专利名称：气丝菌素类似物、它们的制备和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有抗真菌活性的环状化合物(以下称之为气丝菌素)、气丝菌素在医疗中的用途、含有气丝菌素的药物组合物以及用于制备气丝菌素的方法和中间体。
吡咯抗真菌剂目前广泛用于系统性真菌病的治疗。不过，由于吡咯抗真菌剂的真菌抑制作用，长期预防性使用导致吡咯耐受性念珠菌的产生。因此，杀真菌剂对严重的系统性真菌病的治疗来说是特别重要的。此外，目前可得到的抗真菌剂对镰孢霉无效，后者是在免疫减弱患者中出现的病原体之一。两性霉素β是目前临床使用的非常有效的杀真菌剂，但是它的治疗指数(有效剂量对中毒剂量)是相当窄的。某些环状化合物，例如LY 303366(EP 736 541)、WF 11243(EP 584 360)，已知通过抑制β-1,3-葡聚糖合酶，显示杀真菌活性。不过，它们在抗真菌谱和/或安全性上仍具有一些缺点。因此，迫切需要研制新的杀真菌剂，它们应具有更好的安全性和对抗主要的系统性病原体的功效，包括新出现的病原体，如镰孢霉。
确切地说，本发明涉及新颖的由式(Ⅰ)代表的气丝菌素， 其中R1是胍基、三-低级烷基铵、-N(R10)-R11，-N(R15)-CO-R14,-N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13,-NHCOCH(R13)-NHCOCH(NH2)-R13， R10和R11各自独立地选自氢；被一或两个氨基取代的杂芳基；可选被一或多个、优选为一或两个氨基、氨基-低级烷基、氰基、胍基、含氮杂环或含有氨基、脒基或胍基的苯基取代的低级烷基；R13是从天然或非天然氨基酸衍生的残基；R14是被一或多个、优选为一或两个氨基、胍基、含氮杂环或含有氨基、脒基或胍基的苯基取代的低级烷基；R15是氢、可选被一或多个、优选为一或两个氨基、胍基、含氮杂环或含有氨基、脒基或胍基的苯基取代的低级烷基；R2是氢、羟基磺酰、低级烷基或低级烯基，其中低级烷基和低级烯基可以任选被酰基、氨基甲酰基、氨基、单-低级烷基氨基或二-低级烷基氨基取代；R3是氢、羟基、硝基、氨基、酰氨基、(低级烷基氨基甲酰基)氨基、羧基、低级烷氧基、低级烷氧基羰基、低级烷基、低级烯基或低级炔基，其中低级烷基、低级烯基和低级炔基可以任选被羟基、氨基、单-低级烷基氨基、二-低级烷基氨基、低级烷氧基羰基或氨基甲酰基取代；R4是可以任选被低级烷基、芳基、环烷基或氟原子取代的烷基、烯基、烷氧基或烯氧基；R5是-CONH2、-CN或-CH2NH2；X是单键，或可选含有一或多个杂原子和/或被卤原子或低级烷基取代的芳基、联苯基或三联苯基；
Y是单键、-CH2-、-CH(低级烷基)-、-CONH-或-CON(低级烷基)-；Z是-O-、-NH-或-N(低级烷基)-；m是0至4的整数；且n是2至5的整数；其前提条件是，若-Y-(CH2)m-X-R4是未取代的烷基或芳烷基，则同时R1不是氨基，R2和R3不是氢，R5不是-CONH2，Z不是-O-或-NH-；及其药学上可接受的盐。
本发明也涉及包含式(Ⅰ)气丝菌素和药学上可接受的载体的药物组合物。此外，本发明涉及该气丝菌素在药物制备中的用途，以及用于制备式(Ⅰ)气丝菌素的方法和中间体。另外，本发明涉及预防和/或治疗由病原性微生物导致的传染病的方法。
本说明书中，术语“低级”用于指由1至6个、优选为1至4个碳原子组成的基团，另有指定除外。
术语“烷基”指一至二十个碳原子、优选为一至十六个碳原子的支链或直链一价饱和脂族烃基。术语“低级烷基”指一至六个碳原子、优选为一至四个碳原子的支链或直链一价烷基原子团。该术语进而例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等。
术语“烯基”指在亚烷基链中含有一或多条双键的烷基。
术语“炔基”指在亚烷基链中含有一或多条叁键的烷基。
术语“烷氧基”指基团-O-R’，其中R’是烷基。术语“低级烷氧基”指基团-O-R’，其中R’是低级烷基。
术语“烯氧基”指在亚烷基链中含有一或多条双键的烷氧基。
术语“酰基”指基团-C(O)-R’，其中R’是低级烷基。术语“酰氨基”指连接到亚氨基原子团、即-NH-上的酰基。
术语“单-低级烷基氨基”指连接到亚氨基原子团、即-NH-上的一个低级烷基。术语“二-低级烷基氨基”指连接到氮原子上的两个独立选择的低级烷基，即-N(-低级烷基)-低级烷基。术语“三-低级烷基铵”指含有三个独立选择的C1-3-烷基的三-低级烷基铵。
术语“低级烷氧基羰基”指基团-C(O)OR’，其中R’是低级烷基。
术语“(低级烷基氨基甲酰基)氨基”指基团-NHCONH-R’，其中R’是低级烷基。
术语“卤原子”指氟、氯、溴和碘。
术语“芳基”指一价碳环芳族原子团(例如苯基)，或两个稠合的碳环(例如萘基)，可选独立地被低级烷基、三氟甲基、卤素等单、二或三取代。
术语“含氮杂环”指含有至少一个氮原子的饱和、不饱和或芳族一价环状原子团。
术语“杂芳基”指含有至少一个杂原子即氮、硫或氧的芳族一价单-或多-碳环原子团。具有一或多个氮原子的杂芳基残基的例子是吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、三嗪基和咪唑基。
术语“环烷基”指三至十个碳原子、优选为三至六个碳原子的一价碳环原子团。
术语“药学上可接受的盐”包含式(Ⅰ)气丝菌素与无机或有机酸的盐，酸例如氢氯酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、甲酸、马来酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、酒石酸、甲磺酸、对甲苯磺酸等，它们对活的生物体是无毒的。
下面详细解释上式(Ⅰ)中的各取代基。
R1的定义中，术语“三-低级烷基铵”优选指三甲铵和三乙铵。
R10和R11的定义中，术语“杂芳基”优选指2-吡啶基、2-吡嗪基、2-嘧啶基、2-哒嗪基、2-三嗪基、2-咪唑基等，更优选为2-吡啶基和2-咪唑基，最优选为2-吡啶基。术语“低级烷基”优选指由1至6个碳原子组成的烷基链，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、新戊基、叔戊基和正己基；优选为甲基、乙基、正丙基或正丁基，最优选为甲基、乙基或正丙基。术语“含氮杂环”优选指吗啉代、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、吡咯烷基、哌啶基、咪唑烷基、吡唑烷基、咪唑基、吡唑基、三唑基、吡啶基、吡嗪基等，更优选为哌嗪基和吗啉代，最优选为哌嗪基。术语“含有氨基、脒基或胍基的苯基”优选指4-氨基苯基、4-脒基苯基、4-胍基苯基等。
R13的定义中，术语“从天然或非天然氨基酸衍生的残基”优选指氢，或可以任选被羟基、氨基、胍基、甲硫基、巯基、氨基甲酰基、羧基、苯基、羟基苯基、氨基苯基、咪唑基或吲哚基等取代的低级烷基。R13的优选实施方式是被氨基或胍基取代的低级烷基，例如氨基甲基、2-氨基乙基、3-氨基丙基、4-氨基丁基、4-胍基丁基。
R14的定义中，术语“低级烷基”含义与R10和R11中所定义的相同。优选指由2至5个碳原子组成的烷基链，例如乙基、丙基、丁基和戊基。术语“含氮杂环”含义与R10和R11中所定义的相同。优选指吗啉代、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、吡咯烷基、哌啶基、咪唑烷基、吡唑烷基、咪唑基、吡唑基、三唑基、吡啶基、吡嗪基等，更优选为哌嗪基和吗啉代。术语“含有氨基、脒基或胍基的苯基”优选指4-氨基苯基、4-脒基苯基、4-胍基苯基等。R14的优选实施方式是2-氨基乙基、3-氨基丙基、4-氨基丁基、2-胍基乙基、3-胍基丙基、2-哌嗪子基乙基、2-吗啉代乙基、4-氨基苯乙基等。
R15的定义中，术语“低级烷基”、“含氮杂环”和“含有氨基、脒基或胍基的苯基”与R14所定义的相同。R15的优选实施方式是2-氨基乙基、3-氨基丙基、4-氨基丁基、2-胍基乙基、3-胍基丙基、2-哌嗪子基乙基、2-吗啉代乙基、4-氨基苯乙基等。
-N(R10)-R11[其中R10和R11定义同上]的优选实施方式是氨基、5-氨基吡啶-2-基氨基、甲氨基、乙氨基、丙氨基、(2-氨基乙基)氨基、(3-氨基丙基)氨基、[3-[(3-氨基丙基)氨基]丙基]氨基、(2-哌嗪基乙基)氨基、(2-吗啉代乙基)氨基、N,N-二甲氨基、N,N-二乙氨基、N,N-二丙氨基、N,N-乙基甲氨基、N,N-双(2-氨基乙基)氨基、N,N-双(3-氨基丙基)氨基、N,N-双(4-氨基丁基)氨基、N,N-双(2-哌嗪基乙基)氨基、N,N-双(2-吗啉代乙基)氨基、N,N-双(2-胍基乙基)氨基、N,N-双(3-胍基丙基)氨基、N,N-双(2-吡啶-2-基乙基)氨基、N,N-双(咪唑-2-基甲基)氨基、N-(2-氨基乙基)-N-(3-氨基丙基)氨基、N-(3-氨基丙基)-N-(2-哌嗪基乙基)氨基、N-(3-氨基丙基)-N-(2-吡啶-2-基乙基)氨基等。更优选的实施方式是氨基、5-氨基吡啶-2-基氨基、N,N-二甲氨基、(2-氨基乙基)氨基、(3-氨基丙基)氨基、[3-[(3-氨基丙基)氨基]丙基]氨基、(2-哌嗪基乙基)氨基、N,N-双(2-氨基乙基)氨基、N,N-双(3-氨基丙基)氨基、N,N-双(4-氨基丁基)氨基、N,N-双(2-哌嗪基乙基)氨基、N,N-双(2-胍基乙基)氨基、N,N-双(3-胍基丙基)氨基、N-(2-氨基乙基)-N-(3-氨基丙基)氨基、N-(3-氨基丙基)-N-(2-哌嗪基乙基)氨基等。最优选的实施方式是(3-氨基丙基)氨基、N,N-双(2-氨基乙基)氨基、N,N-双(3-氨基丙基)氨基和N,N-双(2-哌嗪基乙基)氨基。
-N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13的定义中，基团-CO-CH[N(R10)R11]-R13[其中R10和R11是氢；R13是从天然或非天然氨基酸衍生的残基]优选指肌氨酰、甘氨酰、丙氨酰、鸟氨酰、赖氨酰、缬氨酰、亮氨酰、异亮氨酰、色氨酰、苯丙氨酰、甲硫氨酰、丝氨酰、酪氨酰、苏氨酰、半胱氨酰、天冬酰胺酰、谷氨酰胺酰、天冬氨酰、谷氨酰、精氨酰、组氨酰、2,3-二氨基丙酰、2,4-二氨基丁酰、2-氨基-4-三唑-1-基丁酰等。
-N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13的优选实施方式是从碱性氨基酸衍生的酰氨基。这样的酰氨基的例子是鸟氨酰氨基、赖氨酰氨基、精氨酰氨基、组氨酰氨基、3-氨基脯氨酰氨基、2,3-二氨基丙酰氨基、2,4-二氨基丁酰氨基、2-氨基-4-三唑-1-基丁酰氨基、[3-氨基-2-[双(2-氨基乙基)氨基]丙酰]氨基、[4-氨基-2-[双(2-氨基乙基)氨基]丁酰]氨基、[5-氨基-2-[双(2-氨基乙基)氨基]戊酰]氨基、N-(3-氨基丙基)-N-(2,3-二氨基丙酰)氨基、N-(3-氨基丙基)-N-(2,4-二氨基丁酰)氨基、N-(3-氨基丙基)-N-(2,5-二氨基戊酰)氨基、N-(3-氨基丙基)-N-(2,6-二氨基己酰)氨基等；更优选为鸟氨酰氨基、赖氨酰氨基、精氨酰氨基、组氨酰氨基、2,3-二氨基丙酰氨基、2,4-二氨基丁酰氨基、[3-氨基-2-[双(2-氨基乙基)氨基]丙酰]氨基、[4-氨基-2-[双(2-氨基乙基)氨基]丁酰]氨基、[5-氨基-2-[双(2-氨基乙基)氨基]戊酰]氨基、N-(3-氨基丙基)-N-(2,3-二氨基丙酰)氨基、N-(3-氨基丙基)-N-(2,4-二氨基丁酰)氨基、N-(3-氨基丙基)-N-(2,5-二氨基戊酰)氨基和N-(3-氨基丙基)-N-(2,6-二氨基己酰)氨基，最优选为鸟氨酰氨基、赖氨酰氨基、2,4-二氨基丁酰氨基、[4-氨基-2-[双(2-氨基乙基)氨基]丁酰]氨基、[5-氨基-2-[双(2-氨基乙基)氨基]戊酰]氨基、N-(3-氨基丙基)-N-(2,4-二氨基丁酰)氨基、N-(3-氨基丙基)-N-(2,5-二氨基戊酰)氨基和N-(3-氨基丙基)-N-(2,6-二氨基己酰)氨基。
R1的定义中， 的优选实施方式是双[2-(鸟氨酰氨基)乙基]氨基、双[3-(鸟氨酰氨基)丙基]氨基、[2-(赖氨酰氨基)乙基]氨基、双[3-(赖氨酰氨基)丙基]氨基等。
R1的定义中， 的优选实施方式是N-鸟氨酰-N-[2-(鸟氨酰氨基)乙基]氨基、N-鸟氨酰-N-[3-(鸟氨酰氨基)丙基]氨基、N-鸟氨酰-N-[3-(赖氨酰氨基)丙基]氨基、N-鸟氨酰-N-[3-(赖氨酰氨基)丙基]氨基、N-赖氨酰-N-[2-(鸟氨酰氨基)乙基]氨基、N-赖氨酰-N-[3-(鸟氨酰氨基)丙基]氨基、N-赖氨酰-N-[2-(赖氨酰氨基)乙基]氨基、N-赖氨酰-N-[3-(赖氨酰氨基)丙基]氨基等。
R1的定义中， 的优选实施方式是脯氨酰氨基、3-氨基脯氨酰氨基、4-氨基脯氨酰氨基、N-(3-氨基丙基)-N-脯氨酰氨基、(2-氨基乙基)脯氨酰氨基等。
术语“-NHCOCH(R13)-NHCOCH(NH2)-R13”[其中R13定义同上]优选指鸟氨酰-鸟氨酰氨基、赖氨酰-鸟氨酰氨基、鸟氨酰-赖氨酰氨基、赖氨酰-赖氨酰氨基等。
术语“-N(R15)-CO-R14”[其中R14和R15定义同上]中，术语“含氮杂环”和术语“含有氨基、脒基或胍基的苯基”定义同上。
-N(R15)-CO-R14的优选实施方式是3-氨基丙酰氨基、3-胍基丙酰氨基、3-哌嗪基丙酰氨基、(3-吡啶-3-基丙酰)氨基、[3-(4-氨基苯基)丙酰]氨基、N-(3-氨基丙酰)-N-(3-氨基丙基)氨基等。
在一个优选的方面，R1是-N(R10)-R11，其中R10和R11定义同上。在另一种优选的方面，R1是-N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13，其中R10、R11、R13和R15定义同上。在另一种优选的方面，R1是-N(R15)-CO-R14，其中R14和R15定义同上。在另一种优选的方面，R1是 其中R10和R15定义同上。在另一种优选的方面，R1是-NHCOCH(R13)-NHCOCH(NH2)-R13，其中R13定义同上。在另一种优选的方面，R1是三-低级烷基铵。在另一种优选的方面，R1是氨基或胍基。
R2的定义中，术语“可选被酰基、羧基、氨基甲酰基、氨基、单-低级烷基氨基或二-低级烷基氨基取代的低级烷基”优选指甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、氧代-低级烷基、羧基-低级烷基、氨基甲酰基-低级烷基、氨基-低级烷基等，更优选为甲基、乙基、正丙基、正丁基、2-氧代丙基、羧甲基、氨基甲酰基甲基、3-氨基丙基等。
术语“可选被酰基、羧基、氨基甲酰基、氨基、单-低级烷基氨基或二-低级烷基氨基取代的低级烯基”优选指烯丙基、2-丁烯基、3-丁烯基等，更优选为烯丙基。
在一个优选的方面，R2是氢、羟基磺酰或诸如甲基或乙基的低级烷基。
R3的定义中，术语“酰氨基”优选指低级烷基羰基氨基，例如乙酰氨基、丙酰氨基或异丁酰氨基，或者是从天然或非天然氨基酸衍生的酰氨基，例如肌氨酰氨基、甘氨酰氨基、丙氨酰氨基、鸟氨酰氨基、赖氨酰氨基、脯氨酰氨基、缬氨酰氨基、亮氨酰氨基、异亮氨酰氨基、色氨酰氨基、苯丙氨酰氨基、甲硫氨酰氨基、丝氨酰氨基、酪氨酰氨基、苏氨酰氨基、半胱氨酰氨基、天冬酰胺酰氨基、谷氨酰胺酰氨基、天冬氨酰氨基、谷氨酰氨基、精氨酰氨基、组氨酰氨基等；优选为肌氨酰氨基、甘氨酰氨基、丙氨酰氨基、赖氨酰氨基、脯氨酰氨基等。
术语“(低级烷基氨基甲酰基)氨基”优选指甲基氨基甲酰氨基、乙基氨基甲酰氨基、丙基氨基甲酰氨基、丁基氨基甲酰氨基等，更优选为甲基氨基甲酰氨基或乙基氨基甲酰氨基。
术语“低级烷氧基”优选指甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等，更优选为甲氧基和乙氧基。
术语“低级烷氧基羰基”优选指甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基等，更优选为甲氧基羰基和乙氧基羰基。
