蛇毒止痛剂的制作方法

专利名称：蛇毒止痛剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛇毒作为止痛剂的用途。
背景技术：
尽管疼痛是至关重要的生理反应，不过它也会导致不必要的难受和痛苦。疼痛的控制和缓解是医学的一个重要分支。疼痛既可以作为疾病的结果而发生，也可以作为医疗的结果而发生，例如化疗。无论怎样，尽可能多地减轻疼痛都是重要的，以便患者能够正常活动。
与疼痛有关的两种神经途径在体内同时发挥作用(1)感觉途径，它感觉组织损害，随后产生疼痛的感觉；(2)止痛途径，它减少疼痛的感觉，防止关于疼痛的信息流向中枢神经系统(CNS)，因而允许生物体维持其正常活动，不受损伤影响。使用抑制充当疼痛感受器的外周神经的药物或者增强天然止痛系统都可以实现麻醉。由于这些是不同的途径，因此它们受不同物质的影响。例如，阿斯匹林和利多卡因对外周感觉途径有活性，而吗啡和相关物质对止痛系统有活性。
目前使用的最有效的止痛剂是阿片来源的吗啡类物质。众所周知，大脑产生各种内源性阿片制剂，这一点解释了这些物质的强大效果。它们对神经元的作用受特异性受体的介导。受这些受体调节的信号防止信息从外周疼痛神经元流向CNS。这些CNS神经元对其他各种化学物质也是敏感的，包括儿茶酚胺类(血清素、去甲肾上腺素等)、神经活性肽类(神经降压素)和抑制性氨基酸类(甘氨酸和GABA)。
现存4000余种蛇中，已知大约有400种是有毒的。有毒的物种分为五个科，它们是蝰蛇科、眼镜蛇科、Crotolidae、海蛇科和穴蝰科(Atractaspidae)。蝰蛇科蛇分布在欧洲、亚洲和非洲，包含8个属，其中之一是蝰属。Crotolidae科包括响尾蛇属。眼镜蛇科包括眼镜蛇属。
蛇毒包含多种不同的物质。据估计有数百种化合物，其中据信仅有4-8种参与蛇毒的毒性作用。尽管在功能上有相似性，不过蛇毒在它们的化学组成上还是有显著区别的。每种都具有其特有的蛇毒组成。迄今，在这400余种有毒的蛇中仅鉴别出几百种化合物。它们包括酶、毒素、生长因子等。大多数所分离的蛇毒化合物都是功能未知的。
蛇毒在传统上被视为毒性物质的来源。不过，它也是止痛剂的来源。治疗被一种南美蛇(彩响尾蛇(Crotalus durissus terrificus))咬伤的患者的医生报道说尽管这些患者处于生命垂危状态，不过他们没有感觉到疼痛。有一种从蛇毒中分离的神经毒素产物在南斯拉夫第一届神经毒理学大会(1977)上被认为是新型的止痛剂。这些和其他观察结果引导人们尝试从蛇毒中分离止痛化合物。
Bevan，P.和Hiestand，P.(1983)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)2585319-5326描述了通过阳离子交换色谱法从Viperarusselli russelli毒中分离的单链多肽。该多肽与单胺和阿片配体竞争结合它们各自的受体，大鼠脑室内注射该多肽导致显著的镇静效果。作者认为，该多肽是一种强烈带电的大分子，不太可能通过血-脑屏障。还发现该多肽是一种毒性大小适度的毒素，类似于粗毒。
Dutta，A.S.和Chaudhuri，A.K.N.(1991)《印度实验生物学杂志》(Indian J.Exp.Biol.)29937-942描述了用Viperarusselli粗毒对小鼠和大鼠所进行的实验。将蛇毒通过腹膜内和静脉内方式注射，发现在与CNS有联系的一般行为模式上产生变化。蛇毒在一项测定中显示显著的止痛活性，但是在其他两项测定中没有活性。
1991年2月21日公布的WO91/01740公开了冻干大响尾蛇(Crotalus atrox)全毒在外用药物组合物中的用途。该组合物具有止痛、致充血和解痉活性。
