酸枣枝叶提取物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药化学技术领域，涉及酸枣枝叶提取物及其制备方法和应用，具体 涉及酸枣枝叶提取物及其制备方法和该提取物在制备治疗镇静催眠、抗抑郁药物方面的应 用。
【背景技术】
[0002] 流行病学调查表明，西方国家有不同程度失眠者约为35. 2%。中国卫生部一项统计 资料也显示，目前我国失眠者已达120万~140万人次，失眠率高达109Γ20%。据专家估计， 到2020年全球失眠者将超过7亿。
[0003] 长期失眠会引起人体免疫机能降低和代谢紊乱，加重原有的心脑血管、消化系统 等疾病，失眠又可以加重抑郁、焦虑障碍，导致严重的心理卫生问题。抑郁症是一种常见的 精神障碍，目前其发病率已跃居世界常见疾病的第四位，专家预测今后20年内抑郁症将会 上升为第二大常见疾病。据统计，人群中约59Γ6%的人在不同程度上患有抑郁症。随着生活 节奏不断加快，社会压力越来越大，抑郁症发病率逐年增加，严重影响了人们的生活质量。
[0004] 目前市场上有各种治疗失眠、抗抑郁的药物，虽然能控制疾病，但是仍存在长期疗 效不佳和不良反应等方面的缺点，如催眠药苯二氮类(如艾司唑仑、氟西泮、夸西泮和替马 西泮等）存在明显副作用，包括精神和行为变化、记忆障碍，长期用药时产生一定耐受性，久 服可能发生依赖性和成瘾，停药时可能出现反跳和戒断症状(失眠、焦虑、激动、震颤等)，可 能出现白天残留作用等。用于抑郁症治疗的药物如：三环类药物、单胺氧化酶抑制剂和选择 性5-HT重吸收抑制剂等，虽有确切的疗效，但同时有多种副作用和禁忌症，使病人不能耐 受，难以达到满意疗效，复发率高。因此，世界各国学者都从植物中寻找强效、无毒的活性成 分来开发新药。传统中药有效成分的提取分离工作正受到世界各国的广泛专注，从中药中 提取有效的部位或单体，为新药的发现提供了有效手段。
[0005] 酸麥Mill var. (Bunge) Hu ex H. Fu Chow)是鼠 李科枣属植物，性平，味甘酸，具有很好的开胃健脾、生津止渴、消食止滞的疗效。《神农本草 经》中记载，酸枣可以"安五脏，轻身延年"。酸枣仁在临床上常用于治疗神经衰弱、心烦失 目民、多梦、盗汗、易惊等病。本发明所述的酸麥枝叶，为鼠李科植物酸麥 Mill var. (Bunge) Hu ex H. Fu Chow)的枝和叶。酸麥枝称"棘刺"，主治消肿， 溃脓，止痛。酸枣叶也称棘叶，主治胫臁疮，具有麻醉作用，民间多用于泡水代茶饮，治疗高 血压、失眠，经临床验证，酸枣叶对冠心病也有较好疗效。酸枣树为野生资源，近年来，由于 一些地区野生资源遭到破坏，且一些偏远的丘陵地区的酸枣资源未得到开发，导致酸枣仁 的价格逐年增长，其枝叶也只是作为饲料用，造成资源的极大浪费。目前对酸枣仁的化学成 分和药理作用研究相对较多。据报道，酸枣仁中含有黄酮类、生物碱类、皂苷类、脂肪油、多 糖及有机酸类等多种化合物。而有关酸枣枝叶的化学成分研究，有学者进行了酸枣叶总黄 酮的测定及HPLC-PDA-ESI-MS/MS法鉴定酸枣叶中的三萜类、皂苷类和黄酮类成分。药理作 用方面，酸枣仁镇静催眠抗抑郁作用的研究比较深入，而酸枣枝叶抗失眠和抗抑郁的报道 较少。
【发明内容】
[0006] 为了有效的利用资源，本发明提供酸枣枝叶提取物及单体化合物的制备方法，以 及在治疗失眠抑郁等中枢神经系统药物的应用。