术语“可以任选被羟基、氨基、单-低级烷基氨基、二-低级烷基氨基、低级烷氧基羰基或氨基甲酰基取代的低级烷基”优选指甲基、乙基、丙基、氨基甲基、氨基乙基、氨基丙基、羟甲基、羟乙基、甲氨基甲基、2-(甲氨基)乙基、3-(甲氨基)丙基、二甲氨基甲基、2-(二甲氨基)乙基、3-(二甲氨基)丙基、2-(甲氧基羰基)乙基、2-(氨基甲酰基)乙基等。
术语“可以任选被羟基、氨基、单-低级烷基氨基、二-低级烷基氨基、低级烷氧基羰基或氨基甲酰基取代的低级烯基”优选指乙烯基、2-(甲氧基羰基)乙烯基、2-(氨基甲酰基)乙烯基等。
术语“可以任选被羟基、氨基、单-低级烷基氨基、二-低级烷基氨基、低级烷氧基羰基或氨基甲酰基取代的低级炔基”优选指乙炔基、丙炔基、羟基丙炔基、氨基丙炔基、二乙氨基丙炔基等。
在一个优选的方面，R3是氢、羟基、硝基、氨基或酰氨基。在另一种优选的方面，R3是(低级烷基氨基甲酰基)氨基、羧基、低级烷氧基或低级烷氧基羰基。
R4的定义中，术语“烷基、烯基、烷氧基或烯氧基”优选指含有3至16个碳原子的烷基、烯基、烷氧基或烯氧基，例如丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、辛-4-烯基、辛-6-烯基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基、庚氧基、辛氧基、辛-4-烯氧基、辛-6-烯氧基、壬氧基、壬-5-烯氧基、癸氧基等。
术语“低级烷基”优选指甲基、乙基、丙基、丁基、戊基，更优选为甲基或乙基。
术语“芳基”指可以任选被低级烷基、三氟甲基或卤原子取代的芳基，例如苯基、萘基、3-氟苯基、3-溴苯基、3-氯苯基、4-氟苯基、4-溴苯基、4-氯苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、4-三氟甲基苯基。
术语“环烷基”优选指环丙基、环丁基、环戊基、环己基、金刚烷基等。
术语“可以任选被低级烷基、芳基、环烷基或氟原子取代的烷基、烯基、烷氧基或烯氧基”优选指5-甲基己基、1-甲基十三烷基、2-乙基丁氧基、4-甲基戊氧基、2-丙基戊氧基、2-乙基己氧基、3,7-二甲基辛氧基、2-苯基乙氧基、2-(4-氟苯基)乙氧基、2-(4-氯苯基)乙氧基、2-(3-氟苯基)乙氧基、2-(4-三氟苯基)乙氧基、3-苯基丙氧基、2-萘基乙氧基、3-萘基丙氧基、2-环丙基乙氧基、2-环丁基乙氧基、2-环戊基乙氧基、3-环戊基丙氧基、2-环己基乙氧基、3-环己基丙氧基、3,3-二苯基丙氧基、3,3,3-三氟丙氧基、4,4,4-三氟丁氧基、5,5,5-三氟戊氧基等。
在一个优选的方面，R4是可以任选被低级烷基、芳基、环烷基或氟原子取代的烷基或烷氧基。
R5的优选实施方式是-CONH2或-CH2NH2。
X的定义中，术语“杂原子”优选指氮、硫和氧。
术语“可选含有一或多个杂原子的芳基、联苯基或三联苯基”优选指 等，它们可以进一步被卤原子或低级烷基取代。上式中开端的线表示在相应位置的优选连接。
X的最优选实施方式是单键、 它们可以进一步被卤原子或优选为甲基的低级烷基取代。
Y的定义中，术语“低级烷基”优选指由1至3个碳原子组成的烷基，例如甲基、乙基或丙基。Y的优选实施方式是单键、-CH2-、-CH(CH3)-、-CONH-或-CON(CH3)-，更优选为单键、-CH(CH3)-或-CONH-。
Z的定义中，术语“-N(低级烷基)-”优选指由1至3个碳原子组成的N-烷基，例如N-甲基、N-乙基或N-丙基。Z的优选实施方式是-O-；Z的另一种优选实施方式是-NH-。
m是0至4的整数，优选为0至2。
按照本发明优选的气丝菌素是如下表1列举的气丝菌素2和4至131。
表1 式(Ⅰ) 式(Ⅰ) 式(Ⅰ) *(S)构型式(Ⅰ) 式(Ⅰ) 式(Ⅰ) *(R)构型特别优选的气丝菌素选自由气丝菌素2、4至32、63、96-99、101至131组成的组。也特别优选的气丝菌素选自由气丝菌素14、15、21、26-29、63、98、99、101-131组成的组。
由式(Ⅰ)代表的气丝菌素可以按照下列过程生产。
过程A式(Ⅱ)气丝菌素可以这样生产在需氧条件下，将能够产生气丝菌素1、2和3[气丝菌素3(=WF11243)描述在参照例1]的属于Deuteromycotina的微生物在含水或固体培养基中培养，再从培养物中分离气丝菌素1、2和3。 [其中R3是氢或羟基，Y是-CH(CH3)-或-CH2-]过程B式(Ⅰ)气丝菌素[其中R1是氨基；Y是-CONH-、-CON(低级烷基)-、-CH2-或单键；Z是-NH-或-N(低级烷基)-；R2、R3、R4、R5、X和m定义同上]可以这样制备使用一种肽合成用羧基活化剂，使式(Ⅲ)化合物 [其中R6是氨基保护基团；R2、R3和R5定义同上]与式(Ⅳ)化合物缩合 [其中R7是氨基保护基团；R8是氢或低级烷基；R4、X、Y和m定义同上]，然后选择性除去所得直链肽的氨基保护基团R7，连续用一种肽合成用羧基活化剂环化，再除去氨基保护基团R6。
过程C式(Ⅰ)气丝菌素[其中R3是硝基；R1、R2、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]可以通过式(Ⅰ)气丝菌素[其中R3是氢；R1、R2、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]的硝化加以制备。
过程D式(Ⅰ)气丝菌素[其中R3是氨基；R1、R2、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]可以通过式(Ⅰ)气丝菌素[其中R3是硝基；R1、R2、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]的硝基的还原加以制备。
过程E
式(Ⅰ)气丝菌素[其中R3是酰氨基或(低级烷基氨基甲酰基)氨基；R1、R2、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]可以这样制备将式(Ⅰ)气丝菌素[其中R3是氨基；R1、R2、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]的氨基用酰氯、酸酐、羧酸/缩合剂或低级烷基氨基甲酰氯酰化，然后如果必要的话，除去氨基保护基团。
过程F式(Ⅰ)气丝菌素[其中R1是(3-氨基丙基)氨基、(2-氰基乙基)氨基、3-氨基-2-(氨基甲基)丙基]氨基或-N(R15)-COCH[NH(CH2)3NH2]-R13[其中R13和R15定义同上]]可以这样制备使式(Ⅰ)气丝菌素[其中R1是氨基或-N(R15)-COCH(NH2)-R13[其中R13和R15定义同上]；R2、R3、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]的氨基与丙烯腈、乙氧基亚甲基丙二腈或(1-乙氧基亚乙基)丙二腈反应，然后将所得腈基还原为氨基，如果必要的话，再除去保护基团。
过程G式(Ⅰ)气丝菌素[其中R1是-N(R10)-R11[其中R10和R11各自独立地选自氢、可选被一或多个氨基、胍基、含氮杂环或含有氨基、脒基或胍基的苯基取代的低级烷基]或-N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13[其中R10和R11各自是可选被一或多个氨基、氨基-低级烷基、胍基、含氮杂环或含有氨基、脒基或胍基的苯基取代的低级烷基；R13和R15定义同上]；R2、R3、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]可以这样制备将式(Ⅰ)气丝菌素[其中R1是氨基、(2-氰基乙基)氨基或-N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13[其中R10和R11各自独立地是氢原子或(2-氰基乙基)氨基；R13和R15定义同上]；R2、R3、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]的氨基用式(Ⅴ)醛进行还原性烷基化R9-CHO(Ⅴ)[其中R9是氢、可以进一步被一或多个保护的氨基、含氮杂环或含有保护的氨基的苯基取代的低级烷基]，然后如果必要的话，除去氨基保护基团或还原氰基。
过程H
式(Ⅰ)气丝菌素[其中R1是-N(R10)-R11[其中R10和R11各自独立地选自氢或被一或两个氨基取代的杂芳基]；R2、R3、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]可以这样制备使式(Ⅰ)气丝菌素[其中R1是氨基；R2、R3、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]的氨基与式(Ⅵ)化合物反应R12-Q(Ⅵ)[其中R12是可以进一步被保护的氨基或硝基取代的含氮杂芳基；Q是卤原子，例如氯或溴]，然后如果必要的话，除去氨基保护基团或还原硝基。
过程I-1式(Ⅰ)气丝菌素[其中R1是 -NHCO-CH(NH2)-R13[其中R13是从天然或非天然氨基酸衍生的残基]或-NHCO-R14[其中R14定义同上]；R2、R3、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]可以这样制备将式(Ⅰ)气丝菌素[其中R1是氨基；R2、R3、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]的氨基用式(Ⅶ)或(Ⅶ’)酸HO(O=)C-CH(NH-R7)-R13(Ⅶ) [其中R13是从天然或非天然氨基酸衍生的残基，这些氨基酸的官能团被适当地保护起来，R7是氨基保护基团]，或式(Ⅷ)的酸进行酰化HO(O=)C-R14(Ⅷ)[其中R14是具有一或多个保护的氨基、含氮杂环或含有保护的氨基的苯基的低级烷基]；然后如果必要的话，除去保护基团。
过程I-2式(Ⅰ)气丝菌素[其中R1是 [其中R10、R11、R13、R15和m定义同上]或 [其中R10、R11、R13、R15和m定义同上]]可以这样制备将式(Ⅰ)气丝菌素[其中R1是-N(R10)-R11[其中R10和R11都是被氨基取代的低级烷基]或-N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13[其中R15是被氨基取代的低级烷基；R10、R11和R13是如权利要求1所定义的，其前提条件是，R10、R11和R13中存在的氨基被保护起来]]的氨基用式(Ⅶ)酸酰化HO(O=)C-CH(NH-R7)-R13(Ⅶ)[其中R13是从天然或非天然氨基酸衍生的残基，这些氨基酸的官能团被适当地保护起来，R7是氨基保护基团)；然后除去保护基团。
过程J式(Ⅰ)气丝菌素[其中R1是-N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13[其中R10和R11是氢，R13定义同上，R15是可选被一或多个氨基、胍基、含氮杂环或含有氨基、脒基或胍基的苯基取代的低级烷基]、 [其中R10是氢，R15是可选被一或多个氨基、胍基、含氮杂环或含有氨基、脒基或胍基的苯基取代的低级烷基]或-N(R15)-CO-R14[其中R15是可选被一或多个氨基、胍基、含氮杂环或含有氨基、脒基或胍基的苯基取代的低级烷基，R14定义同上]；R2、R3、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]可以这样制备如过程F所述进行式(Ⅰ)气丝菌素[其中R1是氨基；R2、R3、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]的氨基的单N-烷基化作用，然后如过程Ⅰ所述用相应的式(Ⅶ)、(Ⅶ’)或(Ⅷ)化合物酰化，然后如果必要的话，除去保护基团。
过程K式(Ⅰ)气丝菌素[其中R1是胍基、-N(R10)-R11[其中R10和R11各自独立地选自被胍基或含有胍基的苯基取代的低级烷基]、-N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13[其中R10、R11和R13定义同上，R15是可选被一或多个胍基、含氮杂环或含有胍基的苯基取代的低级烷基]或-N(R15)CO-R14[其中R14是被一或多个胍基、含氮杂环或含有胍基的苯基取代的低级烷基]；R2、R3、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]可以这样制备使式(Ⅰ)气丝菌素[其中R1是氨基、-N(R10)-R11[其中R10和R11各自独立地选自被氨基或含有氨基的苯基取代的低级烷基]、-N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13[其中R10、R11和R13定义同上，R15是可选被一或多个氨基、含氮杂环或含有氨基的苯基取代的低级烷基]或-NHCO-R14[其中R14是被一或多个氨基、含氮杂环或含有氨基的苯基取代的低级烷基；R2、R3、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]与活化的脒衍生物反应。
过程L式(Ⅰ)气丝菌素[其中R2是可选被酰基、羧基、氨基甲酰基、羟基、氨基、单-低级烷基氨基或二-低级烷基氨基取代的低级烷基或低级烯基；R1、R3、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]可以这样制备将式(Ⅰ)气丝菌素[其中R2是氢；R1、R3、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]的酚式羟基用烷基化剂进行O-烷基化。
过程M式(Ⅰ)气丝菌素[其中R3是羧基、低级烷氧基羰基、可以任选被羟基、氨基、单-低级烷基氨基、二-低级烷基氨基、低级烷氧基羰基或氨基甲酰基取代的低级烷基、烯基或炔基；R2是氢；R1、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]可以这样制备将式(Ⅰ)气丝菌素[其中R2和R3是氢；R1、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]用碘化剂碘化，然后使所得式(Ⅰ)碘代衍生物[其中R3是碘；R1、R2、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]与一氧化碳、丙烯酸甲酯等进行钯(O)催化的偶合作用，然后如果必要的话，除去保护基团。
过程N式(Ⅰ)气丝菌素[其中R5是-CN；R1、R2、R3、R4、X、Y、Z和m定义同上]可以这样制备将式(Ⅰ)气丝菌素[其中R5是-CONH2；R1、R2、R3、R4、X、Y、Z和m定义同上]的氨基甲酰基用脱水剂脱水，如果必要的话，再除去氨基保护基团。
过程O式(Ⅰ)气丝菌素[其中R5是-CH2NH2；R1、R2、R3、R4、X、Y、Z和m定义同上]可以这样制备将式(Ⅰ)气丝菌素[其中R5是-CONH2或-CN；R1、R2、R3、R4、X、Y、Z和m定义同上]的氨基甲酰基或氰基用还原剂还原，如果必要的话，再除去氨基保护基团。
过程P式(Ⅰ)气丝菌素[其中R2是羟基磺酰；R1、R3、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]可以这样制备将式(Ⅰ)气丝菌素[其中R2是氢；R1、R3、R4、R5、X、Y、Z和m定义同上]的酪氨酸残基进行羟基磺化，然后除去保护基团。
过程Q式(Ⅰ)气丝菌素[其中-Y-(CH2)m-X-R4是正十三烷基或1-甲基十三烷基，R5是-CONH2,Z是氧原子，R1、R2和R3定义同上]可以通过流程1所述方法，从式(Ⅸ)直链肽制备。
上式(Ⅲ)化合物[其中R2、R3和R5定义同上，R6是氨基保护基团，其前提条件是，若R5是-CONH2，则R2或R3不是氢]及其盐是新的，也是本发明的主题。此外，流程1所示式(Ⅸ)、(Ⅹ)和(Ⅻ)直链肽及其可选的盐是新的，也是本发明的主题。
流程1
过程A至Q可以详细阐述如下过程A本发明所用微生物可以是任意能够产生气丝菌素1、2和3的属于半知菌亚门(Deuteromycotina)的菌株，包括突变体和变体。尤其优选的是菌株NR 7379，它是从采集自日本Kagoshima pref.的落叶中分离到的，确认是属于半知菌亚门的菌株。
