清分型和/或分类。
本发明还提供了用于诊断疾病、优选是细菌感染、更优选是粘膜炎莫拉氏菌导致的感染的方法，包括从得自个体的样品(如身体材料)中测定具有SEQ ID NO:1或3的序列的多核苷酸的表达水平的增加。可以使用任何一种本领域内众所周知的用于定量多核苷酸的方法，测定BASB027多核苷酸表达的增加或降低，所述方法如例如扩增、PCR、RT-PCR、RNA酶保护、RNA印迹法、光谱测定法和其它杂交方法。
此外，根据本发明的用于检测与正常对照组织样品相比BASB027多肽过量表达的诊断测定，可以用于例如检测感染的存在。可以用来测定从宿主得到的样品(如身体材料)中BASB027多肽的水平的测定技术，对于本领域内的技术人员是熟知的。这样的分析方法包括放射免疫测定、竞争性结合测定、蛋白质印迹分析、抗体夹心测定、抗体检测和ELISA测定。
本发明的多核苷酸可以用作多核苷酸阵列、最好是高密度阵列或网格的成分。这些高密度阵列对于诊断和预测目的特别有用。例如，有一组点，每个点包括一个不同的基因，并且还包含一种或多种本发明多核苷酸，该组点可以用于探测，如通过使用杂交或核酸扩增，使用从身体样品获得或衍生的探针，确定个体中特定多核苷酸序列或相关序列的存在。这样一种存在可以指示病原体、尤其是粘膜炎莫拉氏菌的存在，并可以用于诊断和/或预测疾病或疾病的病程。优选包括大量SEQ ID NO:1或3的多核苷酸序列的变异体的网格。还优选包括大量编码SEQ ID NO:2或4的多肽序列的多核苷酸的变异体的网格。抗体本发明的多肽和多核苷酸或其变异体、或表达上述的细胞可以用作免疫原，以产生分别对这样的多肽或多核苷酸免疫专一性的抗体。
在本发明某些优选的实施方案中，提供了对抗BASB027多肽或多核苷酸的抗体。
可以使用常规方法，通过给予动物(最好不是人类)本发明的多肽和/或多核苷酸、或二者中其中一种或两种的带有表位的片段、二者中其中一种或两种的类似物、或表达二者中其中一种或两种的细胞，获得针对本发明的多肽或多核苷酸而产生的抗体。为制备单克隆抗体，可以使用本领域内提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术。实例包括各种技术，如在以下文献中的技术Kohler,G.和Milstein,C.,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today4:72(1983)；Cole等，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY，第77-96页，Alan R.Liss,Inc.(1985)。
可以修改产生单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号)，以产生针对本发明的多肽或多核苷酸的单链抗体。此外，可以使用转基因小鼠、或其它生物或动物(如其它哺乳动物)表达对本发明的多肽或多核苷酸免疫专一性的人源化抗体。
另一方面，可以利用噬菌体展示技术，或者从根据带有抗BSAB027而筛选出的人得到的PCR扩增的淋巴细胞v基因库的所有组成成分中、或者从原初文库(naive library)中，选择对本发明的多肽有结合活性的抗体基因(McCafferty等，(1990).Nature 348,552-554；Marks等，(1992)Biotechnology 10,779-783)。也可以通过例如链改组，改善这些抗体的亲和力(Clackson等，(1991)Nature 352:628)。
可以使用上述抗体来分离或鉴定表达本发明的多肽或多核苷酸的克隆，以通过例如亲和层析纯化所述多肽或多核苷酸。
因此，其中可以使用对抗BASB027多肽或BASB027多核苷酸的抗体来治疗感染，尤其是细菌感染。
多肽变异体包括在抗原上、表位上或免疫上等同的变异体，这些构成本发明一个具体的方面。
最好修饰所述抗体及其变异体以使其在个体中免疫原性更低。例如，假如所述个体是人，那么最好“人源化”所述抗体，其中将杂交瘤衍生抗体的一个或多个互补决定区移植到人单克隆抗体中，例如在Jones等(1986),Nature 321,522-525或Tempest等，(1991)Biotechnology 9,266-273中所述。拮抗剂和激动剂-测定和分子也可以使用本发明的多肽和多核苷酸，评估小分子底物与配体在例如细胞、无细胞制备物、化学文库以及天然产物混合物中的结合。这些底物和配体可以是天然底物和配体，或者可以是结构模拟物或功能模拟物。见例如Coligan等，Current Protocols in Immunology1(2)第5章(1991)。
使用与候选化合物直接或间接结合的标记，筛选方法可以仅测量所述候选化合物与所述多肽或多核苷酸的结合、或所述候选化合物与带有所述多肽或多核苷酸的细胞或膜的结合、或所述候选化合物与带有所述多肽的融合蛋白的细胞或膜的结合。或者，所述筛选方法涉及与标记的竞争物的竞争。此外，使用对于包含所述多肽或多核苷酸的细胞合适的检测系统，这些筛选方法可以测试所述候选化合物是否导致由于所述多肽或多核苷酸的激活或抑制而产生的信号。一般在一种已知激动剂的存在下测定激活的抑制物，并观察在所述候选化合物存在下所述激动剂对激活的效应。组成型有活性的多肽和/或组成型表达的多肽和多核苷酸可以用于筛选逆向激动剂或抑制剂的筛选方法中在缺乏激动剂或抑制物的情况下，根据具体情况测试所述候选化合物是否导致对所述多肽或多核苷酸的激活的抑制。此外，所述测试方法可以仅包括以下步骤将候选化合物与含有本发明的多肽或多核苷酸的溶液混合，形成混合物，测定所述混合物中BASB027多肽和/或多核苷酸活性，并将所述混合物的BASB027多肽和/或多核苷酸活性与标准的活性作比较。也可以使用融合蛋白，例如如前文所述那些由Fc部分和BASB027多肽制成的融合蛋白，进行高通过量筛选测定，以鉴定本发明多肽的拮抗剂、以及系统发生上和/或功能上相关多肽的拮抗剂(见D.Bennett等，JMol Recognition,8:52-58(1995)；和K.Johanson等，J Biol Chem,270(16):9459-9471(1995))。
也可以使用所述多核苷酸、多肽以及结合本发明多肽和/或与本发明多肽相互作用的抗体来配置筛选方法，以测试添加的化合物对细胞中mRNA和/或多肽的产生的效应。例如，通过本领域内已知的标准方法，使用单克隆抗体和多克隆抗体，可以构建ELISA测定以测定多肽的分泌水平或细胞相关水平。这可以用于从适当操作过的细胞或组织中发现可能抑制或增强多肽产生的试剂(也分别称为拮抗剂或激动剂)。
本发明还提供了筛选化合物的方法，以鉴定那些增强(激动剂)或阻断(拮抗剂)BASB027多肽或多核苷酸的作用的化合物，尤其是那些制菌和/或杀菌的化合物。所述筛选方法涉及高通过量技术。例如，为筛选激动剂或拮抗剂，在存在或不存在可能是BASB027激动剂或拮抗剂的候选分子的情况下，将包含BASB027多肽的合成反应混合物、细胞区室(如膜、胞外被膜或细胞壁、或它们中任何一种的制备物)与所述多肽的标记底物或配体一起温育。候选分子激动或拮抗BASB027多肽的能力反映在标记配体的结合减少或从这样的底物生产产物减少。无偿结合的分子，即不诱导BASB027多肽的效应的分子很有可能是好的拮抗剂。结合很好并且根据具体情况，增加从底物生产产物的速、增加信号转导或增加化学通道活性的分子是激动剂。使用报告系统，可以增强(根据具体情况)对由底物产生产物、信号转导或化学通道活性的速率或水平的检测。在这一方面可能有用的报告系统包括但不限于比色法、标记底物转化成产物、对于BASB027多核苷酸或多肽的活性变化作出应答的报告基因、以及本领域内已知的结合测定。
测定BASB027激动剂的另一个例子是竞争性测定，即将BASB027和可能的激动剂与BASB027结合分子、重组BASB027结合分子、天然底物或配体、或底物或配体模拟物在合适条件下混合，以进行竞争性抑制分析。可以通过如放射性或显色化合物来标记BASB027，以便可以准确测定与结合分子结合或转化成产物的BASB027分子的数量，以评估所述可能的拮抗剂的有效性。
可能的拮抗剂其中包括，结合本发明的多核苷酸和/或多肽并因此抑制或消除其活性或表达的小有机分子、肽、多肽以及抗体。可能的拮抗剂还可以是小有机分子、肽、多肽，如结合在结合分子(如结合分子)上相同位点的密切相关的蛋白或抗体，所述蛋白或抗体同时不诱导BASB027所诱导的活性，因此通过排除BASB027多肽和/或多核苷酸使其不能结合而防止BASB027多肽和/或多核苷酸的作用或表达。
可能的拮抗剂包括这样的小分子所述小分子结合并占据所述多肽的结合位点、因此防止其结合到细胞结合分子，以致防止正常的生物活性。小分子的例子包括但不限于小有机分子、肽或肽样分子。其它可能的拮抗剂包括反义分子(见Okano,J.Neurochem.56:560(1991)；OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSEINHIBITORSOF GENE EXPRESSION,CRC Press,Boca Raton,FL(1988)对这些分子的描述)。优选的可能拮抗剂包括与BASB027相关的化合物以及BASB027的变异体。
在再一方面，本发明涉及遗传工程化的可溶性融合蛋白，所述蛋白包括本发明的多肽或其片段，以及不同亚类免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重链或轻链的恒定区的不同部分。作为免疫球蛋白优选人类IgG(尤其是IgGl)的重链的恒定部分，其中融合发生在绞链区。在具体的实施方案中，可以通过插入能用凝血因子Xa切割的切割序列来简单地除去Fc部分。此外，本发明涉及通过遗传工程制备这些融合蛋白的方法，以及所述融合蛋白用于药物筛选、诊断和治疗的应用。本发明的另一方面还涉及编码这样的融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技术的例子可以在国际专利申请第WO94/29458号和第WO94/22914号中发现。
本文提供的每一种多核苷酸序列都可以用于发现和研制抗细菌化合物。在表达后，所编码的蛋白可以用作筛选抗细菌药物的靶。此外，相应的mRNA上编码所述编码蛋白氨基末端区的多核苷酸序列、或Shine-Delgarno或其它便利翻译的序列可以用于构建控制目的编码序列表达的反义序列。
本发明还提供使用本发明的多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂来干扰一种病原体或多种病原体与真核宿主、最好是哺乳动物宿主之间导致感染后遗症的初始物理相互作用。本发明的分子尤其可以用于防止细菌、尤其是革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌附着到留置装置上真核生物、最好是哺乳动物的细胞外基质蛋白，或附着到伤口中的细胞外基质蛋白；阻断介导组织损伤的真核生物、最好是哺乳动物的细胞外基质蛋白与细菌BASB027蛋白间的细菌附着，和/或；阻断除了由于植入留置装置或其它外科技术以外引发的感染中发病机理的正常进行。