Giorgi，R.，Bernardi，M.M.和Cury，Y.(1993)《Toxicon》311257-1265描述了由通过超滤法从彩响尾蛇(Crotalus durissusterrificus)毒提取的小分子量物质所激发的止痛效果。将提取物通过皮下、腹膜内和口服方式对小鼠给药。
1993年5月26日公布的CN1,072,344公开了含有蛇毒素酶商品(未给出来源)、白细胞肽因子和冰片的蛇毒素软膏，冰片是一种已知的止痛中药。该软膏起到抗生素的作用，没有毒副作用。
Pu，X.C.，Wong，P.T.H.和Gopalakrishnakone，P.(1995)《Toxicon》331425-1431描述了通过凝胶过滤和HPLC法从扁颈眼镜蛇毒中精制的神经毒素。将该毒素通过腹膜内、口服或i.c.v.方式对小鼠给药，发现具有有力的止痛效果。
U.S.S.R.专利No.435,824描述了从Nayaksin干燥眼镜蛇毒中制备的止痛组合物。这种蛇来自眼镜蛇科的眼镜蛇属。
过去20年间，一种名为Viprosalum或Viprosal的软膏在前苏联和东欧用于缓解疼痛。这种软膏是蝰蛇毒(欧洲种)的凡士林溶液以及羊毛脂、樟脑和solicilate的混合物。
发明概述本发明的目的是提供从蛇毒中分离的止痛物质，它基本上是无毒的。
按照本发明的一个方面，提供了基本上无毒的、从蛇毒中分离的级分，具有通过Mono Q离子交换色谱法从蛇毒中精制的级分特征，其中该级分具有止痛效果。
在本发明这方面的优选实施方式中，在Mono Q柱上、在20mMTris-HCl缓冲液pH7.0中进行色谱法，该级分在12-28分钟时洗脱。应当强调的是，上述条件打算限定本发明的级分，并不限制可以制备该级分的方式。换句话说，本发明的级分可以通过各种精制方法而从蛇毒制备。不过，它被限定为具有如上所限定的精制级分的特征。
进而按照本发明的这个方面，提供了作为止痛剂使用的药物组合物，包含基本上无毒的、从蛇毒中分离的级分，具有通过Mono Q离子交换色谱法从蛇毒中精制的级分特征，其中该级分具有止痛效果。
在本发明的优选实施方式中，该药物组合物用于局部使用。
本发明在进一步方面提供了用于从蛇毒中分离基本上无毒的级分的方法，该级分具有止痛效果，是用一种水性缓冲液通过离子交换色谱法从蛇毒中精制的。
在本发明这方面的优选实施方式中，该离子交换色谱法是用MonoQ FPLC柱进行的。在进一步优选的实施方式中，该水性缓冲液是Tris-HCl缓冲液或乙酸铵缓冲液。在特别优选的实施方式中，缓冲液的浓度是20mM，pH在6.8-7.5范围内。
由本发明所提供的级分结合了大量以前未曾报道共同出现在相同材料中的性质。这些性质包括(1)具有止痛活性；(2)基本上没有毒性；和(3)基本上是精制的。
本说明书中，术语无毒被定义为不发生作为使用具有止痛效果的药理水平的本发明级分的结果的病理现象。术语基本上无毒被定义为包括低至可接受程度的毒性以及没有毒性。
本发明的级分可以从蝰蛇科(Viperidae)、眼镜蛇科(Elapidae)、响尾蛇科(Crotolidae)、海蛇科(Hydrophidae)和穴蝰科(Atractaspidae)各种毒蛇中分离。尽管下述用于阐述本发明的实验涉及山蝰(Vipera xanthina)、蝰蛇(Vipera russelli)、菱斑响尾蛇(Crotalus adamanteus)和黑唇眼镜蛇(Naja melanoleuca)，不过不言而喻的是这些物种仅仅充当上述五科毒蛇的实例。
尽管本发明的级分是粗毒的精制级分，不过它显然包含不止一种物质。本发明不仅包括本发明的级分，而且包括各种可以从本发明级分中精制、并且具有本发明级分性质的产物。本发明还包括这些产物的衍生物，它们保留了本发明级分的性质。在蛋白质类材料的情况下，这样的衍生物将包括蛋白质或多肽，其中一种或多种氨基酸已被加入、删去和/或取代。其他化学修饰也涵盖其中。