菌株NR 7379的培养和形态学特征如下1、培养特征玉米粉琼脂(CMA)生长是不广泛的。在25℃下14天后，菌落从接种物(4.5mm直径琼脂塞)长到直径达11mm。它们是扁平的，呈淡乳黄色。反面呈淡乳黄色。存在无色胶粘性渗出物。
Miura培养基(LCA)生长是不广泛的。在25℃下14天后，菌落从接种物长到直径达11mm。它们是扁平的，呈淡乳黄色。反面呈淡乳黄色。不存在渗出物。
麦芽提取物琼脂(MEA)生长是不广泛的。在25℃下14天后，菌落是脓疱样的，从接种物长到直径达18mm。菌落的颜色是浅黄棕色。反面是相同的颜色。渗出物是无色胶粘性的。
马铃薯-葡萄糖琼脂(PDA)生长是不广泛的。在25℃下14天后，菌落是脓疱样的，从接种物长到直径达14mm。菌落的颜色和纹理与MEA上的相似。渗出物是无色胶粘性的。
在5℃与30℃之间，观察CMA、LCA、MEA和PDA上的萌发情况。
2、形态学特征菌丝体是部分浸入的、部分浅表的、分枝的、有隔的，呈淡棕色至乳黄色。由浸入的菌丝体形成分生孢子梗。它们是玻璃样的、有隔的、分枝的、不规则的。产孢细胞在明显的分生孢子梗或不规则的菌丝上。它们是成肠细胞的、管形瓶样的、末端的或近末端的。末端或近末端管形瓶的长度和形状是可变的。它们是圆柱形的至烧瓶形的，它们的长度和宽度分别达到5.5至10μm和2.5至5.5μm。经常形成侧产孢细胞恰好在中隔下面的不规则丝状分生孢子梗。分生孢子是单细胞的、玻璃样的、平滑的、球状的至近球状的，长2.0至5.5μm，宽2.0至5.0μm。
根据这些明显的培养和形态学特征，属于半知菌亚门的该菌株指定为半知菌亚门NR 7379。
表示为半知菌亚门NR 7379的菌株已经按照布达佩斯条约，由Nippon Roche K.K.于1998年6月16日保藏在位于6-1,Shiba2-chome,Minato-ku Tokyo,105 Japan的日本国家生物科学与人类技术研究院的工业科学与技术处如下半知菌亚门NR 7379(FERMBP-6391)。
按照由本发明提供的方法，培养可以在含有可被所培养的微生物所利用的常规营养物的培养基中进行。作为碳源，例如可以提到葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油、糖蜜、糊精和它们的混合物。氮源例如大豆粉、棉籽粉、肉浸膏、蛋白胨、干酵母、酵母浸膏、玉米浆、硫酸铵、硝酸钠和它们的混合物。而且，还可以向培养基中加入其它有机或无机物，用于促进微生物的生长和提高气丝菌素1的产量。这样的物质的例子是无机盐，例如碳酸钙、氯化钠、磷酸盐等。
在需氧条件下，优选通过深层发酵在液体培养基中进行培养，或者通过静态发酵在固体培养基中进行培养。适合培养的温度为20℃至30℃，最佳温度为27℃。培养优选地在pH 3至9下进行。培养时间取决于进行培养的条件。一般来说，培养进行20至360小时已足够。
为了从培养物中收获目的气丝菌素1、2和3，可以适当地采用通常用于从其培养物中分离由微生物产生的代谢产物的分离方法。例如，有利地按照下列程序回收气丝菌素1，它是可用甲醇提取的两性物质。
也就是说，将通过固态发酵所得全部培养物固体用适当溶剂提取，回收所要的产物。可以用于从全部培养物固体中提取目标化合物的溶剂包括水溶性有机溶剂或水溶性有机溶剂的水溶液，例如甲醇、乙醇和含水醇。
为了从所得提取物中除去盐、水溶性物质等，有利地采用在水与水不混溶性有机溶剂之间的溶剂分配法，该有机溶剂例如正丁醇、乙酸乙酯等。为了从提取物中除去有色物质、脂溶性物质等，有利地采用甲醇、乙醇、乙腈-0.1％含水三氟乙酸混合物等的溶剂纯化法。
为了完成气丝菌素的纯化，有利地采用柱色谱法。可以用在柱色谱法中的载体例如YMC-GEL ODS(Yamamura Chemical Laboratories,Japan)或制备型C18(Waters Millipore Corporation)。洗脱剂使用由含水三氟乙酸和适当的水溶性有机溶剂的混合物组成的溶剂系统，该有机溶剂例如甲醇、乙醇、乙腈等。含有每种组分的所纯化的洗脱级分可以进行浓缩或冷冻干燥，以粉碎气丝菌素1、2和3。
分离气丝菌素1、2和3的三氟乙酸盐，但游离的气丝菌素1、2和3可以按照下列程序制备。也就是说，将气丝菌素1、2和3的三氟乙酸盐溶于水，向其中加入一当量氢氧化钠，混合物进行SephadexLH-20柱色谱，然后用含水醇洗脱，例如甲醇-水等，从而分别得到气丝菌素1、2和3(游离形式)。过程B按照类似于WO 96/30399所述的方法，式(Ⅲ)起始化合物可以从式(Ⅰ)气丝菌素[包括气丝菌素1至3以及利用选自过程C至Q的方法从气丝菌素1至3转化的那些]制备。该方法包括内酯环的碱水解，然后是脂肪酸链的酶裂解。式(Ⅲ)中R6和式(Ⅳ)中R8的优选的氨基保护基团分别是叔丁氧基羰基(Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)。
按照下文提到的常规肽合成法，式(Ⅲ)起始化合物也可以从式(Ⅸ)直链肽制备，后者通过半知菌亚门的发酵得到。
式(Ⅳ)起始化合物[其中Y是-CONH-；R4、R8和X定义同上]可以这样制备使式(ⅩⅣ)化合物 ，与式(ⅩⅤ)化合物缩合R8NH-(CH2)m-X-R4(ⅩⅤ)[其中R4、R8、X和m定义同上]，然后除去叔丁基。式(ⅩⅣ)化合物是商业上可得到的。
式(ⅩⅤ)起始化合物[其中X是单键、可选含有一或多个杂原子和/或被卤原子或低级烷基取代的芳基、联苯基或三联苯基]是商业上可得到的，或者可以按照类似于EP 736541所述的方法和流程2制备例如，从下文提到的流程2中的羧酸中间体制得羧酰胺，进行LiAlH4还原，然后用Fmoc氯等保护氨基。
代表性式(Ⅳ)化合物[其中Y是-CONH-或-CON(低级烷基)-；R4、R7、R8和X定义同上]是HO2C-CH2CH(NHFmoc)-CONH-(CH2)10CH3,HO2C-CH2CH(NHFmoc)-CONH-(CH2)12CH3,HO2C-CH2CH(NHFmoc)-CONH-(CH2)14CH3,HO2C-CH2CH(NHFmoc)-CONH-(CH2)11CH(CH3)2,HO2C-CH2CH(NHFmoc)-CONH-(CH2)10-CH=CH-CH2CH3,HO2C-CH2CH(NHFmoc)-CONH-(CH2)8-CH=CH-(CH2)3CH3, HO2C-CH2CH(NHFmoc)-CON(CH3)-(CH2)12CH3,HO2C-CH2CH(NHFmoc)-CON(CH3)-(CH2)14CH3,等。
式(Ⅳ)起始化合物[其中Y是单键或-CH2-；R4、R8和X定义同上]可以这样制备在强碱的存在下，例如LDA，使(R)-(+)-N-苄基-1-苯乙胺与式(ⅩⅥ)化合物 [其中R4、X和m定义同上]进行Michael加成[参照《不对称四面体》2(3),183(1991)]，然后ⅰ)通过催化氢化进行N-去苄基化，ⅱ)用Fmoc氯等保护所得伯胺，和ⅲ)除去叔丁基。
式(ⅩⅥ)起始化合物可以按照下列流程2所述方法制备。 流程2其中m是4的式(ⅩⅥ)化合物可以这样制备在最后一步维蒂希反应之前重复流程2中的步骤1至3。
代表性式(Ⅳ)化合物[其中Y是单键或-CH2-；R4、R7和X定义同上]是 HO2C-CH2CH(N(CH3)Fmoc)-(CH2)14CH3等。
第一步肽键形成反应以及所得直链肽的环化可以按照肽化学领域技术人员已知的方法进行[参照《肽合成实践》M.Bodansky和A.Bodansky/第2版1994(Springer-Verlag)]。优选的缩合剂是BOP-HOBt、PyBOPTM-HOBt、PyBroPTM-HOBt等[偶合试剂商业上可得到(参照《组合化学目录》1997年2月，Novabiochem)]。
进行反应时可以在溶剂中，例如甲醇、乙醇、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等，在有或没有碱的存在下进行，例如三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶等，在-20℃与+50℃之间的温度下，优选为0℃至+25℃。
过程C式(Ⅰ)气丝菌素的硝化可以按照本领域技术人员已知的方法进行；通常使用亚硝酸钠/乙酸、四硝基甲烷/吡啶等。
反应可以在-20℃与0℃之间的温度下进行，优选为0℃。
过程D硝基的还原可以按照本领域技术人员已知的方法实现；通常使用催化剂进行催化氢化，催化剂例如钯-C、氧化铂等。
反应可以在室温下，在诸如甲醇、乙醇、乙酸等溶剂中进行。
过程E和I存在于式(Ⅰ)R1或R3中的氨基的N-酰化可以按照本领域技术人员已知的方法，利用酸酐或氨基甲酰氯实现，或者与羧酸实现，并使用缩合剂，例如二环己基碳二亚胺、BOP、HBTU、TNTU、PyBroPTM、PyBOPTM、TBTU、TSTU、HOBt等，或者这两者的结合。
进行反应时可以在溶剂中，例如甲醇、乙醇、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等，在有或没有碱的存在下进行，例如三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶等，在-20℃与+50℃之间的温度下，优选为0℃至+25℃。
在使用N-保护的氨基酸进行缩合反应时，氨基保护基团的除去可以按照本领域技术人员已知的方法进行，例如用三氟乙酸处理Boc基团，或者用哌啶处理Fmoc基团。
过程F存在于式(Ⅰ)R1中的氨基的N-单烷基化可以按照《OrganicSynthesis col.》Ⅲ卷93页所述方法，利用丙烯腈、乙氧基亚甲基-丙二腈或(1-乙氧基亚乙基)丙二腈实现，然后通过催化氢化还原所得腈基，或者利用硼氢化钠/氯化钴、硼烷-甲基硫配合物等进行还原[参照《医药化学杂志》37,222(1994)]。
过程G存在于式(Ⅰ)R1中的伯氨基或仲氨基的N-烷基化可以这样实现在有或没有弱酸的存在下，例如乙酸，使用还原剂，例如氰基硼氢化钠，与式(Ⅴ)醛衍生物进行常规的还原性烷基化作用。
反应可以在室温下，在诸如甲醇、乙醇、乙酸等溶剂中进行。
过程H进行取代反应的式(Ⅵ)化合物(R12-Q)的例子是2-溴-5-硝基吡啶、2-氯嘧啶、氯吡嗪等。
进行取代反应时，可以在-20℃与+50℃之间的温度下，优选为0℃至+25℃，在溶剂中，例如乙腈、N,N-二甲基甲酰胺等，在有或没有酸清除剂的存在下，例如碳酸钾、三乙胺、二异丙基乙胺等。
过程J存在于式(Ⅰ)R1中的氨基的第一步单-N-烷基化可以按照过程F所述方法实现。连续的N-酰化可以按照过程E和I所述方法实现。
过程K存在于式(Ⅰ)R1中的氨基向胍基的转化可以利用活化的脒衍生物实现，例如3,5-二甲基-1H-吡唑-1-甲脒、甲脒磺酸、苯并三唑-1-脒鎓甲苯磺酸酯等。
反应可以在0℃与约50℃之间的温度下，优选为20℃至约30℃，在溶剂中进行，例如甲醇、乙醇、水、N,N-二甲基甲酰胺等。
过程L式(Ⅰ)中酪氨酸残基的羟基的O-烷基化可以按照本领域技术人员已知的方法，在酸清除剂的存在下实现，例如碳酸钠、二异丙基乙胺等[《加拿大化学杂志》36,1521(1958)]。
反应可以在0℃与+50℃之间的温度下，优选为0℃至+25℃，在溶剂中进行，例如甲醇、乙醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺等。过程M酪氨酸残基中酚基邻位的碘化可以这样实现在室温下，将其中R2是氢的式(Ⅰ)气丝菌素用一氯化碘或碘化钠/含水次氯酸钠在诸如甲醇、乙醇等溶剂中的溶液处理。
钯(O)催化的与一氧化碳、丙烯酸甲酯等的偶合反应可以这样进行使用钯(O)催化剂，例如Pd(OAc)2、Pd(OAc)2(dppp)2，在溶剂中，例如甲醇、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈等，在碱的存在下，例如三乙胺，在20℃与+100℃之间的温度下，优选为20℃至+70℃[《生物有机与医药化学快报》7(22),2879(1997)]。
过程N式(Ⅰ)的氨基甲酰基(R5)的脱水可以利用Burgess试剂[可从Aldrich获得]、氰尿酰氯、草酰氯等实现[参照《医药化学杂志》37,222(1994)]。
反应可以在室温下，在溶剂中进行，例如N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等。
过程O式(Ⅰ)的氨基甲酰基或氰基(R5)的还原可以利用硼氢化钠/氯化钴、硼烷-甲基硫配合物等实现[参照《医药化学杂志》37,222(1994)]。
反应可以在室温下，在溶剂中进行，例如甲醇、乙醇等。
过程P式(Ⅰ)的酪氨酸残基的羟基磺化可以这样进行利用三氧化硫-DMF配合物、三氧化硫-吡啶配合物或三氧化硫-三乙胺配合物，在溶剂中，例如N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、1,4-二噁烷、四氢呋喃等，在-30℃与+70℃之间的温度下，优选为室温[参照J.Chem.Soc.Perkin Trans,(6)1739(1990)]。
过程Q
该过程所涉及的反应可以按照类似于过程B-O所述的方法实现。
式(Ⅸ)直链肽原料可以这样获得在需氧条件下，在含水或固体培养基中培养属于半知菌亚门的微生物，再从培养物中分离式(Ⅸ)直链肽。
本发明所用微生物可以是任意能够产生式(Ⅸ)直链肽的属于半知菌亚门的菌株，包括突变体和变体。尤其优选的是菌株NR 7379，它是从采集自日本Kagoshima pref.的落叶中分离到的，确认是属于半知菌亚门的菌株。
表示为半知菌亚门NR 7379的菌株已经按照布达佩斯条约，于1998年6月16日保藏在日本国家生物科学与人类技术研究院的工业科学与技术处如下半知菌亚门NR 7379(FERM BP-6391)。
按照由本发明提供的方法，培养可以在含有可被所培养的微生物所利用的常规营养物的培养基中进行。作为碳源，例如可以提到葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油、糖蜜、糊精和它们的混合物。氮源例如大豆粉、棉籽粉、肉浸膏、蛋白胨、干酵母、酵母浸膏、玉米浆、硫酸铵、硝酸钠和它们的混合物。而且，还可以向培养基中加入其它有机或无机物，用于促进微生物的生长和提高式(Ⅸ)直链肽的产量。这样的物质的例子是无机盐，例如碳酸钙、氯化钠、磷酸盐等。
在需氧条件下，优选通过深层发酵在液体培养基中进行培养，或者通过静态发酵在固体培养基中进行培养。适合培养的温度为20℃至30℃，最佳温度为27℃。培养优选地在pH 3至9下进行。培养时间取决于进行培养的条件。一般来说，培养进行120至672小时已足够。
为了从培养物中收获式(Ⅸ)目的直链肽，可以适当地采用通常用于从其培养物中分离由微生物产生的代谢产物的分离方法。例如，有利地按照下列程序回收式(Ⅸ)直链肽，它是可用甲醇提取的两性物质。
也就是说，将通过液态发酵所得培养肉汤用适当溶剂提取，回收所要的产物。可以用于从培养肉汤中提取目标化合物的溶剂包括水溶性有机溶剂或水溶性有机溶剂的水溶液，例如甲醇、乙醇和含水醇，或水不混溶性有机溶剂，例如n-BuOH。
为了从所得提取物中除去盐、水溶性物质等，有利地采用在水与水不混溶性有机溶剂之间的溶剂分配法，该有机溶剂例如正丁醇、乙酸乙酯等。为了从提取物中除去有色物质、脂溶性物质等，有利地采用甲醇、乙醇、乙腈-0.1％含水三氟乙酸的混合物等的溶剂纯化法。
为了完成式(Ⅸ)直链肽的纯化，有利地采用柱色谱法。可以用在柱色谱法中的载体例如Capcel Pak C18 UG80(Shiseido Co.LTD，Japan)。洗脱剂使用由含水三氟乙酸和适当的水溶性有机溶剂的混合物组成的溶剂系统，该有机溶剂例如甲醇、乙醇、乙腈等。含有式(Ⅸ)直链肽的所纯化的洗脱级分可以进行浓缩或冷冻干燥，以粉碎式(Ⅸ)直链肽。
分离式(Ⅸ)直链肽的三氟乙酸盐，但游离的式(Ⅸ)直链肽可以按照下列程序制备。也就是说，将式(Ⅸ)直链肽的三氟乙酸盐溶于水，向其中加入一当量氢氧化钠，混合物进行Sephadex LH-20柱色谱，然后用含水醇洗脱，例如甲醇-水等，从而得到式(Ⅸ)直链肽。