[0007] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的： 1.酸枣枝叶提取物的制备： (1) 将酸枣枝叶粉碎，酸枣枝叶粉末用水或体积浓度为30%_80%醇溶液提取，浓缩成浸 膏； (2) 浸膏加入5~10倍的蒸馏水溶解； (3) 将步骤（2)所得液体通过大孔树脂柱色谱，依次用水、10%-30%乙醇、40%-60%乙醇 和70%-90%乙醇的溶液洗脱； (4) 弃去水、10%-30%乙醇洗脱液，合并40%-60%和70%-90%乙醇洗脱液，减压浓缩至干， 得到酸枣枝叶提取物。
[0008] 步骤（1)中，药材粉碎目数为10-40目，优选20目。
[0009] 所述的醇溶液为甲醇、乙醇或正丁醇的含水溶液，优选乙醇溶液，浓度优选 40%-80%〇
[0010] 所述的水或醇溶液的用量为酸枣枝叶的8-20倍量，优选15-20倍。
[0011] 所述的提取所用方法为回流、冷浸或闪式提取，每次I mirTl h，优选回流提取。
[0012] 所述的回流提取中，提取时间为1~3小时，回流温度为7(T90°C，优选1小时。
[0013] 冷浸时间为1~3小时，优选3小时。
[0014] 闪式提取时间为20秒~3分钟，优选1分钟。
[0015] 步骤（2)中，加入蒸馏水的用量为浸膏重量5~10倍，在6(T80°C或超声的条件下溶 解浸膏； 步骤（3)中，所述的大孔树脂为D101、AB-8、HPD-100、HPD-400或HPD-450,优选D101、 HPD-100 或 AB-8。
[0016] 步骤（3)包括如下步骤： (a) 用水上柱，冲洗至苯酚-硫酸试液反应阴性，水用量为柱体积的1(Γ15倍，流速为 1~2柱体积/小时； (b) 用体积浓度为10%-30%的乙醇溶液洗脱，冲洗至盐酸镁粉反应阳性，乙醇用量为柱 体积的ΚΓ20倍，流速为1?2柱体积/小时；优选10%，30%。
[0017] (C)用体积浓度为40%_60%的乙醇溶液上柱，冲洗至盐酸镁粉阴性乙醇用量为柱 体积的ΚΓ20倍，流速为1?2柱体积/小时；优选40%，60%。
[0018] (d)用体积浓度为70-90%的乙醇溶液上柱，冲洗至Liebrmann Burchard反应阴 性，乙醇用量为柱体积的ΚΓ20倍，流速为广2柱体积/小时；优选70%，90%。
[0019] 2.酸枣枝叶单体化合物的分离 利用多种分离手段，包括硅胶、聚酰胺、S印hadex LH-20和ODS柱色谱及制备HPLC等， 从酸枣枝叶乙醇提取物中共分离得到16个化合物，，根据理化性质及波谱数据，确定了化 合物的结构，其中化合物3、4、7、8、15和16为首次从枣属植物中分离得到。
[0020] 上述16个化合物是由如下的方法制备： 将40%-60%的乙醇洗脱液浓缩后经聚酰胺柱色谱，用乙醇-水系统0:100-90:100梯度 洗脱，其中经聚酰胺柱色谱洗脱下的30%乙醇流份再经聚酰胺柱色谱，用二氯甲烷-甲醇或 石油醚-丙酮（100:20-100:30)梯度洗脱。得到三个流份。流份1经S印hadex LH-20凝胶 柱色谱，再经制备高效液相分离得到化合物1。流份2经ODS柱色谱及反复S印hadex LH-20 凝胶柱色谱，得到化合物2和化合物3。流份3经S印hadex LH-20凝胶柱色谱和制备高效 液相得到化合物4、化合物5、化合物6、化合物7和化合物8。