本发明的级分可以用于制备作为止痛剂使用的药物组合物。这样一种组合物还将包含药学上可接受的载体或赋形剂，例如羊毛脂和凡士林的混合物。该组合物可以制成肠胃外使用的剂型，例如盐水溶液，或局部使用的软膏剂、霜剂或油膏剂。为了缓解受治疗者的疼痛，药物组合物将被注射或者局部涂抹在适当的位置。其他可能的用药模式是口服和直肠用药。除了活性成分以外，任何药物组合物一般还将包接受的载体或赋形剂。由于本发明的级分有时在一迟滞期后发挥作用，预期它将尤其对慢性疼痛有效，尽管它可以用于治疗任何类型的疼痛。
附图的简要说明结合下列优选实施方式的详细说明和下列附图，有助于更好地理解本发明，其中

图1A和1B阐述在Mono Q柱上精制巴勒斯坦山蝰(Viperapalestinae)毒期间所得结果。Y轴代表280nm下的吸光度，X轴是洗脱时间，以分钟计。图B是图A9-31分钟和更低吸光度范围区域的放大；图2阐述另一次在Mono Q柱上精制巴勒斯坦山蝰(Viperapalestinae)毒期间所得结果；图3阐述在Mono Q柱上精制蝰蛇(Vipera russelli)毒期间所得结果；图4阐述在Mono Q柱上精制菱斑响尾蛇(Crotalus adamanteus)毒期间所得结果；图5阐述用Tris-HCl缓冲液在Mono Q柱上精制黑唇眼镜蛇(Najamelanoleuca)毒期间所得结果；和图6阐述用乙酸铵缓冲液在Mono Q柱上精制黑唇眼镜蛇(Najamelanoleuca)毒期间所得结果。
优选实施方式的详细说明材料和方法蛇毒提取数百条蛇，得到巴勒斯坦山蝰(Vipera palestinae)毒。将它们的蛇毒冷冻和冻干。其他蝰属蛇毒购自‘Latoxin’，Rosans，France。菱斑响尾蛇(Crotalus adamanteus)和黑唇眼镜蛇(Najamelanoleuca)毒购自‘Quality Venoms for Medical Research’，NewYork，U.S.A.。
测定A、止痛测定
A、止痛测定每项试验使用数十只相似体重和年龄的仓鼠。根据所要试验的样本数将仓鼠分组。将含有供试物质的软膏剂(50％羊毛脂和50％凡士林)涂抹在动物背部毛皮上。不切除毛皮，以确保对皮肤没有损害。对照组仓鼠用不含本发明级分的软膏剂处理。通过连续局部涂抹6、14或21天对仓鼠进行处理。在最后一次涂抹软膏剂后第二天进行止痛性试验。
在典型的试验中，对每只动物涂抹含有或不含止痛物质的恒量软膏剂达预定天数。这个阶段之后，在股骨区皮下注射0.8ml 1NHCl/0.1kg体重诱发疼痛。仓鼠对HCl注射的反应是用舌头触及注射区域，这称为“舔”。从注射后20分钟开始观察仓鼠达40分钟，计数“舔”的次数。“舔”的次数充当HCl诱发疼痛的定量指征。
比较对照动物与治疗动物“舔”的平均次数，测定止痛效果。利用t检验统计测定差异的显著性。
B、致死剂量测定将四种不同浓度的供试物质注射至体重20-25克的小鼠的腹膜内。每种浓度注射八只小鼠。计算供试物质引起50％死亡的剂量(LD50)的方法描述在Reed，L.J.和Muench，H.(1938)《美国卫生学杂志》(Am.J.Hygiene)27493中。LD50单位被定义为每20g体重导致注射小鼠50％死亡所必需的供试物质量(mg/20g)。
C、毒性测定使用仓鼠进行短期测定(最多10天)，其中将供试物质注射至腹膜内达10天。使用大鼠进行长期测定，此间局部涂抹软膏剂，每天一次，每周6天，历时4个月(共计涂抹100次)。
在即期毒性测定中，用0.1或0.2ml各种未稀释的Mono Q级分皮下注射小鼠(20-25克)。