由本发明所提供的式(Ⅸ)直链肽对各种真菌不表现任何杀真菌活性，不过，它是生产诸如气丝菌素等有效抗真菌剂的关键中间体。
本发明也涉及气丝菌素的酸加成盐。酸加成盐可以是在正常的分离过程后所得到的三氟乙酸盐。可以将所得的盐溶于水，使其通过携带所需阴离子的阴离子交换柱。可以浓缩含有所需盐的洗脱液，回收该盐，为固体产物。
由于叔氮原子的存在，式(Ⅰ)气丝菌素可以转化为相应的盐。
式(Ⅰ)气丝菌素的酸加成盐可以这样得到将气丝菌素的游离碱用至少为化学计算量的适当的酸处理，例如无机酸，如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，和有机酸，如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。通常，将游离碱溶于惰性有机溶剂，例如乙醇、甲醇等，再在类似的溶剂中加入酸。温度保持在约40℃。所得的盐自发地或者用弱极性溶剂从溶液中沉淀出来。
式(Ⅰ)气丝菌素的酸加成盐可以如下转化为相应的游离碱用至少为化学计算量的适当的碱处理，例如氢氧化钠或钾、碳酸钾、碳酸氢钠、氨等。
由本发明所提供的气丝菌素对各种真菌表现出广泛的杀真菌活性，可用作真菌感染疾病的治疗剂和预防剂。代表性式(Ⅰ)气丝菌素的体外和体内抗真菌活性(见表2和3)以及肝细胞毒性(见表4)显示如下1、体外抗真菌活性通过测定50％抑制浓度(IC50)来评价本研究的代表性气丝菌素的体外抗真菌活性，IC50是与不含药物的对照生长相比，抑制真菌生长至浊度为20％的最低抗真菌浓度，用分光光度法测定。
根据NCCLS批准的标准，并作如下微小改变，按照肉汤微量-稀释程序测定IC50值(国家临床实验室标准委员会(1997)《酵母稀释肉汤抗真菌敏感性试验的参考方法》，批准的标准文献号M27-A)。采用补充有1％葡萄糖和0.25％K2HPO4的酵母氮碱(YNB；Difco Lab.)作为酵母的试验培养基，采用被0.2％低熔点琼脂糖(ERL)固化的相同培养基培养丝状真菌。接种物量为1-3×104细胞/ml，培养在35℃下进行1-2天。
表2体外抗真菌活性，IC50(μg/ml)白色念珠菌烟曲霉腐皮镰孢CY1002 CF1003 CF1088气丝菌素1 0.030.06 0.21气丝菌素5 0.030.07 0.19气丝菌素120.090.10 2.20气丝菌素310.070.49 0.70气丝菌素360.080.05 1.00气丝菌素390.090.17 0.70气丝菌素410.080.03 2.40气丝菌素430.050.04 0.70气丝菌素450.070.08 2.30气丝菌素460.090.08 1.80气丝菌素470.090.11 1.40气丝菌素530.110.09 2.30气丝菌素540.150.17 0.74气丝菌素550.040.04 0.39气丝菌素570.140.05 1.30气丝菌素750.150.10 1.40气丝菌素770.130.10 0.67气丝菌素950.140.10 0.742、体内抗真菌功效本发明气丝菌素的体内抗真菌功效显示在下表3中。利用常规的免疫活性小鼠品系Crj:CD-1(ICR)的小鼠作为系统性念珠菌病的实验性感染模型。向4周龄Crj:CD-1(ICR)小鼠经尾静脉注射白色念珠菌5×106分生孢子/小鼠，造成系统性念珠菌病。在造成系统性念珠菌病的第一天处理两次(感染后0、4小时)，在随后2天内每天处理一次(b.i.d.x1天，然后q.d.x2天)，均为静脉内方式(i.v.)。在第14天，由每种剂量下的存活数量计算50％有效剂量(ED50)值。
表3对小鼠系统性念珠菌病的体内抗真菌活性，第14天的ED50(mg/kg)气丝菌素50.3气丝菌素16 0.3气丝菌素18 0.6气丝菌素36 0.6气丝菌素41 0.3气丝菌素42 0.6气丝菌素45 0.3气丝菌素46 0.4气丝菌素50 ＜0.3气丝菌素55 ＜0.3气丝菌素65 0.63、体外肝细胞毒性试验通过胶原酶的消化分离小鼠肝细胞，在微量试验板中培养。将肝细胞单层与供试气丝菌素在培养系统中接触1天。培养期结束后，在显微镜下观察肝细胞，进行形态学评价。比较供试气丝菌素与WF 11243和LY 303366对肝细胞形态的改变程度(变性)。
表4对肝细胞的细胞毒性(μg/ml)气丝菌素14 ＞100气丝菌素15 ＞100气丝菌素21 ＞100气丝菌素34 ＞100气丝菌素38 ＞100气丝菌素45 ＞100气丝菌素47 ＞100气丝菌素48 ＞100气丝菌素53 ＞100气丝菌素65 ＞100气丝菌素67 ＞100气丝菌素72 ＞100气丝菌素81 ＞100WF 11243(=气丝菌素3) 100LY 303366 10
将5mg/kg和30mg/kg气丝菌素1对小鼠给药4周，没有显示急性毒性。
因此，新颖的式(Ⅰ)气丝菌素及其药学上可接受的盐在广泛的剂量范围内，对小鼠包括曲霉病在内的各种真菌感染表现出有效的抗真菌活性，可用作抗真菌剂。而且，由本发明所提供的气丝菌素的肝细胞的细胞毒性大大低于已知的环肽衍生物(WF 11243和LY 303366)。
本发明气丝菌素也可用于抑制或减轻免疫减弱患者的卡氏肺囊虫感染。
本发明进一步涉及含有新颖的式(Ⅰ)气丝菌素及其药学上可接受的盐的药物组合物。
新颖的式(Ⅰ)气丝菌素及其药学上可接受的盐是活性非常高的杀真菌剂。它们对多种真菌有活性，包括念珠菌、曲霉、镰孢霉、毛霉和犁头霉。
因此，本发明气丝菌素可用于动物及人真菌病的局部和系统治疗。例如，它们可用于治疗由念珠菌、毛癣菌和小孢子菌导致的局部和粘膜真菌感染。它们也可用于治疗例如由念珠菌、曲霉或镰孢霉导致的系统真菌感染。
在临床使用时，新颖的式(Ⅰ)气丝菌素及其药学上可接受的盐可以单独给药，不过一般视特定用途和所需目的而定配制成药物混合物后给药，在配制时混合赋形剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、包衣原料、乳化剂、悬浮剂、溶剂、稳定剂、吸收增强剂和/或软膏基质。混合物可用于口服、注射、经鼻、直肠或局部给药。
气丝菌素的口服给药制剂可以是颗粒剂、片剂、糖衣片、胶囊剂、丸剂、悬浮液或乳液。肠胃外注射例如静脉内、肌内或皮下方式，为此可以使用式(Ⅰ)气丝菌素的无菌水溶液形式，其中可以含有其它物质，例如使溶液等渗的盐或葡萄糖。这些组合物也可以是在安瓿或多剂量容器内的单位剂量形式，后者优选地加入防腐剂。或者，活性成分可以是粉末的形式，给药前用适当的载体进行再生。气丝菌素也可以以栓剂或阴道栓的形式给药，或者它们可以以洗剂、溶液、霜剂、软膏或撒布粉的形式局部应用。
通过口服或肠胃外途径给药时，式(Ⅰ)气丝菌素的每日剂量水平为0.1至50mg/kg(均分剂量)。气丝菌素片剂或胶囊剂预期可以含有5mg至0.5g活性化合物，在某个时间一次性或分两次或多次给药，视情况而定。无论怎样，实际剂量可由医师加以确定，可因特定患者的年龄、体重和反应而异。
当气丝菌素用于抗真菌时，可以采用任意给药方法。在治疗真菌感染时，通常采用口服或静脉内给药。
当采用气丝菌素控制肺囊虫感染时，需要直接对肺和支气管进行治疗。为此，吸入法是优选的。在通过吸入法或经鼻给药时，本发明气丝菌素适宜以气雾剂的形式从加压包装或喷雾器中释放出来。吸入法或经鼻给药所优选的释放系统是计量剂量的吸入气雾剂，它可以配制成式(Ⅰ)化合物的粉末、在适当推进剂中的悬浮液或溶液，推进剂例如碳氟化合物或碳氢化合物。
尽管本发明气丝菌素可以采用片剂、胶囊剂、局部组合物、吹入粉末、栓剂等形式，本发明气丝菌素在水和含水介质中的溶解性使它们适合用在注射剂以及用于气雾剂喷雾用的液体组合物中。
下列实施例阐述本发明气丝菌素的优选制备方法，但无意将发明范围局限于此。
下列实施例中，按照HPLC分析和纯化产物，所用反相柱从下列中选择。混合溶剂由0.05％三氟乙酸-水0.05％三氟乙酸-乙腈组成，适当的比例描述在各工作例中。
HPLC柱柱A:CAPCELL PAK C18,UG-120,4.6×250mm柱B:CAPCELL PAK C18,UG-120,10×250mm柱C:CAPCELL PAK C18,UG-80,20×250mm柱D:CAPCELL PAK C18,SG-120,4.6×250mm柱E:CAPCELL PAK C18,SG-120,10×250mm柱F:TSK GEL ODS-80Ts,20×250mm下列工作例中，得到气丝菌素的三氟乙酸盐，另有指定除外。
参照例1(R)-3-(9-芴基甲氧基羰基氨基)-5-(4’-庚氧基联苯-4-基)-戊酸的制备a)4-溴-4’-庚氧基联苯的制备向搅拌着的4-溴-4’-羟基联苯(5.05g,20.2mmol)的DMF(100ml溶液中加入K2CO3(4.20g,30.4mmol)和1-溴庚烷(4.14ml,26.4mmol)，混合物然后在80℃下加热。在80℃下搅拌20小时后，混合物冷却至室温。混合物用Et2O(250ml)稀释，溶液然后用饱和盐水洗涤(150ml×2)。有机层经无水Na2SO4干燥，在真空中浓缩。残余物从CH2Cl2-石油醚中重结晶，得到4-溴-4’-庚氧基联苯(6.21g,88％)，为白色固体；FAB-MS:m/z 347[MH+]。
b)4-甲酰基-4’-庚氧基联苯的制备向冷却(0℃)和搅拌着的4-溴-4’-庚氧基联苯(6.21g,17.9mmol)的THF(120ml)溶液中加入n-BuLi(1.66M己烷溶液，32.3ml,53.6mmol)。混合物在0℃下搅拌20分钟后，在-78℃下加入DMF(4.85ml,62.6mmol)。混合物在-78℃下再搅拌20分钟，然后用饱和含水NH4Cl结束反应。混合物用EtOAc(220ml)稀释，然后连续用饱和含水NH4Cl(125ml)和饱和盐水(100ml)洗涤。有机层经无水Na2SO4干燥，在真空中浓缩。残余物按硅胶柱色谱法纯化(EtOAc/己烷1∶20),得到4-甲酰基-4’-庚氧基联苯(2.21g,42％)，为白色无定形粉末。
c)3-(4’-庚氧基联苯-4-基)丙烯酸乙酯的制备向搅拌着的4-甲酰基-4’-庚氧基联苯(2.21g,7.46mmol)的苯(40ml)溶液中加入Ph3P=CHCOOEt(5.19g,14.9mmol)，混合物然后在60℃下加热。在60℃下搅拌3小时后，混合物冷却至室温，在真空中浓缩。残余物按硅胶柱色谱法纯化(CH2Cl2/己烷1∶2)，得到3-(4’-庚氧基联苯-4-基)丙烯酸乙酯(2.66g,97％)，为白色无定形粉末。FAB-MS:rm/z 367[MH+],1H NMR:δ0.90(t,J=6.8Hz,3H),1.25-1.55(m,8H),1.35(t,J=7.1Hz,3H),1.81(quint,J=6.6Hz,2H),4.00(t,J=6.4Hz,2H),4.28(q,J=7.1Hz,2H),6.46(d,J=16.0Hz,1H),6.94-7.00(m,2H),7.50-7.60(m,6H),7.72(d,J=16.0Hz,1H).
d)3-(4’-庚氧基联苯-4-基)丙酸乙酯的制备向搅拌着的3-(4’-庚氧基联苯-4-基)丙烯酸乙酯(2.65g,7.23mmol)的CH2Cl2(60ml)溶液中加入活性炭上的钯(Pd约10wt％,1.07g)，混合物然后置于H2气氛下。搅拌2小时后，混合物通过硅藻土垫过滤，用CH2Cl2洗涤。合并滤液和洗液，在真空中浓缩，得到3-(4’-庚氧基联苯-4-基)丙酸乙酯(粗产物，2.74g)，无需进一步纯化即可用于下一步。1H NMR:δ0.90(t,J=6.6Hz,3H),1.25(t,J=7.3Hz,3H),1.29-1.56(m,8H),1.75-1.86(m,2H),2.65(t,J=7.8Hz,2H),2.98(t,J=7.8Hz,2H),3.99(t,J=6.6Hz,2H),4.14(q,J=7.3Hz,2H),6.93-6.98(m,2H),7.25(d,J=8.6Hz,2H),7.43-7.52(m,4H).
e)3-(4’-庚氧基联苯-4-基)丙-1-醇的制备向冷却(0℃)和搅拌着的LiAlH4(0.47g,12.4mmol)的THF(20ml)悬浮液中加入3-(4’-庚氧基联苯-4-基)丙酸乙酯(粗产物，2.74g)的THF(30ml)溶液。在室温下搅拌30分钟后，混合物在0℃下用H2O结束反应。混合物通过硅藻土垫过滤，用CH2Cl2洗涤。合并滤液和洗液，在真空中浓缩。残余物按硅胶柱色谱法纯化(EtOAc/己烷2∶3)，得到3-(4’-庚氧基联苯-4-基)丙-1-醇(2.27g,2步收率96％)，为白色无定形粉末。EI-MS:m/z 326[M+],1H NMR:δ0.90(t,J=6.8Hz,3H),1.21-1.55(m,8H),1.81(quint,J=6.6Hz,2H),1.86-2.00(m,2H),2.75(t,J=7.3Hz,2H),3.71(t,J=6.6Hz,2H),3.99(t,J=6.6Hz,2H),6.92-7.00(m,2H),7.25(d,J=7.9Hz,2H),7.44-7.55(m,4H).
f)3-(4’-庚氧基联苯-4-基)丙醛的制备向冷却(0℃)和搅拌着的3-(4’-庚氧基联苯-4-基)丙-1-醇(2.26g,6.92mmol)的CH2Cl2(60ml)溶液中加入分子筛4A粉末(5.17g)和PCC(5.25g,24.4mmol)。在室温下搅拌2小时后，向混合物中加入Et2O(20ml)。将反应混合物转移到短硅胶柱上，用CH2Cl2洗脱。洗脱液在真空中浓缩，得到3-(4’-庚氧基联苯-4-基)丙醛(粗产物，2.45g)，无需进一步纯化即可用于下一步。
g)3-(4’-庚氧基联苯-4-基)戊-2-烯酸叔丁酯的制备向搅拌着的3-(4’-庚氧基联苯-4-基)丙醛(粗产物，2.45g)的苯(150ml)溶液中加入Ph3P=CHCOOt-Bu(5.21g,13.8mmol)，混合物然后在60℃下加热。在60℃下搅拌3小时后，混合物冷却至室温，在真空中浓缩。残余物按硅胶柱色谱法纯化(EtOAc/己烷1∶30)，得到3-(4’-庚氧基联苯-4-基)戊-2-烯酸叔丁酯(1.95g,2步收率67％)，为白色无定形粉末。EI-MS:m/z 422[M+],1H NMR:δ0.90(t,J=6.6Hz,3H),1.21-1.51(m,8H),1.49(s,9H),1.74-1.87(m,2H),2.47-2.58(m,2H),2.79(t,J=7.3Hz,2H),3.99(t,J=6.6Hz,2H),5.81(d.t.,J=1.5Hz,15.5Hz,1H),6.87-7.01(m,3H),7.23(d,J=7.9Hz,2H),7.44-7.53(m,4H).
h)(R)-3-[苄基-((R)-1-苯乙基)氨基]-5-(4’-庚氧基联苯-4-基)戊酸叔丁酯的制备向冷却(0℃)和搅拌着的盐酸(R)-N-苄基-1-苯乙胺(3.28g,13.2mmol)的THF(40ml)悬浮液中加入n-BuLi(1.61M己烷溶液，15.0ml,24.2mmol)。混合物在0℃下搅拌25分钟后，在-78℃下加入3-(4’-庚氧基联苯-4-基)戊-2-烯酸叔丁酯(1.94g,4.38mmol)的THF(30ml)溶液。混合物在-78℃下再搅拌20分钟后，反应混合物用饱和含水NH4Cl结束反应，在真空中浓缩。残余物用饱和含水NH4Cl(200ml)稀释，然后用CH2Cl2萃取(200ml×2)。合并后的萃取液经无水Na2SO4干燥，在真空中浓缩。残余物按硅胶柱色谱法纯化(EtOAc/己烷1∶40)，得到(R)-3-[苄基-((R)-1-苯乙基)氨基]-5-(4’-庚氧基联苯-4-基)戊酸叔丁酯(2.83g，定量)，为无色的油。EI-MS:m/z 633 [M+],1H NMR:δ0.91(t,J=6.6Hz,2H),1.24-1.55(m,13H),1.28(s,9H),1.57-2.04(m,6H),2.52-2.69(m,1H),2.97-3.10(m,1H),3.37-3.49(m,1H),3.55(ABq,J=15.0Hz,1H),3.85(ABq,J=15.0Hz,1H),3.88(q,J=6.9Hz,1H),4.00(t,J=6.6Hz,1H),6.96(d,J=8.6Hz,2H),7.16(d,J=8.2Hz,2H),7.21-7.53(m,16H).