[0021] 将70%_90%的乙醇洗脱液浓缩后经硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇或石油醚-丙 酮（100:0-100:10)梯度洗脱，得到5个流份（Fr. 1?Fr. 5)。Fr. 2经硅胶柱色谱，S印hadex LH-20凝胶柱色谱及重结晶等手段得化合物9、化合物10、化合11、化合物12和化合物13。 Fr. 3经硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇/乙酸乙酯系统梯度（100:1-100:20)洗脱，再用 Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，制备高效液相色谱分离等手段得化合物14。Fr. 5经 硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇-水（100:10:0-100:20:1)梯度洗脱，再用ODS柱色谱及 Sephadex LH-20凝胶柱色谱等手段得化合物15和化合物16。
[0022] 本发明还提供了一种药物组合物，包含如上所述的酸枣枝叶提取物。所述的酸枣 枝叶提取物可以和药学上可接受的载体混合制备临床可接受的固体制剂或液体制剂，固体 制剂包括颗粒剂、片剂、胶囊剂等，液体制剂包括，口服液体制剂和注射液体制剂。
[0023] 3.酸枣枝叶提取物抗失眠、抗抑郁作用的研究 (1)酸枣枝叶提取物对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡的影响 昆明种小鼠随机分为空白对照组(生理盐水)、酸枣仁粗提取物组、阳性药组、酸枣枝叶 40%-60%乙醇洗脱物组、70%-90%乙醇洗脱物组和酸枣枝叶提取物组(实施例1)，每组8只， 连续灌胃给药5 d,于末次给药60 min后,腹腔注射戊巴比妥钠50 mg*kg-l (阈上剂量指 90%的小鼠入睡的剂量)，观察并记录小鼠发生睡眠只数、睡眠潜伏期及睡眠持续时间。以注 射戊巴比妥钠后15 min内翻正反射消失达I min以上者确定为阳性，以注射戊巴比妥钠后 15 min内出现翻正反射消失为睡眠潜伏期；以动物翻正反射消失至恢复为睡眠持续时间。 全部数据均采用Spss 16.0统计软件进行处理。结果表明各给药组对阈上剂量戊巴比妥钠 致小鼠入睡的睡眠潜伏期均无显著性影响，除酸枣枝叶70%-90%洗脱物组外，其他各给药 组均能显著增加小鼠睡眠时间（P〈0.01)。
[0024] (2)酸枣枝叶提取物对对氯苯丙胺酸（PCPA)致失眠大鼠血清细胞因子的影响 研究表明，中枢的细胞因子参与睡眠的调节，其中白细胞介素 -I (IL-I)和肿瘤坏死因 子-α (TNF-α)在睡眠调节中发挥着重要的作用。IL-I是一种具有致睡作用的细胞因子， 当睡眠剥夺时IL-I以及其他促睡眠物质在体内的蓄积标志着睡眠的积累，这些物质给机 体以睡眠压力，从而形成睡眠剥夺后的睡眠"反跳"现象，以补偿所失去的睡眠。IL-I包括 IL-I a、IL-I β和IL-lRa(IL-l受体拮抗剂)。IL-I β是血液循环中的主要形式，生理功能 较强，所以目前大多以IL-I β研究为主。TNF-α与IL-I具有类似的睡眠调节作用。TNF-α 在免疫系统影响睡眠过程中起到中介的作用，可通过提高脑内5-羟色胺（5-ΗΤ)的更新率， 增强5-ΗΤ能神经元的功能，延长慢波睡眠时间。本研究观察酸枣枝叶提取物对对氯苯丙胺 酸（PCPA)致失眠大鼠血清细胞因子的影响。
[0025] 选用SD大鼠，随机分为空白组、模型组、酸枣枝叶粗提物组、酸枣仁粗提取物组、 阳性药组、酸枣枝叶40%-60%乙醇洗脱物组、70%-90%乙醇洗脱物组和酸枣枝叶提取物组 (实施例1)，每组8只，除空白组外，其他各组均于每天上午