按照本发明的再一方面，提供了BASB027激动剂和拮抗剂，最好是制菌或杀菌的激动剂和拮抗剂。
本发明的拮抗剂和激动剂也可以用于例如预防、抑制和/或治疗疾病。
在另一方面，本发明涉及本发明多肽的mimotope。mimotope是与天然肽足够相似(序列上或结构上)的肽序列，能够被识别天然肽的抗体识别；或者当偶联到合适载体时，能够产生识别天然肽的抗体。
可以通过添加、缺失或取代选定的氨基酸而设计肽mimotope用于特定用途。因此，可以为了易于缀合于蛋白载体而修饰所述肽。例如，一些化学缀合方法可能需要包括一个末端半胱氨酸。此外，与蛋白载体缀合的肽可能需要在所述肽缀合末端远处包括一个疏水末端，以便所述肽游离的未结合末端保持与载体蛋白的表面结合。因此使所述肽呈现出这样的构象所述构象与在完整的天然分子中发现的所述肽的构象最密切相似。例如，可以改变所述肽使其具有一个N末端半胱氨酸和一个C末端疏水性酰胺化尾。或者，可以进行一个或多个氨基酸的D-立体异构体的添加或取代，以产生有益的衍生物，例如以增强所述肽的稳定性。
或者，使用如噬菌体展示技术(EP 0 552 267 B1)的技术，用本身能够结合本发明多肽的抗体，可以鉴定肽mimotope。该技术产生了大量模拟天然肽的结构并因此能够结合抗天然肽抗体的肽序列，但所述肽序列本身并不一定与所述天然多肽具有显著的序列同一性。疫苗本发明的另一方面涉及在个体、特别是哺乳动物、最好是人类中诱导免疫应答的方法，包括用足以产生抗体和/或T细胞免疫应答的BASB027多核苷酸和/或多肽或它们的片段或变异体接种所述个体，以保护所述个体免受感染，尤其是细菌感染，更特别是粘膜炎莫拉氏菌感染。还提供的是这样的方法凭借这种方法，这样的免疫应答减慢细菌的复制。而本发明的再一方面涉及在个体中诱导免疫应答的方法，包括传递核酸载体、序列或核酶给这样的个体，来指导BASB027多核苷酸和/或多肽、或其片段或变异体的表达，以在体内表达BASB027多核苷酸和/或多肽、或其片段或变异体，以此诱导免疫应答，如产生抗体和/或T细胞免疫应答(包括例如产生细胞因子的T细胞或细胞毒性T细胞)，来保护所述个体(最好是人类)免受疾病，而不论该疾病是否已经在所述个体内建立。给予所述基因的一个例子是将其作为颗粒的包被物或者相反而加速进入所需细胞。这样的核酸载体可以包括DNA、RNA、核酶、修饰过的核酸、DNA/RNA杂种、DNA-蛋白质复合体或RNA-蛋白质复合体。
本发明的再一方面涉及免疫组合物，当所述免疫组合物引入个体、最好是人类中时，由于所述免疫组合物能够在所述个体中诱导免疫应答，因此在所述个体中诱导针对BASB027多核苷酸和/或由其编码的多肽的免疫应答，其中所述组合物包含重组BASB027多核苷酸和/或由其编码的多肽，和/或所述组合物包括编码和表达所述BASB027多核苷酸的抗原的DNA和/或RNA、由其编码的多肽、或其它本发明的多肽。所述免疫应答可以用于治疗或为预防目的，并采用抗体免疫和/或细胞免疫的形式，如由CTL或CD4+T细胞引起的细胞免疫。
BASB027多肽或其片段可以与辅蛋白(co-protein)或化学部分融合，所述化学部分本身可能产生抗体或不产生抗体，但能够稳定所述第一种蛋白并产生具有抗原性和/或免疫原性的特性、最好是保护特性的融合或修饰蛋白。因此，融合的重组蛋白最好还包含一种抗原性辅蛋白，或任何其它稳定所述蛋白并便利其生产和纯化的相对大的辅蛋白，其中所述抗原性辅蛋白如来自流感嗜血杆菌的脂蛋白D、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或β-半乳糖苷酶。此外，所述辅蛋白可以在提供对接受所述蛋白的生物的免疫系统的普通性刺激的意义上，作为佐剂起作用。所述辅蛋白可以连接到第一种蛋白的氨基端或者羧基端。
本发明提供组合物，尤其是疫苗组合物，以及包含本发明的多肽和/或多核苷酸以及免疫刺激性DNA序列的方法，所述免疫刺激性DNA序列如那些在Sato,Y.等Science 273:352(1996)中所述的序列。
本发明还提供使用所述多核苷酸或其特定片段的方法，其中已经显示在粘膜炎莫拉氏菌感染的动物模型中，在这样的遗传免疫实验中使用的多核苷酸构造物中，所述多核苷酸或其特定片段编码细菌细胞表面蛋白的非可变区。这样的实验对于鉴定能够引起预防性或治疗性免疫应答的蛋白质表位特别有用。相信该方法将使得能够随后制备特别有用的单克隆抗体，以开发针对在哺乳动物、尤其是人类中的细菌感染(尤其是粘膜炎莫拉氏菌感染)的预防试剂或治疗疗法，其中所述单克隆抗体得自成功抵御或清除感染的动物的必需器官。
本发明还包括疫苗制剂，所述疫苗制剂包括本发明的免疫原性重组多肽和/或多核苷酸以及合适的载体，如药学上可接受的载体。由于所述多肽和多核苷酸可能在胃中分解，因此它们中的每一种最好胃肠外给予，包括例如皮下给予、肌内给予、静脉内给予或皮内给予。适于胃肠外给予的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，所述溶液可以包含抗氧化剂、缓冲剂、制菌化合物和使得所述制剂与个体的体液(最好是血液)等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，所述悬浮液可以包括悬浮剂或增稠剂。所述制剂可以盛装在单位剂量或多剂量容器(如封口的安瓿和管形瓶)中，并可以在冻干条件下保存，仅要求在使用前加入无菌液体载体。
本发明的疫苗制剂也可以包括佐剂系统以增强所述制剂的免疫原性。所述佐剂系统最好优先引起TH1型反应。
免疫应答可以广义地归入两个最基本的类体液免疫应答或细胞介导的免疫应答(传统上分别用抗体保护机制或细胞效应物保护机制来特征定义)。免疫应答的这两个类被命名为TH1型反应(细胞介导的反应)和TH2型免疫应答(体液应答)。
最基本的TH1型免疫应答的特征在于产生抗原特异性单倍型限制性细胞毒性T细胞以及天然杀伤细胞应答。在小鼠中，TH-1型反应通常特征为产生IgG2a亚型抗体，而在人中，这些抗体对应于IgG1型抗体。TH-2型免疫应答的特征在于产生广泛范围的免疫球蛋白同种型，在小鼠中所述免疫球蛋白同种型包括IgG1、IgA和IgM。
可以认为在这两种免疫应答类型产生背后的推动力是细胞因子。高水平的TH-1型细胞因子倾向于促进诱导针对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的TH-2型细胞因子倾向于促进诱导对抗原的体液免疫应答。
TH-1和TH-2型免疫应答的区别并不是绝对的。事实上某个个体会支持被描述为主要是TH1或主要是TH2的免疫应答。然而，按照Mosmann和Coffman在鼠CD4+ve T细胞克隆中所述来考虑细胞因子家族常常是方便的(Mosmann,T.R.和Coffman,R.L.(1998)TH1和TH2细胞不同的淋巴因子分泌模式导致不同的功能特性AnnualReview of Immunology,7，第145-173页)。传统上，TH-1型反应与T淋巴细胞产生INF-γ和IL-2细胞因子有关。其它常常与诱导TH1型免疫应答直接相关的细胞因子并不是由T细胞产生，如IL-12。相比之下，TH2型反应与IL-4、IL-5、IL-6和IL-13的分泌有关。
已知某些疫苗佐剂特别适于刺激TH1或TH2型细胞因子应答。传统上，在接种疫苗或感染后免疫应答TH1:TH2平衡的最佳指标，包括在体外用抗原再刺激后直接测量T淋巴细胞的TH1或TH2细胞因子产生，和/或测量抗原特异性抗体反应的IgG1:IgG2a比例。
因此，TH1型佐剂是这样一种佐剂它优先刺激分离的T细胞群体以在体外用抗原再刺激时产生高水平TH1型细胞因子，并促进CD8+细胞毒性T淋巴细胞以及与TH1型同种型有关的抗原特异性免疫球蛋白反应的产生。
在国际专利申请No.WO94/00153和WO95/17209中描述了能够优选刺激TH1细胞应答的佐剂。
3-脱氧乙酰单磷酰脂质A(3D-MPL)就是这样一种佐剂。这可以从GB2220211(Ribi)得知。化学上它是有4、5或6个乙酰化链的3-脱氧乙酰单磷酰脂质A的混合物，由Ribi Immunochem,Montana生产。在欧洲专利0689454B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)中公开了3-脱氧乙酰单磷酰脂质A的一种优选形式。
3D-MPL的颗粒最好小得足以通过0.22微米的膜来进行除菌过滤(如欧洲专利0689454中所述)。3D-MPL在每剂量中使用的范围是10μg-100μg，最好是25-50μg，其中抗原在每剂量中使用的范围通常是2-50μg。
另一种优选的佐剂包括QS21，一种从皂树(Quillaja SaponariaMolina)的树皮中得到的Hplc纯化的无毒组分。这种佐剂可以可选地与3-脱氧乙酰单磷酰脂质A(3D-MPL)混合，其中可以可选地还有一种载体。
美国专利第5,057,540号公开了QS21的生产方法。
以前已经描述了含有QS21的无反应原性佐剂制剂(WO96/33739)。当与抗原一起配制时，已经显示这种包含QS21和胆固醇的制剂是成功的TH1刺激佐剂。
其它为TH1细胞应答的优先刺激物的佐剂包括免疫调节性寡核苷酸，例如WO96/02555中所公开的未甲基化CpG序列。
不同TH1刺激佐剂(如上文所提到的那些)的组合也应当被认为是提供了为TH1细胞应答优先刺激物的佐剂。例如，QS21可以与3D-MPL一起配制。QS21∶3D-MPL的比例通常约为1∶10到10∶1；最好是1∶5到5∶1，而实际上常常是1∶1。最佳协同作用的优范围是2.5∶1到1∶1 3D-MPL∶QS21。
依照本发明的疫苗组合物中最好还存在一种载体。所述载体可以是水包油乳状液，或一种铝盐，如磷酸铝或氢氧化铝。
优选的水包油乳状液包含一种可代谢的油，如角鲨烯、α-生育酚和Tween80。在一个特别优选的方面，在依照本发明的疫苗组合物中的抗原在这样的乳剂中与QS21和3D-MPL混合。此外所述水包油乳状液可以含有span85和/或卵磷脂和/或甘油三辛酸酯。
在给予人时，疫苗中使用的QS21和3D-MPL通常在每剂量1μg-200μg的范围内，如10-100μg，最好是10μg-50μg。而水包油乳状液通常会含有2-10％的角鲨烯、2-10％的α-生育酚和0.3-3％的Tween80。角鲨烯α-生育酚的比例最好是等于或小于1，因为这提供了一种更稳定的乳状液。可以在1％的水平上使用Span85。在某些情况下，本发明的疫苗另外含有一种稳定剂是可能有利的。