i)(R)-3-氨基-5-(4’-庚氧基联苯-4-基)戊酸叔丁酯的制备向搅拌着的(R)-3-[苄基-((R)-1-苯乙基)氨基]-5-(4’-庚氧基联苯-4-基)戊酸叔丁酯(2.82g,4.45mmol)的EtOAc(50ml)溶液中加入AcOH(2.5ml)和碳上的Pd(OH)2(Pd(OH)2约20wt％,1.07g)，混合物然后置于H2气氛下。搅拌15小时后，混合物通过硅藻土垫过滤，用MeOH洗涤。合并滤液和洗液，在真空中干燥，得到(R)-3-氨基-5-(4’-庚氧基联苯-4-基)戊酸叔丁酯(粗产物，3.14g)，无需进一步纯化即可用于下一步。
j)(R)-3-(9-芴基甲氧基羰基氨基)-5-(4’-庚氧基联苯-4-基)戊酸叔丁酯的制备向搅拌着的(R)-3-氨基-5-(4’-庚氧基联苯-4-基)戊酸叔丁酯(粗产物，3.14g)的50％含水1,4-二噁烷(40ml)悬浮液中加入Na2CO3(1.19g,11.2mmol)和FmocCl(1.28g,4.95mmol)。搅拌1小时后，混合物用饱和盐水(100ml)稀释，用CH2Cl2萃取(100ml×3)。合并后的萃取液经无水Na2SO4干燥，在真空中浓缩，得到(R)-3-(9-芴基甲氧基羰基氨基)-5-(4’-庚氧基联苯-4-基)戊酸叔丁酯(粗产物，3.34g)，无需进一步纯化即可用于下一步。FAB-MS:m/z 668[M++Li],1H NMR:δ0.81(t,J=6.6Hz,3H),1.15-1.44(m,8H),1.35(s,9H),1.62-1.93(m,4H),2.29-2.68(m,4H),3.84-4.02(m,1H),3.88(t,J=6.6Hz,2H),4.13(t,J=6.8Hz,1H),4.25-4.41(m,2H),5.27(d,J=9.2Hz,1H),6.85(d,J=8.6Hz,2H),7.06-7.42(m,10H),7.51(d,J=7.3Hz,2H),7.66(d,J=7.6Hz,2H).
k)(R)-3-(9-芴基甲氧基羰基氨基)-5-(4’-庚氧基联苯-4-基)戊酸的制备向搅拌着的(R)-3-(9-芴基甲氧基羰基氨基)-5-(4’-庚氧基联苯-4-基)戊酸叔丁酯(粗产物，3.34g)的CH2Cl2(20m1)溶液中滴加TFA(20ml)。在室温下搅拌1小时后，混合物在真空中浓缩。残余物按硅胶柱色谱法纯化(MeOH/CH2Cl21∶20)，得到(R)-3-(9-芴基甲氧基羰基氨基)-5-(4’-庚氧基联苯-4-基)戊酸(2.07g,3步收率77％)，为白色无定形粉末。FAB-MS:m/z 606[MH+],1H NMR:δ0.88(t,J=6.6Hz,3H),1.21-1.51(m,8H),1.64-2.04(m,2H),1.78(q,J=6.6Hz,2H),2.27-2.78(m,4H),3.91-4.07(m,1H),3.96(t,J=6.6Hz,2H),4.20(t,J=6.6Hz,1H),4.34-4.56(m,2H),5.09-5.28(m,1H),6.92(d,J=8.9Hz,2H),7.10-7.49(m,10H),7.57(d,J=7.3Hz,2H),7.73(d,J=7.3Hz,2H).
过程B中所用式(Ⅳ)起始化合物[其中Y是单键或-CH2-]按照类似于上述的方法制备。
参照例2(S)-3-(9H-芴基甲氧基羰基氨基)-N-十一烷基琥珀酰胺酸的制备a)向(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)琥珀酸(150mg,0.36mmol)、BOP试剂(162mg,0.36mmol)与HOBT水合物(56mg,0.36mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(0.2ml)溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(64μl,0.36mmol)。在室温下搅拌30分钟后，加入1-氨基十一烷(79μl,0.37mmol)。混合物在室温下搅拌3小时。反应混合物用水稀释，用Et2O萃取。合并后的萃取液用水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物按硅胶柱色谱法纯化(使用正己烷∶乙酸乙酯=3∶1作为洗脱剂)，得到(S)-3-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-N-十一烷基琥珀酰胺酸叔丁酯(169mg，收率82％)，为无色无定形固体。FAB-MS (m/z):565[MH+],1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(3H,t,J=7Hz),1.24(16H,m),1.45(11H,m),2.58(1H,dd,J1=17Hz,J2=7Hz),2.91(1H,dd,J1=17Hz,J2=4Hz),3.23(2H,q,J=7Hz),4.22(1H,t,J=7Hz),4.42～4.45(3H,m),5.94(1H,broad d,J=8Hz),6.43(1H,broad s),7.31(2H,t,J=7Hz),7.41(2H,t,J=7Hz),7.58(2H,d,J=7Hz),7.77(2H,d,J=7Hz).
b)将(S)-3-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-N-十一烷基琥珀酰胺酸叔丁酯(113mg，0.2mmol)的TFA(2ml)溶液在室温下搅拌30分钟。反应完成后，在真空中蒸发除去TFA。残余物按硅胶柱色谱法纯化(使用二氯甲烷∶甲醇=9∶1作为洗脱剂)，得到(S)-3-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-N-十一烷基琥珀酸(101mg，收率99％)，为无色无定形固体。FAB-MS (m/z):507[MH+],1H-NMR(CDCl3)δ:0.87(3H,t,J=7Hz),1.23(16H,m),1.46(2H,m),2.62～2.80(1H,m),2.90～3.05(1H,m),3.21(2H,m),4.20(1H,t,J=7Hz),4.44(2H,d,J=6Hz),4.53(1H,broad s),5.98(1H,m),6.52(1H,broad s),7.30(2H,t,J=7Hz),7.40(2H,t,J=7Hz),7.56(2H,d,J=7Hz),7.76(2H,d,J=7Hz).
过程B中所用通式(Ⅳ)起始化合物[其中Y是-CONH-或-CON(CH3)-]按照上述的方法制备。
参照例3N-Boc-气丝菌素3(化合物A)的制备向气丝菌素3(10.0g,6.07mmol)的MeOH(1500ml)溶液中连续加入三乙胺(2.54ml,18.2mmol)、重碳酸二叔丁酯(13.9ml,60.7mmol)。混合物在室温下搅拌18小时后，在真空中蒸发溶剂。将残余物溶于MeOH(约10ml)，将溶液加入到二乙醚(1500ml)中。过滤所得沉淀，用二乙醚洗涤，得到9.9g N-Boc-气丝菌素3(化合物A)，为淡黄色无定形固体，无需进一步纯化即可用在下述工作例中，用于进一步的结构修饰。
实施例4气丝菌素1、2和3的制备
a)固体发酵将半知菌亚门NR 7379(FERM BP-6391)的10％(v/v)甘油溶液的0.1ml冷冻培养物解冻，接种在含有100ml培养基的500ml锥形瓶内，培养基由2％葡萄糖、1％马铃薯淀粉、1.5％甘油、1％Toast大豆(Nissin Seiyu)、0.35％酵母浸膏(Nippon Seiyaku)、0.25％Polypepton(Nihon Seiyaku)、0.3％NaCl、0.5％CaCO3、0.005％ZnSO4·7H2O、0.0005％CuSO4·5H2O和0.0005％MnSO4·4H2O组成。培养基的pH没有作调整。在27℃下，将种培养物在220rpm旋转摇动器上培养7天。将2ml种培养物转移到含有固体培养基的3升锥形瓶内，培养基由200g压制大麦、0.12g酵母浸膏(Difco)、0.06g酒石酸钠、0.06g KH2PO4和120ml水组成。发酵在27℃静态条件下进行。在发酵240小时左右达到最大产量，对培养物进行气丝菌素1、2和3的分离程序。
向所得经过培养后的固体(10kg)中加入甲醇(40L)，混合物搅拌，然后过滤，得到甲醇提取液(39L)。所得甲醇提取液在减压下浓缩至干，向残余物(64.8g)中加入乙酸乙酯(1L)和水(1L)。混合物搅拌，然后除去乙酸乙酯层。
进而，含水层同样用乙酸乙酯(1L)洗涤两次。剩余含水层用正丁醇(1L)萃取三次。所得萃取液合并，在减压下浓缩至干，将残余物(28.5g)溶于乙腈-0.1％含水三氟乙酸(1∶1)的混合物(250ml)。离心除去不溶物后，所得溶液在减压下蒸发至干，向残余物中加入甲醇(300ml)，混合物搅拌，然后过滤，得到甲醇溶液(280ml)。所得可溶于甲醇的物质(9.3g)然后进行反相硅胶C18(1L)柱色谱。柱子逐步用甲醇-0.1％含水三氟乙酸的混合物(2∶8,4∶6,5∶5,6∶4,7∶3和8∶2)洗脱。用甲醇-0.1％含水三氟乙酸(7∶3)按顺序洗脱气丝菌素1、2和3，将其在真空中浓缩至干，分别得到白色粉末状气丝菌素3的三氟乙酸盐(731mg)和气丝菌素1的三氟乙酸盐(747mg)。含有气丝菌素2的部分在减压下浓缩，进一步按HPLC纯化，条件如下柱Capcell Pak C18(i.d.30×250mm,Shiseido CO.,LTD)；移动相乙腈-0.1％含水三氟乙酸(45∶55)；流速40ml/分钟；检测UV220nm。将在上述条件下得到的适当洗脱液在真空中浓缩至干，得到白色粉末状气丝菌素2的三氟乙酸盐(42mg)。
b)烧瓶发酵将半知菌亚门NR 7379(FERM BP-6391)的10％(v/v)甘油溶液的2ml冷冻培养物解冻，接种在含有100ml培养基的500ml锥形瓶内，培养基由1％葡萄糖、1％燕麦粉、4％番茄糊、0.5％玉米浆(Ando kasei)、0.001％FeSO4·7H2O、0.001％MnSO4·4H2O、0.0001％CaCl2、0.0002％ZnSO4·7H2O、0.00002％(NH4)6MoO2·4H2O和0.00006％H3BO3组成。在消毒前，将培养基的pH调至6.8。在27℃下，将种培养物在220rpm旋转摇动器上培养3天。将2ml第一种培养物转移到含有100ml相同培养基的500ml锥形瓶内，在相同条件下，在旋转摇动器上培养3天。将2ml第二种培养物接种到含有100ml培养基的500ml锥形瓶内，培养基由8.5％甘油、1％柑橘属果胶、0.4％花生粉、0.4％不含维生素的乳酪蛋白、0.4％番茄糊、0.4％玉米浆(Ando kasei)、0.2％甘氨酸和0.2％KH2PO4组成。在消毒前，将培养基的pH调至7.0。发酵在27℃下进行，并以220rpm搅拌。培养10天后，产量达到最大，对全部培养物进行气丝菌素1、2和3的分离程序。
c)罐发酵将半知菌亚门NR 7379(FERM BP-6391)的10％(v/v)甘油溶液的2ml冷冻培养物解冻，接种在含有100ml上述相同种培养基的500ml锥形瓶内。在27℃下，烧瓶以220rpm摇动3天。将2ml第一种培养物转移到含有100ml相同种培养基的500ml锥形瓶内，在相同条件下，在旋转摇动器上培养3天。将600ml第二种培养物接种在含有30升上述相同生产培养基和0.4％disfoam(Nissan Disfoam CA-123)的50升罐发酵器内。发酵在27℃下进行，并以30升/分钟通气，以400rpm搅拌。发酵168小时左右达到最大产量，对全部培养物进行气丝菌素1、2和3的分离程序。
气丝菌素1
1)外观白色固体2)分子量(FAB-MS法)m/z 1547(M+H)+3)分子式C72H118N14O234)高分辨质谱(M+H)+实测值1547.8568C72H119N14O23计算值1547.85725)UV光谱(
图1)在甲醇中λ(ε)max(MeOH):225±5(10600sh),270±5(2000),278±5(2100)λ(ε)max(N/10 NaOH-MeOH):240±5(7700),268±5(1800),298±5(1800)6)IR光谱(KBr)(图2)主要吸收波数(cm-1)如下3379,2927,2855,1740,1660,1535,1453,1203,1139,8377)1H-NMR光谱(图3)400MHz,在CD3OD中8)13C-NMR光谱(图4)100MHz,在CD3OD中9)溶解性可溶于水、甲醇、二甲基亚砜10)颜色反应阳性茚三酮、茴香醛-硫酸、碘蒸气、香草醛-硫酸、Rydon-Smith试剂、磷钼酸阴性Sakaguchi试剂、溴甲酚绿、2,4-二硝基苯肼-硫酸11)薄层色谱(TLC)
载体溶剂Rf硅胶F254* n-BuOH∶丙酮∶AcOH∶H20 0.74(4∶5∶1∶1)MeOH∶H2O(95∶5) 0.12*E.Merck AG.德国12)高效液相色谱载体Capcell Pak C18硅胶S120A,4.6×250mm(Shiseido,Co.,LTD.制造)移动相乙腈∶0.05％含水三氟乙酸=1∶1流速1ml/分钟Rt=12.1±0.513)氨基酸分析将气丝菌素1在120℃6N HCl中加热24小时，然后进行氨基酸分析，以检测苏氨酸、3单位别苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、3-羟基谷氨酰胺。
气丝菌素21)外观白色固体2)分子量(FAB-MS法)m/z 1549(M+H)+3)分子式C71H116N14O244)高分辨质谱(M+H)+实测值1549.8384C71H117N14O24计算值1549.83655)UV光谱(图5)在甲醇中λ(ε)max(MeOH):225±5(10200sh),275±5(1900),278±5(2000)λ(ε)max(N/10 NaOH-MeOH):240±5(7700),293±5(2000)
6)IR光谱(KBr)(图6)主要吸收波数(cm-1)如下3323,2928,2856,1740,1670,1531,1450,1203,1137,8377)1H-NMR光谱(图7)400MHz,在CD3OD中8)13C-NMR光谱(图8)100MHz,在CD3OD中9)溶解性可溶于水、甲醇、二甲基亚砜10)颜色反应阳性茚三酮、茴香醛-硫酸、碘蒸气、香草醛-硫酸、Rydon-Smith试剂、磷钼酸阴性Sakaguchi试剂、溴甲酚绿、2,4-二硝基苯肼-硫酸11)薄层色谱(TLC)载体 溶剂Rf硅胶F254*n-BuOH∶丙酮∶AcOH∶H2O 0.29(4∶5∶1∶1)MeOH∶H2O(95∶5) 0.15*E.Merck AG.德国12)高效液相色谱载体Capcell Pak C18胶S120A,4.6×250mm(Shiseido,Co.,LTD.制造)移动相∶乙腈∶0.05％含水三氟乙酸=1∶1流速1ml/分钟Rt=9.9±0.513)氨基酸分析将气丝菌素2在120℃6N HCl中加热24小时，然后进行氨基酸分析，以检测苏氨酸、3单位别苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、3-羟基酪氨酸(DOPA)、鸟氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、3-羟基谷氨酰胺。
气丝菌素31)外观白色固体2)分子量(FAB-MS法)m/z 1533(M+H)+3)分子式C71H116N14O234)UV光谱在甲醇中λ(ε)max(MeOH):225±5(11000sh),275±5(2000),280±5(1900)λ(ε)max(N/10 NaOH-MeOH):243±5(7800),295±5(1800)5)IR光谱(KBr)主要吸收波数(cm-1)如下3334,2928,2852,1742,1662,1520,1449,1202,1136,8366)溶解性可溶于水、甲醇、二甲基亚砜7)颜色反应阳性茚三酮、茴香醛-硫酸、碘蒸气、香草醛-硫酸、Rydon-Smith试剂、磷钼酸阴性Sakaguchi试剂、溴甲酚绿、2,4-二硝基苯肼-硫酸8)薄层色谱(TLC)载体 溶剂Rf硅胶F254*n-BuOH∶丙酮∶AcOH∶H2O 0.26(4∶5∶1∶1)MeOH∶H2O(95∶5) 0.09*E.Merck AG.德国
9)高效液相色谱载体Capcell Pak C18胶S120A,4.6x250mm(Shi seido,Co.,LTD.制造)移动相乙腈∶0.05％含水三氟乙酸=1∶1流速1ml/分钟Rt=9.1±0.510)氨基酸分析将气丝菌素3在120℃6N HCl中加热24小时，然后进行氨基酸分析，以检测苏氨酸、3单位别苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、3-羟基谷氨酰胺。
实施例5化合物(Ⅸ)的制备1)烧瓶发酵将半知菌亚门NR 7379(FERM BP-6391)的10％(v/v)甘油溶液的2ml冷冻培养物解冻，接种在含有100ml培养基的500ml锥形瓶内，培养基由1％葡萄糖、1％燕麦粉、4％番茄糊、0.5％玉米浆(Ando kasei)、0.001％FeSO4·7H2O、0.001％MnSO4·4H2O、0.0001％CaCl2、0.0002％ZnSO4·7H2O、0.00002％(NH4)6MoO2·4H2O和0.00006％H3BO3组成。在消毒前，将培养基的pH调至6.8。在27℃下，将种培养物在220rpm旋转摇动器上培养4天。将2ml种培养物接种在含有100ml培养基的500ml锥形瓶内，培养基由8.5％甘油、1％柑橘属果胶、2％花生粉、0.4％不含维生素的乳酪蛋白、0.4％番茄糊、0.4％甘氨酸和0.2％KH2PO4组成。在消毒前，将培养基的pH调至7.0。发酵在27℃下进行，并以220rpm搅拌。培养14天后，产量达到最大，对全部培养物进行分离操作。