D、蛋白质测定使用已知浓度的卵清蛋白标准，在280nm下通过光谱法测定本发明级分中的蛋白质类材料的量及其在每份分离物中的浓度。
实施例I、从巴勒斯坦山蝰(Vipera palestinae)毒精制本发明的级分在典型的精制中，将50-80mg巴勒斯坦山蝰毒溶于20mM Tris缓冲液pH7.5，最终浓度为0.1g/ml。离心并除去沉淀后，将上清液通过微孔滤器(40微米)过滤，取0.1-0.2ml上1×10cm FPLC Mono Q柱(Pharmacia)。A溶剂由20mM Tris缓冲液pH7.5组成，B缓冲液由20mM Tris和0.5M NaCl组成。在洗脱的前20分钟期间单用缓冲液A。在后45分钟期间使用缓冲液A与B的混合物(50％∶50％)，最后5分钟使用100％缓冲液B。本发明的级分在20-25分钟区域洗脱出来(见图2B)，这是根据各种测定所确定的(见下)。洗脱也可以单用缓冲液A进行，可以用20mM乙酸铵pH6.9代替。历时3年用Mono Q柱进行了一百次精制，均得到相似的结果。
II、来自巴勒斯坦山蝰(Vipera palestinae)毒的本发明级分的鉴别A、本发明级分的性质为了测定本发明级分的性质，将在Mono Q柱上制得的0.1mg本发明级分溶于缓冲溶液。同时，将2.4mg链霉蛋白酶E溶于洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5)，制得链霉蛋白酶E。准备三支试管，一支仅含有链霉蛋白酶，第二支仅含有本发明级分，第三支中将本发明级分用5μl链霉蛋白酶E(0.17微克)培养。将试管在室温下培养24小时，然后试验止痛活性。
结果是仅有试管2具有止痛活性。该试验重复3次，均得到同一结果。因此可以得出结论，本发明级分具有蛋白质样性质或者它的止痛活性需要蛋白质的参与。
B、本发明级分的纯度在10次分离操作的基础上，来自Mono Q柱的20-25分钟级分(见上I)含有0.02±0.05S.D.mg/ml蛋白质。每次操作得到0.1mg本发明级分。该数量相当于总上柱蛇毒蛋白的0.6％。这说明本发明级分的纯度高。
III、止痛活性使用历时两年制得的制剂试验本发明级分的止痛活性。将含有0.01mg蛋白质的0.2ml本发明级分溶于50g软膏，得到浓度为0.0002mg本发明级分/g软膏。如“方法”一节所述将仓鼠用该软膏局部处理21天。结果总结在表1中。
表1
*7次实验“舔”的平均数±S.D.
这些实验显示，与对照相比，用本发明级分处理的仓鼠减少了对HCl诱发疼痛的感觉。用Mono Q柱制备的本发明级分完全与蛇毒的毒性组分分离开来，见如下讨论。
IV、毒理学研究A、本发明级分的注射A1、向小鼠(每只20-25g)s.c.注射0.05mg用Mono Q柱制备的本发明级分。该剂量是在仓鼠中产生止痛效果所需量的250倍。在该剂量下，本发明级分对小鼠没有毒性，观察到没有可见的症状。相形之下，注射从柱子洗脱的0.02mg前几次级分(试管2-7)导致被注射的全部5只小鼠立即死亡。该发现证明止痛级分基本上没有毒性。
A2、在进一步的实验中，用本发明级分注射3组仓鼠，每组8只(100-120克)。将冻干级分溶于生理盐水溶液，浓度为0.002mg/ml，分别取0.1ml或0.2ml每日注射到第一组和第二组动物腹膜内达10天。第三(对照)组仅注射0.2ml盐水。注射的10天内，采集血样用于生化参数的测定和组织病理学试验。
在所测定的生化因子中，在前两组中观察到胆固醇和淀粉酶增加(结果没有显示)。不过观察到肝酶(LDH，SGOT，SGPT)功能没有显著变化。
A3、研究了A2节实验动物的组织病理学。在本发明级分注射组与对照组之间检测到没有显著的组织病理学差异。