无毒的水包油乳状液最好在一种水性载体中含有一种无毒的油，如角鲨烷或角鲨烯，以及一种乳化剂，如Tween80。所述水性载体可以是例如磷酸缓冲盐溶液。
WO95/17210中描述了一种特别有效的佐剂制剂，该制剂涉及在水包油乳状液中的QS21、3D-MPL和生育酚。
本发明还提供了多价疫苗组合物，所述多价疫苗组合物包含与其它抗原组合的本发明的疫苗制剂，所述其它抗原尤其是可用于治疗癌症、自身免疫病以及相关病症的抗原。这样一种多价疫苗组合物可以包括如前文所述的诱导TH-1的佐剂。
虽然已经根据某些BASB027多肽和多核苷酸而描述本发明，但应当理解本发明覆盖天然出现的多肽和多核苷酸的片段，以及带有添加、缺失或取代的相似多肽和多核苷酸，其中所述添加、缺失或取代基本不影响所述重组多肽或多核苷酸的免疫原性特性。组合物、试剂盒以及给药在本发明的再一方面，提供了用于给予单个细胞或多细胞生物的包含BASB027多核苷酸和/或BASB027多肽的组合物。
本发明还涉及包含本文所讨论的多核苷酸和/或多肽或它们的激动剂或拮抗剂的组合物。本发明的多肽和多核苷酸可以与非无菌或无菌的一种载体或多种载体组合使用以用于细胞、组织或生物，所述载体如适于给予个体的药用载体。这样的组合物包括例如媒介添加物(media additive)或治疗有效量的本发明的多肽和/或多核苷酸以及药学上可接受的载体或赋形剂。这样的载体可以包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及它们的组合物。所述制剂应当配合给药模式。本发明还涉及诊断用和药用包和试剂盒，所述包和试剂盒包括一个或多个容器，所述容器中装有前文所述本发明的组合物的一种或多种成份。
本发明的多肽、多核苷酸和其它化合物可以单独使用或与其它化合物如治疗化合物结合使用。
所述药用组合物可以以任何有效、方便的方式给予，所述方式其中包括例如表面途径、口服途径、肛门途径、阴道途径、静脉内途径、腹膜内途径、肌内途径、皮下途径、鼻内途径或皮内途径。
在治疗中或用作预防药时，可以将所述活性药剂作为可注射的组合物给予个体，例如作为无菌水性分散体，所述分散体最好是等渗的。
在另一方面，本发明提供了药用组合物，所述药用组合物包括组合了药学可接受的载体或赋形剂的治疗有效量的多肽和/或多核苷酸(如可溶形式的本发明的多肽和/或多核苷酸)、激动剂肽或拮抗剂肽或小分子化合物。这样的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及它们的组合物。本发明还涉及医药包和试剂盒，所述医药包和试剂盒包括一个或多个容器，所述容器中装有前文所述本发明的组合物的一种或多种成份。
本发明的多肽、多核苷酸和其它化合物可以单独使用或与其它化合物如治疗化合物结合使用。
可以改变所述组合物以适应给药途径，所述给药途径如系统性途径或口服途径。系统性给药的优选形式包括注射，一般是通过静脉内注射。可以使用其它注射途径，如皮下注射、肌内注射或腹膜内注射。用于系统性给药的其它可选方法包括使用渗透剂经粘膜和经皮给药，所述渗透剂如胆汁盐或梭链孢酸或其它去污剂。此外，如果本发明的多肽或其它化合物可以配制到肠制剂或胶囊化制剂中，那么口服给药也是可能的。这些化合物也可以是以药膏、糊剂、凝胶、溶液、粉剂等形式表面和/或局部给予。
为给予哺乳动物，尤其是人类，预期所述活性药剂的每日剂量水平将从0.01mg/kg到10mg/kg，一般是1mg/kg左右。在任何情况下，医师将确定最适于个体的实际剂量，并且该剂量将随着特定个体的年龄、体重和反应而不同。上面的剂量是一般情况的例子。当然，有可能有需要更高或更低剂量范围的个别例子，而这些情况处于本发明的范围内。
所需的剂量范围取决于肽的选择、给药途径、制剂的性质、患者病症的性质以及主治医师的判断。然而，合适的剂量处于0.1-100μg/kg患者体重的范围内。
疫苗组合物方便地采用可注射的形式。可以使用常规佐剂以增强免疫应答。用于疫苗的合适单位剂量是0.5-5微克/kg的抗原，并且最好以1-3周的间隔给予这样的剂量1-3次。使用指示的剂量范围，用本发明的化合物将不会观察到阻止将它们给予合适个体的不利的毒理学效应。
然而，考虑到可用的化合物的多样性以及各种给药途径的不同功效，预期在所需剂量上将有很大变化。例如，预期口服将比通过静脉内注射给予需要更高剂量。使用本领域内熟知的用于优化的标准经验程序，可以调整这些剂量水平上的变化。序列数据库、在有形媒介中的序列以及算法多核苷酸和多肽序列形成有价值的信息来源，使用这样的信息来源确定它们的2维和3维结构，并鉴定具有相似同一性的其它序列。通过将序列储存在计算机可读媒介中并随后使用在已知的大分子结构程序所存储的数据，或使用所存储的数据，通过众所周知的搜索工具如GCG程序包搜索序列数据库，大大便利了这些方法。
本发明还提供的是特征序列或信息串(string)、尤其是基因序列或所编码的蛋白序列的分析方法。优选的序列分析方法包括例如序列同源性分析的方法(如同一性和相似性分析)、DNA、RNA和蛋白质结构分析、序列装配、分支分析、序列基序分析、确定可读框、核酸碱基调入(nucleic acid base calling)、密码子选择分析、核酸碱基修整(nucleic acid base trimming)以及序列色谱峰分析。
为进行同源性鉴定提供了基于计算机的方法。该方法包括下列步骤在计算机可读媒介中提供包含本发明多核苷酸的序列的第一个多核苷酸序列；将所述第一个多核苷酸序列与至少一种第二个多核苷酸或多肽序列比较，鉴定同源性。
还为进行同源性分析提供了基于计算机的方法，所述方法包括下列步骤在计算机可读媒介中提供包含本发明多肽的序列的第一个多肽序列；将所述第一个多肽序列与至少一种第二个多核苷酸或多肽序列比较，鉴定同源性。
在本说明书中引用的所有出版物和参考资料(包括但不限于专利和专利申请)通过引用完整地结合到本文中，就象具体并单独地指出每个个别的出版物或参考资料已经完全陈述一样通过引用结合到本文中。同时以出版物和参考资料的上述方式将本申请要求获得优先权的任何专利申请通过引用完整地结合到本文中。定义“同一性”，如本领域内已知的，指根据情况，通过比较序列而确定的两种或两种以上多肽序列或两种或两种以上多核苷酸序列之间的关系。在本领域内，“同一性”也指根据情况，通过匹配多肽或多核苷酸序列的信息串而确定的多肽或多核苷酸的序列之间的序列相似程度。通过已知方法，可以容易地计算“同一性”，所述方法包括但不限于那些在以下文献中描述的方法ComputationalMolecular Biology,Lesk,A.M.编辑，Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编辑，Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of SequenceData，第1部分，Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.编辑，Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heine,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,编辑，M Stockton Press,New York,1991；和Carillo,H.,和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)。用于测定同一性的方法设计用来给出所测试序列之间的最大匹配。此外，测定同一性的方法用公众可得到的计算机程序编码。用于测定两序列间同一性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包中的GAP程序(Devereux,J.等，Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN(Altschul,S.F.等，J.Molec.Biol.215:403-410(1990))以及FASTA(Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-2448(1988)。公众可以从NCBI和其它来源公开地得到BLAST程序系列(BLAST Manual,Altschul,S.等，NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894；Altschul,S.等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。也可以使用众所周知的Smith Waterman算法测定同一性。
用于多肽序列比较的参数包括下列算法Needleman和Wunsch,J.Mol Biol.48:443-453(1970)比较矩阵(Comparison matrix)得自Henikoff和Henikoff Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915-10919(1992)的BLOSSUM62间隔补偿(Gap Penalty):8间隔长度补偿2根据这些参数可以使用的程序可作为Genetics Computer Group,Madison WI的“间隔(gap)”程序公开地得到。前面提到的参数是进行肽比较(对末端间隔没有补偿)的默认参数。
用于多核苷酸比较的参数包括下列算法Needleman和Wunsch,J.Mol Biol.48:443-453(1970)比较矩阵匹配=+10，错配=0间隔补偿50
间隔长度补偿3可作为Genetics Computer Group,Madison WI的“间隔”程序得到。这些参数是进行核酸比较的默认参数。
根据情况，对于多核苷酸和多肽来说“同一性”的优选意义在下面的(1)和(2)中提供。
(1)多核苷酸实施方案还包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包括与SEQ ID NO:1的参考序列有至少50、60、70、80、85、90、95、97或100％同一性的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列可以与SEQ ID NO:1的参考序列相同，或者与所述参考序列相比，包括多至某一整数的核苷酸改变，其中所述改变选自以下至少一个核苷酸缺失、取代(包括碱基转换和碱基颠换)或插入，并且所述改变可以发生在所述参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置间的任何地方，或者各自单独散布于参考序列的核苷酸中，或者以一个或多个连续的组散布于参考序列中，其中所述核苷酸改变的数量如下确定将定义同一性百分率的整数除以100，然后乘以SEQ IDNO:1中核苷酸的总数，随后从所述SEQ ID NO:1中核苷酸的总数中减去该乘积，或nn≤xn-(xn·y)其中nn是核苷酸改变的数目，xn是SEQ ID NO:1中核苷酸的总数，y是0.50代表50％、0.60代表60％、0.70代表70％、0.80代表80％、0.85代表85％、0.90代表90％、0.95代表95％、0.97代表97％或1.00代表100％，而·是乘法运算符的符号，其中将任何xn和y的非整数乘积从xn减去之前，将该乘积舍入为最接近的整数。编码SEQID NO:2的多肽的多核苷酸的改变可能在该编码序列中产生无义、错义或移码突变，并因此在这样的改变后改变由所述多核苷酸编码的多肽。