向所得经过培养后的全部肉汤(1.9L)中加入正丁醇(2L)，混合物搅拌。所得萃取液在减压下浓缩至干。向残余物中加入己烷(500ml)和甲醇(500ml)，所得混合物搅拌，然后除去己烷层。在减压下除去甲醇后，所得残余物用己烷与乙酸乙酯的混合物洗涤(1∶1；200ml，两次)，在减压下干燥。
向残余物(3.9g)加入水(20ml)，混合物搅拌，然后离心，得到水溶液。所得溶液然后进行反相硅胶C18(200L)柱色谱。柱子先用0.1％含水三氟乙酸洗脱，再逐步用甲醇-0.1％含水三氟乙酸(1∶9,3∶7,5∶5,6∶4,7∶3和8∶2)的混合物洗脱。将用甲醇-0.1％含水三氟乙酸(7∶3)洗脱的化合物(Ⅸ)合并，溶液用1N含水氢氧化钠中和，然后在真空中浓缩至干。向所得残余物中加入水(10ml)和正丁醇(10ml)，混合物搅拌。所得提取液在减压下浓缩，得到化合物(Ⅸ)(96.9mg)，为白色粉末。进一步按HPLC纯化，得到可用于光谱测定的化合物(Ⅸ),HPLC条件如下柱Capcell Pak C18 UG80(i.d.20×250mm,Shiseido.Co.,LTD)；移动相0.05％三氟乙酸/乙腈-0.05％三氟乙酸/水(38∶62)；流速22.86ml/分钟；检测UV210nm。将在上述条件下得到的适当洗脱液在真空中浓缩至干，得到白色粉末状化合物(Ⅸ)的三氟乙酸盐。
c)罐发酵将半知菌亚门NR 7379(FERM BP-6391)的10％(v/v)甘油溶液的2ml冷冻培养物解冻，接种在含有100ml上述相同种培养基的500ml锥形瓶内。在27℃下，烧瓶以220rpm摇动4天。将2ml第一种培养物转移到含有100ml相同种培养基的500ml锥形瓶内，在相同条件下，在旋转摇动器上培养3天。将600ml第二种培养物接种在含有30升上述相同生产培养基和0.4％disfoam(Nissan Disfoam CA-123)的50升罐发酵器内。发酵在27℃下进行，并以30升/分钟通气，以400rpm搅拌。发酵278小时左右达到最大产量，对全部培养物进行化合物(Ⅸ)的分离程序。
化合物(Ⅸ)1)外观白色固体2)分子量(FAB-MS法)m/z 1317(M+H)+
3)分子式C59H104N12O214)高分辨质谱(M+H)+实测值1317.7555C59H105N12O21计算值1317.75175)UV光谱在甲醇中λ(ε)max(MeOH)末端吸收6)IR光谱(KBr)(图9)主要吸收波数(cm-1)如下3450,2928,1665,1520,1450,1225,11357)1H-NMR光谱(图10)500MHz,在DMSO-d6中8)13C-NMR光谱(图11)125MHz，在DMSO-d6中9)溶解性可溶于水、甲醇、二甲基亚砜10)颜色反应阳性茚三酮、茴香醛-硫酸、碘蒸气、香草醛-硫酸、Rydon-Smith试剂、磷钼酸阴性Sakaguchi试剂、溴甲酚绿、2,4-二硝基苯肼-硫酸11)高效液相色谱载体Capcell Pak C18 UG80A,4.6×250mm(Shiseido,Co.,LTD.制造)移动相0.05％三氟乙酸/乙腈∶0.05％三氟乙酸/水=38∶62流速1ml/分钟Rt=7.7±0.5实施例6化合物(Ⅸ)鸟氨酸残基的N-Boc衍生物(N(orn)-Boc-IX)的制备式(Ⅻ:R6=Boc)化合物在室温下,向实施例5所得化合物(Ⅸ)(10.4mg,0.0073mmol)的二噁烷-H2O(0.43ml-0.5ml)溶液中加入三乙胺(3μl)和0.1M N-琥珀酰亚氨基碳酸叔丁酯(0.0073μl,0.0073mmol)的二噁烷溶液。搅拌1.5小时后，混合物用乙酸酸化，在减压下蒸发。残余物按HPLC纯化，得到N(orn)-Boc-IX，为无色无定形物(4.8mg，收率45％)；HPLC(Rt)18.0分钟(柱Soken-ODS,20×250mm；流速9ml/分钟；洗脱剂H2O∶CH3CN=梯度1％乙酸)；FAB-MS[M+Na]+1440。
实施例7化合物(Ⅸ)的缬氨酸残基的N-Boc衍生物(N(val)-Boc-IX)的制备式(X∶R7=Boc)化合物将实施例5所得化合物(Ⅸ)(15.0mg,0.0105mol)、重碳酸二叔丁酯(0.073M甲醇溶液，0.20ml,0.015mmol)与三乙胺(7.8μl)在MeOH(3ml)中的混合物在0℃下搅拌24小时。混合物用正己烷洗涤，在减压下蒸发。残余物按反相HPLC纯化，得到(N(val)-Boc-IX)，为无色无定形物(1.0mg，收率6％)；HPLC(Rt)16.0分钟(柱Soken-ODS,20×250mm；流速9ml/分钟；洗脱剂H2O∶CH3CN=梯度1％乙酸)；FAB-MS[M+Na]+1418。
实施例8气丝菌素33的制备向搅拌着的(R)-3-(9-芴基甲氧基羰基氨基)-7-(4-戊氧基苯基)庚酸(25.5mg,0.048mmol)的DMF(0.5ml)溶液中加入BOP试剂(21.3mg,0.048mmol)、HOBT水合物(7.5mg,0.049mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.0095ml,0.055mmol)。混合物在室温下搅拌1小时后，向反应混合物中加入化合物B[=式(Ⅲ)直链肽，其中R2和R3是氢，R5是氨基甲酰基，R7是叔丁氧基羰基，它是按照WO 96/30399所述程序，从气丝菌素1或3制备的](50.7mg,0.036mmol)与N,N-二异丙基乙胺(0.0095ml,0.055mmol)的DMF(0.6ml)溶液。混合物在室温下搅拌2.5小时后，加入哌啶(0.20ml)，混合物在室温下搅拌2小时。在真空中蒸发溶剂，残余物按制备型反相HPLC纯化(柱C，流速9ml/分钟；梯度洗脱剂1％ AcOH-H2O∶1％AcOH-CH3CN=80∶20→2∶98)。合并适当的级分，冷冻干燥，得到49.5mg直链肽C，是环化作用的前体，为白色无定形固体。
向搅拌着的上述直链肽C(49.5mg,0.029mmol)的DMF(27ml)溶液中加入HOBT水合物(11.3mg,0.074mmol)、N,N-二异丙基乙胺(0.018ml,0.105mmol)和BOP试剂(33.1mg,0.075mmol)的DMF(4ml)溶液。混合物在室温下搅拌3小时后，在真空中蒸发溶剂。
将如上所得残余物溶于TFA(6ml)，在0℃下搅拌30分钟。然后在真空中蒸发TFA。残余物按制备型反相HPLC纯化，详细条件如下所示。合并适当的级分，冷冻干燥，得到19.4mg气丝菌素33，为白色无定形固体。
HPLC(Rt):12.4分钟(柱C，流速9ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=61∶39)；FAB-MS(m/z):1568[MH+]。
按照类似于本实施例8所述的方法，采用相应的由式(Ⅳ)代表的结构单元，制备下列气丝菌素34-38、40-53、64-73和89-95、97-99和123。
FAB-MS HPLC分析条件化合物名称 m/z:[NH+]保留时间(分钟)(柱)(流速；洗脱剂比例*)气丝菌素34156814.1 (C) (9ml/分钟；60/40)气丝菌素35156813.2 (C) (9ml/分钟；57/43)气丝菌素36161021.9 (C) (9ml/分钟；55/45)气丝菌素37163844.1 (C) (9ml/分钟；54/46)气丝菌素38161028.1 (C) (9ml/分钟；58/42)气丝菌素40160216.8(F) (10ml/分钟；57/43)气丝菌素41161620.6 (C) (9ml/分钟；60/40)气丝菌素42163016.8(F) (10ml/分钟；62/38)气丝菌素43164429.2 (C) (9ml/分钟；57/43)气丝菌素44165835.5(F) (10ml/分钟；50/50)气丝菌素45163024.7 (C) (9ml/分钟；59/41)气丝菌素46166418.7 (C) (9ml/分钟；59/41)气丝菌素47159422.9 (C) (9ml/分钟；54/46)气丝菌素48157624.4(F) (10ml/分钟；58/42)气丝菌素49159024.2 (C) (9ml/分钟；65/35)气丝菌素50160448.9(F) (10ml/分钟；55/45)气丝菌素51161840.4 (F) (9ml/分钟；60/40)气丝菌素52163232.5(F) (10ml/分钟；50/50)气丝菌素53164627.0 (C) (9ml/分钟；54/46)气丝菌素64154715.5 (B) (4ml/分钟；65/35)气丝菌素65157515.5 (C) (9ml/分钟；55/45)气丝菌素66160316.6 (C) (9ml/分钟；52/48)气丝菌素67158719.9 (C) (9ml/分钟；59/41)气丝菌素68158719.6 (C) (9ml/分钟；59/41)气丝菌素69158921.8 (C) (9ml/分钟；58/42)气丝菌素70161721.6 (C) (9ml/分钟；53/47)气丝菌素71174630.0 (C) (9ml/分钟；64/36)气丝菌素72167322.6 (C) (9ml/分钟；57/43)气丝菌素73172120.2 (C) (9ml/分钟；55/45)气丝菌素89163022.1(F) (10ml/分钟；55/45)气丝菌素90165824.9(F) (10ml/分钟；50/50)气丝菌素91167026.7(F) (10ml/分钟；50/50)气丝菌素92164226.0(F) (10ml/分钟；55/45)气丝菌素93165021.4(F) (10ml/分钟；57/43)气丝菌素94165830.8(F) (10ml/分钟；52/48)气丝菌素95157428.3 (C) (9ml/分钟；57/43)气丝菌素97174044.7(F) (10ml/分钟；57/43)气丝菌素98165630.0(F) (10ml/分钟；62/38)气丝菌素99164416.9(F) (10ml/分钟；53/47)气丝菌素123 163020.7(F) (10ml/分钟；56/44)*0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈的比例实施例9气丝菌素16的制备(a)向搅拌着的化合物A(参照例3所述)(1g,0.61mmol)的吡啶(2.5ml)溶液中加入四硝基甲烷(0.365ml,3.05mmol)。在室温下搅拌4小时后，反应混合物在真空中浓缩。暗棕色残余物按反相HPLC纯化(Lobar RP18,10ml/分钟，0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=50∶50→33∶66 0.05％TFA)。合并适当的级分，冷冻干燥，得到711mg粗的化合物A的硝基衍生物，为淡黄色无定形固体。
(b)将上面得到的粗产物(12mg,0.0071mmol)与TFA(0.5ml)的混合物在0℃下搅拌30分钟。在干燥氮气流下蒸发TFA。黄色残余物按制备型反相HPLC纯化。合并适当的级分，冷冻干燥，得到8mg气丝菌素16的TFA盐，为淡黄色无定形固体。
HPLC(Rt):15.5分钟(柱B，流速4ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=55∶45)；FAB-MS(m/z):1578[MH+]。
按照类似于实施例9所述的方法，采用实施例8所得气丝菌素作为原料，制备下列气丝菌素39、54、55和77。
FAB-MS HPLC 分析条件化合物名称m/z:[MH+]保留时间(分钟)(柱)(流速；洗脱剂比例*)气丝菌素39157713.2 (C) (9ml/分钟；55/45)气丝菌素54166114.2 (C) (9ml/分钟；57/43)气丝菌素55168927.8 (C) (9ml/分钟；55/45)气丝菌素77164825.0 (C) (9ml/分钟；53/47)*0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈的比例实施例10气丝菌素17的制备(a)向实施例9(a)所得粗的化合物A的硝基衍生物(55mg,0.033mmol)的MeOH(5ml)溶液中加入10％碳上的钯(20mg)，向反应容器中充入氢。在室温下搅拌13.5小时后，混合物通过滤膜(孔径0.2μm)过滤，蒸发溶剂，得到52mg粗的气丝菌素3的氨基衍生物，为棕色无定形物，无需进一步纯化即可用于下一步。
(b)将上面得到的粗的化合物A(参照例3所述)的氨基衍生物(3.4mg,0.0021mmol)与TFA(0.2ml)的混合物在0℃下搅拌30分钟。在干燥氮气流下蒸发TFA。棕色残余物按制备型反相HPLC纯化。合并适当的级分，冷冻干燥，得到1.3mg气丝菌素17，为无色无定形固体。
HPLC(Rt):12.8分钟(柱A，流速1ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=59∶41)；FAB-MS(m/z):1548[MH+]。
按照类似于实施例10所述的方法，采用实施例9所得气丝菌素作为原料，制备下列气丝菌素29、56和78。
FAB-MS HPLC分析条件化合物名称m/z:[MH+]保留时间(分钟)(柱)(流速；洗脱剂比例*)气丝菌素29160631.0 (C) (9ml/分钟；60/40)气丝菌素56165915.1 (C) (9ml/分钟；57/43)气丝菌素78161816.8 (C) (9ml/分钟；57/43)*0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈的比例实施例11气丝菌素18的制备(a)向实施例10(a)所得粗的化合物A的氨基衍生物(1.7mg,0.001mmol)的甲醇(0.05ml)与吡啶(0.025ml)的溶液中连续加入Boc-Gly-OH(18mg,0.10mmol)、WSCI(30mg,0.15mmol)和HOBT水合物(24mg,0.15mmol)。混合物在室温下搅拌15小时后，用干燥氮气流除去溶剂。
(b)将上面得到的粗残余物溶于TFA(0.1ml)，在0℃下搅拌30分钟。用干燥氮气流除去TFA。残余物按制备型反相HPLC纯化。合并适当的级分，冷冻干燥，得到0.54mg气丝菌素18，为无色无定形固体。
HPLC(Rt):8.9分钟(柱B，流速4ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=57∶43)；FAB-MS(m/z):1605[MH+]。
按照类似于实施例11所述的方法，采用相应的酰化剂和实施例10所得气丝菌素作为原料，制备下列气丝菌素19-23、30、57-62、79和81。
FAB-MSHPLC 分析条件化合物名称m/z:[MH+]保留时间(分钟)(柱)(流速；洗脱剂比例*)气丝菌素19159017.5(A) (1ml/分钟；57/43)气丝菌素2016196.0 (B) (4ml/分钟；55/45)气丝菌素21166318.0(C) (9ml/分钟；60/40)气丝菌素22160512.5(A) (1ml/分钟；55/45)气丝菌素23162023.9(C) (9ml/分钟；55/45)气丝菌素30167624.6(C) (9ml/分钟；61/39)气丝菌素57170121.2(C) (9ml/分钟；56/44)气丝菌素58173023.4(C) (9ml/分钟；55/45)气丝菌素59171613.7(C) (9ml/分钟；58/42)气丝菌素60173016.3(C) (9ml/分钟；55/45)气丝菌素61173039.1(C) (9ml/分钟；47/53)气丝菌素62173015.8(C) (9ml/分钟；55/45)气丝菌素79168936.1(C) (9ml/分钟；57/43)气丝菌素81167524.4(C) (9ml/分钟；60/40)*0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈的比例实施例12气丝菌素12的制备在室温下，向气丝菌素5(7.5mg,0.0048mmol)、37％福尔马林(150μl)与乙酸(50μl)的MeOH(1.0ml)溶液中加入氰基硼氢化钠(7.5mg,0.119mmol)的MeOH(100μl)溶液，混合物在室温下搅拌7小时。在真空中蒸发溶剂后，将残余物溶于正丁醇，连续用稀氢氯酸和水洗涤。有机层在真空中蒸发。残余物按制备型反相HPLC纯化，详细条件如下所示。合并适当的级分，冷冻干燥，得到5.4mg气丝菌素12，为无色无定形固体。
HPLC(Rt):7.1分钟(柱B，流速4ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=50∶50)；FAB-MS(m/z):1575[NH+]。
按照类似于实施例12所述的方法，制备下列气丝菌素13、25、30和75。
FAB-MS HPLC 分析条件化合物名称m/z:[MH+]保留时间(分钟)(柱)(流速；洗脱剂比例*)气丝菌素13156113.7 (B) (4ml/分钟；55/45)气丝菌素25160723.5 (C) (4ml/分钟；55/45)气丝菌素30167624.6 (C) (9ml/分钟；61/39)气丝菌素75163124.2 (C) (9ml/分钟；55/45)*0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈的比例实施例13气丝菌素111的制备(a)在室温下，向气丝菌素3(500mg,0.326mmol)、(2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯*(1.66g,10.4mmol)与乙酸(5ml)的MeOH(45ml)溶液中加入氰基硼氢化钠(410mg,6.52mmol)的MeOH(5ml)溶液。混合物在室温下搅拌18小时。在真空中蒸发溶剂后，将残余物溶于正丁醇，连续用稀氢氯酸和水洗涤。有机层在真空中蒸发。
