ctin抗体(1: 10000)，室温孵育I h，最后用ECL发光剂显示阳性条带，用凝胶成像系统扫描灰度值，试验重复3次。
[0024]三、统计学处理
采用SPSS 15.0统计软件，实验数据通过one way ANOVA分析，P〈 0.05表明有统计学意义。
[0025]结果
一、情况观察
C组小鼠在整个实验过程中精神状态好、动作敏捷、毛色光泽4组小鼠由于患有II型糖尿病但没有给予有效治疗，该组小鼠精神萎靡、动作迟钝、形体消瘦、体毛松散并伴有烂尾现象；D1、D2和D3组精神状态有所改善，毛色明显较光滑，烂尾现象也有所缓解。
[0026]二、免疫组化结果
免疫细胞化学显示(见图1)，P-PI3K p85 (Y458)和p-Akt (Ser 473)在正常小鼠肾组织表达极少，而在肾病模型组阳性染色明显增多，且主要分布在肾小管上皮细胞的胞浆中；PTEN主要分布在肾小管上皮细胞核中，肾小球组织中也有少量阳性染色。与A组相比，D1、D2和D3组，p-PI3K p85 (Y458)和p-Akt (Ser 473)阳性染色的数量均有不同程度的减少，而PTEN的表达和分布有所增多。
[0027]三、westernblotting 结果
western blotting 结果见图 2和图 3,通过计算 p-Akt (Ser 473) /Akt、p-PI3Kρ85 (Υ458) /ΡΙ3Κ ρ85 和 PTEN/ β -actin 相对灰度值，分别来反映 p_Akt (Ser 473)、p-PI3Kρ85 (Υ458)和PTEN的表达情况。统计结果显示与C组相比，A组p_Akt(Ser 473)和p_PI3Kρ85 (Υ458)的表达水平显著增高(aP〈0.05，bP〈0.05),PTEN的表达水平降低(cP〈0.05)。经药物干预后，与A组相比，B组、D1、D2和D3组的p-PI3K p85 (Y458)、p-Akt (Ser 473)水平均明显减少(aP〈0.05，bP〈0.05)。而与模型组相比，只有B组和D3组中PTEN蛋白的表达明显增加(cP〈0.05)。
[0028]本研究首先建立成功的小鼠糖尿病肾病模型，在此基础上再研究苦瓜皂苷对糖尿病肾病的作用效果和机制。关于糖尿病肾病模型的制备，我们参考了国内外的一些模型制作经验，最终选择高脂饮食加小剂量STZ，使A组的血糖水平均高于350mg/dl水平，最终形成糖尿病肾病模型。Western blotting和免疫组化结果显示，A组肾组织中p_PI3Kρ85 (Υ458)和p-Akt (Ser 473)表达水平增加，这与Rane等人的研究结果相一致。然后主要针对苦瓜皂苷对糖尿病肾病模型小鼠的治疗效果及其机制进行初步探讨。结合前期研究结果分别设立了高、中、低三个剂量组，结果显示不同剂量的三个组对糖尿病小鼠整体状态都有不同程度的改善作用，同时检测了与糖尿病密切相关的PI3k/Akt通路中关键成分的表达和活性。PI3k/Akt通路是葡萄糖的吸收与利用，以及调节血糖平衡的主要转导途径[7]。Akt是胰岛素信号转导的调定点，Akt的激活依赖于PIP3的产生，PI3K它是由一个分子量85 kDa的调节亚基p85和一个分子量110 kDa的催化亚基pi 10组成[7]。p85与胰岛素受体底物(IRS)结合，PllO与细胞膜上的磷脂酰肌醇(PI)结合，促进第二信使PIP3产生，进而激活Akt，启动PI3K/Akt信号通路。而PTEN是主要的负反馈调节，可以阻断Akt及其下游效应分子的活化。该通路既是药物保护肾脏细胞的重要作用靶点，又是调节抑制细胞凋亡的上游通路。