举例来说，本发明的多核苷酸序列可以与SEQ ID NO:1的参考序列相同，即可以100％相同，或者与所述参考序列比较，该序列包括多至某一整数的核酸改变，以致同一性百分率小于100％同一性。这样的改变选自以下至少一个核苷酸缺失、取代(包括碱基转换和碱基颠换)或插入，其中所述改变可以发生在所述参考多核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置间的任何地方，或者各自单独散布于参考序列的核酸中，或者以一个或多个连续的组散布于参考序列中。如下确定对于给定百分率的核酸改变的数目将定义同一性百分率的整数除以100，然后乘以SEQ ID NO:1中核酸的总数，随后从所述SEQ ID NO:1中核酸的总数中减去该乘积，或nn≤xn-(xn·y)其中nn是核酸改变的数目，xn是SEQ ID NO:1中核酸的总数，y是例如0.70代表70％、0.80代表80％、0.85代表85％等等，而·是乘法运算符的符号，其中将任何xn和y的非整数乘积从xn减去之前，将该乘积舍入为最接近的整数。
(2)多肽实施方案还包括分离的多肽，所述分离的多肽包括与SEQ ID NO:2的多肽参考序列有至少50、60、70、80、85、90、95、97或100％同一性的多肽，其中所述多肽序列可以与SEQ ID NO:2的参考序列相同，或者与所述参考序列相比，包括多至某一整数的氨基酸改变，其中所述改变选自以下至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守取代和非保守取代)或插入，并且所述改变可以发生在所述参考多肽序列的氨基末端或羧基末端位置或那些末端位置间的任何地方，或者各自单独散布于参考序列的氨基酸中，或者以一个或多个连续的组散布于参考序列中，其中如下确定所述氨基酸改变的数量将定义同一性百分率的整数除以100，然后乘以SEQ ID NO:2中氨基酸的总数，随后从所述SEQ ID NO:2中氨基酸的总数中减去该乘积，或na≤xa-(xa·y)其中na是氨基酸改变的数目，xa是SEQ ID NO:2中氨基酸的总数，y是0.50代表50％、0.60代表60％、0.70代表70％、0.80代表80％、0.85代表85％、0.90代表90％、0.95代表95％、0.97代表97％或1.00代表100％，而·是乘法运算符的符号，其中将任何xa和y的非整数乘积从xa减去之前，将该乘积舍入为最接近的整数。
举例来说，本发明的多肽序列可以与SEQ ID NO:2的参考序列相同，即可以100％相同，或者与所述参考序列比较，该序列包括多至某一整数的氨基酸改变，以致同一性百分率小于100％同一性。这样的改变选自以下至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守取代和非保守取代)或插入，并且所述改变可以发生在所述参考多肽序列的氨基末端或羧基末端位置或那些末端位置间的任何地方，或者各自散布于参考序列的氨基酸中，或者以一个或多个连续的组散布于参考序列中。给定％同一性的氨基酸改变的数量如下确定将定义同一性百分率的整数除以100，然后乘以SEQ ID NO:2中氨基酸的总数，随后从所述SEQ ID NO:2中氨基酸的总数中减去该乘积，或na≤xa-(xa·y)其中na是氨基酸改变的数目，xa是SEQ ID NO:2中氨基酸的总数，y是例如0.70代表70％、0.80代表80％、0.85代表85％等等，而·是乘法运算符的符号，其中将任何xa和y的非整数乘积从xa减去之前，将该乘积舍入为最接近的整数。
“个体”，当在本文内用以指生物时，指多细胞真核生物，包括但不限于后生动物、哺乳动物、羊科动物(ovid)、牛科动物(bovid)、猿、灵长类动物和人类。
“分离的”指“通过人的劳动”从其自然状态改变，即如果它存在自然界中的话，则它已经从原始环境中改变或取出，或者改变并取出。例如，天然存在于活生物中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但从其天然状态共存的物质中分离出来的同样的多核苷酸或多肽是“分离的”，正如该术语在本文中使用的一样。此外，通过转化、遗传操作或通过任何其它重组方法引入生物中的多核苷酸或多肽是“分离的”，即使它仍然存在于所述生物中，而所述生物可以是活的或非活的。
“多核苷酸”一般指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，所述多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸可以是包括单链区和双链区的未修饰RNA或DNA或修饰过的RNA或DNA。
“变异体”指与参考多核苷酸或多肽不同、但保持了基本特性的多核苷酸或多肽。典型的多核苷酸变异体在核苷酸序列上与另一个多核苷酸即参考多核苷酸不同。所述变异体核苷酸序列的改变可能改变或不改变由所述参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下面讨论的，核苷酸变化可能导致由参考序列编码的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。典型的多肽变异体在氨基酸序列上与另一个多肽即参考多肽不同。一般说来，差异受到限制，以便参考多肽和变异体的序列在总体上紧密相似并且在许多区相同。变异体和参考多肽可以在氨基酸序列上由于以任何组合的一个或多个取代、添加、缺失而不同。取代或插入的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的残基。多核苷酸或多肽的变异体可以是天然出现的(如等位变异体)，或者可以是还未知的天然出现的变异体。可以通过诱变技术或直接合成来制造多核苷酸和多肽的非天然出现的变异体。
“疾病”指任何由细菌感染引起或与细菌感染有关的疾病，包括例如婴儿和儿童的中耳炎、年纪大的人的肺炎、鼻窦炎、医院感染和侵袭性疾病、伴有听力损失的慢性中耳炎、体液在中耳积累、听觉神经损伤、语言学习延迟、上呼吸道感染以及中耳的炎症。
实施例使用标准技术实施下面的实施例，所述技术除另外详细描述的外，对于本领域内的技术人员是熟知并且常规的。实施例是说明性的，而不限制本发明。实施例1来自粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617的BASB027基因的发现和确证性DNA测序首先在包含粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617(也称为菌株Mc2931)的未完成的基因组DNA序列的Incyte PathoSeq数据库中发现SEQ ID NO:1的BASB027基因。如SEQ ID NO:2所示，所述BASB027多核苷酸序列的翻译显示与脑膜炎奈瑟氏球菌的OMP85外膜蛋白有显著相似性(在817个氨基酸重叠区内有32％同一性)。
进一步用实验方法证实了BASB027基因的序列。为此目的，使用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒(Qiagen Gmbh)，从1010个粘膜炎莫拉氏菌细胞(菌株ATCC43617)提取基因组DNA，并使用引物E515515(5’-ACT-ATA-GGG-CAC-GCG-TG-3’)[SEQ ID NO:5]和E515528:(5’-CCT-GCG-TTT-GTT-TGA-TTG-AG-3’)[SEQ ID NO:6]，用1μg该材料进行聚合酶链式反应DNA扩增。在Biorobot9600(Qiagen Gmbh)仪器上纯化所述PCR产物，并用Big Dye CycleSequencing试剂盒(Perkin-Elmer)以及ABI377/PRISM DNA测序仪进行DNA测序。以丰余性(redundancy)为2，在两条链上进行DNA测序，并使用DNASTAR Lasergene软件包的SeqMan程序装配全长序列。得到的DNA序列和推导的多肽序列分别如SEQ ID NO:3和SEQID NO:4显示。四个核苷酸的差异将SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:1区别开来。使用DNASTAR Lasergene软件包的MEGALIGN程序，进行SEQ ID NO:1和3的多核苷酸序列的序列对比，该序列对比显示于图2；据计算，它们的同一性水平是99.8％。使用同样的程序，进行SEQ ID NO:2和4的多肽序列的序列对比，该序列对比显示于图3；据计算，它们的同一性水平是99.8％。实施例2在几种粘膜炎莫拉氏菌菌株中BASB027基因的变异性分析2A限制性片段长度分析(RFLP)如下所述从16个粘膜炎莫拉氏菌菌株(显示于表1)中提取基因组DNA。将粘膜炎莫拉氏菌在BHI琼脂平板上划线形成单菌落，并在37℃培养过夜。挑取三个或四个单菌落，接种到约1.5ml BHI(脑-心浸液)肉汤种子培养基，在摇床上于37℃下约300rpm培养过夜。用该种子培养物接种包含约150ml BHI肉汤的500ml锥形瓶，摇床上于37℃下约175rpm培养约12到16小时，产生用于分离DNA的细胞物质。在Sorvall GSA转子中以约2000×g在室温下离心15分钟，收集细胞。除去上清液并将细胞沉淀重悬浮于约5.0ml无菌水中。加入等体积裂解缓冲液(200mM NaCl,20mM EDTA,40mMTris-HCl,pH8.0,0.5％(重量/体积)SDS,0.5％(体积比)2-巯基乙醇以及250μg/ml蛋白酶K)并通过温和搅拌和研磨悬浮细胞。然后将所述细胞悬浮物在50℃培育约12小时以裂解细胞并释放染色体DNA。通过加入5.0ml饱和NaCl(约6.0M，在无菌水中)并在Sorvall SS34转子中以约5,500×g在室温下离心，沉淀蛋白质的物质。通过加入两倍体积的100％乙醇，从澄清过的上清液中沉淀染色体DNA。收集聚集的DNA，并在小体积的70％乙醇溶液中使用温和搅拌而洗涤。纯化后的染色体DNA重悬浮于无菌水中并在4℃下通过轻微摇摆过夜使其溶解/分散。在260nn下使用1.0O.D.单位约50μg/ml的消光系数，通过分光光度法测定溶解DNA的浓度。