粗残余物无需进一步纯化即可用于下一步。
*CAS No.89711-08-0(b)将上面得到的粗残余物的TFA(20ml)溶液在0℃下搅拌30分钟。在真空中蒸发TFA。残余物按制备型反相HPLC纯化，详细条件如下所示。合并适当的级分，冷冻干燥，得到253mg气丝菌素111，为无色无定形固体。
HPLC(Rt)18.6分钟(柱F，流速10ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=57∶43)；FAB-MS(m/z):1619[M+H]+。
按照类似于实施例13所述的方法，制备下列气丝菌素100、112、114和115。
FAB-MS HPLC 分析条件化合物名称m/z:[MH+]保留时间(分钟)(柱)(流速；洗脱剂比例*)气丝菌素100 1730 14.8(F) (10ml/分钟；56/44)气丝菌素112 1647 11.8(F) (10ml/分钟；57/43)气丝菌素114 1759 23.1(C) (10ml/分钟；60/40)气丝菌素115 1633 19.6(F) (10ml/分钟；59/41)*0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈的比例实施例14气丝菌素120的制备在室温下，向气丝菌素3(500mg,0.326mmol)与三乙胺(682μl,4.89mmol)在MeOH(10ml)中的混合物中加入丙烯腈(214μl,3.27mmol)。混合物在室温下搅拌20小时。在真空中蒸发溶剂后，将残余物溶于正丁醇，连续用稀氢氯酸和水洗涤。有机层在真空中蒸发。粗残余物按制备型反相HPLC纯化，详细条件如下所示。合并适当的级分，冷冻干燥，得到207mg气丝菌素120，为无色无定形固体。
HPLC(Rt)27.5分钟(柱F，流速10ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=53∶47)；FAB-MS(m/z):1586[M+H]+。
实施例15气丝菌素113的制备向气丝菌素120(100mg,0.063mmol)与MeOH(5ml)的混合物中加入10％碳上的钯(20mg)，向反应容器中充入氢。在室温下搅拌20小时后，混合物通过滤膜(孔径0.2μm)过滤，在真空中蒸发溶剂。粗残余物按制备型反相HPLC纯化，详细条件如下所示。合并适当的级分，冷冻干燥，得到87.2mg气丝菌素113，为无色无定形固体。
HPLC(Rt)23.0分钟(柱F，流速10ml/分钟；移动相0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=57∶43)；FAB-MS(m/z):1590[M+H]+。
按照类似于实施例14-15所述的方法，然后用三氟乙酸除去鸟氨酸残基的Boc基团，制备气丝菌素129。在这种情况下，原料是气丝菌素106的(D)-鸟氨酸部分的Nδ-Boc衍生物，它是通过类似于实施例16的过程得到的。
FAB-MS HPLC分析条件化合物名称m/z:[MH+]保留时间(分钟)(柱)(流速；洗脱剂比例*)气丝菌素129 170533.8(F) (10ml/分钟；62/38)*0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈的比例实施例16气丝菌素14的制备向N-Boc-肌氨酸(123mg,0.65mmol)、WSC·HCl(240mg,1.25mmol)与DMAP(150mg,1.23mmol)的CH3CN(10ml)溶液中加入气丝菌素3(100mg,0.065mmol)的CH3OH(3ml)溶液。混合物在室温下搅拌15小时，然后在真空中浓缩。将残余物溶于n-BuOH(10ml)，用H2O洗涤(5ml×2，用1N HCl调pH为3-4)。n-BuOH层在真空中浓缩，在0℃下将残余物溶于TFA(5ml)。溶液在室温下搅拌1小时后，在真空中蒸发TFA。残余物按制备型反相HPLC纯化，得到40.8mg(收率39％)气丝菌素14，为白色无定形粉末。
HPLC(Rt):23.1分钟(柱C，流速9ml/分钟，0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=60∶40)；FAB-MS(m/z):1605[MH+]。
按照类似于实施例16所述的方法，使用相应的酸作为结构单元，制备气丝菌素15、21、26-29和101-107、109、110、118、130和131。
FAB-MS HPLC 分析条件化合物名称m/z:[MH+]保留时间(分钟)(柱)(流速；洗脱剂比例*)气丝菌素15163124.0 (C) (9ml/分钟；57/43)气丝菌素21166318.0 (C) (9ml/分钟；60/40)气丝菌素26165019.9 (C) (9ml/分钟；50/50)气丝菌素27167622.5 (C) (9ml/分钟；55/45)气丝菌素28163620.9 (C) (9ml/分钟；50/50)气丝菌素29160631.0 (C) (9ml/分钟；60/40)气丝菌素101 164716.5 (F) (10ml/分钟；56/44)气丝菌素102 166116.3 (F) (10ml/分钟；56/44)气丝菌素103 168913.4 (F) (10ml/分钟；54/46)气丝菌素104 163322.6 (F) (10ml/分钟；58/42)气丝菌素105 161929.2 (F) (10ml/分钟；52/38)气丝菌素106 164717.3 (F) (10ml/分钟；56/44)气丝菌素107 166136.5 (F) (10ml/分钟；60/40)气丝菌素109 163326.1 (F) (10ml/分钟；58/42)气丝菌素110 161928.8 (F) (9ml/分钟；58/42)气丝菌素118 168515.2 (F) (10ml/分钟；51/49)气丝菌素130 184716.0 (F) (10ml/分钟；63/37)气丝菌素131 181821.1 (F) (10ml/分钟；63/37)*0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈的比例实施例17气丝菌素74的制备将气丝菌素66(20mg,0.012mmol)、硝酸3,5-二甲基吡唑-1-甲脒(13mg,0.064mmol)与三乙胺(18ml,0.13mmol)在MeOH(1ml)中的混合物在室温下搅拌15小时。蒸发溶剂后，粗残余物按制备型反相HPLC纯化，详细条件如下所示。合并适当的级分，冷冻干燥，得到10.2mg气丝菌素74，为无色无定形固体。
HPLC(Rt)21.2分钟(柱C，流速9ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=54∶46)；FAB-MS(m/z):1645[MH+]。
按照类似于实施例17所述的方法，分别采用气丝菌素3和111作为原料，制备下列气丝菌素4和116。
FAB-MSHPLC分析条件化合物名称m/z:[MH+]保留时间(分钟)(柱)(流速；洗脱剂比例*)气丝菌素415767.6 (D)(1ml/分钟；50/50)气丝菌素116 170314.9(F)(10ml/分钟；57/43)*0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈的比例实施例18气丝菌素5的制备(a)在室温下，向参照例3所得化合物A(10mg,0.0061mmol)与碳酸钾(10mg,0.072mmol)的DMF(1ml)溶液中加入甲基碘(8μl,0.129mmol)，混合物在室温下搅拌43小时。混合物用硅藻土垫过滤后，滤液在真空中蒸发。将残余物溶于正丁醇，连续用稀氢氯酸和水洗涤。有机层在真空中蒸发。粗残余物无需进一步纯化即可用于下一步。
(b)将上面得到的粗残余物的TFA(1.0ml)溶液在0℃下搅拌30分钟。在真空中蒸发TFA。残余物按制备型反相HPLC纯化，详细条件如下所示。合并适当的级分，冷冻干燥，得到3.8mg气丝菌素5，为无色无定形固体。
HPLC(Rt):14.5分钟(柱B，流速4ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=55∶45)；FAB-MS(m/z):1547[MH+]。
按照类似于实施例18所述的方法，采用相应的烷基化剂，制备下列气丝菌素6-10和76。
FAB-MS HPLC分析条件化合物名称m/z:[MH+]保留时间(分钟)(柱)(流速；洗脱剂比例*)气丝菌素6156116.0 (A)(1ml/分钟；55/45)气丝菌素71573 8.4 (A)(1ml/分钟；50/50)气丝菌素8158926.1(B)(4.7ml/分钟；58/42)气丝菌素9159138.5 (B)(4ml/分钟；60/40)气丝菌素10 1590 6.7 (A)(1ml/分钟；53/47)气丝菌素76 161726.0 (C)(9ml/分钟；53/47)*0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈的比例实施例19气丝菌素24的制备(a)将冷却的参照例3所得化合物A(100mg)、碘化钠(29.5mg，0.197mmol)与次氯酸钠溶液(250μl)在甲醇(2ml)中的混合物在0℃下搅拌2小时。反应混合物用饱和含水硫代硫酸钠结束反应，用1N HCl酸化，用正丁醇萃取。合并后的有机萃取液在真空中蒸发。此时，原料仍然存在。为了完成碘化反应，重复相同的实验程序。相同的操作后，残余物按制备型反相HPLC纯化，得到化合物A的碘代衍生物，为无色固体(54mg，收率50％)。
(b)将上面得到的化合物A的碘代衍生物(23.8mg)、丙烯酸甲酯(16μl)、三乙胺(40μl)与乙酸钯(2.1mg)在乙腈(250μl)与N,N-二甲基甲酰胺(750μl)中的混合物在70℃下加热28小时。所得混合物通过C-18短柱，将残余物在0℃下用三氟乙酸(1ml)处理1小时。所得混合物在真空中蒸发。残余物按制备型反相HPLC纯化，得到气丝菌素24，为无色固体(8.8mg，收率40％)。
HPLC(Rt):86.3分钟(柱F，流速9ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=58∶42)；FAB-MS(m/z):1617[MH+]。
实施例20
气丝菌素96的制备将实施例19(a)所得化合物A的碘代衍生物(30mg)、乙酸钾(6.9mg)与四(三苯膦)钯(4.6mg)在脱气二甲基亚砜(2ml)中的混合物在60℃一氧化碳气氛下加热20小时。所得混合物通过C-18反相短柱，将残余物在0℃下用三氟乙酸处理1小时。所得混合物在减压中蒸发。残余物按制备型反相HPLC纯化，得到气丝菌素96，为无色固体(2.3mg，收率8％)。
HPLC(Rt):23.2分钟(柱F，流速10ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=52.2∶47.8)；FAB-MS(m/z):1677[MH+]。
实施例21气丝菌素32的制备(a)将参照例3所得化合物A(20mg)与(甲氧基羰基氨磺酰)三乙铵氢氧化物(26.5mg,0.108mmol)在乙腈(3ml)中的混合物在室温下搅拌8小时。反应混合物用1N HCl酸化，在真空中蒸发。残余物用正丁醇萃取，萃取液在真空中蒸发。
(b)将粗产物在0℃下用三氟乙酸处理1小时。在真空中蒸发TFA。残余物按制备型反相HPLC纯化，得到气丝菌素32，为无色固体(2.0mg，收率10％)。
HPLC(Rt):42.9分钟(柱B，流速4ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=55∶45)；FAB-MS(m/z):1516[MH+]。
实施例22气丝菌素31的制备(a)在-10℃下，向冷却的参照例3所得化合物A(25.7mg)的四氢呋喃(5ml)溶液中加入硼烷-二甲基硫配合物(25ml)。在-10℃下搅拌5小时后，反应混合物用2N HCl结束反应，用正丁醇萃取。合并后的萃取液在真空中蒸发。
(b)将粗产物在0℃下用三氟乙酸处理1小时。在减压中蒸发THF。残余物按制备型反相HPLC纯化，得到气丝菌素31，为无色固体(3.7mg，收率15％)。
HPLC(Rt):25.1分钟(柱B，流速4ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=62∶38)；FAB-MS(m/z):1519[MH+]。
实施例23气丝菌素121的制备向气丝菌素3(50mg)的DMF(1ml)与三乙胺(0.025ml)溶液中加入甲基碘(0.010ml)。在室温下搅拌16小时后，向混合物中进一步加入三乙胺(0.025ml)和甲基碘(0.05ml)，在室温下搅拌24小时。混合物的LCMS分析显示向所需化合物的转化率＞90％。用氮气流清除溶剂，残余物按制备型反相HPLC纯化，详细条件如下所示。合并适当的级分，冷冻干燥，得到23mg气丝菌素121，为无色无定形固体。
HPLC(Rt):20.5分钟(柱B，流速4ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=52∶48)；FAB-MS(m/z):1576[M+]。
实施例24气丝菌素122的制备向气丝菌素3(50mg)的吡啶(1ml)溶液中加入三氧化硫-N,N-二甲基甲酰胺配合物(23mg)。在室温下搅拌2小时后，用干燥氮气流清除溶剂。
将上面得到的粗残余物的TFA(1ml)溶液在0℃下搅拌30分钟。用干燥氮气流清除TFA，残余物按制备型反相HPLC纯化，详细条件如下所示。合并纯的级分，冷冻干燥，得到5mg气丝菌素122，为无色无定形固体。
HPLC(Rt):24.6分钟(柱F，流速10ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=52∶48)；FAB-MS(m/z):1613[MH+]。
实施例25
气丝菌素63的制备(a)向搅拌着的Nα-Fmoc-Nβ-Boc-(S)-2,3-二氨基丙酸(343mg,0.80mmol)的DMF(10ml)溶液中加入BOP试剂(355mg,0.80mmol)、HOBT水合物(124mg,0.81mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.174ml,1.00mmol)。混合物在室温下搅拌1.5小时后，向混合物中加入气丝菌素3(1.10g,0.67mmol)与N,N-二异丙基乙胺(0.174ml,1.00mmol)的DMF(9.5ml)溶液。在室温下再搅拌1小时后，混合物在真空中浓缩。
(b)向搅拌着的上面得到的残余物的DMF(20ml)溶液中加入哌啶-4-羧酸聚胺树脂(200-400目)、HL(1.50mmol/g,2.66g)，反应混合物用超声照射6小时。通过硅藻土垫过滤除去树脂，用MeOH洗涤，合并滤液和洗液，冷冻干燥，得到1.08g气丝菌素3的粗衍生物，为白色无定形固体，无需进一步纯化即可用于下一步。
(c)向搅拌着的上面得到的气丝菌素3的粗衍生物(25.6mg,0.015mmol)的MeOH(1ml)溶液中加入(2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯(粗品，207mg)、AcOH(0.1ml)和NaBH3CN(19.1mg)。混合物在室温下搅拌2小时后，反应混合物在真空中浓缩。残余物用n-BuOH(4ml)稀释，用H2O洗涤(1ml×2，用0.1N HCl调pH为3-4)。n-BuOH层在真空中浓缩。粗残余物无需进一步纯化即可用于下一步。
(d)将上面得到的粗残余物的TFA(2ml)溶液在0℃下搅拌2小时。在真空中蒸发TFA，残余物按制备型反相HPLC纯化，详细条件如下所示。合并纯的级分，冷冻干燥，得到8.8mg气丝菌素63，为白色无定形固体。
HPLC(Rt):24.8分钟(柱F，流速9ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=54∶36)；FAB-MS(m/z):1706[MH+]。
实施例26气丝菌素127的制备按照与气丝菌素63所述相同的方法，利用Nα-Fmoc-Nδ-Boc-(D)-鸟氨酸制备气丝菌素127。所得气丝菌素127为白色无定形固体。
HPLC(Rt):23.9分钟(柱F，流速9ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=54∶36)；FAB-MS(m/z):1734[MH+]。
实施例27气丝菌素124的制备(a)向搅拌着的Boc-D-Orn(Boc)-OH(46mg,0.138mmol)的DMF(2ml)溶液中加入BOP试剂(62mg,0.14mmol)、HOBT水合物(22mg,0.144mmol)和N,N-二异丙基乙胺(24μl,0.138mmol)。在室温下搅拌30分钟后，向反应混合物中加入气丝菌素120(100mg,0.063mmol)与N,N-二异丙基乙胺(24μl,0.138mmol)的DMF(2ml)溶液。在室温下搅拌18小时后，在真空中蒸发溶剂。
将残余物溶于TFA(4ml)，溶液在0℃下搅拌30分钟。用干燥氮气流除去TFA后，残余物按制备型反相HPLC纯化，详细条件如下所示。合并纯的级分，冷冻于燥，得到48.6mg腈衍生物，为白色无定形固体。