[0029]同C组相比，A组中，p-Akt和P-PI3K表达显著增加，且在肾间质的沉积也显著增力口，而PTEN蛋白的阳性染色明显减少。这与以往研究结果相一致，PTEN在糖尿病肾病的肾脏组织中表达下调。由于PTEN在A组的表达减少，负调节PI3K/Akt通路的作用减弱，可导致TGF过激活PI3K/Akt通路，使p-Akt表达增加，促进糖尿病时肾组织的纤维化。糖尿病小鼠经苦瓜皂苷治疗后，肾组织PTEN的表达增加，而p-PI3K p85 (Y458)和p-Akt (Ser 473)的表达有不同程度的下调，也提示PI3K和Akt的激活可能受到PTEN的调节，有研究报道PI3K/Akt信号通路不仅可以抑制细胞凋亡的上游通路，还能上调各种抗凋亡蛋白以达到对肾脏细胞的保护作用从而延缓或阻断糖尿病肾病纤维化的发生和发展。比较苦瓜皂苷不同剂量组发现随着剂量的增加，苦瓜皂苷对肾脏病变的缓解作用越好。综上所述，苦瓜皂苷可能通过上调小鼠肾组织的PTEN表达，抑制PI3K/Akt信号通路的活化而发挥减轻和延缓糖尿病肾小管间质纤维化发生发展的作用，为临床治疗提供重要的理论依据同时带给我们一个重要提示:苦瓜作为一种食材可以有效的降低血糖，缓解糖尿病肾病的发展。
【主权项】
1.苦瓜皂苷在治疗糖尿病肾病药物中的用途，其特征在于，所述的治疗糖尿病肾病药物包括苦瓜皂苷和其他辅料。
2.根据权利要求1所述的苦瓜皂苷在治疗糖尿病肾病药物中的用途，其特征在于，所述的治疗糖尿病肾病药物剂型包括口服制剂、吸入剂、注射剂、栓剂。
3.根据权利要求2所述的苦瓜皂苷在治疗糖尿病肾病药物中的用途，其特征在于，所述的口服制剂包括片剂、丸剂、胶囊、颗粒、膏剂、脂质体、酊剂、汤剂。
4.根据权利要求1所述的苦瓜皂苷在治疗糖尿病肾病药物中的用途，其特征在于，苦瓜皂苷在治疗糖尿病肾病药物中重量比为0.001wt%-50wt%o
5.根据权利要求4所述的苦瓜皂苷在治疗糖尿病肾病药物中的用途，其特征在于，苦瓜皂苷在治疗糖尿病肾病药物中重量比为0.01wt%-10wt%o
6.根据权利要求4所述的苦瓜皂苷在治疗糖尿病肾病药物中的用途，其特征在于，苦瓜皂苷在治疗糖尿病肾病药物中重量比为0.lwt%-5wt%。
7.根据权利要求4所述的苦瓜皂苷在治疗糖尿病肾病药物中的用途，其特征在于，所述的其他辅料为粘合剂、润滑剂、甜味剂、润湿剂、载体、填充剂中的一种或几种。
【专利摘要】本发明公开了苦瓜皂苷在治疗糖尿病肾病药物中的用途，所述的治疗糖尿病肾病药物包括苦瓜皂苷和其他辅料。所述的苦瓜皂苷在治疗糖尿病肾病药物中的用途，所述的治疗糖尿病肾病药物剂型包括口服制剂、吸入剂、注射剂、栓剂。本发明通过明确苦瓜皂苷在缓解和治疗糖尿病肾病中的效果，进而对苦瓜皂苷在治疗糖尿病肾病药物中的用途进行开发，提出了含有苦瓜皂苷的治疗糖尿病肾病药物的新型药物。
【IPC分类】A61P3-10, A61P13-12, A61K36-42, A61K31-704
【公开号】CN104546879
【申请号】CN201510006269
【发明人】张雅琴
【申请人】苏州卫生职业技术学院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月7日