随后使用MC-D15-BamF(5’-AAG GGC CCA ATT ACG CAGAGG GGA TCC ACA GGA CTA CAG CGA GTG ACC ATT GAAAGC TTA C-3’)[SEQ ID NO:7]和MC-D15-SalRC(AAG GGC CCAATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA AAA GAC ACT ACC AATCTG GAA CTG TAC CGT ATC G-3’)[SEQ ID NO:8]寡核苷酸，对该物质进行PCR扩增。然后使用限制酶(AciⅠ、HindⅢ、MaeⅢ、NlaⅢ、RsaⅠ、Sau3AⅠ)独立地水解对应的BASB027基因扩增子，并使用标准分子生物学程序，通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离限制产物，所述标准生物学程序如“Molecular Cloning,a LaboratoryManual，第二版，编辑Sambrook,Fritsch和Maniatis,Cold SpringHarbor press 1989”中描述。得到的电泳凝胶的照片显示于

图1。记录并组合每个菌株对应于6种限制酶的RFLP模式。然后确定具有同样RFLP模式组合的菌株的群。使用这种方法，将在该研究中测试的菌株分成4个基因组群(群1:Mc2906、Mc2908、Mc2912、Mc2926；群2:Mc2905、Mc2907、Mc2909、Mc2911、Mc2913、Mc2960、Mc2975；群3:Mc2910、Mc2912、Mc2956、Mc2969；群4:Mc2931)。这些数据支持这一观点在本研究中使用的粘膜炎莫拉氏菌群体在BASB027基因上显示有限的核苷酸序列多样性。表1在本研究中使用的粘膜炎莫拉氏菌菌株的特征
实施例3构造表达重组BASB027的质粒A:BASB027的克隆将BamHⅠ和SalⅠ限制位点分别工程化进正向互补扩增引物([SEQID NO:7])和反向互补扩增引物([SEQ ID NO:8])，使得能够定向克隆约2500bp的PCR产物进商业上可得的大肠杆菌表达质粒pQE30(QiaGen，抗氨苄青霉素)，以便成熟BASB027蛋白可以作为在N末端包含(His)6亲和层析标记的融合蛋白表达。使用基于硅胶的旋转柱(spin column)(QiaGen)，按照厂家的指导，从扩增反应物中纯化BASB027 PCR产物。为产生克隆所需的BamHⅠ和SalⅠ末端，将纯化的PCR产物顺序用BamHⅠ和SalⅠ限制酶如厂家(Life Technologies)所推荐的消化完全。第一次限制消化后，在第二次酶消化前，如上所述通过旋转柱纯化所述PCR产物以除去盐，然后在无菌水中洗脱。在与pQE30质粒连接前，再次用基于硅胶的旋转柱纯化所消化的DNA片段。B表达载体的产生为制备表达质粒pQE30以用于连接，将其相似地用BamHⅠ和SalⅠ消化完全，随后用小牛小肠磷酸酶(CIP，约0.02单位/皮摩尔5’末端，Life Technologies)根据厂家指导处理，以预防自连接。用比所制备的载体多约5倍摩尔的所述消化片段来进行所述连接反应。使用T4 DNA连接酶(约2.0单位/反应，Life Technologies)，用本领域内众所周知的方法，进行标准的约20μl的连接反应(约16℃，约16小时)。依照本领域内众所周知的方法，使用一等份连接物(约5μl)转化电感受态(electro-competent)的M15(pREP4)细胞。在约1.0ml LB肉汤中于37℃下约2-3小时的生长期后，将转化细胞接种到含卡那霉素(50μg/ml)和氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上。在选择培养基中包括这两种抗生素，以保证所有转化细胞都带有pREP4质粒(KnR)和pQE30-BASB027质粒(ApR)，其中pREP4质粒载有阻抑为pQE30上IPTG诱导型蛋白表达的表达所必需的lacⅠq基因。在37℃培养平板过夜约16小时。用无菌牙签挑取各个KnR/ApR菌落并用于“patch”接种新鲜LB KnR/ApR平板以及约1.0ml LB KnR/ApR肉汤培养基。Patch平板和肉汤培养物或者在标准培养箱中(平板)、或者在振荡水浴中37℃下培养过夜。
使用基于全细胞的PCR分析证实转化子包含所述BASB027 DNA插入片段。在此，将约1.0ml过夜的LB KnR/ApR肉汤培养物转移到1.5ml聚丙烯管，并在Beckmann微量离心机中离心(约3分钟，室温，约12,000×g)，收集细胞。将细胞沉淀悬浮于约200μl无菌水中，并用约10tl等分样品进行约50μl最终体积的PCR反应，所述PCR反应包含BASB027正向扩增引物和反向扩增引物。所述PCR反应成分的最终浓度基本如实施例2中指示的一样，但使用约5.0单位的Taq聚合酶。起始的95℃变性步骤增加到3分钟，以保证热破碎所述细菌细胞并释放质粒DNA。使用ABI9700型热循环仪和32个循环的三步热扩增方法，即95℃，45秒；55-58℃，45秒，72℃，1分钟，扩增来自裂解的转化子样品的BASB027 PCR片段。热扩增之后，通过琼脂糖凝胶电泳(Tris-乙酸-EDTA(TAE)缓冲液中的0.8％琼脂糖)分析约20μl等份的反应物。在凝胶电泳和溴化乙锭染色后，通过紫外线照射使DNA片段可见。与测试样品平行电泳一个DNA分子大小标准(1Kb梯(ladder),Life Technologies)，并用以估计PCR产物的大小。产生预期的约2500 bp PCR产物的转化子鉴定为包含BASB027表达构造物的菌株。随后分析包含表达质粒的菌株的重组BASB027的诱导型表达。C:PCR阳性转化子的表达分析对于上面鉴定的每个PCR阳性转化子，用来自patch平板的细胞接种含卡那霉素(50μg/ml)和氨苄青霉素(100μg/ml)的约5.0ml LB肉汤，并在37℃下振荡培养(约250rpm)过夜。将一等份的过夜种子培养物(约1.0ml)接种进含约25ml LB Kn/Ap肉汤的125ml锥形瓶，并在37℃下振荡培养(约250rpm)直到培养物的浊度达到O.D.600为0.5，即对数中期(通常约1.5-2.0小时)。此时将约一半的培养物(约12.5ml)转移到第二个125ml锥形瓶，并加入IPTG(无菌水配制的1.0M贮液，Sigma)达到1.0mM的终浓度，诱导重组BASB027蛋白的表达。继续在37℃下振荡培养IPTG诱导和未诱导的培养物约4小时。在诱导期后，取诱导和未诱导培养物的样品(约1.0ml)，并在一台微量离心机中室温下离心约3分钟，收集细胞。将各个细胞沉淀悬浮于约50μl无菌水中，然后与等体积的含2-巯基乙醇的2X LaemelliSDS-PAGE样品缓冲液混合，并置于沸水浴中约3分钟以变性蛋白。将等体积(约15μl)IPTG诱导的细胞和未诱导的细胞的粗裂解物一式二份地上样到12％Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(1mm厚的微型凝胶，Novex)。在常规条件下，使用标准SDS/Tris/甘氨酸电泳缓冲液(BioRad)，将诱导和未诱导的裂解物样品与预染的分子量标准参照物(SeeBlue,Novex)一起电泳。电泳后，一块胶用考马斯亮蓝R250(BioRad)染色，随后脱色以使新型BASB027 IPTG可诱导蛋白可见。使用BioRad Mini-ProteanⅡ印迹仪以及Towbin乙醇(20％)转移缓冲液，4℃下将第二块胶在PVDF膜(0.45微米孔径，Novex)上电印迹约2小时。依照本领域内众所周知的方法封闭膜并进行抗体培育。使用单克隆抗RGS(His)3抗体，然后是缀合了HRP的第二兔抗鼠抗体(QiaGen)，证实所述BASB027重组蛋白的表达和身份。使用或者ABT不溶性底物、或者配有Amersham ECL化学发光系统的Hyperfilm,使抗His抗体的反应模式可见。D序列证实为进一步证实所表达的IPTG可诱导的重组BASB027蛋白处于正确的可读框并且不是由于克隆制造物(artifact)(即移码突变)而产生的假的分子，测定了所克隆插入片段的DNA序列。使用常规的不对称PCR循环测序方法(ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing,Perkin-Elmer)，从一条链获得粘膜炎莫拉氏菌BASB027基因的DNA序列。使用未消化的表达质粒DNA(约0.5μg/rxn)作为模板，用合适的pQE30载体特异性测序引物和ORF特异性测序引物(约3.5皮摩尔/rxn)进行测序反应。除所述模板和测序引物外，每个测序反应(约20μl)中还包含四种不同的dNTP(即A、G、C和T)以及四种对应的ddNTP(即ddA、ddG、ddC和ddT)终止子核苷酸；同时每种终止子结合四种荧光染料之一，所述四种荧光染料是Joe、Tam、Rox或Fam。由于插入染料标记的ddNTP终止子，单链测序延伸产物沿着所述模板在随机位置终止。使用微量离心大小排阻层析柱(Princeton Genetics)纯化荧光染料标记的终止产物，在真空下干燥，悬浮于模板再悬浮缓冲液(Template Resuspension Buffer)(Perkin-Elmer)中以进行毛细管电泳，或悬浮于去离子的甲酰胺中以进行PAGE，在95℃变性约5分钟，并通过高分辨率毛细管电泳(ABI310自动化DNA测序仪，Perkin-Elmer)或高分辨率PAGE(ABI377自动化DNA测序仪)按厂家推荐进行分析。收集各个反应产生的DNA序列数据，并在PowerMac计算机上使用ABI序列分析软件(Perkin-Elmer)自动化分析相对荧光峰强度。在使用AutoAssembler软件(Perkin-Elmer)将各自自动化分析的DNA序列合并成共有单链序列“信息串”前，人工编辑所述DNA序列以求准确。测序确定了所述表达质粒以正确的可读框包含正确的序列。实施例4重组BASB027的产生细菌菌株用包含编码来自粘膜炎莫拉氏菌的BASB027的质粒(pQE30)的重组表达菌株大肠杆菌M15(pREP4)产生用于纯化重组蛋白的细胞物质。在含有50μg/ml卡那霉素(“Kn”)和100μg/ml氨苄青霉素(“Ap”)的LB琼脂平板上培养表达菌株，以保证pREP4 lacⅠq控制质粒和pQE30-BASB027表达构造物都得到保持。为在-80℃深低温保藏，在含有同样浓度抗生素的LB肉汤中繁殖所述菌株，然后与等体积含有30％(重量/体积)甘油的LB肉汤混合。