B、局部处理如“方法”一节(止痛测定)所述将本发明级分制成软膏剂。使用三组大鼠，每组10只(雄性和雌性)，体重120-140g。如“方法”一节所述局部涂抹软膏剂。涂于第1组和第2组的软膏剂包含浓度分别为0.0002和0.001mg/g的本发明级分。第3组中，软膏剂仅包含溶剂作为对照。每日向每只大鼠涂抹0.2g软膏。在实验的四个月期间，第1组的每只大鼠总计接受0.03mg/kg体重的本发明级分，第2组的每只大鼠总计接受0.15mg/kg体重的本发明级分。在实验期间，观察到大鼠的行为或体重没有变化。
在实验室中收集血液和尿液。关于收集尿液，将动物置于塑料表面上，收集尿液，立即用Multistick试验。关于采集血液，将大鼠麻醉，采集动脉血。离心除去血浆，贮存在4℃下，测定生化参数。
B1、检测到SGPT或SGOT没有增加。检测到下列血液分析物水平与对照组没有显著差异Cre；Ca2+；P(i)；Glu；Ur；Chl；TP；Alb；Bili；Al.Phos；AMY(结果没有显示)。
B2、尿液中各种生化参数的测量结果总结在表2中。
表2
*仅使用雄性大鼠。
表中分析物水平说明如下(-)阴性；(0)痕量；(+)低；(++)中等。括号后的数字表示所试验的大鼠数。
检测到没有显著差异。
B3、研究了用溶于软膏的本发明级分局部处理的成年大鼠的组织病理学。最后一次涂抹软膏后第二天，处死动物，取它们的皮肤和组织，固定在福尔马林中。将组织包埋在石蜡中，切成6微米切片。用苏木精和Oozin染色。试验了下列组织(1)受处理区域的皮肤；(2)未处理区域的皮肤；(3)心脏；(4)肾脏；和(5)脑。
组织来自(1)用0.0002mg/g止痛级分处理的十只大鼠中的八只；(2)用0.001mg/g止痛级分处理的十只大鼠中的六只；和(3)八只对照大鼠。所有被试验的大鼠都是随机选择的。
结果总结在表3中。
表3
结论是在处理组与对照组之间观察到没有显著的组织病理学变化。
总而言之，发现从Vipera palestinae毒中分离的本发明级分没有显著毒性。
V、Vipera palestinae的额外精制使用不含NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液pH7.0在Mono Q柱上进行Vipera palestinae毒的额外精制，本发明级分在13-17分钟时洗脱，峰值为14.5分钟(图2)。
VI、从蝰蛇(Vipera russelli)制备本发明级分和鉴别A、精制使用20mM Tris-HCl缓冲液pH7.0在Mono Q柱上精制Viperarusselli毒。本发明级分在12-17分钟时洗脱，峰值为13.5分钟(图3)。
B、止痛活性如“方法”一节所述试验如上VI-A精制的级分对仓鼠的止痛活性。发现对照组舔的次数(平均±S.D.)为83.8±11.8，而受处理仓鼠舔的次数为47.6±7.7(p＜0.02)。这说明该级分具有显著的止痛活性。
C、毒理学研究对小鼠进行皮下注射，测量Mono Q级分的即期(immediate-term)毒性。发现在0.3-4.3分钟洗脱的0.1ml级分导致被注射小鼠立即死亡。5分钟后洗脱的0.2ml级分(包括止痛级分)没有毒性。
VII、从菱斑响尾蛇(Crotalus adamanteus)制备本发明级分和鉴别A、精制使用20mM Tris-HCl缓冲液pH7.0在Mono Q柱上精制菱斑响尾蛇(Crotalus adamanteus)毒。本发明级分在10-20分钟时洗脱，峰值为15.3分钟(图4)。在使用20mM乙酸铵缓冲液pH 7.0所进行的另一次精制中，该级分在12.5-17分钟洗脱(结果没有显示)。
B、止痛活性如“方法”一节所述试验如上VII-A精制的级分对仓鼠的止痛活性。发现对照组舔的次数(平均±S.D.)为83.8±11.8，而受处理仓鼠舔的次数为25.3±5.3(p＝0.00)。这说明该级分具有显著的止痛活性。