HPLC(Rt):20.2分钟(柱F，流速10ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=57∶43)；FAB-MS(m/z):1700[M+H]+。
(b)向上面得到的腈衍生物(48.6mg,0.0286mmol)的二噁烷(1ml)与水(1ml)的混合物中加入10％碳上的钯(10mg)，混合物在室温氢气氛下搅拌14小时。混合物然后通过滤膜(孔径0.2μm)过滤，在真空中蒸发溶剂。粗残余物按制备型反相HPLC纯化，详细条件如下所示。合并纯的级分，冷冻干燥，得到26.5mg气丝菌素124，为无色无定形固体。
HPLC(Rt):18.2分钟(柱F，流速10ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=60∶40)；FAB-MS(m/z):1704[M+H]+。
实施例28气丝菌素125的制备
(a)向气丝菌素3单TFA盐(天然产物50mg)的DMF(1ml)与三乙胺(0.126ml)溶液中加入2-溴-5-硝基吡啶(185mg)。在室温下搅拌25小时后，用干燥氮气流清除溶剂。残余物按制备型反相HPLC纯化。合并适当的级分，冷冻干燥，得到25mg气丝菌素3的5-硝基吡啶-2-基衍生物，为浅黄色无定形固体。
HPLC(Rt):29.9分钟(柱F，流速10ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=47∶53)；FAB-MS(m/z):1655[M+H]+。
(b)将上面得到的气丝菌素3的5-硝基吡啶-2-基衍生物(10mg)溶于二噁烷-H2O(1ml-5ml)。加入5％碳上的钯(20mg)，向反应容器内充入氢。在室温下搅拌3小时后，通过滤膜(孔径0.2μm)过滤，蒸发溶剂，得到14mg粗产物，按制备型反相HPLC纯化，详细条件如下所示。合并纯的级分，冷冻干燥，得到2.5mg气丝菌素125，为无色无定形固体。
HPLC(Rt):18.7分钟(柱F，流速10ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=52∶48)；FAB-MS(m/z):1625[M+H]+。
实施例29气丝菌素128的制备(a)向搅拌着的Fmoc-D-Orn(Boc)-OH(389mg,0.86mmol)的DMF(10ml)溶液中加入BOP试剂(378mg,0.85mmol)、HOBT水合物(131mg,0.86mmol)和N,N-二异丙基乙胺(171μl,0.98mmol)。混合物在室温下搅拌40分钟后，向混合物中加入气丝菌素3(1.08g,0.66mmol)与N,N-二异丙基乙胺(171μl,0.98mmol)的DMF(10ml)溶液。在室温下搅拌2.5小时后，加入哌啶(4ml)，混合物在室温下再搅拌1小时。混合物在真空中浓缩。残余物用n-BuOH(50ml)稀释，用H2O洗涤(25ml×2，用1N HCl调pH为3)。n-BuOH层在真空中浓缩。
(b)向搅拌着的Boc-D-Orn(Boc)-OH(9.6mg,0.029mmol)的DMF(1ml)溶液中加入BOP试剂(13.3mg,0.030mmol)、HOBT水合物(4.6mg,0.030mmol)和N,N-二异丙基乙胺(4.8μl,0.028mmol)。混合物在室温下搅拌30分钟后，向混合物中加入上面得到的粗残余物(31.9mg)与N,N-二异丙基乙胺(4.8μl,0.028mmol)的DMF(1ml)溶液。在室温下搅拌4小时后，反应混合物在真空中浓缩。
(c)将上面得到的粗残余物溶于TFA(1.5ml)，在0℃下搅拌1小时。反应混合物在真空中浓缩，残余物按制备型反相HPLC纯化。合并适当的级分，冷冻干燥，得到16.6mg气丝菌素128，为白色无定形固体。
HPLC(Rt):27.23分钟(柱F，流速9ml/分钟；洗脱剂0.05％三氟乙酸-水∶0.05％三氟乙酸-乙腈=55∶35)；FAB-MS(m/z):1762[MH+]。
实施例30从化合物(Ⅸ)制备气丝菌素106(a)将Fmoc-Tyr(But)(21mg,0.0457mmol)、HOBt一水合物(6.6mg,0.0431mmol)、BOP试剂(18.8mg,0.0424mmol)与二异丙基乙胺(DIEA,20μl)在DMF(0.5ml)中的混合物在室温下搅拌1小时，然后加入到实施例6所得N(orn)-Boc-IX(19.3mg,0.0131mmol)与DIEA(10μl)在DMF(1ml)中的混合物中。在室温下搅拌3小时后，将所得混合物用哌啶(0.375ml)处理1小时，然后在真空中浓缩。残余物用二氯甲烷和二乙醚洗涤，除去试剂。残余物按HPLC纯化，得到所需的直链肽A，为白色固体(16.6mg)。
HPLC(Rt)19分钟(柱Soken-ODS/20×250mm，流速9ml/分钟；洗脱剂H2O∶CH3CN=梯度，1％AcOH)。
(b)将Fmoc-D-Ala一水合物(1.2mg,0.034mmol)、HOBt一水合物(4.7mg,0.031mmol)、BOP试剂(13.6mg,0.031mmol)与DIEA(8μl)在DMF(0.5ml)中的混合物在室温下搅拌1小时，然后加入到上面得到的直链肽A(16.6mg,0.0098mmol)与DIEA(6μl)在DMF(1ml)中的混合物中。反应混合物在室温下搅拌，加入活性酯，直到原料几乎被消耗掉。所得混合物在真空中浓缩。残余物用二氯甲烷和二乙醚洗涤，除去试剂。将粗产物在0℃下用三氟乙酸处理1小时。混合物在减压下浓缩。残余物按HPLC纯化，得到所需的直链肽B，为白色固体(6.1mg)。
HPLC(Rt)19分钟(柱Soken-ODS/20×250mm，流速9ml/分钟；洗脱剂H2O∶CH3CN=梯度，1％AcOH)。
(c)将Boc-D-Orn(But)(5.7mg,0.017mmol)、HOBt一水合物(2.3mg,0.015mmol)、BOP试剂(5.4mg,0.012mmol)与DIEA(6μl)在DMF(0.5ml)中的混合物在室温下搅拌1小时，然后加入到直链肽B(6.1mg,0.0033mmol)与DIEA(3μl)在DMF(1ml)中的混合物中。在室温下搅拌2小时后，将所得混合物用哌啶(0.375ml)处理1小时，然后在真空中浓缩。残余物按HPLC纯化，得到直链肽C，为白色固体(4.1mg)。
HPLC(Rt)16.7分钟(柱Soken-ODS/20×250mm，流速9ml/分钟；洗脱剂H2O∶CH3CN=梯度，1％AcOH)。
(d)将直链肽C用0.01N氢氯酸酸化，用正丁醇萃取。丁醇萃取液在真空中浓缩。将萃取液溶于DMF(2ml)。然后向混合物中加入HOBt一水合物(0.1M DMF溶液，60μl)、BOP试剂(0.1M DMF溶液，60μl)和DIEA(2μl)。在室温下搅拌1小时后，所得混合物在真空中浓缩。将残余物在0℃下用三氟乙酸处理1小时。混合物在减压下浓缩。残余物按HPLC纯化，得到气丝菌素106，为白色固体(2.2mg，按N(orn)-Boc-IX计收率为9％)。
分析数据描述在实施例16的表中。
实施例A按本身为常规的方式制造注射液，各自含有下列成分气丝菌素45 20mg无水磷酸氢二钠 7.6mg磷酸二氢钠二水合物 2.0mg乙醇 150mg蒸馏水，去离子，灭菌850mg总计1029.6mg
权利要求
1.由式(Ⅰ)代表的气丝菌素， 其中R1是胍基、三-低级烷基铵、-N(R10)-R11,-N(R15)-CO-R14,-N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13,-NHCOCH(R13)-NHCOCH(NH2)-R13, R10和R11各自独立地选自氢；被一或两个氨基取代的杂芳基；可选被一或多个氨基、氨基-低级烷基、氰基、胍基、含氮杂环或含有氨基、脒基或胍基的苯基取代的低级烷基；R13是从天然或非天然氨基酸衍生的残基；R14是被一或多个氨基、胍基、含氮杂环或含有氨基、脒基或胍基的苯基取代的低级烷基；R15是氢、可选被一或多个氨基、胍基、含氮杂环或含有氨基、脒基或胍基的苯基取代的低级烷基；R2是氢、羟基磺酰、低级烷基或低级烯基，其中低级烷基和低级烯基可以任选被酰基、氨基甲酰基、氨基、单-低级烷基氨基或二-低级烷基氨基取代；R3是氢、羟基、硝基、氨基、酰氨基、(低级烷基氨基甲酰基)氨基、羧基、低级烷氧基、低级烷氧基羰基、低级烷基、低级烯基或低级炔基，其中低级烷基、低级烯基和低级炔基可以任选被羟基、氨基、单-低级烷基氨基、二-低级烷基氨基、低级烷氧基羰基或氨基甲酰基取代；R4是可以任选被低级烷基、芳基、环烷基或氟原子取代的烷基、烯基、烷氧基或烯氧基；R5是-CONH2、-CN或-CH2NH2；X是单键，或可选含有一或多个杂原子和/或被卤原子或低级烷基取代的芳基、联苯基或三联苯基；Y是单键、-CH2-、-CH(低级烷基)-、-CONH-或-CON(低级烷基)-；Z是-O-、-NH-或-N(低级烷基)-；m是0至4的整数；且n是2至5的整数；其前提条件是，若-Y-(CH2)m-X-R4是未取代的烷基或芳烷基，则同时R1不是氨基，R2和R3不是氢，R5不是-CONH2，Z不是-O-或-NH-；及其药学上可接受的盐。
2.权利要求1的气丝菌素，其中R1是-N(R10)-R11，其中R10和R11是如权利要求1所定义的。
3.权利要求1的气丝菌素，其中R1是-N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13，其中R10、R11、R13和R15是如权利要求1所定义的。
4.权利要求1的气丝菌素，其中R1是-NHCOCH(R13)-NHCOCH(NH2)-R13，其中R13是如权利要求1所定义的。
5.权利要求1的气丝菌素，其中R1是 其中R10、R11、R13、R15和n是如权利要求1所定义的。
6.权利要求1的气丝菌素，其中R1是 其中R10、R11、R13、R15和n是如权利要求1所定义的。
7.权利要求1的气丝菌素，其中R1是-N(R15)-CO-R14，其中R14和R15是如权利要求1所定义的。
8.权利要求1的气丝菌素，其中R1是 其中R10和R15是如权利要求1所定义的。
9.权利要求1的气丝菌素，其中R1是氨基或胍基。
10.权利要求1至9任一项的气丝菌素，其中R2是氢、羟基磺酰或低级烷基。
11.权利要求1至10任一项的气丝菌素，其中R3是氢、羟基、硝基、氨基或酰氨基。
12.权利要求1至10任一项的气丝菌素，其中R3是(低级烷基氨基甲酰基)氨基、羧基、低级烷氧基或低级烷氧基羰基。
13.权利要求1至12任一项的气丝菌素，其中R5是-CONH2或-CH2NH2。
14.权利要求1至13任一项的气丝菌素，其中X是单键或下列原子团之一 它们可以进一步被卤原子或低级烷基取代。
15.权利要求1至13任一项的气丝菌素，其中X是单键、苯基、联苯基或萘基，它们可以进一步被卤原子或低级烷基取代。
16.权利要求1至15任一项的气丝菌素，其中R4是可以任选被低级烷基、芳基、环烷基或氟原子取代的烷基或烷氧基。
17.权利要求1至16任一项的气丝菌素，其中m是0至2的整数。
18.权利要求1至17任一项的气丝菌素，其中Y是-CH(CH3)-、-CON(CH3)-、-CONH-、-CH2-或单键。
19.权利要求1至18任一项的气丝菌素，其中Z是-NH-。
20.权利要求1至18任一项的气丝菌素，其中Z是-O-。
21.权利要求1至20任一项的气丝菌素，选自由气丝菌素2、4至32、63、96-99、101至131组成的组。
22.权利要求1至20任一项的气丝菌素，选自由气丝菌素14、15、21、26至29、63、98、99和101至131组成的组。
23.权利要求1至22任一项的气丝菌素，用在医疗中。
24.由式(Ⅲ)代表的化合物 其中R2、R3和R5是如权利要求1所定义的，R6是氨基保护基团；其前提条件是，若R5是-CONH2，则R2或R3不是氢；及其盐。
25.由式(Ⅸ)代表的化合物 及其盐。
26.由式(Ⅹ)代表的化合物 其中R7是氨基保护基团，及其盐。
27.由式(Ⅻ)代表的化合物 其中R6是氨基保护基团，及其盐。
28.药物组合物，包含权利要求1至22任一项的化合物和药学上可接受的载体。
29.如权利要求1至22任一项所定义的化合物在药物制备中的用途，该药物用于真菌病的治疗或预防。
30.半知菌亚门NR 7379(FERM BP-6391)的生物学纯培养物。
31.预防和/或治疗由病原性微生物导致的传染病的方法，包括将权利要求1至22任一项的化合物对人或动物给药。
32.制备如权利要求1至22任一项所述气丝菌素的方法，该方法包括(a)培养属于半知菌亚门属的微生物，从培养肉汤中分离气丝菌素1、2和/或如权利要求25所定义的式(Ⅸ)直链肽；或者(b)将式(Ⅲ)化合物 其中R2、R3和R5是如权利要求1所定义的，R6是氨基保护基团；与式(Ⅳ)化合物缩合，其中R7是氨基保护基团；R8是氢或低级烷基；R4、X、Y和m是如权利要求1所定义的；然后除去氨基保护基团R7，连续进行环化和除去氨基保护基团R6；或者(c)式(Ⅰ)气丝菌素的硝化 其中R3是氢原子；R1、R2、R4、R5、X、Y、Z和m是如权利要求1所定义的；或者(d)上式(Ⅰ)气丝菌素的硝基的还原，其中R3是硝基；R1、R2、R4、R5、X、Y、Z和m是如权利要求1所定义的；或者(e)上式(Ⅰ)气丝菌素的氨基的酰化，其中R3是氨基；R1、R2、R4、R5、X、Y、Z和m是如权利要求1所定义的；然后如果必要的话，除去氨基保护基团；或者(f)式(Ⅰ)气丝菌素的氨基的氰基乙基化或2,2-二氰基乙烯化，其中R1是氨基或-N(R15)-COCH(NH2)-R13；R13、R15、R2、R3、R4、R5、X、Y、Z和m是如权利要求1所定义的；然后还原氰基，如果必要的话，再除去保护基团；或者(g)将上式(Ⅰ)气丝菌素，其中R1是氨基、(2-氰基乙基)氨基或-N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13；其中R10和R11各自独立地选自氢或(2-氰基乙基)氨基；R13、R15、R2、R3、R4、R5、X、Y、Z和m是如上所定义的；的氨基与式(Ⅴ)醛进行还原性烷化，R9-CHO(Ⅴ)其中R9是氢、可以进一步被一或多个保护的氨基、含氮杂环或含有保护的氨基的苯基取代的低级烷基；然后如果必要的话，除去氨基保护基团或还原氰基；或者(h)将上式(Ⅰ)气丝菌素，其中R1是氨基；R2、R3、R4、R5、X、Y、Z和m是如权利要求1所定义的；的氨基与式(Ⅵ)化合物进行芳基化，R12-Q(Ⅵ)其中R12是可以进一步被保护的氨基或硝基取代的含氮杂芳基；Q是卤原子，例如氯或溴；然后如果必要的话，除去氨基保护基团或还原硝基；或者(i-1)上式(Ⅰ)气丝菌素的氨基的酰化，其中R1是氨基；R2、R3、R4、R5、X、Y、Z和m是如权利要求1所定义的；然后如果必要的话，除去氨基保护基团；或者(i-2)上式(Ⅰ)气丝菌素的氨基的酰化，其中R1是-N(R10)-R11[其中R10和R11都是被氨基取代的低级烷基]或-N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13[其中R15是被氨基取代的低级烷基；R10、R11和R13是如权利要求1所定义的，其前提条件是，R10、R11和R13中存在的氨基被保护]，然后除去氨基保护基团；或者(j)上式(Ⅰ)气丝菌素的单N-烷基化，其中R1是氨基；R2、R3、R4、R5、X、Y、Z和m是如权利要求1所定义的；和连续的N-酰化，然后如果必要的话，除去氨基保护基团；或者(k)将上式(Ⅰ)气丝菌素，其中R1是氨基；-N(R10)-R11[其中R10和R11各自独立地选自可选被一个或多个氨基或含有氨基的苯基取代的低级烷基]；-N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13[其中R10、R11和R13是如权利要求1所定义的，R15是可选被一或多个氨基、含氮杂环或含有氨基的苯基取代的低级烷基]；或-NHCO-R14[其中R14是被一或多个氨基、含氮杂环或含有氨基的苯基取代的低级烷基]而R2、R3、R4、R5、X、Y、Z和m是如权利要求1所定义的；的氨基用活化的脒衍生物处理，转化为胍基；或者(l)上式(Ⅰ)气丝菌素的酚式羟基的O-烷基化，其中R2是氢；R1、R3、R4、R5、X、Y、Z和m是如权利要求1所定义的；或者(m)上式(Ⅰ)气丝菌素的碘化，其中R2和R3是氢；R1、R4、R5、X、Y、Z和m是如权利要求1所定义的，然后使所得式(Ⅰ)碘代衍生物，其中R3是碘；R1、R2、R4、R5、X、Y、Z和m是如权利要求1所定义的，进行钯(O)催化的偶合作用，然后如果必要的话，除去氨基保护基团；或者(n)上式(Ⅰ)气丝菌素的氨基甲酰基的脱水，其中R5是-CONH2；R1、R2、R3、R4、X、Y、Z和m是如权利要求1所定义的；然后如果必要的话，除去氨基保护基团；或者(o)上式(Ⅰ)气丝菌素的氨基甲酰基或氰基的还原，其中R5是-CONH2或-CN；R1、R2、R3、R4、X、Y、Z和m是如权利要求1所定义的；然后如果必要的话，除去氨基保护基团；或者(p)上式(Ⅰ)气丝菌素的酪氨酸残基的羟基磺化，其中R2是氢；R1、R3、R4、R5、X、Y、Z和m是如权利要求1所定义的，然后除去保护基团；或者(q)上式(Ⅸ)直链肽通过肽合成法转化为上式(Ⅰ)气丝菌素，然后按照选自上述过程(c)至(o)的方法进行修饰。
33.如上所述的发明。
全文摘要
本发明涉及新颖的由式(Ⅰ)代表的气丝菌素,其中R
文档编号A61P31/10GK1311794SQ99809153
公开日2001年9月5日 申请日期1999年7月22日 优先权日1998年7月23日
发明者M·青木, M·高地, K·增渊, E·水口, T·村田, H·大久间, T·丘田, M·境谷, N·志万, T·渡边, M·柳泽, Y·安田 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司