培养基用于产生重组蛋白的发酵培养基包括含50μg/ml Kn和100μg/mlAp的2X YT肉汤(Difco)。以0.25ml/L在用于发酵罐的培养基中加入消泡剂(Antifoam 204,Sigma)。为诱导BASB027重组蛋白的表达，在发酵罐中加入IPTG(异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷)(1mM，终浓度)。发酵用0.3ml快速解冻的冻存培养物或来自选择性琼脂平板培养物的几个菌落接种含50ml工作体积的500-ml锥形种子瓶，然后在摇床中以150rpm(Innova2100,New Brunswick Scientific)于37±1℃下培养约12小时。然后用该种子培养物接种含2X YT肉汤和Kn以及Ap抗生素的5-L工作体积的发酵罐。发酵罐(Bioflo 3000,NewBrunswick Scientific)以37±1℃,0.2-0.4VVM空气喷射，Rushton叶轮250rpm操作。在瓶装种子培养物或发酵罐中都不控制pH。在发酵过程中，发酵罐内的pH处于6.5到7.3的范围内。当培养物达到对数生长中期(约0.7O.D.600单位)时，在发酵罐中加入IPTG(1.0M贮液，在无菌水中制备)。诱导细胞2-4小时，然后使用或者28RSHeraeus(Sepatech)或者RC5C超速离心机(Sorvall Instrument)通过离心收获细胞。将细胞糊贮存在-20℃直至进一步处理。纯化化学药品和材料生物技术级(biotechnology grade)或更高级别的咪唑、盐酸胍、Tris(羟甲基)和EDTA(乙二胺四乙酸)都得自Ameresco Chemical,Solon,Ohio。Triton X-100(叔辛基苯氧聚乙氧基乙醇)、磷酸二氢钠和尿素是试剂级或更高级别，得自Sigma Chemical Company,St.Louis,Missouri。冰乙酸和盐酸得自Mallincrodt Baker Inc.,Phillipsburg,NewJersey。甲醇得自Fisher Scientific,Fairlawn,New Jersey。PefablocSC(4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟)、完全蛋白酶抑制剂混合片剂和PMSF(苯甲基磺酰氟)得自Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,Indiana。苯丁抑制素、胃蛋白酶抑制剂A和E-64蛋白酶抑制剂得自Calbiochem,LaJolla,California。Dulbecco磷酸盐缓冲盐溶液(1X PBS)得自QualityBiological,Inc.,Gaithersburg,Maryland。Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(10XPBS)得自BioWhittaker,Walkersville,Maryland。无BSA的五组氨酸抗体得自QiaGen,Valencia,California。缀合过氧化物酶的亲和纯化的山羊抗鼠IgG得自Jackson Immuno Research,West Grove,Penn。AEC单一溶液(single solution)得自Zymed,South San Francisco,California。所有其它试剂都是试剂级或更高级别。
Ni-NTA Superflow树脂得自QiaGen Inc.,Valencia,California。预制的Tris-甘氨酸4-20％和10-20％聚丙烯酰胺凝胶、所有电泳缓冲液和溶液、SeeBlue预染标准、MultiMark多色标准和PVDF转移膜得自Novex,San Diego,Caljfornia。SDS-PAGE银染试剂盒得自DaiichiPure Chemicals Company Limited,Tokyo,Japan。考马斯染色液得自Bio-Rad Laboratories,Hercules,California。AcrodiscPF 0.2m针筒式滤器得自Pall Gelman Science,Ann Arbor,Michigan。GD/X25mm一次性针筒式滤器得自Whatman Inc.,Clifton,New Jersey。透析袋8,000MWCO得自BioDesign Inc.Od New York,Carmal New York。BCA蛋白测定试剂和蛇皮(Snake Skin)透析袋3,500MWCO得自PierceChemical Co.,Rockford,Illinois。提取方法在室温下解冻细胞糊30到60分钟。称取五到六克材料，置于50ml一次性离心管中。在其中加入5ml/克盐酸胍(Gu-HCl)缓冲液(6M盐酸胍，100mM磷酸二氢钠，10mM Tris和0.05％Triton X-100,pH8.0)。使用PRO300D proscientific匀浆器在3/4功率一分钟，重悬浮细胞糊。然后将所述提取混合物置于室温下温和搅拌60到90分钟。60到90分钟后，在15,800×g下离心所述提取混合物15分钟(SorvallRC5C离心机，11,500rpm)。倒出上清液(S1)并保存以进行进一步的纯化。保留沉淀(P1)以进行分析。BASB027结合镍-NTA树脂在S1中加入3-4ml Ni-NTA树脂。随后将其置于室温下，温和搅拌一小时。一小时后将S1/Ni-NTA装填进XK 16 Pharmacia柱。然后用1M Gu-HCl缓冲液(1M盐酸胍，100mM磷酸二氢钠，10mM Tris和0.05％Triton X-100,pH8.0)洗柱。然后用磷酸缓冲液(100mM磷酸二氢钠，10mM Tris和0.05％Triton X-100,pH6.3)洗柱。然后用250mM咪唑缓冲液(250mM咪唑，100mM磷酸钠，一元碱，10mM Tris和0.05％Triton X-100,pH5.9)从柱上洗脱蛋白。最终制剂对0.1％Triton X-100和1x PBS,pH7.4透析过夜并在其中三次更换溶液，去除残余的盐酸胍和咪唑，以配制BASB027。鉴定所纯化蛋白的特征并如下所述用于产生抗体。生化特征鉴定SDS-PAGE分析和蛋白质印迹分析如以前所述(Thebaine等1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350-4354)，在4-20％聚丙烯酰胺凝胶中分离纯化的重组蛋白，并在100V下1小时将其电泳转移到PVDF膜上。然后用含5％脱脂粉乳的25ml Dulbecco磷酸缓冲盐溶液预处理所述PVDF膜。使用该预处理缓冲液进行所有随后的培育。
室温下用免疫前血清或兔抗His免疫血清的1∶500稀释物25ml与PVDF膜一起培育1小时。然后用洗涤缓冲液(20mM Tris缓冲液，pH7.5，含有150mM氯化钠和0.05％Tween-20)洗PVDF膜两次。室温下用过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories,West Grove,PA)的1∶5000稀释物25ml与PVDF膜一起培育30分钟。然后用洗涤缓冲液洗PVDF膜4次，然后用Zymed(SanFrancisco,CA)提供的3-氨基-9-乙基咔唑和过氧化脲各显色10分钟。
SDS-PAGE的结果(图4)显示有一种约95kDa的蛋白，该蛋白在SDS-PAGE的蛋白质印迹(图5)中与抗-RGS(His)抗体反应。蛋白测序在具有1090型LC的Hewlett-Packard G1000A型测序仪和具有1100型LC的Hewlett-Packard241型测序仪上，使用已经很好建立的化学方法，进行所纯化蛋白的氨基末端氨基酸测序，以证实产生正确的重组蛋白。实施例5产生针对重组BASB027的抗血清通过用纯化的重组BASB027蛋白接种两只兔，产生对抗BASB027蛋白的多价抗血清。给予每只动物总共接收三次肌内(i.m.)免疫接种，每次注射约20μg BASB027蛋白(开始用完全氟氏佐剂，随后用不完全氟氏佐剂)，间隔约21天。在第一次免疫前(“免疫前取血(pre-bleed)”)和第35和57天从动物取血。
使用纯化的重组BASB027蛋白(0.5μg/孔)，通过ELISA测定抗BASB027蛋白效价。效价定义为等于或比按下面公式计算出的大0.1的最高稀释度两个抗血清测试样品的平均OD-两个缓冲液测试样品的平均OD。如上面的实施例4所述，用所述抗血清在蛋白质印迹中作为第一抗体鉴定所述蛋白。蛋白质印迹显示在免疫后动物的血清中存在抗BASB027抗体(图6)。实施例6免疫学特征鉴定蛋白质印迹分析35℃下5％CO2中，在巧克力琼脂平板上培养几个粘膜炎莫拉氏菌菌株48小时。使用几个菌落接种250ml瓶中的25ml MullerHinton肉汤。将培养物培养过夜并通过离心收集。然后通过悬浮30μg细胞于150μl PAGE样品缓冲液(360mM Tris缓冲液，pH8.8，含4％十二烷基硫酸钠和20％甘油)并在100℃培育所述悬浮物5分钟，溶解细胞。如以前所述(Thebaine等1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350-4354)，在4-20％聚丙烯酰胺凝胶中分离所溶解的细胞，并在100V下1小时，将分离的蛋白电泳转移到PVDF膜上。然后用含5％脱脂乳粉的25ml Dulbecco磷酸缓冲盐溶液预处理所述PVDF膜。使用该预处理缓冲液进行所有随后的培育。
室温下用免疫前血清或兔免疫血清的1∶500稀释物25ml培育PVDF膜1小时。然后用洗涤缓冲液(20mM Tris缓冲液，pH7.5，含有150mM氯化钠和0.05％Tween-20)洗PVDF膜两次。室温下用过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)的1∶5000稀释物25ml培育PVDF膜30分钟。然后用洗涤缓冲液洗PVDF膜4次，并用Zymed(San Francisco,CA)提供的3-氨基-9-乙基咔唑和过氧化脲各显色10分钟。
在所有莫拉氏菌菌株中检测到一种与所述抗血清反应的约95kDa(对应于BASB027的预期分子量)的蛋白(图7)。杀菌活性检测抗BASB027抗体的补体介导的细胞毒活性，以确定BASB027多肽的疫苗潜力(potential)。如上制备抗血清。使用Zollinger等描述的“血清杀菌测试”(对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫应答，在Manual of Clinical Laboratory Immunology，第三版，第347-349页中)，检测免疫前血清和抗BASB027血清在介导补体杀死粘膜炎莫拉氏菌中的活性，但使用粘膜炎莫拉氏菌菌株或品种的细胞，而不是脑膜炎奈瑟氏球菌细胞。