C、毒理学研究如上VI(c)测量Mono Q级分的毒性。发现毒性级分在0.5-5.0分钟洗脱。5分钟后洗脱的全部级分(包括止痛级分)都没有毒性。
VIII、从黑唇眼镜蛇(Naja melanoleuca)制备本发明级分和鉴别A、精制使用20mM Tris-HCl缓冲液pH7.0在Mono Q柱上精制Najamelanoleuca毒。本发明级分在12-18分钟时洗脱，峰值为14.3分钟(图5)。在使用20mM乙酸铵缓冲液pH6.9所进行的另一次精制中，该级分在峰值17分钟洗脱(图6)。
B、毒理学研究如上VI(c)测量Mono Q级分的毒性。发现毒性级分在0.1-4.0分钟洗脱。5分钟后洗脱的全部级分(包括止痛级分)都没有毒性。
本领域技术人员将认识到，本发明并不限于已经描述的内容，相反，本发明的范围仅受下列权利要求的限制。
权利要求
1.基本上无毒的、从蛇毒中分离的级分，具有通过Mono Q离子交换色谱法从蛇毒中精制的级分特征，其中所述级分具有止痛效果。
2.根据权利要求1的级分，其中所述色谱法是在Mono Q柱上、在20mM Tris-HCl缓冲液pH7.0中进行的，该级分在12-28分钟时洗脱。
3.根据权利要求1的级分，其中所述蛇选自由蝰蛇科(Viperidae)、眼镜蛇科(Elapidae)、响尾蛇科(Crotolidae)、海蛇科(Hydrophidae)和穴蝰科(Atractaspidae)组成的组。
4.根据权利要求3的级分，其中所述蝰蛇科是山蝰(Viperaxanthina)。
5.根据权利要求4的级分，其中所述山蝰是巴靳斯坦山蝰(Viperaxanthina palestinae)。
6.根据权利要求3的级分，其中所述响尾蛇科是菱斑响尾蛇(Crotalus adamanteus)。
7.根据权利要求3的级分，其中所述眼镜蛇科是黑唇眼镜蛇(Najamelanoleuca)。
8.从权利要求1级分得到的产物，它保留该级分的所述性质。
9.权利要求8的产物的衍生物，它保留权利要求1级分的所述性质。
10.根据权利要求1的级分在作为止痛剂使用的药物组合物制备中的用途。
11.作为止痛剂使用的药物组合物，包含根据权利要求1的基本上无毒的级分和药学上可接受的载体或赋形剂。
12.用于局部给药的根据权利要求11的药物组合物。
13.用于肠胃外给药的根据权利要求11的药物组合物。
14.用于治疗疼痛的根据权利要求11的药物组合物。
15.缓解受治疗者疼痛的方法，包括将根据权利要求1的基本上无毒的级分对所述受治疗者给药。
16.根据权利要求15的方法，其中所述级分是局部给药的。
17.用于从蛇毒中分离基本上无毒的级分的方法，其中所述级分具有止痛效果，该方法包括将全毒上离子交换柱，用一种水性缓冲液洗脱该级分。
18.根据权利要求17的方法，其中所述柱子是Mono Q离子交换柱。
19.根据权利要求18的方法，其中所述柱子是用Tris-HCl缓冲液或乙酸铵缓冲液洗脱的。
20.根据权利要求19的方法，其中所述缓冲液的浓度是20mM，pH在6.8-7.5范围内。
21.根据权利要求20的方法，其中所述级分在12-28分钟时洗脱。
全文摘要
公开了从蛇毒中分离的基本上无毒的级分,该级分具有止痛效果。该级分具有在Mono Q离子交换柱上从蛇毒中精制的级分特征。还描述了包含该无毒级分的作为止痛剂使用的药物组合物和用于缓解疼痛的方法,包括将该无毒级分给药。
文档编号A61P25/00GK1361695SQ99816844
公开日2002年7月31日 申请日期1999年7月14日 优先权日1999年7月14日
发明者A·舒洛弗, N·普利莫尔 申请人:S.I.S.舒洛弗科学研究有限公司