兔抗血清的杀菌效价(杀死50％同源菌株)是＜1∶8(免疫前血清)和＞1∶128(免疫血清)。实施例7在人类恢复期血清中存在针对BASB027的抗体如上面的实施例4和6所述进行纯化的重组BASB027的蛋白质印迹分析，但使用来自受到粘膜炎莫拉氏菌感染的儿童的人类血清库作为第一抗体制备物。结果显示来自天然感染个体的抗血清与所纯化的重组蛋白反应。实施例8BASB027肽、抗血清的产生以及它们的反应性使用众所周知的方法，在实验室中产生两个短氨基酸BASB027特异性肽，所述肽具有CYAKPLNKKQNDQTDT(SEQ ID NO:9)和YLTARRGQQTTLGEVVC(SEQ ID NO:10)的序列。用这些偶联到KLH的肽在12周龄无特定病原体的新西兰雌性兔中产生抗体。兔以约3周间隔接受4次注射，每次注射在完全氟氏佐剂(第一次注射)或不完全氟氏佐剂(第二、第三、第四次注射)中的200μg肽-KLH。在第一次免疫前和第四次注射后一个月从动物取血。
使用游离肽，通过ELISA测定抗肽的中点效价。第四次免疫后一个月，抗肽的中点效价大于15000。如实施例4和6中所述，使用抗肽抗体作为第一抗体，制备纯化的重组BASB027的蛋白质印迹。结果显示于图8。保藏材料包含粘膜炎莫拉氏菌Caltin菌株的保藏物已经于1997年6月21日保藏在美国典型培养物保藏中心(本文称为“ATCC”)，保藏号为43617。所述保藏物被描述为卡他布兰汉氏菌(Frosch和Kolle)并且是冻干制品。1.5-2.9kb插入片段文库构建自从一位患有慢性支气管炎的矿工的经气管抽吸物中获得的粘膜炎莫拉氏菌分离物。该保藏物在Antimicrob.Agents Chemother.21:506-508(1982)中描述。
粘膜炎莫拉氏菌菌株保藏物在本文内称为“所述保藏菌株”或“所述保藏菌株的DNA”。
所述保藏菌株包含全长的BASB027基因。
包含插入pQE30内的粘膜炎莫拉氏菌DNA的载体pMC-D15的保藏物已经于1999年2月12日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号为207105。
万一与本文的任何描述有冲突，则调制(controlling)包含在所述保藏菌株/克隆内的多核苷酸的序列以及其编码的任何多肽的氨基酸序列。
所述保藏菌株已经根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款保藏。一旦授予专利后，则所述保藏菌株将是不可撤消地并且无限制或无条件地发放给公众。提供所述保藏菌株仅方便本领域内的技术人员，而不是承认保藏是实现所需的，如根据35U.S.C.§112所要求的。
序列表<110>SmithKline Beecham Biologicals<120>新型化合物<130>BM45324<160>10<170>FastSEQ for Windows版本3.0<210>1<211>2442<212>DNA<213>细菌<400>1atgcgtaatt catattttaa aggttttcag gtcagtgcaa tgacaatggc tgtcatgatg 60gtaatgtcaa ctcatgcaca agcggcggat tttatggcaa atgacattac catcacagga 120ctacagcgag tgaccattga aagcttacaa agcgtgctgc cgtttcgctt gggtcaagtg 180gtgagcgaaa accagttggc tgatggtgtc aaagcacttt atgcaacagg caatttttca 240gatgtgcaag tctatcatca agaagggcgt atcatctatc aggtaaccga aaggccgtta 300atcgctgaga ttaattttga gggcaatcgc ttaattccaa aagaaggtct acaagaaggg 360ctaaaaaatg ctggcttagc tgtgggtcaa ccactaaaac aagccacagt acagatgatc 420gaaaccgagc ttaccaatca atatatatca caaggctatt ataataccga aattactgtc 480aaacagacga tgcttgatgg taatcgtgtt aagcttgata tgacctttgc tgaaggtaaa 540cctgcacggg tggttgatat taatatcatt ggcaatcagc attttagcga tgcagatttg 600attgatgtgc ttgcgattaa ggataataaa atcaatccac tgtctaaagc tgaccgttat 660actcaagaaa agctggtgac cagtttagag aatttgcgtg ctaaatatct caatgcaggg 720tttgtgcgtt ttgagattaa agatgctaag 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ID NO:2由SEQ ID NO:1的多核苷酸序列推导出的粘膜炎莫拉氏菌BASB027多肽序列MRNSYFKGFQVSAMTMAVMMVMSTHAQAADFMANDITITGLQRVTIESLQSVLPFRLGQVVSENQLADGVKALYATGNFSDVQVYHQEGRIIYQVTERPLIAEINFEGNRLIPKEGLQEGLKNAGLAVGQPLKQATVQMIETELTNQYISQGYYNTEITVKQTMLDGNRVKLDMTFAEGKPARVVDINIIGNQHFSDADLIDVLAIKDNKINPLSKADRYTQEKLVTSLENLRAKYLNAGFVRFEIKDAKLNINEDKNRIFVEISLHEGEQYRFGQTQFLGNLTYTQAELEALLKFKAEEGFSQAMLEQTTNNISTKFGDDGYYYAQIRPVTRINDESRTVDVEYYIDPVHPVYVRRINFTGNFKTQDEVLRREMRQLEGALASNQKIQLSRARLMRTGFFKHVTVDTRPVPNSPDQVDVNFVVEEQPSGSSTIAAGYSQSGGVTFQFDVSQNNFMGTGKHVNASFSRSETREVYSLGMTNPYFTVNGVSQSLSGYYRKTKYDNKNISNYVLDSYGGSLSYGYPIDENQRISFGLNADNTKLHGGRFMGISNVKQLMADGGKIQVDNNGIPDFKHDYTTYNAILGWNYSSLDRPVFPTQGMSHSVDLTVGFGDKTHQKVVYQGNIYRPFIKKSVLRGYAKLGYGNNLPFYENFYAGGYGSVRGYDQSSLGPRSQAYLTARRGQQTTLGEVVGGNALATFGSELILPLPFKGDWIDQVRPVIFIEGGQVFDTTGMDKQTIDLTQFKDPQATAEQNAKAANRPLLTQDKQLRYSAGVGATWYTPIGPLSISYAKPLNKKQNDQTDTVQFQIGSVFSEQ ID NO:3来自菌株ATCC43617的粘膜炎莫拉氏菌BASB027多核苷酸序列ATGCGTAATTCATATTTTAAAGGTTTTCAGGTCAGTGCAATGACAATGGCTGTCATGATGGTAATGTCAACTCATGCACAAGCGGCGGATTTTATGGCAAATGACATTACCATCACAGGACTACAGCGAGTGACCATTGAAAGCTTACAAAGCGTGCTGCCGTTTCGCTTGGGTCAAGTGGTGAGCGAAAACCAGTTGGCTGATGGTGTCAAAGCACTTTATGCAACAGGCAATTTTTCAGATGTGCAAGTCTATCATCAAGAAGGGCGTATCATCTATCAGGTAACCGAAAGGCCGTTAATCGCTGAGATTAATTTTGAGGGCAATCGCTTAATTCCAAAAGAAGGTCTACAAGAAGGGCTAAAAAATGCTGGCTTAGCTGTGGGTCAACCACTAAAACAAGCCACAGTACAGATGATCGAAACCGAGCTTACCAATCAATATATATCACAAGGCTATTATAATACCGAAATTACTGTCAAACAGACGATGCTTGATGGTAATCGTGTTAAGCTTGATATGACCTTTGCTGAAGGTAAACCTGCACGGGTGGTTGATATTAATATCATTGGCAATCAGCATTTTAGCGATGCAGATTTGATTGATGTGCTTGCGATTAAGGATAATAAAATCAATCCACTGTCTAAAGCTGACCGTTATACTCAAGAAAAGCTGGTGACCAGTTTAGAGAATTTGCGTGCTAAATATCTCAATGCAGGGTTTGTGCGTTTTGAGATTAAAGATGCTAAGCTTAATATTAATGAAGATAAAAACCGTATCTTTGTTGAGATTTCATTGCATGAAGGTGAGCAATATCGCTTTGGACAGACACAGTTTTTGGGTAATTTAACTTATACTCAAGCAGAACTTGAGGCACTGCTTAAATTCAAAGCAGAAGAAGGGTTTTCACAAGCCATGCTTGAGCAAACAACAAACAATATCAGTACCAAATTTGGTGACGATGGCTATTATTATGCTCAAATCCGTCCTGTAACACGCATTAATGATGAAAGTCGTACGGTTGATGTGGAATATTATATTGACCCTGTACACCCTGTCTATGTACGCCGTATTAATTTTACAGGTAACTTTAAGACCCAAGATGAAGTACTCCGTCGTGAGATGCGACAACTTGAAGGTGCGTTGGCATCTAATCAAAAAATCCAGCTGTCTCGTGCACGCTTGATGCGGACTGGGTTTTTTAAACATGTTACCGTTGATACTCGTCCAGTACCCAACTCACCTGATCAGGTTGATGTAAATTTTGTGGTTGAAGAACAACCTTCAGGATCATCAACCATCGCAGCAGGCTACTCTCAAAGTGGTGGTGTAACTTTTCAATTTGATGTTTCTCAAAATAACTTTATGGGTACAGGTAAGCACGTCAATGCTTCGTTTTCTCGCTCTGAGACCCGTGAGGTGTATAGTTTGGGTATGACCAACCCATACTTTACCGTAAATGGCGTCTCGCAAAGCTTGAGTGGCTACTATCGTAAAACCAAGTATGATAACAAGAACATTAGTAATTATGTACTTGATTCTTATGGTGGCTCATTAAGCTATGGATATCCAATTGATGAAAATCAACGCATAAGCTTTGGTCTGAATGCTGACAATACCAAGCTTCATGGCGGTCGTTTTATGGGCATTAGTAATGTCAAGCAGCTGATGGCAGATGGTGGCAAAATTCAAGTGGATAATAATGGCATTCCTGATTTTAAGCATGATTACACAACCTACAATGCCATTTTGGGGTGGAATTATTCAAGTCTAGATCGCCCTGTATTTCCAACCCAAGGCATGAGTCATTCTGTAGATTTGACGGTTGGTTTTGGTGATAAAACTCATCAAAAAGTGGTTTATCAAGGCAATATCTATCGCCCATTTATCAAAAAATCAGTCTTGCGTGGATACGCCAAGTTAGGCTATGGCAATAATTTACCATTTTATGAAAATTTCTATGCAGGCGGCTATGGTTCGGTTCGTGGCTATGATCAATCCTCTTTGGGTCCACGCTCACAAGCCTATTTGACAGCTCGTCGTGGTCAACAAACCACACTAGGAGAGGTTGTTGGTGGTAATGCTTTGGCAACTTTCGGCAGTGAGCTGATTTTACCTTTGCCATTTAAAGGTGATTGGATAGATCAGGTGCGTCCAGTGATATTCATTGAGGGCGGTCAGGTTTTTGATACAACAGGTATGGATAAACAAACCATTGATTTAACCCAATTTAAAGACCCACAAGCAACAGCTGAACAAAATGCAAAAGCAGCCAATCGCCCGCTACTAACCCAAGATAAACAGTTGCGTTATAGTGCTGGTGTTGGTGCAACTTGGTATACGCCCATTGGTCCTTTATCTATTAGCTATGCCAAGCCATTGAATAAAAAACAAAATGATCAGACCGATACGGTACAGTTCCAGATTGGTAGTGTCTTTTAASEQ ID NO:4由SEQ ID NO:3的多核苷酸序列推导出的粘膜炎莫拉氏菌BASB027多肽序列MRNSYFKGFQVSAMTMAVMMVMSTHAQAADFMANDITITGLQRVTIESLQSVLPFRLGQVVSENQLADGVKALYATGNFSDVQVYHQEGRIIYQVTERPLIAEINFEGNRLIPKEGLQEGLKNAGLAVGQPLKQATVQMIETELTNQYISQGYYNTEITVKQTMLDGNRVKLDMTFAEGKPARVVDINIIGNQHFSDADLIDVLAIKDNKINPLSKADRYTQEKLVTSLENLRAKYLNAGFVRFEIKDAKLNINEDKNRIFVEISLHEGEQYRFGQTQFLGNLTYTQAELEALLKFKAEEGFSQAMLEQTTNNISTKFGDDGYYYAQIRPVTRINDESRTVDVEYYIDPVHPVYVRRINFTGNFKTQDEVLRREMRQLEGALASNQKIQLSRARLMRTGFFKHVTVDTRPVPNSPDQVDVNFVVEEQPSGSSTIAAGYSQSGGVTFQFDVSQNNFMGTGKIVNASFSRSETREVYSLGMTNPYFTVNGVSQSLSGYYRKTKYDNKNISNYVLDSYGGSLSYGYPIDENQRISFGLNADNTKLHGGRFMGISNVKQLMADGGKIQVDNNGIPDFKHDYTTYNAILGWNYSSLDRPVFPTQGMSHSVDLTVGFGDKTHQKVVYQGNIYRPFIKKSVLRGYAKLGYGNNLPFYENFYAGGYGSVRGYDQSSLGPRSQAYLTARRGQQTTLGEVVGGNALATFGSELILPLPFKGDWIDQVRPVIFIEGGOVFDTTGMDKQTIDLTQFKDPQATAEQNAKAANRPLLTQDKQLRYSAGVGATWYTPIGPLSISYAKPLNKKQNDQTDTVQFQIGSVFSEQ ID NO:5ACT ATA GGG CAC GCG TGSEQ ID NO:6CCT GCG TTT GTT TGA TTG AGSEQ ID NO:7AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC ACA GGA CTA CAG CGA GTGACC ATT GAA AGC TTA CSEQ ID NO:8AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA AAA GAC ACT ACCAAT CTG GAA CTG TAC CGT ATC GSEQ ID NO:9CYAKPLNKKQNDQTDTSEQ ID NO:10YLTARRGQQTTLGEWC
权利要求
1．分离的多肽，所述多肽包含的一段氨基酸序列与由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4选出的氨基酸序列有至少85％同一性。
2．如权利要求1所要求保护的分离的多肽，其中所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4选出的氨基酸序列有至少95％同一性。
3．如权利要求1所要求保护的多肽，所述多肽包含由以下选出的氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4。
4．SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的分离的多肽。
5．如权利要求1到4中任一项所要求保护的多肽的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段的免疫原性与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4的多肽基本相同。
6．分离的多核苷酸或与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列，所述分离的多核苷酸包含的一段核苷酸序列编码分别在SEQ IDNO:2、4的全长上与SEQ ID NO:2、4的氨基酸序列有至少85％同一性的多肽。
7．分离的多核苷酸或与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列，所述分离的多核苷酸包含的一段核苷酸序列与编码SEQ ID NO:2、4的核苷酸序列在整个编码区上有至少85％同一性。
8．分离的多核苷酸或与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列，所述分离的多核苷酸包含的一段核苷酸序列分别在SEQ ID NO:1、3的全长上与SEQ ID NO:1、3的核苷酸序列有至少85％同一性。
9．如权利要求6到8中任一项所要求保护的分离的多核苷酸，其中所述与SEQ ID NO:1、3的同一性至少为95％。
10．分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4的多肽的核苷酸序列。
11．包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3的多核苷酸的分离的多核苷酸。
12．分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含的一段核苷酸序列编码通过在严格杂交条件下，使用具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3的序列或它们的片段的标记探针筛选合适文库可获得的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4的多肽。
13．表达载体或重组的活微生物，所述表达载体或重组的活微生物包含依照权利要求6-12中任一项的分离的多核苷酸。
14．宿主细胞或所述宿主细胞表达分离的多肽的亚细胞部分或膜，所述宿主细胞包含权利要求13的表达载体，所述分离的多肽包含与由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4选出的氨基酸序列有至少85％同一性的氨基酸序列。
15．产生多肽的方法，所述多肽包含与由SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4选出的氨基酸序列有至少85％同一性的氨基酸序列，所述方法包括在足以产生所述多肽的条件下培养权利要求14的宿主细胞，然后从培养基中回收所述多肽。
16．表达权利要求6-12中任一项的多核苷酸的方法，包括用包含所述多核苷酸中至少一种的表达载体转化宿主细胞，然后在足以表达所述多核苷酸中任何一种的条件下培养所述宿主细胞。
17．疫苗组合物，包含有效量的权利要求1到5中任一项的多肽以及一种药学上可接受的载体。
18．疫苗组合物，包含有效量的权利要求6到12中任一项的多核苷酸以及一种药学上有效的载体。
19．依照权利要求17或18中任一项的疫苗组合物，其中所述组合物包含至少一种其它粘膜炎莫拉氏菌抗原。
20．对如权利要求1到5中任一项要求保护的多肽或免疫片段具有免疫特异性的抗体。
21．诊断粘膜炎莫拉氏菌感染的方法，包括鉴定来自怀疑受到这样一种感染的动物的生物学样品中如权利要求1-5中任一项所要求保护的多肽的存在，或对所述多肽具有免疫特异性的抗体的存在。
22．组合物在制备药物中的用途，所述组合物包含免疫有效量的如权利要求1-5中任一项所要求保护的多肽，所述药物用于在动物中产生免疫应答。
23．组合物在制备药物中的用途，所述组合物包含免疫有效量的如权利要求6-12中任一项所要求保护的多核苷酸，所述药物用于在动物中产生免疫应答。
24．可用于治疗患有粘膜炎莫拉氏菌疾病的人类的治疗组合物，所述组合物包含至少一种针对权利要求1-5的多肽的抗体以及一种合适的药学载体。
全文摘要
本发明提供了BASB027多肽和编码BASB027多肽的多核苷酸,以及通过重组技术产生这样的多肽的方法。还提供了诊断、预防和治疗应用。
文档编号A61P31/04GK1311820SQ99809199
公开日2001年9月5日 申请日期1999年5月31日 优先权日1998年6月3日
发明者C·维纳尔斯怀德巴索尔斯 申请人:史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司